Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En rørledning, der bruger bilateral in Utero Electroporation til at afhøre genetiske påvirkninger af gnaveradfærd

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

Den rolle, som nyligt opdagede sygdomsrelaterede gener spiller i patogenese af neuropsykiatriske lidelser, forbliver uklar. En modificeret bilateral i livmoderelektroporationsteknik giver mulighed for genoverførsel i store populationer af neuroner og undersøgelse af de forårsagende virkninger af genekspressionsændringer på social adfærd.

Abstract

Efterhånden som genomdækkende foreningsundersøgelser kaster lys over de heterogene genetiske fundamenter for mange neurologiske sygdomme, øges behovet for at studere specifikke geners bidrag til hjernens udvikling og funktion. Det er ikke altid muligt at stole på musemodeller til at studere specifikke genmanipulationers rolle, da transgene muselinjer er ret dyre, og mange nye sygdomsrelaterede gener endnu ikke har kommercielt tilgængelige genetiske linjer. Derudover kan det tage mange års udvikling og validering at oprette en muselinje. I livmoderen elektroporation tilbyder en relativt hurtig og nem metode til at manipulere genekspression i en celle-type specifik måde in vivo, der kun kræver at udvikle en DNA plasmid at opnå en bestemt genetisk manipulation. Bilateral i livmoderen elektroporation kan bruges til at målrette store populationer af frontal cortex pyramidal neuroner. Ved at kombinere denne genoverførselsmetode med adfærdsmæssige tilgange kan man studere virkningerne af genetiske manipulationer på funktionen af præfrontale cortexnetværk og den sociale adfærd hos unge og voksne mus.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) har drevet opdagelsen af nye kandidat gener, der er forbundet med hjernen patologier1,2,3,4. Disse undersøgelser har været særligt gavnlige i forståelsen ødelæggende neuropsykiatriske lidelser som skizofreni (SCZ), hvor undersøgelsen af nye gener har fungeret som et udgangspunkt for nye linjer for forskning og terapeutisk intervention5,6. Gener huser risiko for SCZ viser forudindtaget udtryk i præfrontal cortex (PFC) under prænatal og tidlig postnatal udvikling, en region involveret i patologien af flere neuropsykiatriske lidelser7. Derudover udviser musemodeller af psykiatriske lidelser unormal aktivitet i PFC-netværk6,8,9. Disse resultater tyder på, at SZC-associerede gener kan spille en rolle i de udviklingsmæssige ledninger i denne region. Yderligere undersøgelse ved hjælp af dyremodeller er nødvendig for at forstå disse kandidatgeners bidrag til etableringen af forbindelser i PFC og for at afgøre, om disse gener har en forårsagende rolle i patogenese af neuropsykiatriske lidelser. Genmanipulationsteknikker hos mus, der giver mulighed for undersøgelse af genekspressionsændringer på specifikke neuronale kredsløb under prænatal og tidlig postnatal udvikling, er en lovende metode til at forstå de molekylære mekanismer, der forbinder genekspressionsændringer med PFC-dysfunktion.

Genetiske muselinjer tilbyder en metode til at studere virkningen af bestemte gener på hjernens udvikling og funktion. Men at stole på transgene mus kan være begrænsende, da der ikke altid er kommercielt tilgængelige linjer til at undersøge virkningerne af specifikke gener på at udvikle neurale kredsløb. Desuden kan det være ekstremt dyrt og tidskrævende at udvikle brugerdefinerede muselinjer. Brugen af intersektionelle genetiske manipulationsstrategier, der kombinerer transgene mus med virale tilgange, har revolutioneret forståelsen af hjernen10,11,12. På trods af store fremskridt kommer virale strategier med visse begrænsninger afhængigt af den virale vektortype, herunder grænser i emballagekapacitet, der kan begrænse viralt udtryk13 og celletoksicitet forbundet med viralt udtryk14. Desuden kræver robust genekspression ved hjælp af adeno-associeret virus (AAV'er) i de fleste eksperimentelle tilstande ca. 2 til 4 uger15, hvilket gør rutinemæssige virale strategier umulige at manipulere gener under tidlig postnatal udvikling.

I utero elektroporation (IUE) er en alternativ tilgang, der giver mulighed for en hurtig og billig genoverførsel16,17, der, når den kombineres med fluorescerende mærkning og farmakogenetiske eller optogenetiske tilgange, giver en kraftfuld platform til at dissekere funktionen af neuronale kredsløb. Derudover, med udviklingen af CRISPR-Cas9 genom redigering gener kan overekspresseres eller præcist ændres gennem celle-type specifikke knock-down eller knock-out af specifikke gener eller gennem graduering af initiativtagere18,19. Genmanipulationsmetoder ved hjælp af IUE er særligt fordelagtige, når effekten af gener på neuronale kredsløb skal testes under smalle udviklingsvinduer20. IUE er en alsidig teknik, og overekspression kan let opnås ved at indsætte et gen i en ekspressionsvektor under en bestemt promotor. Yderligere kontrol med genekspression kan opnås ved at drive ekspression ved hjælp af initiativtagere med forskellige styrker eller ved hjælp af uovervindelige promotorer , der er i stand til tidsmæssigt at kontrollere genekspression21,22. Derudover giver IUE mulighed for målretning af celler inden for specifikke kortikale lag, celletyper og hjerneområder, hvilket ikke altid er muligt ved hjælp af andre tilgange5,17. Nylige fremskridt i IUE-konfigurationen baseret på brugen af tre elektroder, der genererer en mere effektiv elektrisk feltfordeling, har udvidet denne metodes funktionelle repertoire og gjort det muligt for forskere at målrette mod nye celletyper og øge effektiviteten, nøjagtigheden og antallet af celler, der kan målrettes23,24. Denne teknik blev for nylig brugt til at bestemme den forårsagende rolle komplement komponent 4A (C4A), et gen knyttet til SCZ, i PFC funktion og tidlig kognition5.

Præsenteret her er en eksperimentel pipeline, der kombinerer genoverførselsmetoder for at målrette mod store populationer af excitatoriske neuroner i den frontale cortex, herunder PFC, med adfærdsmæssige paradigmer, der ikke kun gør det muligt at studere celle- og kredsløbsniveauændringer, men også tillader adfærd at blive overvåget gennem tidlig postnatal udvikling og voksenalder. Første beskrevet er en metode til bilateralt at transfekt store populationer af lag (L) 2 / 3 pyramideformede neuroner i frontal kortikale regioner. Dernæst er opgaver til at analysere social adfærd hos unge og voksne mus skitseret. Celletællinger kan opnås ved afslutningen af adfærdsmæssige opgaver for at kvantificere omfanget og placeringen af celletransfekt. Desuden kan antallet af transfected celler korreleres med adfærdsmæssige data for at afgøre, om et større antal transfected celler fører til større forstyrrelser i adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle eksperimentelle protokoller blev udført i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for dyreforskning og blev godkendt af Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Forberedelse af DNA-opløsning

  1. Køb en kommerciel plasmid eller underleverandør et gen af interesse i plasmid med den ønskede promotor. Her blev der anvendt et plasmid indeholdende EGFP under CAG-initiativtageren (pCAG-EGFP).
    BEMÆRK: Bestem den ønskede promotor baseret på det nødvendige udtryksniveau. Generelt kan plasmider under CAG-promotoren bruges til at opnå høje niveauer af transgenet, mens celle-type-specifikke initiativtagere (f.eks synapsin for neuroner) har tendens til at være mindre aktive. Forsøgspresseren bør empirisk bestemme de relevante udtryksniveauer for hvert plasmid.
  2. Transform bakterier og vokse lagre i bakterielle medier med passende antibiotikum.
    1. De kompetente celler (DH5α-celler) fjernes fra -80 °C, og der optøs på is i 20 min.
    2. Der blandes 100 pg -100 ng af plasmid-DNA'et med 30 μL kompetente celler. Inkuber blandingen på is i 20 min.
    3. Udfør varmechok ved at inkubere i et 42 °C vandbad i 45 s og derefter returnere røret tilbage til is i 2 minutter.
    4. Tilsættes 200 - 1.000 μL LB-medier til de transformerede kompetente celler og vokser i 45 minutter ved 37 °C på en rysteinkubator.
    5. Plade 200 μL af de omdannede celler til en LB agar plade, der indeholder det relevante antibiotikum og inkuberer pladen natten over ved 37 °C.
    6. Den næste dag inkuberes en bakteriekoloni i 200 mL LB bouillon med det relevante antibiotikum ved 37 °C på en rysteinkubator natten over.
  3. Rense plasmid DNA ved hjælp af en maxiprep kit.
    1. Følg vejledningen i det opnåede maxiprep-sæt. For elution trin, ikke elute DNA i elution buffer. I stedet elute DNA ved hjælp af enten 200 μL steril 1x PBS eller molekylær kvalitet vand.
    2. Sørg for, at den endelige koncentration af DNA'et er større end 1 μg/μL. Hvis plasmidet, der indeholder det interessegen, ikke indeholder et reportergen, skal du også forberede en plasmid til at krydse med et reportermolekyle, såsom grønt fluorescerende protein (GFP), for at give mulighed for visualisering af transfected celler.
  4. Dna-opløsningen forberedes til operationen ved at fortynde plasmid-DNA'et til 1x PBS til 1 μg/μL endelig koncentration af hvert plasmid. Tilsættes hurtigt grønt farvestof til DNA-opløsningen til en endelig koncentration på 0,1%. Til bilaterale injektioner tilberedes 60 μL opløsning pr. dæmning (til ca. 10 unger).
    BEMÆRK: Hvis plasmid ikke indeholder et reportergen, skal du bruge co-elektroporat med GFP. Co-elektroporationshastigheder er typisk 95% eller højere. I vores hænder blev transfekteffektiviteten ikke påvirket af co-transfekt. Alle elektroporated plasmider fortyndes til 1 μg/μL.

2. Bestilling eller avl timet-gravide mus

  1. Hvis du bestiller tidsindstillede mus, skal du bestille mus til at ankomme på embryonal dag (E) 13 eller tidligere for at give dæmningerne tilstrækkelig tid til at akklimatisere sig til dyrehus.  I denne protokol bruges cd-1-udavlede mus til alle eksperimenter.
    BEMÆRK: Bestilling et par dage i forvejen vil reducere dyrs stress og føre til en højere overlevelsesrate for hvalpene.
  2. Hvis avl timet-gravide mus, par kvindelige mus med en mandlig natten over, en gang om ugen. Kontroller, om der er et vaginalt stik til stede den følgende morgen (E0.5). Bestem graviditeten ved at overvåge vægten af de kvindelige mus.
    BEMÆRK: Forskellige musestammer har forskellige vægtstigninger gennem graviditeten, så bestem typisk vægtforøgelse for den anvendte musestamme.
  3. Uanset om du bestiller eller opdrætter musene, for at reducere stress af dæmningerne, skal du placere en nestepude og musehus i buret. Reduktion af stress kan bidrage til at øge overlevelsesraten for hvalpene.

3. Design og samling af tre benelektroder

  1. Brug klasse 2 titanium plader med en tykkelse på 0,063 i som en bestand materiale til elektrode kontakter.
  2. Brug standardbearbejdningsteknikker eller præcisionshåndværktøj til at lave elektroder med følgende dimensioner: 20 mm x 5 mm med en afrundet spids og rillet tilbage. Fjern eventuelle uslebne kanter eller grater ved hjælp af fint grus sandpapir.
  3. For at wire elektroden kontakter, wrap 22 G strandede kobbertråd omkring rillerne af elektroden og sikker ved lodning. Beskyt dette led ved hjælp af varme krymperør.
  4. Fastgør derefter den tilsluttede elektrode til autoclavable, ikke-ledende pincet ved hjælp af en ekstra varme krymperør for at lave de to negative elektroder. Fastgør den enkelte positive elektrode til et autokraberbart, ikke-ledende materiale (såsom et tandbørstehåndtag med et savet hoved). Sæt den åbne ende af ledningen med et standard bananstik.

4. Forberedelse til operation

  1. Bring gravide dæmninger til operationsområdet mindst 30 minutter før operationen for at give mulighed for reduktion i stressniveauet efter transport fra dyrefaciliteten.
  2. Steriliser hele operationsstedet ved hjælp af steriliserende germicidalservietter og derefter 70% ethanol. Skift handsker, før operationen påbegyndes.
  3. Steriliser autoklaveret værktøj i en glasperle sterilisator.
  4. Sterile 1x PBS (ca. 50 mL pr. dæmning) overføres til 50 mL koniske rør, og der anbringes i et rørstativ i vandbadet opvarmet til 38-40 °C. Kontroller den sterile saltvandstemperatur med et termometer.
  5. Tænd for vandopvarmningspumpen, så den opvarmes til 37 °C inden operationen påbegyndes. Dette vil opretholde musens kropstemperatur i operationens varighed.
  6. Tænd for trykinjektoren og elektroporatoren, og sørg for, at den fungerer korrekt inden operationen.
  7. Drej kort plasmid-DNA-opløsningen (opnået i trin 1.4) på en bordpladecentrifuge og læg den på is.
  8. Træk glaspipetter på en pipettetrækker, så spidsen af den trukket glaspipette er ca. 50 μm i diameter.
  9. Fyld pipette med 20-40 μL DNA-opløsning (opnået i trin 1.4).
  10. Opsæt alle nødvendige elementer til kirurgi, herunder hår fjerne lotion, jod, 70% ethanol, bomuld swaps, øjen salve, suturer, gaze, osv.
  11. Forbered en operation ark og udfylde de nødvendige oplysninger, såsom muse-id og vægt, dato for kirurgi, kirurg navn, osv.

5. I livmoderen elektroporation kirurgi

  1. Vej musen før operationen, og bemærk dette på operationsarket.
  2. Bedøve en gravid mus (E16) ved indånding i et induktionskammer med 4% (v/v) oxygen-isoflurane blanding. Når musen er blevet induceret, skal du gå over til en maske indånding og opretholde isoflurane på 1-1,5% (v / v) og overvåge vejrtrækning under hele operationen. Kontroller, at musen er fuldt bedøvet, skal åndedrættet være ~ 55-65 vejrtrækninger pr. Minut.
  3. Administrere præoperativ smertestillende: buprenorphin (3,25 mg/kg; SC) og meloxicam (1-5 mg/kg; SC) ved et maksimalt volumen på 10-30 ml/kg.
  4. Brug hårfjerning creme eller omhyggeligt bruge en barbermaskine til at fjerne pelsen fra maven. Steriliser maven ved swabbing med povidone-jod og 70% ethanol og gentag dette mindst 3 gange. Opret et sterilt felt omkring maven ved hjælp af en steril gaze, steril drapering kan også bruges.
  5. Lav et midterlinjeindsnit (3-4 cm) i mavehuden, og sørg for at løfte huden op med pincet for at undgå at skære gennem musklen. Derefter skæres gennem musklen, igen at sørge for at løfte musklen op for at undgå at skære vitale organer.
  6. Træk forsigtigt livmoderhornene ud af dæmningen ved hjælp af ring pincet og læg dem forsigtigt på det sterile felt, og sørg for, at livmoderhornet understøttes med polstring og ikke trækker for langt væk fra dæmningen. Fra dette tidspunkt skal livmoderhornet holdes fugtet gennem resten af operationen med den forvarmede sterile 1x PBS.
  7. Placer et foster ved hjælp af enten pincet eller fingre. Sæt forsigtigt den trukket glaspipette i en 45 graders vinkel med hensyn til hovedets vandrette plan og indsættes i den laterale ventrikel, som visuelt kan identificeres mellem hjernens midterlinje og øjet. Der injiceres ca. 2-3 μL i hver lateral ventrikel ved enten at indsætte pipetten i den ene og derefter den anden ventrikel (anbefales) eller ved at injicere DNA-opløsningen i en ventrikel, indtil den passerer ind i begge laterale hjertekamre. Hjertekammeret er blevet målrettet, hvis en halvmåneform er til stede efter injektion.
    BEMÆRK: Spidsen af glaspipetten kan gå i stykker under operationen. Hvis dette sker, skal glaspipetten udskiftes, hvilket sikrer, at livmoderhornene holdes fugtet, mens en ny pipette fremstilles og fyldes med DNA-opløsningen.
  8. For at transfektere celler bilateralt i den frontale cortex skal du placere de to negative elektroder på siderne af embryonerne lige laterale og lidt kaudale til de laterale ventrikler og placere den positive elektrode mellem øjnene lige foran den udviklende snude.
  9. Sørg for, at embryoet er rigeligt fugtet. Påfør fire kvadratimpulser (pulsvarighed = 50 ms varighed, puls amplitude = 36 V, interpulse interval = 500 ms).
  10. Injicere og elektroporate alle embryoner, går én efter én, så hvert foster er elektroporated umiddelbart efter DNA-opløsning injektion. Når alle embryoner er blevet elektroporated, forsigtigt indsætte livmoderhorn tilbage i bughulen. I løbet af dette trin skal du belægge bughulen i steril PBS (1x) for at hjælpe livmoderhornplacering.
  11. Fyld bughulen med steril 1x PBS, så der ikke er luftlommer tilbage, når suturering er afsluttet. Sutur musklen med absorberbare suturer og huden med silke ikke-absorberbare suturer.
  12. Lad dæmningen komme sig helt i et opvarmet kammer i mindst 1 time. I de næste 48 timer skal du regelmæssigt kontrollere dæmningerne. Da dæmningen kommer sig efter anæstesi og genvinder bevidstheden, vil den begynde at bevæge sig og piske.
  13. Administrere postoperative smertestillende midler, hvis dæmninger viser tegn på smerte, såsom balling deres kroppe op og vejrtrækning hurtigt. Kun administrere, hvis der er tegn på smerte, da SC injektioner kunne stresse ud dæmninger, men hvis administreres til den eksperimentelle gruppe også administrere til kontrolgruppen, eller vice versa.

6. Analyse af tidlig social adfærd i en moderlig interaktionsopgave

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra tidligere publikationer5,25. Udfør denne opgave, efter at mus er født fra postnatal dag (P) 18-21.

  1. Moderens homing adfærd i moderens interaktion I (MI1) opgave.
    1. Sørg for, at burstrøelse ikke ændres i ugen før opgaven udføres.
    2. Anskaf eller byg en åben feltarena (OF), der let kan rengøres (akryl anbefales) med følgende dimensioner: 50 x 50 x 30 cm (længdebreddehøjde). Lysforhold under udførelsen af adfærd kan variere afhængigt af eksperimentelle spørgsmål og kan påvirke niveauet af ophidselse og angst-lignende adfærd. Optag adfærdseksperimenter under et svagt lys (ca. 20 lux) placeret over midten af arenaen.
    3. I to dage før adfærdstesten akklimatiserer dæmningen til arenaen ved at placere den under en nettrådskop (såsom en blyantkop) i et hjørne af arenaen i fem minutter om dagen.
    4. På testdagen, som kan være fra P18-21, før mus er blevet fravænnet, skal du rengøre arenaen grundigt med desinficeringsservietter og 70% ethanol.
    5. Opsæt arenaen med to modsatrettede hjørner, der begge indeholder rent sengetøj, og et hjørne, der indeholder snavset redestrøelse fra hvalpens hjemmebur.
    6. Lad hver hvalp udforske arenaen i 3 minutter og placere hver hvalp i det neutrale, tomme hjørne i starten.
      BEMÆRK: Optag funktionsmåden med et videokamera ved 30 fps. Rengør arenaen grundigt mellem hver hvalp og udskift det friske sengetøj. Suppleant hvilket hjørne er den friske versus reden strøelse som en kontrol for at undgå hjørne præference på grund af andre grunde (dvs. omgivende støj eller lys). Hvis du kører flere kuld på tværs af P18-21 udviklingsmæssige vindue, køre adfærdsmæssige eksperimenter på samme tid mellem dage. Sørg også for, at kontrol- og forsøgsgrupper køres parallelt i løbet af en given dag.
  2. Moderens sociale interaktion i moderens interaktion II (MI2) opgave
    1. Udfør denne opgave umiddelbart efter MI1-opgaven.
    2. Opsæt arenaen, så det ene hjørne indeholder en tom trådnetkop, og det modsatte hjørne indeholder dæmningen under en nettrådskop. Hvis mus er i stand til at flytte koppen, skal du veje koppen ned med en vægt, der kan tapes til toppen af koppen for at forhindre bevægelse. Sæt snavset redestrøelse fra hjemmeburet i et andet hjørne.
    3. Kør MI2-opgaven. Placer hvalpen i det tomme hjørne og optag adfærd i fem minutter ved 30 fps, så hvalpen kan udforske. Kør hver hvalp separat og grundigt rense hele arenaen og trådnet kopper mellem hver hvalp.

7. Assaying voksen social adfærd opgave

  1. Kør voksen social adfærd i de samme mus, der blev kørt i MI1- og MI2-opgaven, når de er voksne (P60-P70 eller ældre). Data indsamlet her blev udført i en separat kohorte.
  2. Håndter de voksne mus i 3 på hinanden følgende dage for at tillade tilvænning for eksperimentatoren. Sørg for, at kun eksperimenter, der er blevet gjort bekendt med musene, kører adfærdseksperimenter, ideelt set har den samme person til at køre alle opgaver.
  3. Habituate mus til OF arenaen i 3 dage i 5 minutter hver dag.
  4. Assay adfærd i en ny objekt anerkendelse opgave at måle generelle bevægelse og interesse i et nyt objekt. Dette vil give mulighed for mere meningsfuld fortolkning af social adfærd, hvis mus har et specifikt underskud i sociale interaktioner.
    1. Placer mus i arenaen i 5 minutter med et nyt objekt (lille plastlegetøj med glatte, rene overflader) i det ene hjørne af arenaen. Rengør arenaen grundigt mellem mus med 70% ethanol.
    2. Til anerkendelse af nye objekter skal du placere det tidligere eksponerede 'nye objekt', som nu er velkendt, i det ene hjørne og placere et nyt nyt objekt i det modsatte hjørne. For alle opgaver skal du skifte hjørner mellem forsøg som et kontrolelement.
    3. For nye sociale interaktion, sikre, at romanen mus er alder, stamme og sex-matchede og er akklimatisering til mesh wire kop i 2 på hinanden følgende dage i 5 min hver dag. For hvert forsøg skal du placere en ny mus under en nettrådskop og i det modsatte hjørne placere en tom nettrådskop. Lad musene udforske arenaen i 5 minutter, mens du optager adfærd. Rengør arenaen og mesh wire kopper grundigt mellem hver retssag.

8. Analyse af adfærdsmæssige data

  1. Brug DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) til at udføre grundlæggende sporing af karrosseridele). Detaljerede noter om, hvordan du installerer og bruger DeepLabCut, kan findes på sin GitHub-side. Også tilgængelig er en brugerdefineret python-baseret bibliotek 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) for yderligere analyse af data efter grundlæggende kropsdele sporing er afsluttet. Du kan finde flere oplysninger om, hvordan du bruger dette bibliotek, på GitHub-siden.
    1. Installer DeepLabCut ved hjælp af anaconda-installationsprocessen. Installer en CPU-kompatibel version af DeepLabCut samt den GPU-aktiverede version til træning af netværket.
    2. Følg vejledningen i hyperlinket nedenfor for at oprette et projekt til sporing af kropsdele. Breifly, skal du vælge en prøve af rammer fra dit datasæt og manuelt markere de relevante kropsdele i disse stikprøver rammer. Træn DeepLabCut-netværket for at forudsige kropsdelene og kontrollere, at det uddannede netværk fungerer korrekt.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Med henblik på sporing af kropsposition og identifikation af enkle interaktioner i et åbent felt skal du identificere dyrets centroid, hovedet (operationelt defineret som midtpunktet mellem ørerne), venstre og højre ører samt snuden og bunden af halen. Under flere kropsdele spores giver mulighed for passende udskiftning, når nogle kropsdele mangler i rammen på grund af okklusion.
    4. Bortset fra dyrekropsdele skal du spore en række punkter relateret til miljøet: såsom kanterne af adfærdsbokse. Disse giver mulighed for gentagelig estimering af sådanne punkter på tværs af flere sessioner - selvom placeringen af den adfærdsmæssige opsætning ændres lidt i forhold til kameraet mellem sessioner.
    5. Når du har sporet kropsdelene fra adfærdsdataene, skal du sørge for at filtrere de forudsagte kropsdelsplaceringer baseret på den tillid, der er forbundet med forudsigelsen på hvert billede af videoen. Lav tillid forudsigelser er normalt forbundet med okkluderede kropsdele. For sådanne forudsigelser skal du erstatte en given kropsdel med en anden (hvis en sådan substitution er hensigtsmæssig) eller bruge placeringen af andre kropsdele til at forudsige, hvor den relevante kropsdel sandsynligvis vil være. For de fleste åbne feltapplikationer er centroiden af gnaverkroppen sjældent okkluderet og kan forudsiges med høj nøjagtighed og præcision.
    6. Brug centroidens forventede placering samt placeringen af de sporede punkter i miljøet til at estimere en række funktioner i dyrets adfærd. I de åbne feltdata kan tidsderivaten for positionen f.eks. bruges til at beregne dyrets hastighed.
  2. For at undgå bias skal du udføre alle eksperimenter "blinde" med hensyn til forsøgsgruppen, når det er muligt, især når der er noget subjektivt element i vurderingen af resultaterne. Test for virkningen af kønsforskelle på de vigtigste eksperimentelle resultater ved at samle data i mandlige og kvindelige grupper. Alle statistiske undersøgelser er udformet med henblik på at teste et tilsvarende antal dyr mellem grupperne.

9. Post hoc celletælling til at karakterisere omfanget af celletransfekt

  1. Bestem antallet af celler transfected per mus, da ikke alle mus vil have en vellykket transfekt, og der vil være variation i antallet af transfected celler. En metode til at opnå dette indebærer at tælle antallet af transfected neuroner i vekslende koronar sektioner efterfulgt af en interpolation til at estimere det samlede antal transfected celler. Til dette, billede og tælle alle andre koronar sektion (50 μm).
    1. Brug transcardial perfusioner med 4% PFA til at fastsætte væv og derefter dissekere hjernen. Efter kryoprotektion sektion hjernen i koronar sektioner på 50 μm.
    2. For den frontale cortex tælles celler inden for +2,75 og + 1,35 mm fra Bregma. Disse koordinater indeholder frontale kortikale områder og omfatter en del af somatosensorisk cortex (S1).  Ved hjælp af denne metode var der ingen observerede transfected celler i mere kaudale kortikale regioner eller subkortikale områder.
    3. Sørg for at angive venstre fra højre halvkugle, såsom at markere en halvkugle med et nålehul under sektionering og tælle celler bilateralt. Brug en automatiseret celletællingssoftware eller tælleceller manuelt, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af en celletekst ved hjælp af DAPI.
  2. Når celletællingerne er opnået, skal du angive en tærskel for optagelse. For eksempel omfatter kun mus, der er bilateralt elektroporated i analysen. For yderligere analyse, korrelere antallet af celler transfected med adfærdsmæssige reaktioner for at se, om der er en sammenhæng. Denne teknik vil målrette flere hjerneområder, så det er nødvendigt at give oplysninger om, hvilke hjerneregioner der er blevet genetisk manipuleret.
    BEMÆRK: Det er muligt, at manipulering af visse gener kan ændre neuronal migration, specifikation og/eller død. Sørg for under celletælling, at hjernens anatomi undersøges, og at hver transfected neuron er inden for det lag, der angiveligt blev transfected (dvs. L2/3). Grove anatomiske målinger såsom kortikal tykkelse kan også kvantificeres ved at måle afstanden fra pia til kortikale L6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vellykket udvikling og implementering af en specialbygget elektroporator og tre benelektroder.
For IUEs blev der bygget en billig specialbygget elektroporator baseret på et tidligere beskrevet design27 (Figur 1A og Figur 2). En trebenet elektrode blev lavet23,24 ved hjælp af plast pincet med 2 negative elektroder fastgjort til spidsen af ben og den positive elektrode var fastgjort til slutningen af en tandbørste håndtag (Figur 1B). Elektroporatoren og tre benelektroden blev testet for at sikre korrekt funktion. IUE blev udført ved at udsætte livmoderhornene, injicere plasmid-DNA og elektroporating hvert foster (Figur 1C). De tre ben elektrode kan holdes forholdsvis let i to hænder som vist(Figur 1B, højre), ved hjælp af ben til at stabilisere embryoets hoved. L2/3 PFC pyramidal somas og deres processer blev mærket med GFP via IUE, hvilket bekræfter succesen af genoverførselseksperimentet.

Målretning af en stor population af neuroner bilateralt i musens frontale cortex.
Det samlede antal transfected celler og fordelingen af transfected neuroner kan kvantificeres for både unge og voksne mus5. Ved hjælp af denne bilaterale IUE-metode blev omkring 4000-6000 L2/3 pyramide neuroner transfected med pCAG-GFP plasmid (Figur 3A). Derudover var de fleste af disse celler lokaliseret til frontale kortikale regioner, herunder frontal association cortex, motoriske foreningsområder, prelimbic og infralimbic cortex og orbital og forreste cingulate cortex (Figur 3B). Et repræsentativt eksempel viser rostral-kaudale fordeling af transfected neuroner i en voksen kontrol mus (P60, Figur 3C) og fordelingen mellem halvkugler (Figur 3D). Dette bekræfter bilaterale IUE'ers evne til at målrette og genetisk mærke store populationer af L2/3 pyramide neuroner i den frontale cortex.

Social adfærd hos unge og voksne mus.
Den første del af moderens interaktionsopgave testede evnen til at kontrollere P18 transfected mus (IUE med pCAG-GFP plasmid) for at finde redestrøelse (moderlig interaktion 1 [MI1]). Dette tester de unge muss sensorimotoriske evner. Kontrolmus brugte mere tid på at udforske deres redestrøelse end at udforske frisk strøelse. Således tyder på, at som forventet, disse mus har intakt sensorimotoriske evner og sonderende adfærd (Figur 4A og Figur 3B). Den anden del af opgaven (MI2) drager fordel af musenes tendens til at være motiveret til at interagere med og være i nærheden af deres mor. I denne opgave tilbragte hvalpe det meste af deres tid i nærheden af deres mor, mens de brugte betydeligt mindre tid på at udforske den tomme kop eller redestrøelse(Figur 4C,D). Disse resultater tyder på, at IUE kontrol mus udviser normal homing adfærd.

Voksne kontrolmus (P60) brugte ca. 35% af tiden på at udforske et nyt objekt (samlet tid brugt i arenaen = 5 min. figur 5A,B). Når de blev præsenteret for et nyt og velkendt objekt, brugte voksne mus mere tid på at udforske det nye objekt, hvilket tyder på intakt interesse for nyhed (Figur 5C, D). I sociability-opgaven brugte kontrol voksne mus lignende mængder tid på at udforske en ny mus og tom kop (Figur 5E, F). Denne funktionsmåde blev automatisk sporet ved hjælp af den frit tilgængelige DeepLabCut-software26. Eksempelvideoer viser vellykket mærkning af forskellige punkter på en mus, herunder lemmer, centroid, hoved og ører (Video 1). DeepLabCut blev brugt til at bestemme, hvornår mus var opdræt ved at undersøge længden af musens krop, da denne afstand bliver kortere, når musen stikker (Video 2).

Figure 1
Figur 1: I livmoderelektroporation ved hjælp af en specialbygget elektroporator og en trestrenget elektrode. (A) Billede af den specialbyggede elektroporator (venstre) og dens frontpanel (højre). 1: Effektindikator. 2: Tænd/sluk-knap. 3: Pulsindikator. 4: Testtilstandskontakt.  5: Spændingsvælger. 6: Puls bredde kontrol. 7: Elektrode (+). 8: Ekstern udløser (TTL).  9: Elektrode (-). (B) Billede af den specialbyggede trestrengede elektrode (venstre) og den anbefalede metode til at holde de tre ben elektrode under IUE (højre). (C) Venstre: Diagram, der viser IUE-kirurgi udført i E16-dæmninger. Til højre: repræsentativt 20X konfokalt billede af IUE med GFP målrettet L2/3 mPFC. Gul stjerne: L2/3 GFP+ neuroner. Venstre panelskalalinje = 250 μm. Højre panelskalalinje = 75 μm. Tal og data tilpasset fra Comer et al., 20205. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kredsløbsdiagram over den specialfremstillede elektroporator. Et diagram, der viser det specialfremstillede elektroporatorkredsløb baseret på tidligere beskrevne eksempler27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Målretning af store populationer af L2/3 frontal cortex neuroner ved hjælp af IUE. (A) Samlet antal GFP+-celler i unge kontrolmus. N = 15 mus. (B) Procentdel af GFP+-celler pr. område hos voksne kontrolmus. N = 22 kontrolmus. (C) Repræsentative afsnit, der viser korrostro-kaudale udsnit af transfected celler i den frontale cortex. Billeder i venstre paneler er zoomet områder fra højre paneler (rød firkant). Frontal forening cortex: FrA. Supplerende motorisk cortex: M2. Prelimbic cortex: PL. Infralimbic cortex: IL. Anterior cingulate cortex: ACC. Mediale orbitofrontal cortex: MO. Ventral orbitofrontal cortex: VO. Lateral orbitofrontal cortex: LO. Forreste insulær cortex: AI. Frontal cortex område 3: Fr3.  Primær motorisk cortex: M1.  Primær somatosensorisk cortex: S1. Piriform cortex: Pir. Forreste olfaktoriske kerne: AO. Caudate-putamen: Cpu. Sorte tal: Bregma koordinater. Venstre panelskalalinje = 0,5 mm. Højre panelskalalinje = 1 mm. Middelværdi ± SEM. (D) Data, der viser antallet af celler, der er elektroporated på højre versus venstre halvkugle i hver mus. Viser uinterpolated celletal fra 14 voksne mus elektroporated med pCAG-GFP plasmid. Parret t-test. p = 0,4757.  Data tilpasset fra Comer et al., 20205. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vurdering af sensorimotoriske evner, sonderende adfærd og tidlige sociale interaktioner hos unge transfected mus. (A) Repræsentativt eksempel på sti, der er tilbagelagt (sort spor) af en P18-kontrolunge i MI1-opgave. Friske strøelse hjørner (frisk 1 og 2, pink) og reden strøelse hjørne (grøn). (B) Kontrol hvalpe brugt mere tid på at udforske reden strøelse end den friske strøelse i MI1 opgave. p < 0,001, ****p < 0,0001. Tovejs ANOVA og Sidaks posttest. (C) Repræsentativt eksempel på sti, der er tilbagelagt (sort spor) af en P18-kontrolunge i MI2-opgaven.  Dam's cup (dæmning: blå), Tom kop (tom kop: gul), Nest strøelse hjørne (reden: grøn). (D) Kontrol hvalpe brugt mere tid interagere med deres dæmning end med den tomme kop eller reden strøelse. Tovejs ANOVA og Sidaks posttest. p < 0,0001. N = 15 kontrolmus. Tal og data tilpasset fra Comer et al., 20205. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Vurdering af sociale interaktioner hos voksne transfected mus. (A) Repræsentativt eksempel på sti rejst (sort spor) af P60 kontrol voksen mus i nye objekt interaktion opgave. lyserødt hjørne = placering af nyt objekt. (B) Kontrolmus brugte ca. 35% af tiden på at udforske det nye objekt (5 min. samlet tid). Procent tid brugt i hjørnet med nyt objekt vist. (C) Repræsentative eksempler på sti tilbagelagt (sort spor) af en P60-kontrol voksen mus i nye objekt anerkendelse opgave. lyserødt hjørne: placering af nyt objekt. grønt hjørne: placering af velkendt objekt. (D) Kontrolmus brugte mere tid på at udforske det nye objekt end det velkendte objekt. Forskelsbehandlingsindeks (DI) vist; DI = ((tid med nyt objekt – tid med velkendt objekt) / (tid med nyt objekt + tid med velkendt objekt)). (E) Repræsentative eksempler på sti tilbagelagt (sort spor) af P60 kontrol voksen mus i omgængelse opgave. pink hjørne: placering af nye mus under mesh wire kop. grønt hjørne: placering af tom nettrådskop. (F) Kontrol mus brugt i gennemsnit lige tid på at udforske en tom kop og en kop, der indeholder en ny mus. Grafen viser DI ((tid med ny mus – tid med tom kop) / (tid med ny mus + tid med tom kop)). Da mus ikke var socialt isolerede forud for opgaven, kunne drevet til at interagere med en ny mus være blevet formindsket. Der var dog stadig udforskning af romanmusen. N = 22 kontrolmus. Tal og data tilpasset fra Comer et al., 20205. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Brug af DeepLabCut til automatisk at spore dyrs position i adfærdsopgaver. En repræsentativ video af en voksen mus i den sociale interaktionsopgave, der er mærket ved hjælp af DeepLabCut. Forskellige dele af musen kan mærkes som lemmer og hoved. Brug af centroid er hensigtsmæssigt at spore dyrets position, men andre punkter kan bruges til at identificere mere kompleks adfærd, såsom pleje eller opdræt. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).

Video 2: Brug af DeepLabCut til automatisk at spore opdræt i adfærdsopgaver. En repræsentativ video af en voksen mus i den sociale interaktionsopgave, der er mærket ved hjælp af DeepLabCut. Den røde pil viser musens længde med pilen, der peger mod musens hoved. Længden af pilen kan bruges til at bestemme med musen er opdræt, da længden af musen, og pilen, bliver mindre, når musen stikker. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heri beskrives en rørledning, der kombinerer manipulation af nye gener af interesse i store populationer af frontale kortikale neuroner med adfærdsmæssige assays hos mus. Desuden giver denne rørledning mulighed for den langsgående undersøgelse af adfærd hos de samme mus både i den tidlige postnatale udvikling og i voksenalderen. Denne teknik omgår behovet for at stole på genetiske dyremodeller, der kan være dyre med hensyn til tid og udgifter. Styrken af denne protokol er, at den kan bruges til at studere neuroudviklingsmæssige og neuropsykiatriske lidelser, for hvilke nylige GWAS har opdaget nye genetiskeforeninger 28,29. Selv om denne metode giver celle-type specifikke transfekt af excitatoriske neuroner, en begrænsning er, at det er mindre muligt at målrette andre hjerne celletyper såsom interneurons eller glia celler. Men, flere undersøgelser tyder på en modificeret tilgang til at målrette andre hjerne celle-type30,31. Derudover, ved at ændre placeringen af elektroderne i forhold til embryoets hoved og ændre timingen af IUE, kan andre hjerneregioner bilateralt transfected herunder hippocampus, amygdala, cerebellum, og den visuelle, somatosensory og motor cortices24,32. Derudover kan forskellige kortikale lag målrettes ved at udføre IUE på forskellige udviklingsstadier.

Selvom IUE kan have en høj succesrate, er der vigtige trin og fejlfinding af den metode, der til tider kræves. Det er nødvendigt, at plasmider er omhyggeligt designet og valideret i cellelinjer. Som med al kloning skal man sørge for, at der er et korrekt genekspression, f.eks. Desuden bør virkningen af genmanipulation (f.eks. overekspression eller lyddæmpning) bekræftes under hensyntagen til, at ekspressionsniveauerne kan variere på tværs af musens udviklingstidspunkt og IUE's udviklingsmæssige dato. Western blot og qPCR kan bruges til at bestemme omfanget af genetisk overekspression5. Det anbefales at co-elektroporate en reporter gen, såsom GFP, i en separat plasmid, da proteiner mærket med GFP kan mis-foldet eller miste deres funktion. Alternativt, hvis en reporter ikke bruges eksperimentatoren kan bruge in situ hybridisering, qPCR eller vestlige blot til at bestemme udtryksniveauer af genet af interesse5.

Hvis plasmider er blevet verificeret, men der ikke er nogen dyr, der synes at være positive for transfekt, skal du grundigt kontrollere alt udstyr, især elektroporatoren, for at sikre korrekt funktion. Ved levering af spændingsimpulser til embryoner skal livmoderhornene fugtes godt med opvarmet saltvand, og elektroderne skal producere bobler ved generering af spændingsimpulsen. Hvis der ikke er nogen bobler til stede, når spændingen leveres, er der sandsynligvis et problem med elektroporatoren.  Alternativt er cDNA muligvis ikke blevet injiceret korrekt i hjertekammeret. Når cDNA injiceres korrekt i lateral ventrikel, vil det hurtige grønne farvestof være synligt i form af en halvmåne. Endelig er elektrodernes position vigtig. Hvis elektroderne er placeret lidt forkert, kan cellerne ikke transfected i området af interesse. Derfor, når du kontrollerer for en vellykket transfekt, gemme nogle mere kaudale hjerne sektioner for at se, hvis måske den forkerte hjerne region blev transfected. Når denne metode er blevet praktiseret, en erfaren kirurg kan forvente at opnå en succesrate på næsten 90%. Denne protokol kan ændres til at målrette andre hjerne regioner af interesse. For eksempel er det muligt at målrette de fleste kortikale regioner bilateralt og endda visse subkortikale regioner, herunder hippocampus23 . Det er også muligt yderligere at reducere omkostningerne ved at bygge en brugerdefineret elektroporator, som blev brugt i de data, der præsenteres her5,27.

Fremtidige undersøgelser kunne gøre brug af denne metode til at forstå den rolle, nyopdagede genkandidater i forskellige neurologiske sygdomme. Den præsenterede rørledning tilbyder en relativt hurtig analyse for at teste virkningerne af specifikke genetiske manipulationer på tidlig postnatal udvikling og adfærd i voksenalderen. Fremtidige bestræbelser på at bruge denne metode har potentiale til at opdage, hvilke gener spiller en årsagssammenhæng rolle i visse hjernesygdomme, herunder SCZ og autisme spektrum lidelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Lisa Kretsge for kritisk feedback og redigering til manuskriptet. Vi takker alle forskningsassistenter i Cruz-Martín lab, der var uvurderlige i at hjælpe med perfusioner og celletælling af adfærd hjerner. Vi takker Andrzej Cwetsch for input til designet af tripolarelektroden og Todd Blute og Boston University Biology Imaging Core for brug af konfokalt mikroskop. Dette arbejde blev støttet af en NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), Brenton R. Lutz Award (ALC), I. Alden Macchi Award (ALC), NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) og Boston Undergraduate University Research Opportunities Program (WWY). Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberede manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8, (1), 144 (2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511, (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22, (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51, (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18, (1), 3000604 (2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105, (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9, (1), 74 (2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50, (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95, (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98, (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18, (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35, (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507, (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1, (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30, (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7, (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365, (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7, (2), 32446 (2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11, (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17, (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21, (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57, (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49, (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45, (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513, (1), 113-128 (2009).
En rørledning, der bruger bilateral in Utero Electroporation til at afhøre genetiske påvirkninger af gnaveradfærd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter