Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En pipeline som använder bilateral in utero-elektroporering för att förhöra genetisk påverkan på gnagares beteende

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

Rollen av nyligen upptäckta sjukdom-associerade gener i patogenesen vid neuropsykiatriska störningar förblir dunkel. En modifierad bilateral in utero elektroporation teknik möjliggör gen överföring i stora populationer av nervceller och undersökning av orsakande effekter av genuttryck förändringar på socialt beteende.

Abstract

Eftersom genomomfattande associationsstudier belyser de heterogena genetiska grunderna för många neurologiska sjukdomar ökar behovet av att studera specifika geners bidrag till hjärnans utveckling och funktion. Att förlita sig på musmodeller för att studera rollen av specifika genetiska manipuleringar är inte alltid genomförbart eftersom transgena muslinjer är ganska kostsamma och många nya sjukdomsrelaterade gener ännu inte har kommersiellt tillgängliga genetiska linjer. Dessutom kan det ta år av utveckling och validering att skapa en muslinje. In utero electroporation erbjuder en relativt snabb och enkel metod för att manipulera genuttryck på ett cellliknande specifikt sätt in vivo som bara kräver att utveckla en DNA-plasmid för att uppnå en viss genetisk manipulation. Bilaterala in utero elektroporation kan användas för att rikta in sig på stora populationer av frontal cortex pyramidala nervceller. Genom att kombinera denna genöverföringsmetod med beteendemässiga metoder kan man studera effekterna av genetiska manipuleringar på funktionen hos prefrontala cortexnätverk och det sociala beteendet hos unga och vuxna möss.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genomomfattande associationsstudier (GWAS) har drivit upptäckten av nya kandidatgener som är associerade med hjärnpatologier1,2,3,4. Dessa studier har varit särskilt fördelaktiga för att förstå förödande neuropsykiatriska störningar som schizofreni (SCZ), där undersökningen av nya gener har fungerat som en startpunkt för nya forskningslinjer och terapeutisk intervention5,6. Gener som hyser risk för SCZ visar partiska uttryck i prefrontal cortex (PFC) under prenatala och tidiga postnatala utveckling, en region som är inblandad i patologin hos flera neuropsykiatriska störningar7. Dessutom uppvisar musmodeller av psykiatriska störningar onormal aktivitet i PFC-nätverk6,8,9. Dessa resultat tyder på att SZC-associerade gener kan spela en roll i utvecklings ledningar i denna region. Ytterligare undersökning med hjälp av djurmodeller krävs för att förstå bidraget från dessa kandidatgener till upprättandet av anslutningar i PFC och för att avgöra om dessa gener har en orsakande roll i patogenesen vid neuropsykiatriska störningar. Genetiska manipulationstekniker hos möss som möjliggör studier av genuttrycksförändringar på specifika neuronala kretsar under prenatal och tidig postnatal utveckling är en lovande metod för att förstå de molekylära mekanismer som länkar genuttrycksförändringar till PFC-dysfunktion.

Genetiska muslinjer erbjuder en metod för att studera effekten av vissa gener på hjärnans utveckling och funktion. Att förlita sig på transgena möss kan dock vara begränsande eftersom det inte alltid finns kommersiellt tillgängliga linjer för att undersöka effekterna av specifika gener på utvecklingen av neurala kretsar. Dessutom kan det vara extremt kostsamt och tidskrävande att utveckla anpassade muslinjer. Användningen av intersektionella genetiska manipulationsstrategier som kombinerar transgena möss med virala metoder har revolutionerat förståelsen av hjärnan10,11,12. Trots stora framsteg kommer virala strategier med vissa begränsningar beroende på virusvektortyp, inklusive gränser i förpackningskapacitet som kan begränsavirusuttryck 13 och celltoxicitet i samband med virusuttryck14. Dessutom, under de flesta experimentella förhållanden, robusta genuttryck med hjälp av adeno-associerade virus (AAV) kräver cirka 2 till 4 veckor15, vilket gör rutinmässiga virala strategier omöjliga att manipulera gener under tidig postnatal utveckling.

In utero electroporation (IUE) är ett alternativt tillvägagångssätt som möjliggör en snabb och billig genöverföring16,17 som, när den är kopplad till fluorescerande märkning och farmakogenetiska eller optogenetiska metoder, ger en kraftfull plattform för att dissekera funktionen hos neuronala kretsar. Dessutom, med utvecklingen av CRISPR-Cas9 genomredigering gener kan överuttryckas eller exakt ändras genom cell-typ specifika knock-down eller knock-out av specifika gener eller genom modulering avpromotors 18,19. Genmanipulationsmetoder med IUE är särskilt fördelaktiga när effekten av gener på neuronala kretsar måste testas under smala utvecklingsfönster20. IUE är en mångsidig teknik och överuttryck kan enkelt åstadkommas genom att sätta in en gen i en uttrycksvektor under en specifik promotor. Ytterligare kontroll av genuttryck kan uppnås genom att driva uttryck med hjälp av promotors av olika styrkor eller använda inducerbara promotors som kan temporalt kontrollera genuttryck21,22. Dessutom möjliggör IUE inriktning av celler inom specifika närskikt, celltyper och hjärnregioner, vilket inte alltid är genomförbart med andrametoder 5,17. De senaste framstegen i IUE-konfigurationen baserat på användningen av tre elektroder, som genererar en effektivare elfältsfördelning, har utökat den funktionella repertoaren för denna metod och gjort det möjligt för forskare att rikta in sig på nya celltyper och öka effektiviteten, noggrannheten och antalet celler som kan riktas23,24. Denna teknik användes nyligen för att bestämma den orsakande rollen av komplementkomponent 4A (C4A), en gen kopplad till SCZ, i PFC-funktion och tidig kognition5.

Presenteras här är en experimentell pipeline som kombinerar genöverföringsmetoder för att rikta in sig på stora populationer av excitatoriska nervceller i den främre cortexen, inklusive PFC, med beteendeparadigmer som inte bara möjliggör studier av cell- och kretsnivåförändringar, men också tillåter beteende att övervakas under tidig postnatal utveckling och vuxen ålder. Först beskrivs är en metod för att bilateralt transfect stora populationer av lager (L) 2/3 pyramidala nervceller i frontal när regioner. Därefter beskrivs uppgifter för att analysera socialt beteende hos unga och vuxna möss. Cellantal kan erhållas när beteendeuppgifter har slutförts för att kvantifiera celltransfektions omfattning och plats. Dessutom kan antalet celler som transfecteras korreleras med beteendedata för att avgöra om ett större antal transfekterade celler leder till större problem i beteendet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla experimentella protokoll genomfördes enligt National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för djurforskning och godkändes av Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Beredning av DNA-lösningar

  1. Köp en kommersiell plasmid eller subclone en gen av intresse i plasmid med önskad promotor. Här användes en plasmid som innehåller EGFP under CAG-promotorn (pCAG-EGFP).
    OBS: Bestäm önskad promotor baserat på vilken uttrycksnivå som behövs. I allmänhet kan plasmider under CAG-promotorn användas för att uppnå höga nivåer av transgenen medan celltypspecifika promotors (t.ex. synapsin för nervceller) tenderar att vara mindre aktiva. Experimenteraren bör empiriskt bestämma lämpliga uttrycksnivåer för varje plasmid.
  2. Omvandla bakterier och odla lager i bakteriella medier med lämpligt antibiotikum.
    1. Avlägsna kompetenta celler (DH5α-celler) från -80 °C och tina på is i 20 minuter.
    2. Blanda 100 pg -100 ng av plasmid-DNA med 30 μL kompetenta celler. Inkubera blandningen på is i 20 minuter.
    3. Utför värmechock genom att inkubera i ett 42 °C vattenbad i 45 s och sedan återföra röret tillbaka till is i 2 minuter.
    4. Tillsätt 200 - 1 000 μL LB-media till de omvandlade kompetenta cellerna och växa i 45 minuter vid 37 °C på en skakande inkubator.
    5. Plåt 200 μL av de omvandlade cellerna till en LB-agarplatta som innehåller lämpligt antibiotikum och inkubera plattan över natten vid 37 °C.
    6. Nästa dag inkubera en bakteriekoloni i 200 ml LB-buljong med lämpligt antibiotikum vid 37 °C på en skakande inkubator över natten.
  3. Rena plasmid-DNA:t med hjälp av ett maxiprep-kit.
    1. Följ instruktionerna i det erhållna maxiprep-kitet. För elueringssteg, eluera inte DNA i elueringsbufferten. Istället eluerar DNA med antingen 200 μL sterilt 1x PBS eller molekylärt vatten.
    2. Se till att den slutliga koncentrationen av DNA:t är större än 1 μg/μL. Om plasmiden som innehåller genen av intresse inte innehåller en reportergen, förbered också en plasmid för att samtransfekteras med en reportermolekyl, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), för att möjliggöra visualisering av transfekterade celler.
  4. Förbered DNA-lösningen för operationen genom att späda ut plasmid-DNA:t till 1x PBS till 1 μg/μL slutlig koncentration av varje plasmid. Tillsätt snabbt grönt färgämne till DNA-lösningen till en slutlig koncentration på 0,1%. För bilaterala injektioner, förbered 60 μL lösning per damm (för cirka 10 valpar).
    OBS: Om plasmid inte innehåller en reportergen, samelektroporat med GFP. Co-electroporation hastigheter är vanligtvis 95% eller högre. I våra händer påverkades inte transfection effektivitet av co-transfection. Alla elektroporerade plasmider ska spädas ut till 1 μg/μL.

2. Beställning eller avel av tidsbespäckade dräktiga möss

  1. Om du beställer tidsbegränsade dräktiga möss, beordra möss att anlända på embryonal dag (E) 13 eller tidigare för att ge dammarna tillräckligt med tid att acklimatisera sig till djurhållning.  I det här protokollet används CD-1-outbred möss för alla experiment.
    OBS: Beställning några dagar i förväg kommer att minska djurstressen och leda till en högre överlevnadsgrad för valparna.
  2. Om avel tidsbesparande möss, para kvinnliga möss med en hane över natten, en gång i veckan. Kontrollera om det finns en vaginal plugg följande morgon (E0.5). Bestäm graviditeten genom att övervaka de kvinnliga mössens vikt.
    OBS: Olika musstammar har olika viktökningar under graviditeten, så bestäm typisk viktökning för musstammen som används.
  3. Oavsett om du beställer eller odlar mössen, för att minska dammens stress, placera en boplatta och mushus i buret. Att minska stress kan bidra till att öka valparnas överlevnad.

3. Konstruktion och montering av tre spetselektroder

  1. Använd titanplåt av grad 2 med en tjocklek av 0,063 i som lagermaterial för elektrodkontakter.
  2. Använd standardbearbetningstekniker eller precisionshandverktyg och gör elektroder med följande dimensioner: 20 mm x 5 mm med rundad spets och räfflade rygg. Ta bort eventuella grova kanter eller grader med fint sandpapper.
  3. För att koppla elektrodkontakterna, linda 22 G tvinnad koppartråd runt elektrodens spår och säkra genom lödning. Skydda leden med hjälp av värmekrymsrör.
  4. Fäst sedan den anslutna elektroden på autoklaverbara, icke-ledande tångar med hjälp av ytterligare en värmekrymparslang för att göra de två negativa elektroderna. Fäst den enda positiva elektroden på ett autoklaverbart, icke-ledande material (t.ex. ett tandborsthandtag med sågat avhuvud). Montera trådens öppna ände med en vanlig bananplugg.

4. Förberedelse för kirurgi

  1. Ta med gravida dammar till operationsområdet minst 30 minuter före operationen för att möjliggöra minskning av stressnivåerna efter transport från djuranläggningen.
  2. Sterilisera hela operationsstället med steriliserande germicidalservetter och sedan 70% etanol. Byt handskar innan du påbörjar operationen.
  3. Sterilisera autoklaverade verktyg i en glaspärlsteriliserare.
  4. Överför steril 1x PBS (ca 50 ml per damm) till 50 ml koniska rör och placera i ett rörställ i vattenbadet som värms upp till 38-40 °C. Kontrollera den sterila saltlösningstemperaturen med en termometer.
  5. Slå på vattenuppvärmningspumpen så att den värms upp till 37 °C innan operationen påbörjas. Detta kommer att upprätthålla musens kroppstemperatur under operationen.
  6. Slå på tryckinjektorn och elektroporatorn och se till att den fungerar korrekt före operationen.
  7. Snurra kort plasmid-DNA-lösningen (erhålls i steg 1.4) på en bordscentrifug och placera den på is.
  8. Dra glaspipetter på en pipettdragare så att spetsen på den dragna glaspipetten är ca 50 μm i diameter.
  9. Fyll pipetten med 20-40 μL DNA-lösning (erhålls i steg 1.4).
  10. Ställ in alla nödvändiga föremål för kirurgi inklusive hårborttagning av lotion, jod, 70% etanol, bomullsbyten, ögonsalva, suturer, gasväv etc.
  11. Förbered ett operationsblad och fyll i nödvändig information, till exempel mus-ID och vikt, datum för kirurgi, kirurgnamn etc.

5. In utero elektroporationskirurgi

  1. Väg musen före operationen och notera detta på operationsbladet.
  2. Söv en gravid mus (E16) genom inandning i en induktionskammare med 4% (v/v) syre-isofluranblandning. När musen har inducerats, flytta till en maskinandning och behåll isofluran vid 1-1,5% (v/v) och övervaka andningen under hela operationen. Kontrollera att musen är helt sövd, andningshastigheten ska vara ~ 55-65 andetag per minut.
  3. Administrera preoperativa smärtstillande medel: buprenorfin (3,25 mg/kg; SC) och meloxicam (1–5 mg/kg; SC) med en maxvolym på 10-30 ml/kg.
  4. Använd hårborttagningskräm eller använd försiktigt en rakhyvel för att ta bort pälsen från buken. Sterilisera buken genom att svabba med povidone-jod och 70% etanol och upprepa detta minst 3 gånger. Skapa ett sterilt fält runt buken med hjälp av en steril gasväv, steril drapering kan också användas.
  5. Gör ett mittlinjesnitt (3-4 cm) i bukhuden, var noga med att lyfta upp huden med tång för att undvika att skära genom muskeln. Skär sedan genom muskeln, återigen var noga med att lyfta upp muskeln för att undvika att skära vitala organ.
  6. Dra försiktigt ut livmoderhornen ur dammen med hjälp av ringtångar och placera dem försiktigt på det sterila fältet, se till att livmoderhornet stöds med stoppning och inte drar för långt bort från dammen. Från och med nu, håll livmoderhornet fuktat under resten av operationen med den förvärmda sterila 1x PBS.
  7. Placera ett embryo med antingen tång eller fingrar. Sätt försiktigt in den dragna glaspipetten i 45 graders vinkel med avseende på huvudets horisontella plan och sätts in i den laterala ventrikeln, som kan identifieras visuellt mellan hjärnans mittlinje och ögat. Injicera ca 2-3 μL i varje lateral ventrikel genom att antingen föra in pipetten i en och sedan den andra ventrikeln (rekommenderas) eller genom att injicera DNA-lösningen i en ventrikel tills den passerar in i båda laterala ventriklarna. Ventrikeln har framgångsrikt riktats om en halvmåne form är närvarande efter injektion.
    OBS: Glaspipettens spets kan gå sönder under operationen. Om detta händer, byt ut glaspipetten och se till att livmoderhornen hålls fuktade medan en ny pipett bereds och fylls med DNA-lösningen.
  8. För att transfektera celler bilateralt i den främre cortex, placera de två negativa elektroderna på sidorna av embryona huvudet bara lateralt och något caudal till laterala ventriklarna och placera den positiva elektroden mellan ögonen, precis framför den utvecklande nosen.
  9. Se till att embryot är generöst fuktat. Applicera fyra kvadratiska pulser (pulsvaraktighet = 50 ms varaktighet, pulsamlitud = 36 V, interpulse intervall = 500 ms).
  10. Injicera och elektroporera alla embryon och gå en efter en så att varje embryo elektroporeras omedelbart efter DNA-lösningsinjektionen. När alla embryon har elektroporerats, sätt försiktigt in livmoderhornen tillbaka i bukhålan. Under detta steg, täck bukhålan i steril PBS (1x) för att underlätta placeringen av livmoderhorn.
  11. Fyll bukhålan med steril 1x PBS så att inga luftfickor finns kvar efter att suturing är klar. Suturera muskeln med absorberbara suturer och huden med silke icke-absorberbara suturer.
  12. Låt dammen återhämta sig helt i en uppvärmd kammare i minst 1 timme. Under de kommande 48 h, kontrollera dammarna regelbundet. När dammen återhämtar sig från anestesin och återfår medvetandet, kommer den att börja röra sig och vispa.
  13. Administrera postoperativa smärtstillande medel om dammar visar tecken på smärta, såsom att bolla upp sina kroppar och andas snabbt. Administrera endast om det finns tecken på smärta eftersom SC injektioner kan stressa ut dammarna, men om de administreras till den experimentella gruppen administreras också till kontrollgruppen, eller vice versa.

6. Analysera tidigt socialt beteende i en moderns interaktionsuppgift

OBS: Detta protokoll är anpassat från tidigare publikationer5,25. Utför denna uppgift efter att möss har fötts från postnatal dag (P) 18-21.

  1. Moderns homing beteende i moderns interaktion I (MI1) uppgift.
    1. Se till att bursängkläder inte ändras veckan innan uppgiften utförs.
    2. Skaffa eller bygg en öppen fältarena (OF) som enkelt kan rengöras (akryl rekommenderas) med följande dimensioner: 50 x 50 x 30 cm (längdbreddshöjd). Ljusförhållandena under beteendets prestanda kan variera beroende på experimentell fråga och kan påverka nivåerna av upphetsning och ångestliknande beteende. Spela in beteendeexperiment under ett svagt ljus (cirka 20 lux) placerat över mitten av arenan.
    3. Under två dagar före beteendetestningen acklimatiserar du dammen till arenan genom att placera den under en nättrådkopp (till exempel en pennkopp) i ett hörn av arenan i fem minuter per dag.
    4. På testdagen, som kan vara från P18-21, innan möss har avvänjats, rengör arenan noggrant med saneringsservetter och 70% etanol.
    5. Ställ upp arenan med två motsatta hörnor som båda innehåller rena sängkläder och ett hörn som innehåller smutsiga bosängkläder från valpens hemmabur.
    6. Låt varje valp utforska arenan i 3 minuter och placera varje valp i det neutrala, tomma hörnet i början.
      Notera: Spela in beteendet med en videokamera på 30 fps. Rengör arenan noggrant mellan varje valp och byt ut de färska sängkläderna. Alternera vilket hörn som är det färska kontra bosängkläderna som en kontroll för att undvika hörnpreferenser av andra skäl (dvs. omgivningsbuller eller ljus). Om du kör flera kullar i utvecklingsfönstret P18-21 kör du beteendeexperiment samtidigt mellan dagarna. Se också till att kontroll- och experimentgrupper löper parallellt under en viss dag.
  2. Moderns sociala interaktion i moderns interaktion II (MI2) uppgift
    1. Utför den här uppgiften direkt efter MI1-uppgiften.
    2. Ställ in arenan så att ett hörn innehåller en tom trådnätskopp och motståndarhörnan innehåller dammen under en nättrådskopp. Om möss kan flytta koppen, väg ner koppen med en vikt som kan tejpas fast på toppen av koppen för att förhindra rörelse. Lägg smutsiga bosängkläder från hemburen i ett annat hörn.
    3. Kör MI2-aktiviteten. Placera valpen i det tomma hörnet och spela in beteendet i fem minuter vid 30 fps, så att valpen kan utforska. Kör varje valp separat och rengör noggrant hela arenan och trådnätkopparna mellan varje valp.

7. Analysera uppgiften för vuxnas sociala beteende

  1. Kör vuxen socialt beteende hos samma möss som körts i MI1- och MI2-uppgiften när de är vuxna (P60-P70 eller äldre). Data som samlats in här gjordes i en separat kohort.
  2. Hantera de vuxna mössen i 3 dagar i följd för att tillåta tillvänjning till experimenteraren. Se till att endast experimenterare som har bekantats med mössen kör beteendeexperiment, helst har samma person kört alla uppgifter.
  3. Habituate möss till OF arena i 3 dagar i 5 min varje dag.
  4. Analysbeteende i en ny objektigenkänningsuppgift för att mäta allmän rörelse och intresse för ett nytt objekt. Detta kommer att möjliggöra mer meningsfull tolkning av socialt beteende om möss har ett specifikt underskott i sociala interaktioner.
    1. Placera möss i arenan i 5 minuter med ett nytt föremål (liten plastleksak med släta, rengöringsbara ytor) i ett hörn av arenan. Rengör arenan noggrant mellan möss med 70% etanol.
    2. För igenkänning av nya föremål, placera det tidigare exponerade "romanobjektet", som nu är bekant, i ett hörn och placera ett nytt nytt objekt i det motsatta hörnet. För alla uppgifter växlar du hörnen mellan försök som en kontroll.
    3. För ny social interaktion, se till att de nya mössen är ålders-, stam- och könsmatchade och acklimatiseras till nättrådskoppen i 2 på varandra följande dagar i 5 minuter varje dag. För varje försök, placera en ny mus under en nättrådkopp och i det motsatta hörnet placera en tom nättrådkopp. Låt mössen utforska arenan i 5 minuter medan de spelar in beteende. Rengör arenan och nättrådskopparna noggrant mellan varje försök.

8. Analysera beteendedata

  1. Använd DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) för att utföra grundläggande kroppsdelsspårning). Detaljerade anteckningar om hur du installerar och använder DeepLabCut finns på dess GitHub-sida. Det finns också ett anpassat pythonbaserat bibliotek "dlc_utils" (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) för vidare analys av data efter att grundläggande spårning av kroppsdelar har slutförts. Mer information om hur du använder det här biblioteket finns på GitHub-sidan.
    1. Installera DeepLabCut med anaconda-installationsprocessen. Installera en GUI-kompatibel CPU-version av DeepLabCut samt den GPU-aktiverade versionen för utbildning av nätverket.
    2. Följ instruktionerna i länken nedan för att skapa ett projekt för spårning av kroppsdelar. Breifly, välj ett urval av bildrutor från datauppsättningen och markera de relevanta kroppsdelarna manuellt i dessa provramar. Träna DeepLabCut-nätverket för att förutsäga kroppsdelarna och verifiera att det utbildade nätverket fungerar på ett adekvat sätt.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. För att spåra kroppsposition och identifiera enkla interaktioner i ett öppet fält, identifiera djurets centroid, huvudet (operativt definierat som mittpunkten mellan öronen), vänster och höger öron samt nosen och svansens botten. Att ha flera kroppsdelar spårade möjliggör lämplig ersättning när vissa kroppsdelar saknas i ramen på grund av ocklusion.
    4. Förutom djurkroppsdelar, spåra en mängd olika punkter relaterade till miljön: till exempel kanterna på beteendelådor. Dessa möjliggör repeterbar uppskattning av sådana punkter över flera sessioner - även om beteendeinställningarnas position ändras något i förhållande till kameran mellan sessionerna.
    5. När du har spårat kroppsdelarna från beteendedata, var noga med att filtrera de förväntade kroppsdelsplatserna baserat på det förtroende som är associerat med förutsägelsen för varje bildruta i videon. Förutsägelser med lågt förtroende är vanligtvis förknippade med ockluderade kroppsdelar. För sådana förutsägelser, ersätt en viss kroppsdel med en annan (om en sådan ersättning är lämplig) eller använd andra kroppsdelars platser för att förutsäga var den relevanta kroppsdelen sannolikt kommer att vara. För de flesta öppna fältapplikationer är centroiden i gnagarnas kropp sällan ockluderad och kan förutsägas med hög noggrannhet och precision.
    6. Använd den förväntade platsen för centroiden samt platsen för de spårade punkterna i miljön för att uppskatta ett antal egenskaper hos djurets beteende. Till exempel, i öppna fältdata, kan positionens tidsderivat användas för att beräkna djurets hastighet.
  2. För att undvika partiskhet, utför alla experiment "blinda" med avseende på den experimentella gruppen när det är möjligt, särskilt när det finns något subjektivt element i bedömningen av resultaten. Testa för effekten av könsskillnader på de viktigaste experimentella resultaten genom sammanslagning av data till manliga och kvinnliga grupper. Alla statistiska tester är utformade för att testa lika många djur mellan grupper.

9. Post hoc-cellräkning för att karakterisera celltransfektions omfattning

  1. Bestäm antalet celler som transfecteras per mus eftersom inte alla möss kommer att ha framgångsrik transfection och det kommer att finnas variation i antalet transfekterade celler. En metod för att uppnå detta innebär att räkna antalet transfekterade nervceller i alternerande koronarsektioner följt av en interpolation för att uppskatta det totala antalet transfekterade celler. För detta, avbilda och räkna alla andra koronarsektioner (50 μm).
    1. Använd transkardiella perfusioner med 4% PFA för att fixa vävnad och dissekera sedan hjärnan. Efter kryoprotection, dela upp hjärnan i koronar sektioner på 50 μm.
    2. För den främre cortex, räkna celler inom +2,75 och + 1,35 mm från Bregma. Dessa koordinater innehåller främre när områden och inkluderar en del av somatosensory cortex (S1).  Med denna metod fanns det inga observerade transfected celler i mer kaudal när regioner eller subkortikala områden.
    3. Var noga med att beteckna vänster från höger halvklot, till exempel markera en halvklot med ett nålhål under sektionering och räkna celler bilateralt. Använd ett automatiserat cellräkningsprogram eller räkna celler manuellt, vilket bekräftar närvaron av en cellkropp med DAPI.
  2. När cellantal har erhållits anger du ett tröskelvärde för inkludering. Till exempel inkluderar endast möss som är bilateralt elektroporerade i analys. För vidare analys korrelerar du antalet celler som transfecteras med beteendesvar för att se om det finns en association. Denna teknik kommer att rikta in sig på flera hjärnområden, så det är nödvändigt att ge information om vilka hjärnregioner som har manipulerats genetiskt.
    OBS: Det är möjligt att manipulera vissa gener kan förändra neuronal migration, specifikation och/eller död. Se till under cellräkning att hjärnans anatomi undersöks och varje transfekterad neuron ligger inom det lager som förmodligen transfekterades (dvs. L2/3). Brutto anatomiska mätningar såsom när tjocklek kan också kvantifieras genom att mäta avståndet från pia till när L6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Framgångsrik utveckling och implementering av en specialbyggd elektroporator och tre spetselektroder.
För IUEs byggdes en billig specialbyggd elektroporator baserad på en tidigare beskriven design27 (figur 1A och figur 2). En tre spetselektrod gjordes23,24 med hjälp av plasttångar med 2 negativa elektroder fästa vid spetsarna på spetsarna och den positiva elektroden var fäst vid änden av ett tandborsthandtag ( Figur1B). Elektroporatorn och tre prongelektrod testades för att säkerställa korrekt funktion. IUE utfördes genom att exponera livmoderhornen, injicera plasmid-DNA och elektroporera varje embryo (figur 1C). De tre spetselektroden kan hållas ganska lätt i två händer som visas (Figur 1B, höger), med hjälp av spetsarna för att stabilisera embryots huvud. L2/3 PFC pyramidal somas och deras processer var märkta med GFP via IUE, vilket bekräftar framgången för genöverföring experimentet.

Riktar in sig på en stor population av nervceller bilateralt i mössens främre cortex.
Det totala antalet transfekterade celler och fördelningen av transfekterade nervceller kan kvantifieras för både unga och vuxna möss5. Med hjälp av denna bilaterala IUE-metod transfekterades cirka 4000-6000 L2/3 pyramidala nervceller med pCAG-GFP-plasmid (figur 3A). Dessutom var de flesta av dessa celler lokaliserade till främre när regioner inklusive frontal association cortex, motor associering områden, prelimbic och infralimbic cortex och orbital och främre cingulate cortex (Figur 3B). Ett representativt exempel visar rostral-kaudal fördelning av transfected nervceller i en vuxen kontroll mus (P60, figur 3C) och fördelningen mellan halvklot (Figur 3D). Detta bekräftar förmågan hos bilaterala IEes att rikta och genetiskt märka stora populationer av L2/3 pyramidala nervceller i frontal cortex.

Socialt beteende hos unga och vuxna möss.
Den första delen av moderns interaktion uppgift testade förmågan att kontrollera P18 transfected möss (IUE med pCAG-GFP plasmid) att hitta bo sängkläder (moderns interaktion 1 [MI1]). Detta testar de sensorimotoriska förmågorna hos de unga mössen. Kontrollmöss tillbringade mer tid med att utforska sina bosängkläder än att utforska färska sängkläder. Således tyder på att dessa möss, som förväntat, har intakta sensorimotoriska förmågor och undersökande beteende (figur 4A och figur 3B). Den andra delen av uppgiften (MI2) drar nytta av tendensen hos möss att vara motiverade att interagera med och vara nära sin mamma. I denna uppgift tillbringade valparna större delen av sin tid nära sin mamma samtidigt som de tillbringade betydligt mindre tid med att utforska den tomma koppen eller bosängkläderna (Figur 4C,D). Dessa resultat tyder på att IUE kontroll möss uppvisar normala homing beteende.

Vuxna kontrollmöss (P60) tillbringade ungefär 35% av tiden med att utforska ett nytt objekt (total tid i arenan = 5 min, figur 5A,B). När de presenterades med ett nytt och välbekant objekt tillbringade vuxna möss mer tid på att utforska det nya objektet, vilket tyder på intakt intresse för nyhet (Figur 5C, D). I sällskaplighetsuppgiften tillbringade kontroll av vuxna möss liknande mycket tid på att utforska en ny mus och tom kopp (Figur 5E,F). Detta beteende spårades automatiskt med den fritt tillgängliga DeepLabCut-programvaran26. Exempelvideor visar framgångsrik märkning av olika punkter på en mus, inklusive lemmar, centroid, huvud och öron (Video 1). DeepLabCut användes för att bestämma när mössen uppfostrades genom att undersöka längden på musens kropp, eftersom detta avstånd blir kortare när musen bak (Video 2).

Figure 1
Figur 1: In utero-elektroporering med hjälp av en specialbyggd elektroporator och en tre spetselektrod. (A) Bild av den specialbyggda elektroporatorn (vänster) och dess frontpanel (höger). 1: Strömindikator. 2: Strömbrytare. 3: Pulsindikator. 4: Omkopplare för testläge.  5: Spänningsväljare. 6: Pulsbreddskontroll. 7: Elektrod (+). 8: Extern utlösare (TTL).  9: Elektrod (-). (B) Bild av den specialbyggda tre spetselektroden (vänster) och den rekommenderade metoden för att hålla de tre spetselektroden under IUE (höger). (C) Vänster: Diagram som visar IUE-kirurgi utförd i E16-dammar. Höger: representativ 20X confocal bild av IUE med GFP riktad mot L2/3 mPFC. Gul asterisk: L2/3 GFP+ nervceller. Vänster panel skala bar = 250 μm. Höger panel skala bar = 75 μm. Siffror och data anpassade från Comer et al., 20205. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Kretsdiagram över den specialtillverkade elektroporatorn. Ett diagram som visar den skräddarsydda elektroporatorkretsen baserad på tidigare beskrivna exempel27. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Rikta in sig på stora populationer av L2/3 frontal cortex nervceller med hjälp av IUE. A)Totalt antal GFP+-celler hos möss med ungkontroll. N = 15 möss. B)Procentandel GFP+-celler per område hos vuxna kontrollmöss. N = 22 kontrollmöss. C)Representativa avsnitt som visar rostro-caudal omfattning av transfected celler i frontal cortex. Bilder i vänster paneler är zoomade områden från höger paneler (röd fyrkant). Frontal association cortex: FrA. Kompletterande motorisk cortex: M2. Prelimbic cortex: PL. Infralimbic cortex: IL. Främre cingulate cortex: ACC. Medial orbitofrontal cortex: MO. Ventral orbitofrontal cortex: VO. Laterala orbitofrontal cortex: LO. Främre insular cortex: AI. Främre cortex område 3: Fr3.  Primär motorisk cortex: M1.  Primär somatosensorisk cortex: S1. Piriform cortex: Pir. Främre luktkärna: AO. Caudate-putamen: Cpu. Svarta nummer: Bregma koordinater. Vänster panel skala bar = 0,5 mm. Höger panelskalastång = 1 mm. Medelvärde ± SEM. (D) Data som visar antalet celler som elektroporerats på höger kontra vänster halvklot inom varje mus. Visar ointerpolerade cellantal från 14 vuxna möss som elektroporerats med pCAG-GFP-plasmid. Parat t-test. p = 0,4757.  Data anpassade från Comer et al., 20205. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Bedömning av sensorimotoriska förmågor, undersökande beteende och tidiga sociala interaktioner hos unga transfekterade möss. (A) Representativt exempel på färdväg (svart spårning) med en P18-kontrollpupp i MI1-uppgift. Fräscha sängkläder hörn (färska 1 och 2, rosa) och bo sängkläder hörn (grön). B)Kontrollvalpar ägnade mer tid åt att utforska bosängkläderna än de färska sängkläderna i MI1-uppgiften. p < 0.001, ****p < 0.0001. Tvåvägs ANOVA och Sidaks eftertest. (C) Representativt exempel på färdväg (svart spårning) med en P18-kontrollpupp i MI2-uppgift.  Damkopp (dam: blå), Tom kopp (tom kopp: gul), Nest sängkläder hörn (bo: grön). D)Kontrollvalpar tillbringade mer tid med att interagera med sin damm än med den tomma koppen eller bosängkläderna. Tvåvägs ANOVA och Sidaks eftertest. p < 0.0001. N = 15 kontrollmöss. Siffror och data anpassade från Comer et al., 20205. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Bedömning av sociala interaktioner hos vuxna transfekterade möss. (A) Representativt exempel på sökvägsfärd (svart spårning) av P60 styr vuxenmus i ny objektinteraktionsuppgift. rosa hörn = placering av nytt objekt. (B) Kontrollmöss tillbringade ungefär 35% av tiden med att utforska det nya objektet (5 min total tid). Procenttid i hörnet med nytt objekt visas. (C) Representativa exempel på sökvägsfärd (svart spårning) av en P60-kontroll vuxenmus i ny objektigenkänningsuppgift. rosa hörn: placering av nytt objekt. grönt hörn: placering av välbekant objekt. (D) Kontrollmössen ägnade mer tid åt att utforska det nya objektet än det välbekanta objektet. Diskrimineringsindex (DI) visas. DI = ((tid med nytt objekt – tid med välbekant objekt) / (tid med nytt objekt + tid med välbekant objekt)). (E) Representativa exempel på färdväg (svart spårning) av P60 styr vuxenmus i sällskaplighetsuppgift. rosa hörn: placering av ny mus under mesh tråd kopp. grönt hörn: placering av tom nättrådskopp. (F) Kontrollera möss som tillbringade i genomsnitt lika lång tid med att utforska en tom kopp och en kopp som innehåller en ny mus. Grafen visar DI ((tid med ny mus – tid med tom kopp) / (tid med ny mus + tid med tom kopp)). Eftersom möss inte var socialt isolerade före uppgiften kan drivkraften att interagera med en ny mus ha minskat. Det fanns dock fortfarande utforskning av den nya musen. N = 22 kontrollmöss. Siffror och data anpassade från Comer et al., 20205. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Video 1: Använda DeepLabCut för att automatiskt spåra djurs position i beteendeuppgifter. En representativ video av en vuxen mus i den sociala interaktionsuppgiften som har märkts med DeepLabCut. Olika delar av musen kan märkas som lemmar och huvud. Att använda centroiden är lämpligt för att spåra djurets position, men andra punkter kan användas för att identifiera mer komplexa beteenden, såsom grooming eller uppfödning. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)

Video 2: Använda DeepLabCut för att automatiskt spåra uppfödning i beteendeuppgifter. En representativ video av en vuxen mus i den sociala interaktionsuppgiften som har märkts med DeepLabCut. Den röda pilen visar musens längd med pilen riktad mot musens huvud. Pilens längd kan användas för att bestämma med musen uppfödning, eftersom musens längd och pilen blir mindre när musen bakåt. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Häri beskrivs en pipeline som kombinerar manipulering av nya gener av intresse i stora populationer av främre när nervceller med beteendemässiga analyser hos möss. Dessutom möjliggör denna pipeline den longitudinella studien av beteende hos samma möss både under tidig postnatal utveckling och i vuxen ålder. Denna teknik kringgår behovet av att förlita sig på genetiska djurmodeller som kan vara kostsamma när det gäller tid och utgifter. Styrkan i detta protokoll är att det kan användas för att studera neurodevelopmental och neuropsykiatriska störningar för vilka nyligen GWAS har upptäckt nya genetiskaassociationer 28,29. Även om denna metod ger cell-typ specifika transfection av excitatoriska nervceller, är en begränsning att det är mindre möjligt att rikta in sig på andra hjärncellstyper som interneuroner eller gliaceller. Flera studier tyder dock på ett modifierat tillvägagångssätt för att rikta in sig på andrahjärncellstyper 30,31. Dessutom, genom att ändra elektrodernas position i förhållande till embryots huvud och ändra tidpunkten för IUE, kan andra hjärnregioner bilateralt transfecteras inklusive hippocampus, amygdala, cerebellum och det visuella, somatosensoriska och motoriska cortices24,32. Dessutom kan olika närskikt riktas genom att utföra IUE i olika utvecklingsstadier.

Även om IUE kan ha en hög framgångsgrad finns det kritiska steg och felsökning av den metod som krävs ibland. Det är nödvändigt att plasmider är noggrant utformade och validerade i cellinjer. Som med all kloning måste man se till att korrekt genuttryck som att bekräfta sekvensen är inom ramen. Dessutom bör effekten av genmanipulation (t.ex. överuttryck eller ljuddämpande) bekräftas med hänsyn till att uttrycksnivåerna kan variera över musens utvecklingstid och utvecklingsdatum för IUE. Western blot och qPCR kan användas för att bestämma omfattningen av genetisk överuttryck5. Det rekommenderas att samelektroporera en reportergen, såsom GFP, i en separat plasmid eftersom proteiner märkta med GFP kan felviktas eller förlora sin funktion. Alternativt, om en reporter inte används kan experimenteraren använda in situ hybridisering, qPCR eller western blot för att bestämma uttrycksnivåer för genen av intresse5.

Om plasmider har verifierats men det inte finns några djur som verkar vara positiva för transfection, kontrollera noggrant all utrustning, särskilt elektroporatorn, för att säkerställa korrekt funktion. Vid leverans av spänningspulser till embryon bör livmoderhornen fuktas väl med uppvärmd saltlösning och elektroderna bör producera bubblor vid generering av spänningspulsen. Om det inte finns några bubblor när spänningen levereras är det sannolikt problem med elektroporatorn.  Alternativt kan cDNA inte ha injicerats ordentligt i ventrikeln. När cDNA injiceras ordentligt i den laterala ventrikeln kommer det snabba gröna färgämnet att vara synligt i form av en halvmåne. Slutligen är elektrodernas position viktig. Om elektroderna placeras något felaktigt kanske cellerna inte transfekteras i intresseområdet. Därför, när du letar efter en framgångsrik transfection, spara några mer kaudala hjärnsektioner för att se, om kanske, fel hjärnregion transfekterades. När denna metod har praktiserats kan en erfaren kirurg förvänta sig att uppnå en framgångsgrad på nästan 90%. Detta protokoll kan ändras för att rikta in sig på andra hjärnregioner av intresse. Det är till exempel möjligt att rikta in sig på de flesta när regioner bilateralt och till och med vissa subkortikala regioner, inklusive hippocampus23 . Det är också möjligt att ytterligare minska kostnaderna genom att bygga en anpassad elektroporator, som användes i de data som presenteras här5,27.

Framtida studier skulle kunna använda denna metod för att förstå den roll som nyupptäckta genkandidater spelar i olika neurologiska sjukdomar. Den presenterade pipelinen erbjuder en relativt snabb analys för att testa effekterna av specifika genetiska manipuleringar på tidig postnatal utveckling och beteende i vuxen ålder. Framtida insatser med denna metod har potential att upptäcka vilka gener som spelar en orsakande roll i vissa hjärnsjukdomar, inklusive SCZ och autismspektrumstörning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Lisa Kretsge för kritisk feedback och redigering till manuskriptet. Vi tackar alla forskningsassistenter i Cruz-Martín-labbet som var ovärderliga för att hjälpa till med perfusioner och cellräkning av beteendehjärnor. Vi tackar Andrzej Cwetsch för input på utformningen av tripolarelektroden, och Todd Blute och Boston University Biology Imaging Core för användning av det konfokala mikroskopet. Detta arbete stöddes av ett NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), Brenton R. Lutz Award (ALC), I. Alden Macchi Award (ALC), NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) och Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8, (1), 144 (2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511, (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22, (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51, (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18, (1), 3000604 (2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105, (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9, (1), 74 (2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50, (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95, (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98, (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18, (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35, (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507, (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1, (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30, (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7, (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365, (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7, (2), 32446 (2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11, (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17, (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21, (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57, (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49, (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45, (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513, (1), 113-128 (2009).
En pipeline som använder bilateral in utero-elektroporering för att förhöra genetisk påverkan på gnagares beteende
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter