Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61359
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.

Abstract

התרחבות תאי מערכת החיסון, הפעלתם וסחרם לריאות, הנשלטים על ידי ביטוי של ציטוקינים וכמוקינים מרובים, עשויים להשתנות על-ידי פגיעה מוחית חמורה. עדות לכך היא העובדה כי דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לתמותה בחולים שסבלו משבץ איסכמי. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש באנליזה ציטומטרית של זרימה צבעונית כדי לזהות 13 סוגים של תאי חיסון בריאות של עכברים, כולל מקרופאגים אלוואולריים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, תאים דנדריטיים CD103+ או CD11b+ (DCs), פלסמציטואיד DCs, אאוזינופילים, מונוציטים / תאים שמקורם במונוציטים, נויטרופילים, תאי T ו- B שמקורם בלימפואידים, תאי NK ותאי NKT, בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי על ידי חסימת עורק מוחי אמצעי חולף. יתר על כן, אנו מתארים את ההכנה של הומוגנטים ריאה באמצעות שיטת הומוגניזציה של חרוזים, כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים שונים או כימוקינים בו זמנית על ידי מערכי חרוזים מרובים יחד עם ניתוח ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את התגובה החיסונית הריאתית במסגרות מחלה אחרות, כגון מחלת ריאות זיהומית או מחלה אלרגית.

Introduction

הריאות הן איבר מחסום, חשוף לסביבה החיצונית, ולכן הם מקבלים כל הזמן אתגרים אימונולוגיים כגון פתוגנים ואלרגנים1. הפעלת תאי חיסון תושבי ריאה וחדירת תאי חיסון מהפריפריה נדרשים כדי לנקות פתוגנים מהסביבה הריאתית. בנוסף, תאי מערכת החיסון המתגוררים בריאות שומרים על סבילות לחיידקים קומנסליים, מה שמרמז על כך שתאים אלה ממלאים תפקיד בסילוק פתוגנים ובשמירה על הומאוסטזיס1. מקרופאגים אלוואולריים ואינטרסטיציאליים הם בין תאי מערכת החיסון הזקיף המתגוררים בריאה החשים פתוגנים באמצעות קולטני זיהוי תבניות ומנקים פתוגנים אלה על ידי פאגוציטוזה2. תאים דנדריטיים תושבי ריאות מגשרים על התגובה החיסונית המולדת והנרכשת באמצעות הצגת אנטיגן3. בנוסף, תאי מערכת החיסון המולדת המקומית המופעלים מייצרים ציטוקינים וכימוקינים המגבירים את התגובה הדלקתית ומעוררים את חדירתם של תאי מערכת החיסון כגון מונוציטים, נויטרופילים ולימפוציטים לריאות1. שבץ איסכמי הוכח כמשנה חסינות מערכתית ומוביל לרגישות מוגברת לזיהום ריאתי; עם זאת, מחקרים מעטים העריכו את התא הריאתי לאחר שבץ איסכמי, אם כי כמה מחקרים בחנו אותו במהלך מצבים דלקתיים 4,5,6,7,8,9. מטרת השיטות המתוארות כאן היא לקבוע בו זמנית את הפתולוגיה של הריאות, את הרכב תאי החיסון ואת רמות הביטוי של ציטוקינים וכימוקינים בריאות כדי להעריך שינויים בתא הריאתי ולהעריך שינויים פוטנציאליים בתגובה החיסונית הריאתית בעקבות התקף איסכמי.

המתואר כאן הוא פרוטוקול לקבלת תרחיפים של תאים בודדים מהריאות של העכברים כדי לזהות 13 סוגים של תאים חיסוניים. פרוטוקול זה מבוסס על עיכול רקמות עם קולגן D ללא צורך בדיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול להכנת הומוגנטים של רקמות שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים או כימוקינים שונים באמצעות מערכי חרוזי מולטיפלקס מבוססי ציטומטריה זורמת. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות של שבץ איסכמי על חסינות ריאתית וניתן להשתמש בו גם במודלים אחרים של מחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים והנהלים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מערב וירג'יניה. העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים ספציפיים בוויבריום באוניברסיטת מערב וירג'יניה.

1. הכנת פתרונות

  1. הכינו חיץ פרפוזיה (מלח חצוב פוספט, PBS). יש להשתמש בכ-10 מ"ל של PBS קר כקרח לכל עכבר.
  2. הכן מדיום תאי ריאה/חיץ FACS. מאגר FACS מכיל PBS בתוספת 1% סרום בקר עוברי (FBS). שמור על הקור הבינוני במשך כל התהליך של כריתה והעברה של הריאות. יש להכין כ-8 מ"ל לכל דגימת ריאות. הכינו חיץ בינוני/FACS טרי לפני הניסויים.
  3. הכן מאגר דיסוציאציה לבידוד של תא בודד. Buffer מכיל 1 מ"ג/מ"ל קולגןאז D ו-200 מיקרוגרם/מ"ל DNase I בתמיסת המלח המבוצרת (HBSS) של האנק. יש להכין טרי מתמיסת הציר (100 מ"ג/מ"ל קולגן D ו-10 מ"ג/מ"ל DNase I) לפני הניסויים. יש צורך בכ-6 מ"ל לכל דגימת ריאות. יש לוודא שהמאגר מגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  4. הכן חיץ הומוגניזציה להומוגניזציה של רקמת הריאה. Buffer מכיל PBS וקוקטייל מעכב חלבון ופוספטאז 1x (מלאי = 100x). יש להכין טרי לפני הניסויים. שמור על החיץ קר במהלך כל תהליך ההומוגניזציה. כ-200 μL של החיץ מספיקים להומוגניזציה של אונה ימנית אחת של הריאות.

2. חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (tMCAO)

הערה: הליכים עבור tMCAO באמצעות החדרת monofilament לעורק המוח האמצעי תועדו בפירוט בעבר10. בניסויים אלה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 8 עד 12 שבועות, במשקל 25-30 גרם.

  1. בקצרה, יש לתת 2 מ"ג/ק"ג מלוקסיקום לעכברים לפני הניתוח. הרדימו עמוק את העכברים בתא אינדוקציה באמצעות 5% איזופלורן. אשר הרדמה עמוקה בשיטת צביטה בבוהן. לשמור על הרדמה עם 1-2% isoflurane במהלך הניתוח באמצעות חרוט האף. שמור על טמפרטורת הגוף ב 36.5 - 38 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך על ידי הנחת שמיכה חמה מתחת לעכברים. כל כלי הניתוח צריכים להיות מעוקרים אוטומטית יום לפני הניתוח.
  2. לגלח ולהכין את העור על הצוואר הגחוני באמצעות 70% אתנול ואחריו פילינג כלורהקסידין. יש לתת באופן תת עורי 2 מ"ג/ק"ג בופיוואקאין מעל אזור החתך לפני ביצוע החתך הראשון. השתמשו במשחת עיניים כדי לכסות את העיניים כדי למנוע יובש. בצע חתך בצוואר בקו האמצע. משכו בעדינות הצידה רקמות רכות סביב קנה הנשימה.
  3. זהה את עורק הצוואר המשותף השמאלי ואת עורק הצוואר החיצוני.
  4. יש למרוח תפר זמני (גודל 6/0) על עורק הצוואר המשותף כדי לבלום את זרימת הדם. בצע חתך בעורק הצוואר החיצוני.
  5. הכנס מונופילמנט מצופה גומי סיליקון (גודל 6-0) לעורק הצוואר החיצוני, ולאחר מכן קדם את המונופילמנט לעורק המוח האמצעי. השאירו את המונופילמנט בעורק המוח האמצעי למשך 60 דקות (חסימה).
  6. עקוב אחר קצב זרימת הדם באמצעות זרימת דופלר לייזר. ירידה בקצב הזרימה לעורק המוח האמצעי שהוא > 80% מצביעה על חסימה מוצלחת.
  7. לאחר 60 דקות של חסימה, הסר את monofilament כדי לאפשר את reperfusion להתרחש. סגרו את החתך.
  8. בעכברים המופעלים על ידי בושה, בצע שלבים 2.1-2.6 ללא החדרת המונופילמנט. בעכברים אלה, קצב זרימת הדם צריך להישאר יציב במהלך ההליך כולו.
  9. עקוב אחר העכברים מדי יום ומדוד את הליקויים הנוירולוגיים באמצעות קריטריונים סטנדרטיים לציון11. 0 – ללא גירעון נוירולוגי; 1 – נסוג forepaw contralateral כאשר מורם על ידי הזנב; 2- עיגולים אל contralateral כאשר מורם על ידי הזנב; 3- נפילה לקונטרלטרל תוך כדי הליכה; 4 – לא הולך באופן ספונטני או הוא בתרדמת; 5 – מת.
  10. לספק זריקות תת עוריות של מלח רגיל משכך כאבים (meloxicam, 2 מ"ג / ק"ג) כל 24 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח.
  11. יש לבודד את הריאות 24 ו-72 שעות לאחר tMCAO לצורך ניתוח במורד הזרם.

3. קצירת רקמות הריאה

  1. הרדמה עמוקה של העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין. אשר הרדמה עמוקה בשיטת צביטה בבוהן.
  2. כדי לבצע את כל הגוף זלוף שריר הלב12, להצמיד את העכבר לפלטפורמה כירורגית פרווה רטובה עם 70% אתנול כדי להפחית את הפצת הפרווה לתוך חלל הגוף. השתמש מספריים דיסקציה עדינים כדי לבצע חתך רוחבי בבטן caudal ולאחר מכן חתך קו האמצע של הצפק, עצירה בחלל החזה לפני פירסינג הסרעפת.
    1. אין לחתוך דרך השריר/להסתתר לתוך חלל הצפק ואין להמשיך את החתך מעבר לבטן.
  3. יש להפסיק את החתך ברגע שמגיעים לחלל בית החזה לפני ניקוב הסרעפת. היזהרו שלא לפגוע בלב ובריאות שעלולים לפגוע באיכות הזליפה או בהתאוששות התאים
  4. באמצעות מספריים עדינים לבצע חתך בקו האמצע של הצפק לעצור בחלל החזה לפני פירסינג הסרעפת.
  5. תפסו את העכבר בקצה הדיסטלי של עצם החזה באמצעות מלקחיים והתרוממו כלפי מעלה תוך כדי חיתוך דרך הסרעפת תוך הקפדה שלא לפגוע בלב, בריאות או בכלי הדם. ברגע שהאיברים נראים לעין עושים חתך דרך כלוב הצלעות ומפרידים ומצמידים בחזרה את מארז הצלעות כך שהלב והריאות חשופים לחלוטין.
  6. בזהירות לעשות חתך קטן באטריום הימני ליד קשת אבי העורקים. זה ישמש כיציאה לזילוף.
  7. מיד לאחר מכן, הכנס בעדינות מחט של 25 גרם x 5/8 המחוברת למזרק מלא ב-10 מ"ל של PBS קר לתוך המשטח העליון הדיסטלי של החדר השמאלי. היזהר לא להחדיר דרך מחיצת החדר לתוך החדר הימני. מחט צריך להיות מוכנס בקושי לחדר השמאלי.
    הערה: אם מחיצת החדר מנוקבת, הנוזל ימהר החוצה מאפו של העכבר. פעולה זו תפחית את איכות הזליפה ותגרום לאובדן תאים.
  8. אם תרצה, ניתן להשתמש במהדק כדי להחזיק את המחט בבטחה במקומה בחדר השמאלי במהלך הזלוף.
  9. בהתמדה אך בעדינות לדחוף 10 מ"ל של PBS קר לתוך הלב. רקמת העכבר צריכה להתחיל לחלחל ולנקות את הדם כיציאת נוזלים מהאטריום הימני.
    1. לדחוף אליקוט שני של 10 מ"ל של PBS עד שיתרחש אישור דם מספיק. לכבד יהיה מראה חום בהיר והריאות יעברו מצבע ורוד אדמדם לצבע לבן ברובו.
  10. באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, הסר בזהירות את כל הרקמות שמסביב כולל הלב, קנה הנשימה, הוושט, התימוס, רקמת החיבור, בלוטות הלימפה והסימפונות הגדולים.
  11. הפרידו את אונות הריאה הבודדות והניחו את האונות בצלחת פטרי על קרח המכילה אליקוט של 1-2 מ"ל של מדיום תאי ריאה קרים.

4. הומוגניזציה של רקמת ריאה למערכי חרוזים מולטיפלקס באמצעות הומוגנייזר חרוזים

  1. יש לצנן מראש צינור מכסה בורג חרוטי 2 מ"ל המכיל 3 חרוזי זירקוניה/סיליקה סטריליים בקוטר 2.3 מ"מ. הוסף 200 μL של חיץ הומוגניזציה קר לצינור.
  2. שוקלים את האונה, מעבירים את האונה לצינור החרוטי המצונן מראש המכיל את החרוזים ואת מאגר ההומוגניזציה.
    הערה: כ-50-100 מ"ג של רקמה הומוגנית ב-200 μL של חיץ יספיקו לזיהוי ביטוי ציטוקינים וכימוקין בדגימה.
    1. הומוגניות האונה באמצעות הומוגנייזר מבוסס חרוזים (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך 2 דקות.
    2. ודא שהרקמה הומוגנית לחלוטין. הגדל את הזמן במידת הצורך.
  3. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה של הצינור במיקרו-צנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) ברזולוציה של 15,870 x גרם למשך 3 דקות.
  4. העבירו את הסופרנאטנטים למיקרו-צינורית מקוררת מראש של 1.5 מ"ל.
  5. יש להניח את הדגימה ישירות על קרח לשימוש מיידי או לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי. הימנעו ממחזורי הפשרה מרובים בהקפאה.

5. דיסוציאציה של רקמת הריאה ובידוד תאים בודדים

  1. שפכו את המדיום של תאי הריאה, של אונות הריאה הנותרות כדי למנוע דילול של מאגר הדיסוציאציה. לאחר מכן, הכנס בזהירות מזרק 1 מ"ל עם 25G ו 5/8 מחט המכילה 1 מ"ל של חיץ דיסוציאציה לתוך רקמת הריאה.
  2. מזריקים שברים קטנים (בערך 1/4עד 1/5ת') של מאגר הדיסוציאציה לכל אונת ריאה ומנפחים בעדינות.
    הערה: רוב החיץ ימהר לצאת זמן קצר לאחר ניפוח מכיוון שהאונה נכרתה.
  3. חזור על הזרקת מאגר דיסוציאציה 1-2x.
  4. לדגום את אונות הריאות עם חיץ דיסוציאציה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. טחנו דק את אונות הריאה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים עדינים.
  6. מעבירים את חתיכות הריאה הטחונות עם חיץ הדיסוציאציה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.  יש להוסיף עם מאגר דיסוציאציה נוסף לסך של 6 מ"ל. מערבולת במרץ במשך דקה אחת.
  7. לדגום את הדגימה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבולת במרץ כל 7-8 דקות.
  8. לאחר 45 דקות של דגירה, מערבלים את הדגימה במרץ למשך דקה אחת לקבלת תוצאות אופטימליות.
  9. יש לנתק עוד יותר את הדגימה על ידי מעבר דרך מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר כדי להסיר שאריות של רקמת חיבור ורקמת ביניים.
  10. צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 380 x גרם, להשליך את supernatant.
  11. הוסף 5 מ"ל של מדיום תאי ריאה קרים לדגימה. השהה את כדור התא על ידי מערבולת עדינה.
  12. צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 380 x גרם, להשליך את supernatant.
  13. הוסף 1 מ"ל של מדיום תאי ריאה קרים. השהה את כדור התא על ידי מערבולת עדינה.
  14. עוברים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, וסופרים תאים.

6. ניתוח ציטומטרי של זרימה עבור נישת תאי חיסון הריאה

  1. זרעים 1-2 x 106 תאים / נוגדנים מוגדרים לתוך צלחת תחתונה עגולה היטב 96 (3 סטים בסך הכל). צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  2. יש לתלות את כדור התא ב-50 μL של PBS קר המכיל כתם חי/מת הניתן לתיקון. הכינו את הכתם בהתאם להוראות היצרן.
  3. דגירה של התאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  4. החזירו את גלולת התא עם 25 μL של חיץ FACS קר המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן CD16/32 נגד עכבר. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  5. הוסף 25 μL של מאגר FACS קר המכיל שילובי נוגדנים המפורטים בטבלה 1 לתאים. מערבבים בפיפטציה עדינה.
    הערה: הנפח הכולל של מאגר FACS עבור צביעת הנוגדנים הוא 50 μL. לכן, בעת הכנת תערובת מאסטר של נוגדנים ב 25 μL, ריכוז הנוגדנים צריך להיות כפול הריכוז הסופי.
  6. דגירה של התאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  7. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  8. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. העבר לצינור FACS בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל פוליסטירן המכיל 150 μL של מאגר FACs נוסף. נתח את הדגימה באופן מיידי באמצעות ציטומטר זרימה.
    הערה: קיבוע תאים באמצעות השלבים הבאים מאפשר לנתח דגימות מאוחר יותר.
  9. לאחר שלב 6.7., השהה את הדגימה עם 100 μL של 1% paraformaldehyde ב- PBS.
  10. דגירה של הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  11. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  12. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. אחסן את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור. לנתח את המדגם בתוך 72 שעות.

7. מערכי חרוזים מולטיפלקס לזיהוי ציטוקינים וכימוקין

הערה: לוחות מולטיפלקס של כימוקין פרו-דלקתי ודלקת הזמינים באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) שימשו לקביעת הביטוי של כימוקינים וציטוקינים בריאות לאחר אינדוקציה של tMCAO בהתאם לפרוטוקול היצרן, שתואר בפירוט13.

  1. בקצרה, הפשירו את האנליטים על הקרח אם הם אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לאחר הומוגניזציה של רקמות. צנטריפוגה של הדגימה ב 590 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש כדי להסיר כל רקמה שיורית.
  2. צור עקומה סטנדרטית על ידי דילול סדרתי של הקוקטייל הסטנדרטי (C7) שנמצא בריכוז ידוע של 10 ננוגרם/מ"ל ל-7 תקנים (C1-6) כאשר התקן האחרון הוא חיץ בדיקה בלבד (C0).
  3. לאחר שכל הריאגנטים התחממו לטמפרטורת החדר, הוסיפו 25 μL מכל תקן ו-25 μL של חיץ בדיקה לצלחת V תחתית 96 באר.
  4. לכל דגימה היטב, הוסף 25 μL של הומוגנט ריאה (אנליט) ו 25 μL של חיץ בדיקה לצלחת V תחתית 96 באר
  5. מערבבים במרץ את החרוזים המצופים מראש, ואז מוסיפים 25 μL של חרוזים מצופים מראש לכל אחת מהבארות הסטנדרטיות והדוגמיות.
  6. אטמו את הצלחת והגנו מפני אור על ידי כיסוי בנייר כסף. נערו את הצלחת ב-110 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  7. צנטריפוגה ב 230 x גרם במשך 5 דקות. יש להוסיף 200 מיקרו-ליטר של מאגר כביסה ב-1x (תמיסת המלאי היא פי 20, יש לדלל עד פי 1 עם מים). לדגור במשך דקה אחת.
  8. צנטריפוגה ב 230 x גרם במשך 5 דקות. יש להשהות את התקן ולדגום עם נוגדנים לזיהוי 25 μL.
  9. אטמו וכיסו את הצלחת כדי להגן מפני אור. יש לנער את הצלחת ב-110 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  10. יש להוסיף 25 μL של סטרפטאבידין-פיקוריתרין (SA-PE) לכל תקן ולדגום היטב.
  11. אטמו וכיסו את הצלחת כדי להגן מפני אור. יש לנער ב-110 סל"ד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. סובבו את הצלחת ב 230 x גרם במשך 5 דקות. יש להשעות את התקן והדגימות במאגר כביסה אחד.
  13. העבר לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל FACS המסומן היטב המכיל 150 μL נוספים של מאגר שטיפה 1x.
  14. קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות של אות PE עבור התקנים והדגימות באמצעות ציטומטר זרימה.
  15. בנה עקומה סטנדרטית עבור כל כימוקין וציטוקין באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת (MFI) של PE כנגד הריכוזים שנקבעו מראש.
  16. קבע את הריכוז של כל כימוקין וציטוקין באמצעות העקומה הסטנדרטית וה- MFI מכל דגימה. לוח המולטיפלקס מספק תוכנת ניתוח נתונים שניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הריכוז של כל אנליט. משקל האונה האפית/עליונה משמש לקביעת ריכוז הציטוקינים או הכימוקין למיליגרם רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחרונה דיווחנו כי אינדוקציה של שבץ איסכמי בעכברים משנה את הרכב תאי החיסון של הריאות11. באופן ספציפי, איסכמיה מוחית חולפת הגדילה את האחוזים של מקרופאגים, נויטרופילים ו- CD11b+ DCs, תוך הפחתת אחוזים של תאי CD4+ T, תאי CD8+ T, תאי B, תאי NK ואאוזינופילים בתא הריאתי. יתר על כן, שינויים תאיים התאימו לרמות מופחתות באופן משמעותי של כימוקינים מרובים בריאות. מתוארת כאן שיטה לבידוד וזיהוי של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בתא הריאה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן היו מעכברים שעברו אינדוקציה של tMCAO וניתוח בושה.

זיהינו 13 אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בריאות (L1-L13) באמצעות 3 קבוצות של שילובי נוגדנים, כאשר כל קבוצה מכילה 5-7 נוגדנים (איור 1). תאים מתים לא נכללו באמצעות כתם LIVE/DEAD בכל קבוצה. נוגדנים וסמנים להבחנה בין סוגי תאי חיסון שונים מפורטים בטבלה 1. מקרופאגים אלוואולריים ואינטרסטיציאליים, CD103+ DCs, CD11b+ DCs ואאוזינופילים זוהו בקבוצה 1 (איור 1A,B). מונוציטים פרו-דלקתיים ונויטרופילים זוהו בקבוצה 2 (איור 1C). במהלך תגובות דלקתיות, מונוציטים נודדים לאתר של דלקת, שם תאים אלה מתמיינים לתאים המציגים אנטיגן שמקורו במונוציטים (mo-APCs)14. Downregulation של Ly6C ו- CCR2 אופייניים להבחנה מונוציטים, אשר ניתן להעריך באמצעות סט 215.  תאי CD4+ T, תאי T מסוג CD8+, תאי B, פלסמציטואידי DCs, תאי NK ותאי NKT זוהו באמצעות קבוצה 3 (איור 1D).

כדי לקבוע את האיכות של פרוטוקול הבידוד החד-תאי שלנו, השווינו את מספר התאים בני הקיימא ואת תאי החיסון CD45+ שבודדו בשיטה הידנית עם התאים שבודדו באמצעות דיסוציאציה מסחרית של רקמות (ראו טבלת חומרים), המשמשת לעתים קרובות לבידוד תאים מרקמות 16,17,18,19,20 . בפרוטוקול האחרון, אונות הריאה הועברו לתוך צינור ספציפי לדיסוציאציה (ראו טבלת חומרים) לאחר הזרקת מאגר הדיסוציאציה, והרקמה עוכבה באמצעות תוכנית 37C_m_LDK_1. המספר הכולל של תאים בני קיימא, אחוז תאי CD45+ והמספר הכולל של תאי CD45+ שהתקבלו היו דומים בין שתי השיטות (איור 2A-C). אחוז המוות התאי בקרב תאי CD45+ שהשתמשו בשני הפרוטוקולים היה ~ 10% (איור 2D). תוצאות אלה מצביעות על כך שהפרוטוקול המוצג כאן מאפשר התאוששות תאים עם תפוקה ואיכות גבוהות ללא סיוע של דיסוציאטור רקמות אוטומטי.

נעשה שימוש בבדיקת מולטיפלקס זמינה מסחרית בשילוב עם ניתוח ציטומטרי של זרימה כדי לקבוע את הריכוז של 13 כימוקינים באמצעות 25 μL של דגימה (איור 3). שני גדלים שונים של חרוזים זוהו לראשונה על-ידי FSC/SSC (איור 3A). כל חרוז מצופה ב-6-7 נוגדנים ראשוניים, שניתן להבחין ביניהם על ידי עוצמת פלואורסצנטיות בערוץ APC (איור 3B). רמת הכימוקינים בדגימה פרופורציונלית לעוצמת הפלואורסצנציה בערוץ PE, שיכולה להיקבע על-ידי MFI (איור 3C). על ידי השוואת ערך ה- MFI של כל כימוקין עם העקומה הסטנדרטית הבנויה עם ריכוזים ידועים של כימוקין, ניתן לקבוע את הריכוז בדגימה (לכל מ"ג רקמה).

Figure 1
איור 1: זיהוי של 13 סוגי תאי חיסון מהריאות לאחר עיכול רקמות עם קולגן D לאחר שבץ איסכמי. רקמות הריאה נכרתו 24 שעות לאחר ניתוח tMCAO או sham, תאי מערכת החיסון בריאות נותחו על ידי ציטומטריה של זרימה, שהוגדרה על ידי סמני פני השטח המפורטים בטבלה 1. (A) בקבוצת נוגדנים 1, CD45+ תאים בני קיימא (*) היו מגודרים לראשונה על Siglec F ו- CD11b כדי לזהות את המקרופאגים הנאדיים (L1), שביטאו CD11c ו- MHC II, ואאוזינופילים (L2), שלא ביטאו CD11c ו- MHC II. (B) תאים בתוך אוכלוסיית Siglec F (**) ב-A היו מגודרים כדי לקבוע את הביטוי של CD103 ו-CD11b. CD103+ CD11b- (***). התאים היו מגודרים עוד יותר כדי לקבוע את הביטוי של CD11c ו- MHC II. CD103+ DCs ביטאו הן את CD11c והן את MHC II (L3) אך לא ביטאו את CD64. אוכלוסיית ה-CD11b hi (****) הייתה מגודרת עוד יותר כדי לקבוע את הביטוי של CD64 ו-MHC II. CD11b+ DCs ביטאו MHC II אך לא CD64 (L4), ואילו מקרופאגים אינטרסטיציאליים (L5) ביטאו את שני הסמנים. (C) בקבוצת נוגדנים 2, CD45+ תאים בני קיימא ב-A היו מגודרים כדי לקבוע את הביטוי של CD11b ו-Ly6C. תאי Ly6C hi (*) ייצגו את המונוציטים הלא מובחנים ששמרו על רמה גבוהה של ביטוי CCR2 (L6, החלק האמצעי), ואילו תאים נמוכים Ly6C (**) הכילו אוכלוסייה מעורבת של מונוציטים מתמיינים שהיו Ly6G- (L6, חלקה ימנית) ונויטרופילים Ly6G+ (L7). (D) בקבוצת נוגדנים 3, CD45+ תאים בני קיימא ב-A היו מגודרים כדי לקבוע את הביטוי של CD11c ו-B220 כדי לזהות תאי B (L8) ופלסמציטואיד DCs (L9). אוכלוסיית CD11c ו-B220 (*) הייתה מגודרת כדי לקבוע את הביטוי של CD4 ו-CD8 כדי לזהות תאי CD4+ T (L10) ו-CD8+ T (L11). אוכלוסיית CD4- CD8 (**) הייתה מגודרת עוד יותר כדי לקבוע את הביטוי של NK1.1 ו- TCRb לזיהוי תאי NK (L12) ותאי NKT (L13). מוצגות חלקות מייצגות מ-12 עכברי C57BL/6J לאחר פעולת tMCAO ו-sham. חלקים מהאיור הודפסו מחדש מתוך ספרות11 שפורסמה בעבר באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: השוואה בין שיטת הדיסוציאציה הידנית לבין השימוש בדיסוציאציה של רקמות לבידוד תאים בודדים מהריאות. (א-ג) הושוו המספר הכולל של תאים, אחוז תאי CD45+ והמספר הכולל של תאי CD45+. מוצגות תוצאות משולבות מ-3 ניסויים בלתי תלויים. NS: לא מובהק סטטיסטית. (D) חלקות מייצגות לקביעת אחוז תאי CD45+ המתים לאחר הבידוד. מוצגות חלקות מייצגות משלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שבץ איסכמי מדכא ייצור של כימוקינים מרובים בריאות. (א-ג) עלילות מייצגות המציגות את קביעת רמת 13 הכימוקינים בריאות על ידי מערך חרוזים מולטיפלקס.  (A) שער FSC/SSC שימש לזיהוי חרוזים A ו-B בגדלים שונים. (B) ניתן להבחין בנוגדנים ראשוניים המצופים על החרוזים על ידי עוצמת פלואורסצנטיות בערוץ APC. (C) רמת הכימוקינים בדגימה הייתה פרופורציונלית לעוצמת הפלואורסצנטיות בערוץ PE. מוצגות חלקות מייצגות מ-12 עכברי C57BL/6J לאחר פעולת הבושה. (D) רקמות הריאה עברו הומוגניות 24 שעות לאחר tMCAO או sham operatio. הרמה של 13 כימוקינים בריאות של בעלי חיים בודדים נקבעה על ידי מערך חרוזים מולטיפלקס. הנתונים המוצגים הם תוצאות משולבות משלושה ניסויים בלתי תלויים עם n = 11-12 בעלי חיים לכל קבוצה. *, P < 0.05; **, P < 0.01; P < 0.001., NS, לא שונה סטטיסטית. חלקים מהאיור הודפסו מחדש מתוך ספרות11 שפורסמה בעבר באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

נוגדן שיבוט סוג תאי מערכת החיסון אוכלוסייה ביטוי סמן פני השטח
CD45-FITC 30-F11 מקרופאגים אלוולווארים L1 CD45+ סיגלק F+ CD11b-
סיגלק F-PE E50-2440 אאוזינופילים L2 CD45+ סיגלק F+ CD11b+
CD11c-Percp/Cy5.5 N418 CD103+ DCs L3 CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+
CD11b-PE/Cy7 מ"1/70 CD11b+ DCs L4 CD45+ סיגלק F- CD11b היי CD103- CD64- MHC II+
CD64-APC X54-5/7.1 מקרופאגים אינטרסטיציאליים L5 CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+
CD103-BV421 2E7
MHC II-BV510 M5/114.15.2
נגמ"ש חי/מת/Cy7
CD45-FITC 30-F11 מונוציטים/moDCs L8 CD45+ CD11b היי Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G-
Ly6C-PE HK1.4 נויטרופילים L9 CD45+ CD11b היי Ly6C int CCR2- Ly6G+
CD11b-PE/Cy7 מ"1/70
CCR2-BV421 SA203G11
Ly6G-BV510 1א8
נגמ"ש חי/מת/Cy7
CD45-FITC 30-F11 פלסמציטואיד DCs L6 CD45+ B220+ CD11c+
CD8-PE 53-6.7 תאי B L7 CD45+ B220+ CD11c-
NK1.1-Percp/Cy5.5 PK136 תאי T של CD4+ L10 CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8-
CD11c-PE/Cy7 N418 CD8+ תאי T L11 CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+
APC-B220 RA3-6B2 תאי NK L12 CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb-
CD4-BV421 GK1.5 תאי NKT L13 CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+
TCRb-BV510 H57-597
נגמ"ש חי/מת/Cy7

טבלה 1: סמני פני השטח ושילובי נוגדנים לקביעת תאי חיסון שבודדו מהריאות לאחר tMCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים זיהוי של סוגי תאי חיסון הריאה וביטוי של כימוקינים או ציטוקינים באותו עכבר. אם רוצים מחקר היסטופתולוגיה, ניתן להסיר אונה בודדת ולתקן אותה למטרה זו לפני שממשיכים לשלבי הבידוד של התא הבודד. מגבלה אחת של שיטה זו היא שגישה זו עשויה שלא להתאים במסגרות מחלה מסוימות אם השינוי בהרכב תאי החיסון והביטוי של כימוקינים ו/או ציטוקינים צפויים להתחלק באופן לא שווה בין אונות שונות של הריאות. לדוגמה, חיידקים מסוימים, כגון שחפת Mycobacterium, מראים נטייה להדבקת אונות מסוימות של הריאה21. במקרה זה, ייתכן שתידרש השוואה בין האונות.

הריכוז, זמן הדגירה והטמפרטורה של פרוטוקול הבידוד של התא הבודד מהריאות משפיעים באופן קריטי על התאוששות תאי החיסון מהריאות. האיכות של קולגןאז D חיונית להשגת תוצאות מיטביות ויש לבדוק אם נעשה שימוש במקור אחר של קולגןאז D. עיכול יתר של הרקמות גורם לעלייה במוות התאים; ואילו תת-עיכול של הרקמות גורם לתפוקה נמוכה של תאי מערכת החיסון, במיוחד מקרופאגים ו-DCs.

השתמשנו ב-3 שילובי נוגדנים כדי לקבוע 13 אוכלוסיות של תאי חיסון בריאות, כאשר כל קבוצה מכילה 5-7 נוגדנים וכתם LIVE/DEAD. ניתן לשלב נוגדנים בכל קבוצה אם מספר התאים המתקבלים מהדגימות מוגבל.  עם זאת, בעיה מרכזית אחת המתעוררת כאשר מספר הנוגדנים גדל היא שהפיצוי של אות הפלואורסצנציה על ציטומטר הזרימה יכול להיות מאתגר, במיוחד כאשר מבדילים בין תאים לרירית מיאלואידית בתנאים דלקתיים. ניתן להשתמש בקוקטיילים נוספים של נוגדנים כדי לזהות תאים מולדים אחרים בתוך התרחיף החד-תאי, כגון תאי לימפה מולדים ותאי γδ T, התורמים לתגובה החיסונית בריאות22,23. מכיוון שאונה אחת של הריאה נלקחת עבור מערך המולטיפלקס, לא ניתן לקבוע ולהשוות באופן סופי את המספר המדויק של כל סוג תא בריאות, וזה מהווה מגבלה של שיטה זו. כדי להתמודד עם זה, ניתן לבודד מספר מוגדר של תאים מהריאות של עכברים הנגרמים על-ידי sham ו-tMCAO. במקרה זה, ניתן להשוות במדויק את המספר המוחלט של כל סוג תא חיסוני בין שתי הקבוצות. בנוסף, שיטה זו אינה מאפשרת לקבוע את לוקליזציה של תאי החיסון בריאה. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה על מקטעי ריאות.

לסיכום, פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את ההשפעה של שבץ איסכמי בחסינות הריאתית, אבל זה יכול לשמש גם כדי ללמוד מודלים אחרים של המחלה, כגון זיהום ואלרגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH P20 GM109098 ותוכנית פרס החדשנות מפראספרו לאדווין וואן. ניסויי ציטומטריה של זרימה בוצעו במתקן ציטומטריה של זרימה WVU ומתקן ליבה של תא יחיד, הנתמך על ידי מענקי NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 ו- P20 GM103434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B220-APC, clone RA3-6B2 Biolegend 103212 1:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizer Benchmark Scientific D1030 Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11 Biolegend 150605 1:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7 Biolegend 121422 1:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 Biolegend 101216 1:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418 Biolegend 117318 1:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 Biolegend 117328 1:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5 Biolegend 100443 1:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11 Biolegend 103108 1:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1 Biolegend 139306 1:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7 Biolegend 100708 1:800 dilution
Collagenase D Sigma Aldrich 11088882001 Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tube ThermoFisher 02-681-344 Tube for tissue homogenization
DNase I Sigma Aldrich 10104159001 Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibody Biolegend 101320 1:100 dilution
genlteMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial ThermoFisher 78442 Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitor Moor MOORVMS-LDF Blood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel Biolegend 740451 Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stain ThermoFisher L34976 Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4 Biolegend 128008 1:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8 Biolegend 127633 1:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium Doccol 602356PK10Re tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 Biolegend 107636 1:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 Biolegend 108728 1:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440 BD Biosciences 552126 1:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0 Fine Science Tools 18020-60 tMCAO
SomnoSuite anesthesia system Kent Scientific SS-01 Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897 Biolegend 109234 1:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mm Biospec 11079125z Beads for tissue homogenization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 160 חסינות ריאתית פרופיל תאי מערכת החיסון ציטוקינים כימוקינים ציטומטריה של זרימה מערכי חרוזים מרובי-פלקס שבץ איסכמי
אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monaghan, K. L., Farris, B. Y.,… More

Monaghan, K. L., Farris, B. Y., Zheng, W., Wan, E. C. K. Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment. J. Vis. Exp. (160), e61359, doi:10.3791/61359 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter