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Immunology and Infection

फुफ्फुसीय वातावरण में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और प्रोइंफ्लेमेटरी मध्यस्थों की विशेषता

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61359
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा, इस्केमिक स्ट्रोक के एक म्यूरिन मॉडल के बाद फुफ्फुसीय वातावरण में प्रतिरक्षा कोशिका संरचना, साइटोकिन प्रोफाइल और केमोकाइन प्रोफाइल में परिवर्तन की पहचान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग का वर्णन करता है।

Abstract

प्रतिरक्षा कोशिका विस्तार, सक्रियण और फेफड़ों की तस्करी, जो कई साइटोकिन्स और केमोकिन्स की अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रित होते हैं, गंभीर मस्तिष्क की चोट से बदल सकते हैं। यह इस तथ्य से प्रमाणित होता है कि निमोनिया उन रोगियों में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है जो इस्केमिक स्ट्रोक से पीड़ित हैं। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वायुकोशीय मैक्रोफेज, अंतरालीय मैक्रोफेज, सीडी 103 + या सीडी 11 बी + डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी), प्लाज्मासाइटोइड डीसी, ईोसिनोफिल, मोनोसाइट्स / मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल सहित चूहों के फेफड़ों में 13 प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए बहुरंगी प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के उपयोग का वर्णन करना है। इसके अलावा, हम प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ मिलकर मल्टीप्लेक्स मनका सरणियों द्वारा एक साथ 13 अलग-अलग साइटोकिन्स या केमोकिन्स की अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए, एक मनका होमोजेनाइजेशन विधि का उपयोग करके फेफड़ों के होमोजेनेट्स की तैयारी का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य रोग सेटिंग्स में फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे संक्रामक फेफड़ों की बीमारी या एलर्जी रोग।

Introduction

फेफड़े एक बाधा अंग हैं, जो बाहरी वातावरण के संपर्क में हैं और इसलिए, लगातार रोगजनकों और एलर्जी जैसी प्रतिरक्षात्मक चुनौतियों को प्राप्त कर रहे हैं1. फुफ्फुसीय वातावरण से रोगजनकों को साफ करने के लिए फेफड़ों के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता और परिधि से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, फेफड़ों के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं कमेंसल बैक्टीरिया के प्रति सहिष्णुता बनाए रखती हैं, यह सुझाव देते हुए कि ये कोशिकाएं रोगज़नक़ निकासी और होमोस्टैसिस1 को बनाए रखने में भूमिका निभाती हैं। वायुकोशीय और अंतरालीय मैक्रोफेज फेफड़ों के निवासी प्रहरी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में से हैं जो पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स के माध्यम से रोगजनकों को समझते हैं और फागोसाइटोसिस2 द्वारा इन रोगजनकों को साफ करते हैं। फेफड़े के निवासी डेंड्राइटिक कोशिकाएं एंटीजन प्रस्तुति के माध्यम से जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को पुलकरती हैं 3. इसके अलावा, सक्रिय स्थानीय जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं साइटोकिन्स और केमोकिन्स का उत्पादन करती हैं जो भड़काऊ प्रतिक्रिया को बढ़ाती हैं और फेफड़ों में मोनोसाइट्स, न्यूट्रोफिल और लिम्फोसाइट्स जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ को उत्तेजित करती हैं1. इस्केमिक स्ट्रोक को प्रणालीगत प्रतिरक्षा को संशोधित करने और फुफ्फुसीय संक्रमण के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है; हालांकि, कुछ अध्ययनों ने इस्केमिक स्ट्रोक के बाद फुफ्फुसीय डिब्बे का मूल्यांकन किया है, हालांकि कुछ अध्ययनों ने भड़काऊ स्थितियों 4,5,6,7,8,9 के दौरान इसकी जांच की है। यहां वर्णित विधियों का लक्ष्य एक साथ फेफड़ों की विकृति, प्रतिरक्षा कोशिका संरचना और फेफड़ों में साइटोकिन और केमोकाइन अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करना है ताकि फुफ्फुसीय डिब्बे में परिवर्तन का मूल्यांकन किया जा सके और इस्केमिक हमले के बाद फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में संभावित परिवर्तनों का आकलन किया जा सके।

यहां वर्णित 13 प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए चूहों के फेफड़ों से एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह प्रोटोकॉल एक स्वचालित ऊतक विघटनकारी की आवश्यकता के बिना कोलेजनेज डी के साथ ऊतक पाचन पर आधारित है। इसके अतिरिक्त, हमने ऊतक होमोजेनेट्स तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया जिसका उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मल्टीप्लेक्स मनका सरणियों का उपयोग करके 13 अलग-अलग साइटोकिन्स या केमोकिन्स के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा पर इस्केमिक स्ट्रोक के प्रभावों की जांच करने के लिए उपयोग किया गया था और इसका उपयोग अन्य रोग मॉडल में भी किया जा सकता है।

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Protocol

प्रदर्शन किए गए सभी प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं को वेस्ट वर्जीनिया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को वेस्ट वर्जीनिया विश्वविद्यालय में विवेरियम में विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त स्थितियों के तहत रखा गया था।

1. समाधान की तैयारी

  1. छिड़काव बफर (फॉस्फेट बफर खारा, पीबीएस) तैयार करें। माउस प्रति बर्फ ठंडा पीबीएस के लगभग दो 10 एमएल विभाज्य का प्रयोग करें।
  2. फेफड़े सेल मध्यम /एफएसीएस बफर तैयार करें। एफएसीएस बफर में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक पीबीएस होता है। फेफड़ों के छांटना और हस्तांतरण की पूरी प्रक्रिया के लिए मध्यम ठंडा रखें। फेफड़ों के नमूने प्रति लगभग 8 एमएल तैयार करें। प्रयोगों से पहले ताजा माध्यम / एफएसीएस बफर तैयार करें।
  3. एकल सेल अलगाव के लिए पृथक्करण बफर तैयार करें। बफर में हांक के बफर किए गए नमक समाधान (एचबीएसएस) में 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज डी और 200 μg / एमएल डीएनएएसई आई होता है। प्रयोगों से पहले स्टॉक समाधान (100 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज डी और 10 मिलीग्राम / एमएल डीएनएएसई आई) से ताजा तैयार करें। फेफड़ों के नमूने के प्रति लगभग 6 एमएल की आवश्यकता होती है। सुनिश्चित करें कि बफर उपयोग से पहले कमरे के तापमान तक पहुंचता है।
  4. फेफड़ों के ऊतकों के होमोजेनाइजेशन के लिए होमोजेनाइजेशन बफर तैयार करें। बफर में पीबीएस और 1 एक्स प्रोटीनेज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल (स्टॉक = 100 एक्स) शामिल हैं। प्रयोगों से पहले ताजा तैयारी करें। संपूर्ण होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया के दौरान बफर को ठंडा रखें। बफर का लगभग 200 μL फेफड़ों के एक एकल दाहिने लोब को समरूप बनाने के लिए पर्याप्त है।

2. क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (टीएमसीएओ)

नोट: मध्य मस्तिष्क धमनी के लिए मोनोफिलामेंट सम्मिलन के माध्यम से टीएमसीएओ के लिए प्रक्रियाएं पहले10 से पहले विस्तार से प्रलेखित की गई थीं। इन प्रयोगों में, 8- से 12 सप्ताह के पुरुष सी 57 बीएल / 6 जे चूहों, जिनका वजन 25-30 ग्राम था, का उपयोग किया गया था।

  1. संक्षेप में, चमड़े के नीचे सर्जरी से पहले चूहों को 2 मिलीग्राम / किग्रा मेलोक्सिकैम का प्रशासन करें। 5% आइसोफ्लूरेन का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में चूहों को गहराई से संवेदनाहारी करें। पैर की अंगुली-चुटकी विधि का उपयोग करके गहरी संवेदनाहारी की पुष्टि करें। नाक शंकु का उपयोग करके सर्जरी के दौरान 1-2% आइसोफ्लूरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। चूहों के नीचे एक गर्म कंबल रखकर प्रक्रिया के दौरान 36.5 - 38 डिग्री सेल्सियस पर शरीर के तापमान को बनाए रखें। सर्जरी से एक दिन पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को आटोक्लेव-निष्फल किया जाना चाहिए।
  2. क्लोरहेक्सिडाइन स्क्रब के बाद 70% इथेनॉल का उपयोग करके उदर गर्दन पर त्वचा को दाढ़ी और तैयार करें। चमड़े के नीचे पहला चीरा लगाने से पहले चीरा क्षेत्र पर 2 मिलीग्राम / ड्राईनेस को रोकने के लिए आंखों को ढकने के लिए आंखों के मरहम का इस्तेमाल करें। एक मिडलाइन गर्दन चीरा बनाएं। धीरे-धीरे श्वासनली के चारों ओर नरम ऊतकों को एक तरफ खींचें।
  3. बाईं आम कैरोटिड धमनी और बाहरी कैरोटिड धमनी की पहचान करें।
  4. रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए सामान्य कैरोटिड धमनी पर एक अस्थायी सिवनी (आकार 6/0) लागू करें। बाहरी कैरोटिड धमनी में चीरा लगाएं।
  5. बाहरी कैरोटिड धमनी में एक सिलिकॉन रबर-लेपित मोनोफिलामेंट (आकार 6-0) डालें, फिर मोनोफिलामेंट को मध्य सेरेब्रल धमनी में आगे बढ़ाएं। 60 मिनट (रोड़ा) के लिए मध्य सेरेब्रल धमनी में मोनोफिलामेंट छोड़ दें।
  6. लेजर डॉपलर फ्लोमेट्री का उपयोग करके रक्त प्रवाह की दर की निगरानी करें। मध्य मस्तिष्क धमनी में प्रवाह दर में कमी जो 80% > है, एक सफल रोड़ा इंगित करती है।
  7. रोड़ा के 60 मिनट के बाद, पुनरावृत्ति होने की अनुमति देने के लिए मोनोफिलामेंट को हटा दें। चीरा बंद करें।
  8. शम-संचालित चूहों में, मोनोफिलामेंट के सम्मिलन के बिना चरण 2.1-2.6 करें। इन चूहों में, रक्त प्रवाह की दर पूरी प्रक्रिया के दौरान स्थिर रहनी चाहिए।
  9. चूहों दैनिक निगरानी और मानक स्कोरिंग मानदंड11 का उपयोग कर न्यूरोलॉजिकल घाटे को मापने। 0 - कोई न्यूरोलॉजिकल घाटा नहीं; 1 - पूंछ द्वारा उठाए जाने पर कॉन्ट्रालेटरल फोरपाव को वापस ले लेता है; 2- पूंछ द्वारा उठाए जाने पर कॉन्ट्रालेटरल के लिए हलकों; 3- चलते समय कॉन्ट्रालेटरल पर गिरना; 4 - अनायास नहीं चलता है या कोमाटोज है; 5 - मृत।
  10. सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए हर 24 घंटे में सामान्य खारा और एनाल्जेसिक (मेलोक्सिकैम, 2 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदान करें।
  11. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए टीएमसीएओ के बाद फेफड़ों को 24 और 72 घंटे अलग करें।

3. फेफड़ों के ऊतकों की कटाई

  1. केटामाइन के 100 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किलो ज़ाइलाज़िन के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा माउस को गहराई से संवेदनाहारी करें। पैर की अंगुली-चुटकी विधि का उपयोग करके गहरी संवेदनाहारी की पुष्टि करें।
  2. पूरे शरीर ट्रांसकार्डियल छिड़काव12 करने के लिए, शरीर गुहा में फर वितरण को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल प्लेटफॉर्म और गीले फर में माउस को पिन करें। पुच्छल पेट में एक अनुप्रस्थ चीरा बनाने के लिए ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करें और फिर पेरिटोनियम का एक मिडलाइन चीरा, डायाफ्राम भेदी से पहले वक्ष गुहा पर रोकें।
    1. पेरिटोनियल गुहा में छिपाने के लिए मांसपेशियों के माध्यम से कटौती न करें और पेट के पीछे चीरा जारी न रखें।
  3. जैसे ही डायाफ्राम पंचर करने से पहले वक्ष गुहा तक पहुंच गया है चीरा बंद करो। ध्यान रखें कि हृदय और फेफड़ों को नुकसान न पहुंचे जो छिड़काव की गुणवत्ता या सेल रिकवरी से समझौता कर सकते हैं
  4. ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करके डायाफ्राम को भेदने से पहले वक्ष गुहा पर पेरिटोनियम का एक मिडलाइन चीरा बनाते हैं।
  5. संदंश का उपयोग उरोस्थि के बाहर के अंत तक माउस को समझें और डायाफ्राम के माध्यम से काटते समय ऊपर की ओर उठाएं, हृदय, फेफड़ों या वास्कुलचर को नुकसान नहीं पहुंचाएं। एक बार जब अंग दिखाई देते हैं तो रिब पिंजरे के माध्यम से एक चीरा बनाएं और रिब केस को अलग करें और वापस पिन करें ताकि हृदय और फेफड़े पूरी तरह से उजागर हो जाएं।
  6. महाधमनी मेहराब के पास दाएं आलिंद में सावधानीपूर्वक एक छोटा चीरा बनाएं। यह छिड़काव के लिए बहिर्वाह के रूप में काम करेगा।
  7. इसके तुरंत बाद, धीरे-धीरे बाएं वेंट्रिकल की डिस्टल बेहतर सतह में 10 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस से भरे सिरिंज से जुड़ी 25 जी एक्स 5/8 सुई डालें। वेंट्रिकुलर सेप्टम के माध्यम से दाएं वेंट्रिकल में सम्मिलित न करने के लिए देखभाल का उपयोग करें। सुई को मुश्किल से बाएं वेंट्रिकल में डाला जाना चाहिए।
    नोट: यदि वेंट्रिकुलर सेप्टम को छेदा जाता है, तो माउस की नाक से तरल पदार्थ बाहर निकल जाएगा। यह छिड़काव की गुणवत्ता को कम करेगा और इसके परिणामस्वरूप सेल हानि होगी।
  8. यदि वांछित है, तो छिड़काव के दौरान बाएं वेंट्रिकल में सुई को सुरक्षित रूप से रखने के लिए एक क्लैंप का उपयोग किया जा सकता है।
  9. लगातार लेकिन धीरे-धीरे दिल में 10 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस को धक्का दें। माउस ऊतक को रक्त को छिड़कना और साफ करना शुरू करना चाहिए क्योंकि द्रव सही आलिंद से बाहर निकलता है।
    1. पर्याप्त रक्त निकासी होने तक पीबीएस के 10 मिलीलीटर के दूसरे विभाज्य को धक्का दें। यकृत में हल्के भूरे रंग की उपस्थिति होगी और फेफड़े लाल गुलाबी से ज्यादातर सफेद रंग के होंगे।
  10. संदंश और ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, ध्यान से हृदय, श्वासनली, अन्नप्रणाली, थाइमस, संयोजी ऊतक, लिम्फ नोड्स और बड़े ब्रोन्कियल सहित आसपास के सभी ऊतकों को हटा दें।
  11. अलग-अलग फेफड़ों के लोब को अलग करें और लोब को बर्फ पर पेट्री डिश में रखें जिसमें ठंडे फेफड़ों की कोशिका माध्यम का 1-2 एमएल विभाज्य होता है।

4. मनका होमोजेनाइज़र का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स मनका सरणियों के लिए फेफड़ों के ऊतकों का होमोजेनाइजेशन

  1. प्री-चिल एक 2 एमएल शंक्वाकार स्क्रू कैप ट्यूब जिसमें 3 बाँझ 2.3 मिमी ज़िरकोनिया / ट्यूब के लिए ठंड समरूपता बफर के 200 μL जोड़ें।
  2. लोब का वजन करें, पालि को मोती और होमोजेनाइजेशन बफर युक्त पूर्व-ठंडा शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: बफर के 200 μL में समरूप ऊतक के लगभग 50-100 मिलीग्राम नमूने में साइटोकिन और केमोकाइन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए पर्याप्त होगा।
    1. 2 मिनट के लिए 4,000 आरपीएम पर एक मनका-आधारित होमोजेनाइज़र ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके लोब को समरूप करें।
    2. सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से समरूप है। जरूरत पड़ने पर समय बढ़ाएं।
  3. होमोजेनाइजेशन के बाद, 3 मिनट के लिए 15,870 एक्स जी पर एक पूर्व-ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) माइक्रो-अपकेंद्रित्र में ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  4. सतह पर तैरनेवालों को पूर्व-ठंडा 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  5. तत्काल उपयोग के लिए सीधे बर्फ पर नमूना रखें या भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें। कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचें।

5. फेफड़ों के ऊतकों पृथक्करण और एकल कोशिका अलगाव

  1. पृथक्करण बफर के कमजोर पड़ने से बचने के लिए शेष फेफड़ों के लोब के फेफड़ों की कोशिका माध्यम को बंद करें। फिर, ध्यान से फेफड़ों के ऊतकों में पृथक्करण बफर के 1 एमएल युक्त 25 जी और 5/8 सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज डालें।
  2. प्रत्येक फेफड़े के लोब में पृथक्करणबफर के छोटे अंशों (लगभग 1/4 वें से 1/5वें) को इंजेक्ट करें और धीरे-धीरे फुलाएं।
    नोट: अधिकांश बफर फुलाए जाने के तुरंत बाद बाहर निकल जाएंगे क्योंकि लोब को एक्साइज किया गया है।
  3. पृथक्करण बफर 1-2x के इंजेक्शन को दोहराएं।
  4. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए पृथक्करण बफर के साथ फेफड़ों के लोब सेते हैं।
  5. ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करके फेफड़ों के लोब को छोटे टुकड़ों में बारीक कीमा बनाएं।
  6. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए पृथक्करण बफर के साथ कीमा बनाया हुआ फेफड़ों के टुकड़े स्थानांतरण।  6 एमएल की कुल करने के लिए अतिरिक्त पृथक्करण बफर के साथ पूरक। 1 मिनट के लिए सख्ती से भंवर।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए नमूना सेते हैं। भंवर सख्ती से हर 7-8 मिनट.
  8. इनक्यूबेशन के 45 मिनट के बाद, इष्टतम परिणामों के लिए 1 मिनट के लिए सख्ती से नमूना भंवर।
  9. अवशिष्ट, अवांछित संयोजी और अंतरालीय ऊतक को हटाने के लिए 100 μm सेल छलनी से गुजरकर नमूने को अलग करें।
  10. अपकेंद्रित्र 380 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए नमूना, सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  11. नमूने में ठंडे फेफड़ों की कोशिका माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें। कोमल भंवर द्वारा सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  12. अपकेंद्रित्र 380 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए नमूना, सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  13. ठंडे फेफड़ों की कोशिका माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। कोमल भंवर द्वारा सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  14. एक 100 μm सेल छलनी के माध्यम से पारित करें, और कोशिकाओं की गिनती करें।

6. फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिका आला के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. एंटीबॉडी एक96 अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट (कुल में 3 सेट) में सेट। 830 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवालों को त्यागें।
  2. मृत दाग युक्त ठंड पीबीएस के 50 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार दाग तैयार करें।
  3. प्रकाश से संरक्षित 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं। 830 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवालों को त्यागें।
  4. एंटी-माउस सीडी 16/32 एंटीबॉडी के 5 μg / एमएल युक्त ठंडे एफएसीएस बफर के 25 μL के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। 10-15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. कोशिकाओं के लिए तालिका 1 में सूचीबद्ध एंटीबॉडी संयोजन युक्त ठंडे एफएसीएस बफर के 25 μL जोड़ें। कोमल पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    नोट: एंटीबॉडी धुंधला के लिए एफएसीएस बफर की कुल मात्रा 50 μL है। इसलिए, 25 μL में एंटीबॉडी का एक मास्टर मिश्रण तैयार करते समय, एंटीबॉडी की एकाग्रता अंतिम एकाग्रता से दोगुनी होनी चाहिए।
  6. प्रकाश से संरक्षित 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं। 830 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवालों को त्यागें।
  7. ठंडे एफएसीएस बफर के 100 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 830 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवालों को त्यागें।
  8. ठंडे एफएसीएस बफर के 100 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अतिरिक्त एफएसी बफर के 150 μL युक्त एक पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके तुरंत नमूने का विश्लेषण करें।
    नोट: निम्न चरणों का उपयोग कर सेल निर्धारण नमूने बाद में विश्लेषण करने की अनुमति देता है।
  9. चरण 6.7 के बाद, पीबीएस में 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 μL के साथ नमूने को फिर से निलंबित करें।
  10. प्रकाश से संरक्षित 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं। 830 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवालों को त्यागें।
  11. ठंडे एफएसीएस बफर के 100 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 830 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवालों को त्यागें।
  12. ठंडे एफएसीएस बफर के 100 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्रकाश से संरक्षित, 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें। 72 घंटे के भीतर नमूने का विश्लेषण करें।

7. साइटोकिन और केमोकाइन का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स मनका सरणियाँ

नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोइंफ्लेमेटरी केमोकाइन और सूजन मल्टीप्लेक्स पैनल ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार टीएमसीएओ प्रेरण के बाद फेफड़ों में केमोकिन्स और साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसे विस्तार से वर्णित किया गया है13.

  1. संक्षेप में, बर्फ पर विश्लेषण को पिघलाएं यदि वे ऊतक समरूपता के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। किसी भी अवशिष्ट ऊतक को हटाने के लिए उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 590 एक्स जी पर नमूना अपकेंद्रित्र।
  2. मानक कॉकटेल (सी 7) को क्रमिक रूप से पतला करके एक मानक वक्र उत्पन्न करें जो 7 मानकों (सी 1-6) में 10 एनजी / एमएल की ज्ञात एकाग्रता पर है, जिसमें अंतिम मानक अकेले परख बफर (सी 0) है।
  3. एक बार जब सभी अभिकर्मकों कमरे के तापमान के लिए गर्म हो गया है, प्रत्येक मानक के 25 μL और एक वी नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए परख बफर के 25 μL जोड़ें।
  4. प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से करने के लिए, एक वी नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए फेफड़ों होमोजेनेट (विश्लेषण) और परख बफर के 25 μL के 25 μL जोड़ें
  5. पूर्व लेपित मोतियों को सख्ती से भंवर करें, फिर मानक और नमूना कुओं में से प्रत्येक में पूर्व-लेपित मोतियों के 25 μL जोड़ें।
  6. प्लेट को सील करें और पन्नी के साथ कवर करके प्रकाश से बचाएं। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 110 आरपीएम पर प्लेट हिलाएं।
  7. 5 मिनट के लिए 230 x g पर अपकेंद्रित्र। 1x पर धोने बफर के 200 μL जोड़ें (स्टॉक समाधान 20x है, पानी के साथ 1x करने के लिए पतला)। 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. 5 मिनट के लिए 230 x g पर अपकेंद्रित्र। 25 μL का पता लगाने एंटीबॉडी के साथ मानक और नमूना पुन: निलंबित।
  9. प्रकाश से बचाने के लिए प्लेट को सील और कवर करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 110 आरपीएम पर शेक प्लेट।
  10. प्रत्येक मानक और नमूना अच्छी तरह से करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-फाइकोएरिथ्रिन (एसए-पीई) के 25 μL जोड़ें।
  11. प्रकाश से बचाने के लिए प्लेट को सील और कवर करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 110 आरपीएम पर हिलाएं।
  12. 5 मिनट के लिए 230 x g पर प्लेट स्पिन। 1x धोने बफर में मानक और नमूने पुन: निलंबित।
  13. एक अच्छी तरह से लेबल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एक्स वॉश बफर के अतिरिक्त 150 μL होते हैं।
  14. एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग मानकों और नमूनों के लिए पीई संकेत प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करें।
  15. पूर्व निर्धारित सांद्रता के खिलाफ पीई की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का उपयोग करके प्रत्येक केमोकाइन और साइटोकिन के लिए एक मानक वक्र का निर्माण करें।
  16. प्रत्येक नमूने से मानक वक्र और एमएफआई का उपयोग करके प्रत्येक केमोकाइन और साइटोकिन की एकाग्रता निर्धारित करें। मल्टीप्लेक्स पैनल डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रदान करता है जिसका उपयोग प्रत्येक विश्लेषण की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। बेहतर लोब के वजन का उपयोग ऊतक के प्रति मिलीग्राम साइटोकिन्स या केमोकाइन की एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

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Representative Results

हमने हाल ही में बताया कि चूहों में इस्केमिक स्ट्रोक प्रेरण फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिका संरचना को बदल देता है11. विशेष रूप से, क्षणिक सेरेब्रल इस्किमिया ने वायुकोशीय मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल और सीडी 11 बी + डीसी के प्रतिशत में वृद्धि की, जबकि फुफ्फुसीय डिब्बे में सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं और ईोसिनोफिल के प्रतिशत को कम कर दिया। इसके अलावा, सेलुलर परिवर्तन फेफड़ों में कई केमोकिन्स के काफी कम स्तर के अनुरूप था। यहां वर्णित फुफ्फुसीय डिब्बे में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के अलगाव और पहचान के लिए एक विधि है। यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम चूहों से थे जो टीएमसीएओ प्रेरण और एक नकली ऑपरेशन से गुजरे थे।

हमने 5-7 एंटीबॉडी (चित्रा 1) युक्त प्रत्येक सेट के साथ एंटीबॉडी संयोजनों के 3 सेटों का उपयोग करके फेफड़ों (एल 1-एल 13) में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की 13 अलग-अलग आबादी की पहचान की। मृत कोशिकाओं को प्रत्येक सेट में एक जीवित / मृत दाग का उपयोग करके बाहर रखा गया था। विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों को अलग करने के लिए एंटीबॉडी और मार्कर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। वायुकोशीय और अंतरालीय मैक्रोफेज, सीडी 103 + डीसी, सीडी 11 बी + डीसी, और ईोसिनोफिल सेट 1 (चित्रा 1ए, बी) में पहचाने गए थे। प्रोइंफ्लेमेटरी मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल सेट 2 (चित्रा 1 सी) में पहचाने गए थे। भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान, मोनोसाइट्स सूजन की साइट पर चले जाते हैं, जहां ये कोशिकाएं मोनोसाइट-व्युत्पन्न एंटीजन प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं (मो-एपीसी) 14 में अंतर करती हैं। एलवाई 6 सी और सीसीआर 2 का डाउनरेगुलेशन मोनोसाइट भेदभाव की विशेषता है, जिसका मूल्यांकन सेट 215 का उपयोग करके किया जा सकता है।  सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, प्लाज्मासाइटोइड डीसी, एनके कोशिकाओं और एनकेटी कोशिकाओं को सेट 3 (चित्रा 1 डी) का उपयोग करके पहचाना गया था।

हमारे एकल सेल अलगाव प्रोटोकॉल की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक पृथक्करणकर्ता (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके अलग की गई कोशिकाओं के साथ मैनुअल विधि का उपयोग करके अलग व्यवहार्य कोशिकाओं और सीडी 45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या की तुलना की, जिसका उपयोग अक्सर ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है16,17,18,19,20 . बाद के प्रोटोकॉल में, फेफड़ों के लोब को पृथक्करण बफर के इंजेक्शन के बाद एक विघटनकारी-विशिष्ट ट्यूब (सामग्री की तालिका देखें) में स्थानांतरित किया गया था, और ऊतक को 37C_m_LDK_1 कार्यक्रम का उपयोग करके पचाया गया था। व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या, सीडी 45 + कोशिकाओं का प्रतिशत, और प्राप्त सीडी 45 + कोशिकाओं की कुल संख्या दो तरीकों (चित्रा 2ए-सी) के बीच तुलनीय थी। दोनों प्रोटोकॉल का उपयोग कर सीडी 45 + कोशिकाओं के बीच कोशिका मृत्यु का प्रतिशत ~ 10% (चित्रा 2 डी) था। इन परिणामों से पता चलता है कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक स्वचालित ऊतक विघटनकारी की सहायता के बिना उच्च उपज और गुणवत्ता के साथ सेल वसूली की अनुमति देता है।

प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ युग्मित एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीप्लेक्स परख नमूना (चित्रा 3) के 25 μL का उपयोग कर13 केमोकिन्स की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मोतियों के दो अलग-अलग आकारों को पहले एफएससी / एसएससी (चित्रा 3 ए) द्वारा पहचाना गया था। प्रत्येक मनका 6-7 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेपित है, जिसे एपीसी चैनल (चित्रा 3 बी) में प्रतिदीप्ति तीव्रता से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। नमूने में केमोकिन्स का स्तर पीई चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए आनुपातिक है, जिसे एमएफआई (चित्रा 3 सी) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। केमोकाइन की ज्ञात सांद्रता के साथ निर्मित मानक वक्र के साथ प्रत्येक केमोकाइन के एमएफआई मूल्य की तुलना करके, नमूने में एकाग्रता (ऊतक के प्रति मिलीग्राम) निर्धारित की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: इस्केमिक स्ट्रोक के बाद कोलेजनेज डी के साथ ऊतक पाचन के बाद फेफड़ों से 13 प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की पहचान। फेफड़ों के ऊतकों को टीएमसीएओ या शम ऑपरेशन के बाद 24 घंटे बढ़ाया गया था, फेफड़ों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था, जिसे तालिका 1 पर सूचीबद्ध सतह मार्करों द्वारा परिभाषित किया गया था। (ए) एंटीबॉडी सेट 1 में, सीडी 45+ व्यवहार्य कोशिकाओं (*) को पहली बार वायुकोशीय मैक्रोफेज (एल 1) की पहचान करने के लिए सिगलेक एफ और सीडी 11 बी पर गेट किया गया था, जिसने सीडी 11 सी और एमएचसी द्वितीय, और ईोसिनोफिल (एल 2) व्यक्त किया था, जो सीडी 11 सी और एमएचसी द्वितीय को व्यक्त नहीं करता था। (बी) ए में सिगलेक एफ- जनसंख्या (**) के भीतर कोशिकाओं को सीडी 103 और सीडी 11 बी की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए गेट किया गया था। सीडी 11 सी और एमएचसी द्वितीय की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं को आगे गेट किया गया था। सीडी 103+ डीसी ने सीडी 11 सी और एमएचसी द्वितीय (एल 3) दोनों को व्यक्त किया लेकिन सीडी 64 को व्यक्त नहीं किया। सीडी 64 और एमएचसी द्वितीय की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए सीडी 11 बी हाय आबादी (*) को आगे गेट किया गया था। सीडी 11 बी + डीसी ने एमएचसी द्वितीय व्यक्त किया लेकिन सीडी 64 (एल 4) नहीं, जबकि अंतरालीय मैक्रोफेज (एल 5) ने दोनों मार्करों को व्यक्त किया। (सी) एंटीबॉडी सेट 2 में, ए में सीडी 45+ व्यवहार्य कोशिकाओं को सीडी 11 बी और एलवाई 6 सी की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए गेट किया गया था। एलवाई 6 सी हाय कोशिकाओं (*) ने उदासीन मोनोसाइट्स का प्रतिनिधित्व किया जो सीसीआर 2 अभिव्यक्ति (एल 6, मध्य साजिश) के उच्च स्तर को बनाए रखते थे, जबकि एलवाई 6 सी कम कोशिकाओं (**) में विभेदित मोनोसाइट्स की मिश्रित आबादी थी जो एलवाई 6 जी- (एल 6, दाएं प्लॉट), और एलवाई 6 जी + न्यूट्रोफिल (एल 7) थे। (डी) एंटीबॉडी सेट 3 में, ए में सीडी 45+ व्यवहार्य कोशिकाओं को बी कोशिकाओं (एल 8) और प्लाज्मासाइटोइड डीसी (एल 9) की पहचान करने के लिए सीडी 11 सी और बी 220 की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए गेट किया गया था। सीडी 11 सी- और बी 220- जनसंख्या (*) को सीडी 4 + टी कोशिकाओं (एल 10) और सीडी 8 + टी कोशिकाओं (एल 11) की पहचान करने के लिए सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए गेट किया गया था। सीडी 4- सीडी 8- जनसंख्या (**) को एनके कोशिकाओं (एल 12) और एनकेटी कोशिकाओं (एल 13) की पहचान करने के लिए एनके 1.1 और टीसीआरबी की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए आगे गेट किया गया था। दिखाया गया है कि टीएमसीएओ और शम ऑपरेशन के बाद 12 सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से प्रतिनिधि भूखंड हैं। आकृति के कुछ हिस्सों को अनुमति के साथ पहले प्रकाशित साहित्य11 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फेफड़ों से एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए मैनुअल पृथक्करण विधि और ऊतक पृथक्करण के उपयोग के बीच तुलना। (ए-सी) कोशिकाओं की कुल संख्या, सीडी 45+ कोशिकाओं का प्रतिशत, और सीडी 45+ कोशिकाओं की कुल संख्या की तुलना की गई थी। दिखाया गया है कि 3 स्वतंत्र प्रयोगों से संयुक्त परिणाम हैं। एनएस: सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं है। (डी) अलगाव के बाद मृत सीडी 45 + कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए प्रतिनिधि भूखंड। दिखाया गया है कि 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रतिनिधि भूखंड हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इस्केमिक स्ट्रोक फेफड़ों में कई केमोकिन्स के उत्पादन को दबा देता है। (ए-सी) मल्टीप्लेक्स मनका सरणी द्वारा फेफड़ों में 13 केमोकिन्स के स्तर के निर्धारण को दर्शाने वाले प्रतिनिधि भूखंड।  (ए) एफएससी /एसएससी गेट का उपयोग विभिन्न आकार के साथ मोती ए और बी की पहचान करने के लिए किया गया था। (बी) मोतियों पर लेपित प्राथमिक एंटीबॉडी को एपीसी चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (सी) नमूने में केमोकिन्स का स्तर पीई चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता के आनुपातिक था। शम ऑपरेशन के बाद 12 सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से प्रतिनिधि भूखंड दिखाए गए हैं। (डी) फेफड़ों के ऊतकों को टीएमसीएओ या शम ऑपरेशियो के बाद 24 घंटे होमोजेनाइज किया गया था। व्यक्तिगत जानवरों के फेफड़ों में 13 केमोकिन्स का स्तर मल्टीप्लेक्स मनका सरणी द्वारा निर्धारित किया गया था। दिखाए गए डेटा प्रति समूह एन = 11-12 जानवरों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों से संयुक्त परिणाम हैं। *, पी < 0.05; **, पी < 0.01; , पी < 0.001। एनएस, सांख्यिकीय रूप से अलग नहीं है। आकृति के कुछ हिस्सों को अनुमति के साथ पहले प्रकाशित साहित्य11 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रोग-प्रतिकारक क्लोन प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार आबादी सतह मार्कर अभिव्यक्ति
सीडी 45-एफआईटीसी 30-F11 अल्वेलोआर मैक्रोफेज एल 1 सीडी 45 + सिगलेक एफ + सीडी 11 बी-
सिगलेक एफ-पीई E50-2440 ईोसिनोफिल एल 2 सीडी 45 + सिगलेक एफ + सीडी 11 बी +
सीडी 11 सी-पर्क/ N418 सीडी 103+ डीसी एल 3 सीडी 45 + सिगलेक एफ- सीडी 11 बी- सीडी 103 + सीडी 11 सी + एमएचसी द्वितीय +
सीडी 11 बी-पीई / M1/70 सीडी 11 बी + डीसी एल 4 सीडी 45 + सिगलेक एफ- सीडी 11 बी हाय सीडी 103- सीडी 64- एमएचसी द्वितीय +
सीडी 64-एपीसी एक्स 54-5 / अंतरालीय मैक्रोफेज एल 5 सीडी 45 + सिगलेक एफ- सीडी 11 बी हाय सीडी 103- सीडी 64 + एमएचसी द्वितीय +
सीडी 103-बीवी 421 2E7
एमएचसी द्वितीय-बीवी 510 M5/114.15.2
लाइव / मृत-एपीसी / सीवाई 7
सीडी 45-एफआईटीसी 30-F11 मोनोसाइट्स / एल 8 सीडी 45 + सीडी 11 बी हाय एलवाई 6 सी हाय /
एलवाई 6 सी-पीई एचके 1.4 न्यूट्रोफिल एल 9 सीडी 45+ सीडी 11 बी सीसीआर 2- एलवाई 6 जी + में एलवाई 6 सी
सीडी 11 बी-पीई / M1/70
सीसीआर 2-बीवी 421 एसए 203 जी 11
एलवाई 6 जी-बीवी 510 1ए8
लाइव / मृत-एपीसी / सीवाई 7
सीडी 45-एफआईटीसी 30-F11 प्लाज्मासाइटोइड डीसी एल 6 सीडी 45 + बी 220 + सीडी 11 सी +
सीडी 8-पीई 53-6.7 बी कोशिकाएं एल 7 सीडी 45 + बी 220 + सीडी 11 सी-
एनके 1.1-पर्क / पीके 136 सीडी 4 + टी कोशिकाएं एल 10 सीडी 45 + बी 220- सीडी 11 सी- सीडी 4 + सीडी 8-
सीडी 11 सी-पीई / N418 सीडी 8 + टी कोशिकाएं एल11 सीडी 45 + बी 220- सीडी 11 सी- सीडी 4- सीडी 8 +
एपीसी-बी 220 आरए 3-6 बी 2 एनके कोशिकाएं एल12 सीडी 45 + बी 220- सीडी 11 सी- सीडी 4- सीडी 8- एनके 1.1 + टीसीआरबी-
सीडी 4-बीवी 421 जीके 1.5 एनकेटी कोशिकाएं एल 13 सीडी 45 + बी 220- सीडी 11 सी- सीडी 4- सीडी 8- एनके 1.1 + टीसीआरबी +
टीसीआरबी-बीवी 510 H57-597
लाइव / मृत-एपीसी / सीवाई 7

तालिका 1: टीएमसीएओ के बाद फेफड़ों से पृथक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए सतह मार्कर और एंटीबॉडी संयोजन।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की पहचान और एक ही माउस में केमोकिन्स या साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं। यदि एक हिस्टोपैथोलॉजी अध्ययन वांछित है, तो एकल सेल अलगाव चरणों में आगे बढ़ने से पहले एक व्यक्तिगत लोब को हटाया जा सकता है और उस उद्देश्य के लिए तय किया जा सकता है। इस पद्धति की एक सीमा यह है कि यह दृष्टिकोण कुछ रोग सेटिंग्स में उपयुक्त नहीं हो सकता है यदि प्रतिरक्षा कोशिका संरचना में परिवर्तन और केमोकिन्स और / या साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति फेफड़ों के विभिन्न पालियों के बीच असमान रूप से वितरित होने का अनुमान है। उदाहरण के लिए, कुछ बैक्टीरिया, जैसे कि माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस, फेफड़ोंके कुछ लोबों को संक्रमित करने के लिए एक पूर्वाग्रह दिखाते हैं 21. इस मामले में, लोब के बीच तुलना की आवश्यकता हो सकती है।

एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय, और फेफड़ों से एकल कोशिका अलगाव प्रोटोकॉल का तापमान फेफड़ों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वसूली को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज डी की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है और यदि कोलेजनेज डी के एक अलग स्रोत का उपयोग किया जाता है तो इसका परीक्षण किया जाना चाहिए। ऊतकों के अति-पाचन के परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु में वृद्धि होती है; जबकि, ऊतकों के अंडर-पाचन से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से मैक्रोफेज और डीसी की कम उपज होती है।

हमने फेफड़ों में 13 प्रतिरक्षा कोशिका आबादी निर्धारित करने के लिए 3 एंटीबॉडी संयोजनों का उपयोग किया, प्रत्येक सेट में 5-7 एंटीबॉडी और एक जीवित / नमूनों से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या सीमित होने पर प्रत्येक सेट में एंटीबॉडी को जोड़ा जा सकता है।  हालांकि, एंटीबॉडी की संख्या बढ़ने पर उत्पन्न होने वाला एक प्रमुख मुद्दा यह है कि प्रवाह साइटोमीटर पर प्रतिदीप्ति संकेत का मुआवजा चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब भड़काऊ परिस्थितियों में माइलॉयड लिनेज से कोशिकाओं को अलग करना। अतिरिक्त एंटीबॉडी कॉकटेल का उपयोग एकल-कोशिका निलंबन के भीतर अन्य जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाएं और δδ टी कोशिकाएं, जो फेफड़ों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में योगदान करती हैं22,23. चूंकि फेफड़ों का एक लोब मल्टीप्लेक्स सरणी के लिए लिया जाता है, इसलिए फेफड़ों में प्रत्येक कोशिका प्रकार की सटीक संख्या निश्चित रूप से निर्धारित और तुलना नहीं की जा सकती है, और यह इस विधि की एक सीमा का गठन करती है। इसे संबोधित करने के लिए, कोशिकाओं की एक परिभाषित संख्या को शम और टीएमसीएओ-प्रेरित चूहों के फेफड़ों से अलग किया जा सकता है। इस मामले में, प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की पूर्ण संख्या की दो समूहों के बीच सटीक तुलना की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, यह विधि फेफड़ों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीयकरण को निर्धारित करने की अनुमति नहीं देती है। यह फेफड़ों के वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करके पूरा किया जा सकता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा में इस्केमिक स्ट्रोक के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था, लेकिन इसका उपयोग संक्रमण और एलर्जी जैसे अन्य रोग मॉडल का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान पी 20 जीएम 10 9 0 9 8 और प्रेस्पेरो से एडविन वान तक इनोवेशन अवार्ड प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगडब्ल्यूवीयू फ्लो साइटोमेट्री और सिंगल सेल कोर सुविधा में किए गए थे, जो एनआईएच अनुदान एस 10 ओडी 016165, यू 57 जीएम 104942, पी 30 जीएम 103488 और पी 20 जीएम 103434 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B220-APC, clone RA3-6B2 Biolegend 103212 1:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizer Benchmark Scientific D1030 Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11 Biolegend 150605 1:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7 Biolegend 121422 1:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 Biolegend 101216 1:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418 Biolegend 117318 1:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 Biolegend 117328 1:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5 Biolegend 100443 1:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11 Biolegend 103108 1:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1 Biolegend 139306 1:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7 Biolegend 100708 1:800 dilution
Collagenase D Sigma Aldrich 11088882001 Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tube ThermoFisher 02-681-344 Tube for tissue homogenization
DNase I Sigma Aldrich 10104159001 Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibody Biolegend 101320 1:100 dilution
genlteMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial ThermoFisher 78442 Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitor Moor MOORVMS-LDF Blood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel Biolegend 740451 Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stain ThermoFisher L34976 Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4 Biolegend 128008 1:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8 Biolegend 127633 1:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium Doccol 602356PK10Re tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 Biolegend 107636 1:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 Biolegend 108728 1:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440 BD Biosciences 552126 1:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0 Fine Science Tools 18020-60 tMCAO
SomnoSuite anesthesia system Kent Scientific SS-01 Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897 Biolegend 109234 1:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mm Biospec 11079125z Beads for tissue homogenization

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 160 फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रतिरक्षा कोशिका प्रोफाइलिंग साइटोकिन्स केमोकिन्स प्रवाह साइटोमेट्री मल्टीप्लेक्स मनका सरणियों इस्केमिक स्ट्रोक
फुफ्फुसीय वातावरण में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और प्रोइंफ्लेमेटरी मध्यस्थों की विशेषता
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Monaghan, K. L., Farris, B. Y.,… More

Monaghan, K. L., Farris, B. Y., Zheng, W., Wan, E. C. K. Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment. J. Vis. Exp. (160), e61359, doi:10.3791/61359 (2020).

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