Summary
이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.
Abstract
면역 세포 확장, 활성화 및 여러 사이토카인 및 케모카인의 발현에 의해 조절되는 폐로의 밀매는 심각한 뇌 손상에 의해 변경될 수 있다. 이것은 폐렴이 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자의 주요 사망 원인이라는 사실에 의해 입증됩니다. 이 프로토콜의 목표는 폐포 대식세포, 간질성 대식세포, CD103+ 또는 CD11b+ 수지상 세포(DCs), 혈장 세포질 DCs, 호산구, 단핵구/단핵구 유래 세포, 호중구, 림프구 유래 T 및 B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 마우스의 폐에서 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 다색 유세포 분석의 사용을 설명하는 것이며, 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색에 의한 허혈성 뇌졸중 유도에 이른다. 더욱이, 우리는 비드 균질화 방법을 사용하여 폐 균질액의 제조를 기술하고, 유세포 분석과 결합된 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 동시에 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정한다. 이 프로토콜은 또한 감염성 폐 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 다른 질병 설정에서 폐 면역 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.
Introduction
폐는 외부 환경에 노출되는 장벽 기관이므로 병원균 및 알레르겐1과 같은 면역 학적 도전을 끊임없이 받고 있습니다. 폐 거주 면역 세포의 활성화와 주변부에서 면역 세포의 침윤은 폐 환경에서 병원균을 제거해야합니다. 또한, 폐에 거주하는 면역 세포는 공생 박테리아에 대한 내성을 유지하며, 이는 이들 세포가 병원균 제거 및 항상성 유지에 중요한 역할을한다는 것을 암시합니다1. 폐포 및 간질성 대식세포는 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 감지하고 식균작용에 의해 이러한 병원체를 제거하는 폐 상주 감시자 면역 세포 중하나입니다 2. 폐-상주 수지상 세포는 항원 제시3을 통해 선천적 및 적응성 면역 반응을 연결한다. 또한, 활성화된 국소 선천적 면역 세포는 염증 반응을 증폭시키고 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 폐로의 침윤을 자극하는 사이토카인 및 케모카인을 생성한다1. 허혈성 뇌졸중은 전신 면역을 변형시키고 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 폐 구획을 평가 한 연구는 거의 없지만 일부 연구는 염증 상태 4,5,6,7,8,9 동안이를 조사했습니다. 본원에 기재된 방법의 목표는 폐 병리, 면역 세포 조성물, 폐에서의 사이토카인 및 케모카인 발현의 수준을 동시에 결정하여 폐 구획에 대한 변경을 평가하고 허혈성 발작 후 폐 면역 반응에 대한 잠재적 변화를 평가하는 것이다.
여기에 기재된 것은 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 마우스의 폐로부터 단일 세포 현탁액을 수득하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 자동화된 조직 해리제가 필요 없이 콜라게나제 D를 사용한 조직 소화를 기반으로 합니다. 추가적으로, 우리는 유세포 분석기 기반 멀티플렉스 비드 어레이를 사용하여 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 조직 균질물을 제조하기 위한 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중이 폐 면역에 미치는 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었으며 다른 질병 모델에서도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
수행 된 모든 프로토콜과 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 마우스는 웨스트버지니아 대학교의 vivarium에서 특이적-병원체-비함유 조건 하에 수용되었다.
1. 용액의 제조
- 관류 완충액(인산완충식염수, PBS)을 준비한다. 마우스 당 약 두 개의 얼음처럼 차가운 PBS 분취량을 사용하십시오.
- 폐 세포 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오. FACS 완충액은 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 PBS를 함유한다. 폐 절제와 이동의 전체 과정을 위해 중간 정도를 차갑게 유지하십시오. 폐 샘플 당 약 8 mL를 준비하십시오. 실험 전에 신선한 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오.
- 단일 세포 분리를 위해 해리 완충액을 준비하십시오. 완충액은 행크의 완충 염 용액(HBSS)에 1mg/mL 콜라게나제 D와 200μg/mL DNase I을 함유한다. 실험 전에 원액 (100 mg / mL 콜라게나제 D 및 10 mg / mL DNase I)에서 신선하게 준비하십시오. 폐 샘플 당 약 6 mL가 필요합니다. 사용하기 전에 버퍼가 실온에 도달하는지 확인하십시오.
- 폐 조직 균질화를 위한 균질화 완충액을 준비한다. 완충액은 PBS 및 1x 프로테이나제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유한다(스톡=100x). 실험 전에 신선하게 준비하십시오. 전체 균질화 과정 동안 버퍼를 차갑게 유지하십시오. 대략 200 μL의 완충제는 폐의 단일 우로브를 균질화하기에 충분하다.
2. 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 (tMCAO)
참고: 중간 대뇌 동맥에 모노필라멘트 삽입을 통한 tMCAO에 대한 절차는 이전에10에 상세히 문서화되었다. 이들 실험에서, 25-30 g의 체중을 갖는 8-12주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.
- 간단히 말해서, 수술 전에 마우스에 2 mg / kg 멜록시캄을 피하 투여하십시오. 마우스를 5% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 깊이 마취시킨다. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오. 코 콘을 사용하여 수술 중에 1-2 % 이소 플루란으로 마취를 유지하십시오. 마우스 아래에 따뜻한 담요를 놓아 시술 내내 체온을 36.5 - 38 °C로 유지하십시오. 모든 수술 도구는 수술 하루 전에 오토클레이브 살균해야합니다.
- 면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 복부 목의 피부를 준비한 다음 클로르헥시딘 스크럽을 준비하십시오. 첫 번째 절개를하기 전에 절개 부위에 2mg / kg bupivacaine을 피하 투여하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈을 가리기 위해 눈 연고를 사용하십시오. 중간 선 목 절개를하십시오. 기관 주위의 연조직을 부드럽게 당겨 내립니다.
- 왼쪽 일반적인 경동맥과 외부 경동맥을 확인하십시오.
- 혈액의 흐름을 막기 위해 일반적인 경동맥에 임시 봉합사 (크기 6/0)를 적용하십시오. 외부 경동맥을 절개하십시오.
- 실리콘 고무 코팅 모노필라멘트(크기 6-0)를 외부 경동맥에 삽입한 다음, 모노필라멘트를 중간 대뇌 동맥으로 전진시킨다. 모노 필라멘트를 중간 대뇌 동맥에 60 분 동안 두십시오 (폐색).
- 레이저 도플러 유량계를 사용하여 혈류 속도를 모니터링합니다. 중간 대뇌 동맥으로의 유속의 감소가 > 80%는 성공적인 폐색을 나타낸다.
- 60분의 폐색 후, 모노필라멘트를 제거하여 재관류가 일어나도록 한다. 절개를 닫습니다.
- 가짜 조작된 마우스에서, 모노필라멘트의 삽입 없이 단계 2.1-2.6을 수행한다. 이 생쥐에서 혈류 속도는 전체 절차 중에 일정하게 유지되어야합니다.
- 매일 마우스를 모니터하고 표준 채점 기준11을 사용하여 신경 학적 결핍을 측정하십시오. 0 – 신경 학적 결손 없음; 1 – 꼬리에 의해 들어 올릴 때 반대쪽 앞발을 철회; 2- 꼬리에 의해 들어 올릴 때 대측으로 원; 3- 걷는 동안 대측으로 떨어지는 것; 4 – 자발적으로 걷지 않거나 혼수 상태; 5 - 죽었어.
- 수술 후 3 일 동안 24 시간마다 정상 식염수와 진통제 (meloxicam, 2 mg / kg)를 피하 주사하십시오.
- 하류 분석을 위해 tMCAO 후 24 및 72 h 후에 폐를 분리한다.
3. 폐 조직 수확
- 100 mg / kg의 케타민과 10 mg / kg의 자일라진 주사를 복강 내 (i.p.) 주사하여 마우스를 깊이 마취하십시오. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오.
- 전신 심질 관류(12)를 수행하기 위해, 마우스를 수술 플랫폼에 고정하고 70% 에탄올로 모피를 적셔 체강 내로의 모피 분포를 감소시킨다. 미세한 해부 가위를 사용하여 꼬리 복부를 가로 절개 한 다음 복막의 중간 선 절개를 만들어 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈 춥니 다.
- 근육을 통해 자르지 말고 복강으로 숨어 복부를 절개하지 마십시오.
- 횡격막에 구멍을 뚫기 전에 흉강에 도달하자마자 절개를 중단하십시오. 관류 품질 또는 세포 회복을 저해 할 수있는 심장과 폐를 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 미세한 해부 가위를 사용하여 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈추는 복막의 중간 선 절개를 만듭니다.
- 포셉을 사용하여 흉골의 원위 끝으로 마우스를 잡고 횡격막을 절단하면서 위쪽으로 들어 올려 심장, 폐 또는 혈관 조직을 손상시키지 않도록하십시오. 장기가 보이면 흉곽을 통해 절개를하고 흉곽 케이스를 분리하고 핀으로 고정하여 심장과 폐가 완전히 노출되도록하십시오.
- 조심스럽게 대동맥 아치 근처의 오른쪽 심방에서 작은 절개를하십시오. 이것은 관류를위한 유출 역할을 할 것입니다.
- 그 직후, 차가운 PBS 10 mL로 채워진 주사기에 부착된 25 G x 5/8 바늘을 좌심실의 원위 우량한 표면 내로 부드럽게 삽입한다. 심실 중격을 통해 우심실에 삽입하지 않도록주의하십시오. 바늘은 좌심실에 간신히 삽입해야합니다.
참고 : 심실 중격이 뚫리면 마우스의 코에서 액체가 흘러 나옵니다. 이것은 관류 품질을 감소시키고 세포 손실을 초래할 것이다. - 원하는 경우, 관류 동안 좌심실 내의 제자리에 바늘을 단단히 고정시키기 위해 클램프를 사용할 수 있다.
- 차가운 PBS 10 mL를 꾸준히 부드럽게 밀어 넣는다. 마우스 조직은 유체가 오른쪽 심방에서 빠져 나올 때 혈액을 관류하고 제거해야합니다.
- 충분한 혈액 클리어런스가 발생할 때까지 PBS 10 mL의 두 번째 분취량을 밀어 넣습니다. 간은 밝은 갈색으로 보이고 폐는 붉은 분홍색에서 대부분 흰색으로 변합니다.
- 포셉과 미세 해부 가위를 사용하여 심장, 기관, 식도, 흉선, 결합 조직, 림프절 및 대형 기관지를 포함한 모든 주변 조직을 조심스럽게 제거하십시오.
- 개별 폐 엽을 분리하고 엽을 차가운 폐 세포 배지의 1-2 mL 분취량을 함유하는 얼음 위에 페트리 접시에 넣는다.
4. 비드 호모게나이저를 이용한 멀티플렉스 비드 어레이용 폐 조직의 균질화
- 멸균 2.3mm 지르코니아/실리카 비드 3개가 들어 있는 2mL 원뿔형 스크류 캡 튜브를 미리 식히십시오. 200 μL의 차가운 균질화 완충액을 튜브에 첨가한다.
- 엽을 계량하고, 로브를 비드 및 균질화 완충액을 함유하는 미리 냉각된 원뿔형 튜브로 옮긴다.
참고: 200 μL의 완충액에서 균질화된 대략 50-100 mg의 조직은 샘플에서 사이토카인 및 케모카인 발현을 검출하기에 충분할 것이다.- 비드계 호모게나이저(표 표 참조)를 사용하여 로브를 4,000 rpm에서 2분 동안 균질화한다.
- 조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 시간을 늘리십시오.
- 균질화 후, 튜브를 3분 동안 15,870 x g 에서 미리 냉각된 (4°C) 마이크로원심분리기에서 원심분리한다.
- 상청액을 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로튜브로 옮긴다.
- 샘플을 즉시 사용하기 위해 얼음 위에 직접 놓거나 나중에 사용하기 위해 샘플을 -80°C에 보관하십시오. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.
5. 폐 조직 해리 및 단일 세포 분리
- 해리 완충액의 희석을 피하기 위해 나머지 폐 엽의 폐 세포 배지를 붓는다. 그런 다음, 해리 완충액 1mL를 함유하는 25G 및 5/8 바늘이 있는 1 mL 주사기를 폐 조직에 조심스럽게 삽입한다.
- 해리 버퍼의 작은 분획 (약 1/4~ 1/5th)을 각 폐 엽에 주입하고 부드럽게 팽창시킵니다.
참고 : 대부분의 버퍼는 엽이 절제됨에 따라 팽창 한 직후에 급히 빠져 나옵니다. - 해리 버퍼 1-2x의 주입을 반복하십시오.
- 폐 엽을 실온에서 2분 동안 해리 완충액으로 인큐베이션한다.
- 미세한 해부 가위를 사용하여 폐 엽을 작은 조각으로 잘게 다듬습니다.
- 다진 폐 조각을 해리 완충액과 함께 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 추가 해리 완충액을 총 6 mL로 보충하십시오. 1 분 동안 격렬하게 소용돌이.
- 샘플을 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다. 소용돌이는 7-8 분마다 격렬하게 소용돌이친다.
- 45분 인큐베이션 후, 최적의 결과를 위해 샘플을 1분 동안 격렬하게 와류시킨다.
- 샘플을 100 μm 세포 스트레이너를 통과시켜 잔존, 바람직하지 않은 결합 및 간질성 조직을 제거함으로써 샘플을 더욱 해리시킨다.
- 샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 차가운 폐 세포 배지 5 mL를 샘플에 첨가한다. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
- 샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 차가운 폐 세포 배지 1 mL를 첨가하십시오. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
- 100 μm 세포 스트레이너를 통과시키고, 세포를 계수한다.
6. 폐 면역 세포 틈새 시장에 대한 유세포 분석
- 시드 1-2 x 106 세포 / 항체를 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (총 3 세트)에 설정합니다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포 펠릿을 고정가능한 생/사 얼룩을 함유하는 50 μL의 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 얼룩을 준비하십시오.
- 세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포 펠렛을 5 μg/mL의 항-마우스 CD16/32 항체를 함유하는 25μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 4°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.
- 표 1에 열거된 항체 조합을 함유하는 25 μL의 차가운 FACS 완충액을 세포에 첨가한다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오.
참고: 항체 염색을 위한 FACS 완충액의 총 부피는 50 μL이다. 따라서, 항체의 마스터 믹스를 25 μL로 제조할 때, 항체의 농도는 최종 농도의 두 배가 되어야 한다. - 세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 150 μL의 추가 FAC 완충액을 함유하는 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 옮긴다. 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 즉시 분석하십시오.
참고: 다음 단계를 사용한 셀 고정을 통해 나중에 샘플을 분석할 수 있습니다. - 단계 6.7.에 이어서, 샘플을 PBS 중의 1% 파라포름알데히드의 100 μL로 재현탁시켰다.
- 샘플을 빛으로부터 보호된 15분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 4°C에서 저장하고, 빛으로부터 보호한다. 72 h 이내에 샘플을 분석하십시오.
7. 사이토카인 및 케모카인 검출을 위한 멀티플렉스 비드 어레이
참고: 상업적으로 입수가능한 전염증성 케모카인 및 염증 멀티플렉스 패널( 표 참조)은 제조자 프로토콜에 따라 tMCAO 유도에 따라 폐에서 케모카인 및 사이토카인의 발현을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는도 13에 상세히 기술되어 있다.
- 간단히 말해서, 분석물을 얼음 상에서 해동시키면 조직 균질화 후 -80°C에서 보관하였다. 샘플을 사용하기 전에 4°C에서 2분 동안 590 x g 에서 원심분리하여 임의의 잔류 조직을 제거하였다.
- 10ng/mL의 알려진 농도에 있는 표준 칵테일(C7)을 7개의 표준(C1-6)으로 연속적으로 희석하여 표준 곡선을 생성하고, 마지막 표준은 분석 버퍼 단독(C0)입니다.
- 모든 시약을 실온으로 가온한 후, 각 표준 25μL와 분석 완충액 25μL를 V 하부 96웰 플레이트에 첨가한다.
- 각 샘플 웰에 25 μL의 폐 균질물 (분석물) 및 25 μL의 분석 완충액을 V 하부 96 웰 플레이트에 첨가한다.
- 예비코팅된 비드를 격렬하게 볼텍스한 다음, 25μL의 예비코팅된 비드를 각각의 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.
- 플레이트를 밀봉하고 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 110 rpm으로 흔들었다.
- 230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 1x에서 세척 완충액 200μL를 첨가한다(원액은 20x, 물로 1x로 희석). 1분 동안 인큐베이션한다.
- 230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 표준 및 샘플을 25 μL 검출 항체로 재현탁시킨다.
- 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 플레이트를 실온에서 1 h 동안 110 rpm으로 진탕한다.
- 25 μL의 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE)을 각 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.
- 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 실온에서 30분 동안 110rpm으로 흔들어 주십시오.
- 플레이트를 230 x g 에서 5분 동안 회전시킨다. 표준 및 샘플을 1x 세척 완충액에 재현탁한다.
- 웰 라벨링된 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 150 μL의 1x 세척 완충액을 추가로 함유한다.
- 유세포 분석기를 사용하여 표준 및 샘플에 대한 PE 신호 형광 강도를 결정한다.
- 미리 결정된 농도에 대해 PE의 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인에 대한 표준 곡선을 구성한다.
- 각 샘플로부터의 표준 곡선 및 MFI를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인의 농도를 결정한다. 멀티플렉스 패널은 각 분석물의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있는 데이터 분석 소프트웨어를 제공합니다. apical/superior lobe의 무게는 조직의 밀리그램 당 사이토카인 또는 케모카인의 농도를 결정하는 데 사용됩니다.
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Representative Results
우리는 최근에 마우스에서 허혈성 뇌졸중 유도가 폐11의 면역 세포 조성을 변화시킨다고보고했다. 구체적으로, 일과성 뇌 허혈은 폐포 대식세포, 호중구 및 CD11b+ DC의 백분율을 증가시켰고, 폐 구획에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 호산구의 백분율을 감소시켰다. 또한, 세포 변화는 폐에서 여러 케모카인의 상당히 감소된 수준에 상응했다. 여기에 기재된 것은 폐 구획에서 상이한 면역 세포 집단의 단리 및 동정을 위한 방법이다. 여기에 나타난 대표적인 결과는 tMCAO 유도 및 가짜 수술을 받은 마우스로부터의 것이었다.
우리는 5-7 개의 항체를 포함하는 각 세트와 3 세트의 항체 조합을 사용하여 폐 (L1-L13)에서 13 개의 다른 면역 세포 집단을 확인했습니다 (그림 1). 죽은 세포는 각 세트에서 LIVE/DEAD 염색을 사용하여 배제하였다. 상이한 면역 세포 유형을 구별하기 위한 항체 및 마커는 표 1에 열거되어 있다. 폐포 및 간질성 대식세포, CD103+ DC, CD11b+ DCs, 및 호산구는 세트 1에서 확인되었다(도 1A, B). 전염증성 단핵구 및 호중구는 세트 2에서 확인되었다(도 1C). 염증 반응 동안, 단핵구는 염증 부위로 이동하며, 여기서 이들 세포는 단핵구 유래 항원 제시 세포 (mo-APCs)14로 분화된다. Ly6C 및 CCR2의 하향조절은 단핵구 분화의 특징이며, 이는 세트 215를 사용하여 평가될 수 있다. CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, 혈장 세포질 DCs, NK 세포, 및 NKT 세포를 세트 3을 사용하여 동정하였다 (도 1D).
우리의 단일 세포 분리 프로토콜의 품질을 결정하기 위해, 우리는 수동 방법을 사용하여 분리 된 생존 가능한 세포와 CD45+ 면역 세포의 수를 상업적으로 이용 가능한 조직 해리기를 사용하여 분리 된 세포와 비교했습니다 (자료 표 참조), 조직에서 세포를 분리하는 데 자주 사용되는16,17,18,19,20 . 후자의 프로토콜에서, 폐 엽을 해리 완충액의 주사 후 해리기 특이적 튜브 (물질의 표 참조)로 옮기고, 조직은 37C_m_LDK_1 프로그램을 사용하여 소화되었다. 생존 세포의 총 수, CD45+ 세포의 백분율, 및 수득된 CD45+ 세포의 총 수는 두 방법 사이에서 필적하였다 (도 2A-C). 두 프로토콜을 모두 사용한 CD45+ 세포 중 세포 사멸의 백분율은 ~10%였다(도 2D). 이러한 결과는 여기에 제시된 프로토콜이 자동화 된 조직 해리제의 도움없이 높은 수율과 품질로 세포 회복을 허용한다는 것을 시사합니다.
유세포 분석과 결합된 상업적으로 이용가능한 멀티플렉스 분석법을 사용하여 25 μL의 샘플을 사용하여 13개의 케모카인의 농도를 결정하였다(도 3). 두 가지 크기의 비드가 FSC/SSC에 의해 처음 확인되었습니다(그림 3A). 각각의 비드는 APC 채널에서의 형광 강도에 의해 구별될 수 있는 6-7개의 일차 항체로 코팅된다(도 3B). 샘플에서 케모카인의 수준은 MFI에 의해 결정될 수 있는 PE 채널에서의 형광 강도에 비례한다(도 3C). 각 케모카인의 MFI 값을 알려진 케모카인 농도로 구성된 표준 곡선과 비교함으로써, 샘플 내의 농도(조직 mg 당)를 결정할 수 있다.
도 1: 허혈성 뇌졸중 후 콜라게나제 D로 조직 소화 후 폐로부터 13개의 면역 세포 유형의 확인. 폐 조직은 tMCAO 또는 가짜 조작 후 24시간 동안 적출되었고, 폐의 면역 세포는 표 1에 열거된 표면 마커에 의해 정의된 유세포 분석기에 의해 분석되었다. (a) 항체 세트 1에서, CD45+ 생존 세포 (*)를 먼저 Siglec F 및 CD11b 상에 게이팅하여 CD11c 및 MHC II를 발현하는 폐포 대식세포 (L1), 및 CD11c 및 MHC II를 발현하지 않은 호산구 (L2)를 동정하였다. (B) A에서 Siglec F-집단 내 세포(**)를 게이팅한 다음, CD103 및 CD11b의 발현을 결정하였다. 세포를 CD11c 및 MHC II의 발현을 결정하기 위해 추가로 게이팅하였다. CD103+ DC는 CD11c 및 MHC II(L3)를 모두 발현했지만 CD64는 발현하지 않았다. CD11bhi 집단(****)을 CD64 및 MHC II의 발현을 결정하기 위해 추가로 게이팅하였다. CD11b+ DC는 MHC II를 발현하지만 CD64(L4)는 발현하지 않은 반면, 간질성 대식세포(L5)는 두 마커 모두를 발현하였다. (c) 항체 세트 2에서, A에서 CD45+ 생존 세포를 CD11b 및 Ly6C의 발현을 결정하기 위해 게이팅하였다. Ly6Chi 세포(*)는 높은 수준의 CCR2 발현을 유지하는 미분화 단핵구(L6, 중간 플롯)를 나타내는 반면, Ly6C 낮은 세포(**)는 Ly6G-(L6, 오른쪽 플롯) 및 Ly6G+ 호중구(L7)인 분화 단핵구의 혼합 집단을 포함하였다. (d) 항체 세트 3에서, A에서 CD45+ 생존 세포를 B 세포 (L8) 및 혈장 세포질 세포질 DCs (L9)를 확인하기 위해 CD11c 및 B220의 발현을 결정하기 위해 게이팅하였다. 이어서, CD11c- 및 B220-집단(*)을 게이팅하여 CD4+ T 세포(L10) 및 CD8+ T 세포(L11)를 동정하기 위해 CD4 및 CD8의 발현을 확인하였다. CD4-CD8-집단(**)을 NK 세포(L12) 및 NKT 세포(L13)를 확인하기 위해 NK1.1 및 TCRb의 발현을 결정하기 위해 추가로 게이팅하였다. tMCAO 및 가짜 조작에 뒤따르는 12마리의 C57BL/6J 마우스로부터의 대표적인 플롯이 도시되어 있다. 그림의 일부는 이전에 출판 된 문헌11 에서 허가를 받아 재 인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수동 해리 방법과 폐에서 단일 세포를 분리하기 위한 조직 해리제 사용 간의 비교. (A-C) 총 세포 수, CD45+ 세포의 백분율, 및 CD45+ 세포의 총 수를 비교하였다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 결합 결과를 나타내었다. NS: 통계적으로 유의하지 않습니다. (d) 단리 후 죽은 CD45+ 세포의 백분율을 결정하기 위한 대표적인 플롯. 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 플롯들이 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 허혈성 뇌졸중은 폐에서 여러 케모카인의 생성을 억제합니다. (A-C) 멀티플렉스 비드 어레이에 의한 폐에서 13개의 케모카인의 수준을 결정하는 것을 보여주는 대표적인 플롯. (A) FSC/SSC 게이트는 크기가 다른 비드 A와 B를 식별하는데 사용되었다. (b) 비드 상에 코팅된 일차 항체는 APC 채널에서의 형광 강도에 의해 구별될 수 있었다. (c) 샘플 내의 케모카인의 수준은 PE 채널에서의 형광 강도에 비례하였다. 가짜 조작 후 12마리의 C57BL/6J 마우스로부터의 대표적인 플롯이 도시되어 있다. (d) 폐 조직을 tMCAO 또는 가짜 오페비비에 이어 24시간 동안 균질화시켰다. 개별 동물의 폐에서 13개의 케모카인의 수준은 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 결정되었다. 나타낸 데이터는 그룹당 n=11-12마리의 동물을 사용한 세 개의 독립적인 실험으로부터의 결합 결과이다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; , P < 0.001. NS, 통계적으로 다르지 않습니다. 그림의 일부는 이전에 출판 된 문헌11 에서 허가를 받아 재 인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체 | 클론 | 면역 세포 유형 | 인구 | 표면 마커 표현식 |
| CD45-FITC | 30-F11 | 알벨로아르 대식세포 | L1 | CD45+ 시글렉 F+ CD11b- |
| 시글렉 F-PE | E50-2440 | 호산구 | L2 | CD45+ 시글렉 F+ CD11b+ |
| CD11c-퍼cp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DC | L3 | CD45+ 시글렉 F-CD11b-CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ DC | L4 | CD45+ 시글렉 F-CD11b hi CD103- CD64-MHC II+ |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | 간질성 대식세포 | L5 | CD45+ 시글렉 F-CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| 라이브/데드-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | 단핵구/moDC | L8 | CD45+ CD11b hi Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | 홍콩 1.4 | 호중구 | L9 | CD45+ CD11b hi Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| 라이브/데드-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | 혈장 세포질 DCs | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | B 세포 | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-퍼cp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T 세포 | L10 | CD45+ B220- CD11c-CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | CD8+ T 세포 | L11 | CD45+ B220- CD11c-CD4- CD8+ |
| APC-B220 | RA3-6B2 | NK 세포 | L12 | CD45+ B220- CD11c-CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1.5 | NKT 세포 | L13 | CD45+ B220- CD11c-CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| 라이브/데드-APC/Cy7 |
표 1: tMCAO 후 폐로부터 단리된 면역 세포를 결정하기 위한 표면 마커 및 항체 조합물.
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Discussion
여기에 기술된 프로토콜은 폐 면역 세포 유형의 확인 및 동일한 마우스에서 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 허용한다. 조직병리학 연구가 바람직한 경우, 단일 세포 분리 단계로 진행하기 전에 개별 엽을 제거하고 그 목적을 위해 고정시킬 수 있다. 이 방법의 한 가지 한계는 면역 세포 조성의 변화와 케모카인 및/또는 사이토카인의 발현이 폐의 상이한 엽 사이에 불평등하게 분포될 것으로 예상되는 경우 일부 질병 설정에서 이 접근법이 적합하지 않을 수 있다는 것이다. 예를 들어, Mycobacterium tuberculosis 와 같은 일부 박테리아는 폐(21)의 특정 엽을 감염시키는 경향을 나타낸다. 이 경우 로브 간의 비교가 필요할 수 있습니다.
폐로부터의 단일 세포 분리 프로토콜의 농도, 배양 시간 및 온도는 폐로부터의 면역 세포의 회복에 중대한 영향을 미친다. 콜라게나제 D의 품질은 최적의 결과를 얻는 데 중요하며 콜라게나제 D의 다른 공급원을 사용하는 경우 테스트해야 합니다. 조직의 과잉 소화는 세포 사멸의 증가를 초래한다; 반면, 조직의 소화 부족은 면역 세포, 특히 대식세포 및 DC의 낮은 수율을 유발합니다.
우리는 3 개의 항체 조합을 사용하여 폐의 13 개의 면역 세포 집단을 결정했으며, 각 세트에는 5-7 개의 항체와 LIVE / DEAD 염색이 포함되어 있습니다. 각 세트의 항체는 샘플로부터 수득된 세포의 수가 제한되는 경우에 조합될 수 있다. 그러나, 항체의 수가 증가될 때 발생하는 한 가지 주요 문제점은 유세포 분석기 상의 형광 신호의 보상이 특히 염증 조건 하에서 세포를 골수성 혈통과 구별할 때 어려울 수 있다는 것이다. 추가의 항체 칵테일은 폐(22,23)에서의 면역 반응에 기여하는 선천적 림프성 세포 및 γδ T 세포와 같은 단일 세포 현탁액 내의 다른 선천적 면역 세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 폐의 한 엽이 멀티플렉스 어레이를 위해 취해지기 때문에, 폐에 있는 각 세포 유형의 정확한 수는 결정적으로 결정되고 비교될 수 없으며, 이것은 이 방법의 한계를 구성한다. 이를 해결하기 위해, 정의된 수의 세포가 가짜 및 tMCAO-유도된 마우스의 폐로부터 단리될 수 있다. 이 경우, 각 면역 세포 유형의 절대 수는 두 그룹 간에 정확하게 비교될 수 있다. 추가적으로, 이 방법은 폐에서 면역 세포의 국소화가 결정되는 것을 허용하지 않는다. 이는 폐 절편에서 면역조직화학을 수행함으로써 달성될 수 있다.
결론적으로,이 프로토콜은 폐 면역에서 허혈성 뇌졸중의 효과를 조사하는 데 사용되었지만 감염 및 알레르기와 같은 다른 질병 모델을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 P20 GM109098과 Praespero에서 Edwin Wan까지의 혁신 상 프로그램에 의해 지원되었습니다. 유세포 측정 실험은 NIH grants S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 및 P20 GM103434에 의해 지원되는 WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
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