Summary
Este protocolo describe el uso de la citometría de flujo para identificar los cambios en la composición de las células inmunitarias, el perfil de citoquinas y el perfil de quimiocinas en el entorno pulmonar después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media, un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico.
Abstract
La expansión, activación y tráfico de células inmunes a los pulmones, que están controlados por la expresión de múltiples citoquinas y quimiocinas, pueden verse alterados por una lesión cerebral grave. Esto se evidencia por el hecho de que la neumonía es una causa importante de mortalidad en pacientes que han sufrido un accidente cerebrovascular isquémico. El objetivo de este protocolo es describir el uso del análisis citométrico de flujo multicolor para identificar 13 tipos de células inmunes en los pulmones de ratones, incluidos macrófagos alveolares, macrófagos intersticiales, células dendríticas (DC) CD103 + o CD11b +, CD plasmocitoides, eosinófilos, monocitos / células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T y B derivadas de linfoides, células NK y células NKT, después de la inducción isquémica de accidente cerebrovascular por oclusión transitoria de la arteria cerebral media. Además, describimos la preparación de homogeneizados pulmonares utilizando un método de homogeneización de perlas, para determinar los niveles de expresión de 13 citoquinas o quimiocinas diferentes simultáneamente mediante matrices de perlas multiplex junto con análisis citométrico de flujo. Este protocolo también se puede utilizar para investigar la respuesta inmune pulmonar en otros entornos de enfermedades, como la enfermedad pulmonar infecciosa o la enfermedad alérgica.
Introduction
Los pulmones son un órgano barrera, expuestos al ambiente externo y, por lo tanto, están constantemente recibiendo desafíos inmunológicos como patógenos y alérgenos1. La activación de las células inmunes residentes en los pulmones y la infiltración de células inmunes de la periferia son necesarias para eliminar los patógenos del entorno pulmonar. Además, las células inmunes residentes en los pulmones mantienen la tolerancia a las bacterias comensales, lo que sugiere que estas células desempeñan un papel en la eliminación de patógenos y en el mantenimiento de la homeostasis1. Los macrófagos alveolares e intersticiales se encuentran entre las células inmunes centinela residentes en los pulmones que detectan patógenos a través de receptores de reconocimiento de patrones y eliminan estos patógenos por fagocitosis2. Las células dendríticas residentes en los pulmones unen la respuesta inmune innata y adaptativa a través de la presentación del antígeno3. Además, las células inmunes innatas locales activadas producen citoquinas y quimiocinas que amplifican la respuesta inflamatoria y estimulan la infiltración de células inmunes como monocitos, neutrófilos y linfocitos en los pulmones1. Se ha demostrado que el accidente cerebrovascular isquémico modifica la inmunidad sistémica y conduce a una mayor susceptibilidad a la infección pulmonar; Sin embargo, pocos estudios han evaluado el compartimento pulmonar después del accidente cerebrovascular isquémico, aunque algunos estudios lo han examinado durante condiciones inflamatorias 4,5,6,7,8,9. El objetivo de los métodos descritos en este documento es determinar simultáneamente la patología pulmonar, la composición de las células inmunes y los niveles de expresión de citoquinas y quimiocinas en los pulmones para evaluar las alteraciones en el compartimiento pulmonar y evaluar las posibles alteraciones en la respuesta inmune pulmonar después del ataque isquémico.
Aquí se describe un protocolo para obtener suspensiones de células individuales de los pulmones de los ratones para identificar 13 tipos de células inmunes. Este protocolo se basa en la digestión de tejidos con colagenasa D sin necesidad de un disociador tisular automatizado. Además, desarrollamos un protocolo para preparar homogeneizados tisulares que se pueden usar para determinar los niveles de expresión de 13 citoquinas o quimiocinas diferentes utilizando matrices de perlas multiplex basadas en citometría de flujo. Este protocolo se utilizó con éxito para investigar los efectos del accidente cerebrovascular isquémico en la inmunidad pulmonar y también se puede utilizar en otros modelos de enfermedad.
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Protocol
Todos los protocolos y procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de West Virginia. Los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos en el vivero de la Universidad de Virginia Occidental.
1. Preparación de soluciones
- Preparar tampón de perfusión (solución salina tamponada con fosfato, PBS). Use aproximadamente dos alícuotas de 10 ml de PBS helado por ratón.
- Preparar el medio de células pulmonares/tampón FACS. El tampón del FACS contiene PBS suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 1%. Mantener el medio frío durante todo el proceso de escisión y transferencia pulmonar. Preparar aproximadamente 8 ml por muestra de pulmón. Prepare un medio fresco/tampón FACS antes de los experimentos.
- Preparar el tampón de disociación para el aislamiento de una sola célula. El tampón contiene 1 mg/ml de colagenasa D y 200 μg/ml de DNasa I en la solución salina tamponada de Hank (HBSS). Preparar fresco de la solución madre (100 mg/ml de colagenasa D y 10 mg/ml de DNasa I) antes de los experimentos. Se necesitan aproximadamente 6 ml por muestra pulmonar. Asegúrese de que el tampón alcance la temperatura ambiente antes de su uso.
- Preparar el tampón de homogeneización para la homogeneización del tejido pulmonar. El tampón contiene PBS y 1x cóctel de inhibidores de proteinasa y fosfatasa (stock = 100x). Recién preparado antes de los experimentos. Mantenga el tampón frío durante todo el proceso de homogeneización. Aproximadamente 200 μL del tampón es suficiente para homogeneizar un solo lóbulo derecho de los pulmones.
2. Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO)
NOTA: Los procedimientos para tMCAO a través de la inserción de monofilamento en la arteria cerebral media se documentaron en detalle previamente10. En estos experimentos, se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de 8 a 12 semanas de edad, con un peso de 25-30 g.
- En resumen, administrar por vía subcutánea 2 mg/kg de meloxicam a los ratones antes de la cirugía. Anestesiar profundamente a los ratones en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 5%. Confirme la anestesia profunda utilizando el método de pellizco del dedo del pie. Mantener la anestesia con isoflurano al 1-2% durante la cirugía utilizando un cono nasal. Mantenga la temperatura corporal a 36.5 - 38 ° C durante todo el procedimiento colocando una manta caliente debajo de los ratones. Todas las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas en autoclave un día antes de la cirugía.
- Afeite y prepare la piel del cuello ventral con etanol al 70% seguido de exfoliante de clorhexidina. Administrar por vía subcutánea 2 mg/kg de bupivacaína sobre el área de la incisión antes de hacer la primera incisión. Use ungüento para los ojos para cubrir los ojos y prevenir la sequedad. Haga una incisión en la línea media del cuello. Retire suavemente los tejidos blandos alrededor de la tráquea.
- Identificar la arteria carótida común izquierda y la arteria carótida externa.
- Aplique una sutura temporal (tamaño 6/0) a la arteria carótida común para detener el flujo de la sangre. Haga una incisión en la arteria carótida externa.
- Inserte un monofilamento recubierto de goma de silicona (tamaño 6-0) en la arteria carótida externa, luego avance el monofilamento a la arteria cerebral media. Dejar el monofilamento en la arteria cerebral media durante 60 min (oclusión).
- Controle la tasa de flujo sanguíneo utilizando la flujometría láser Doppler. Una reducción en la tasa de flujo a la arteria cerebral media que es > 80% indica una oclusión exitosa.
- Después de los 60 minutos de oclusión, retire el monofilamento para permitir que ocurra la reperfusión. Cierre la incisión.
- En ratones operados con simulacro, realice los pasos 2.1-2.6 sin la inserción del monofilamento. En estos ratones, la tasa de flujo sanguíneo debe permanecer estable durante todo el procedimiento.
- Monitorizar diariamente los ratones y medir los déficits neurológicos utilizando criterios de puntuación estándar11. 0 – sin déficit neurológico; 1 – retrae la pata delantera contralateral cuando se levanta por la cola; 2- círculos a la contralateral cuando se levanta por la cola; 3- caer a la contralateral mientras camina; 4 – no camina espontáneamente o está en coma; 5 – muerto.
- Proporcionar inyecciones subcutáneas de solución salina normal y analgésico (meloxicam, 2 mg/kg) cada 24 horas durante 3 días después de la cirugía.
- Aislar los pulmones 24 y 72 h después de tMCAO para el análisis posterior.
3. Recolección de los tejidos pulmonares
- Anestesiar profundamente al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina. Confirme la anestesia profunda utilizando el método de pellizco del dedo del pie.
- Para realizar la perfusión transcárdica de todo el cuerpo12, fije el ratón a la plataforma quirúrgica y moje el pelaje con etanol al 70% para reducir la distribución del pelaje en la cavidad corporal. Use tijeras de disección fina para hacer una incisión transversal en el abdomen caudal y luego una incisión en la línea media del peritoneo, deteniéndose en la cavidad torácica antes de perforar el diafragma.
- No corte a través del músculo/piel en la cavidad peritoneal y no continúe la incisión más allá del abdomen.
- Detenga la incisión tan pronto como se haya alcanzado la cavidad torácica antes de perforar el diafragma. Tenga cuidado de no dañar el corazón y los pulmones que puedan comprometer la calidad de la perfusión o la recuperación celular
- Usando tijeras de disección fina haga una incisión en la línea media del peritoneo deteniéndose en la cavidad torácica antes de perforar el diafragma.
- Agarre al ratón por el extremo distal del esternón con fórceps y levántelo hacia arriba mientras corta a través del diafragma asegurándose de no dañar el corazón, los pulmones o la vasculatura. Una vez que los órganos sean visibles, haga una incisión a través de la caja torácica y separe y fije la caja de la costilla para que el corazón y los pulmones estén completamente expuestos.
- Haga con cuidado una pequeña incisión en la aurícula derecha cerca del arco aórtico. Esto servirá como salida para la perfusión.
- Inmediatamente después, inserte suavemente una aguja de 25 G x 5/8 conectada a una jeringa llena con 10 ml de PBS frío en la superficie superior distal del ventrículo izquierdo. Tenga cuidado de no insertarse a través del tabique ventricular en el ventrículo derecho. La aguja apenas debe insertarse en el ventrículo izquierdo.
NOTA: Si se perfora el tabique ventricular, el líquido saldrá corriendo de la nariz del ratón. Esto disminuirá la calidad de la perfusión y dará lugar a la pérdida de células. - Si se desea, se puede usar una pinza para mantener la aguja firmemente en su lugar en el ventrículo izquierdo durante la perfusión.
- Empuje de manera constante pero suave 10 ml de PBS frío en el corazón. El tejido del ratón debe comenzar a perfundir y limpiar la sangre a medida que el líquido sale de la aurícula derecha.
- Empuje una segunda alícuota de 10 ml de PBS hasta que se haya producido suficiente aclaramiento sanguíneo. El hígado tendrá una apariencia marrón claro y los pulmones pasarán de un color rosa rojizo a un color mayormente blanco.
- Usando fórceps y tijeras de disección fina, retire cuidadosamente todos los tejidos circundantes, incluidos el corazón, la tráquea, el esófago, el timo, el tejido conectivo, los ganglios linfáticos y los bronquios grandes.
- Separe los lóbulos pulmonares individuales y coloque los lóbulos en una placa de Petri sobre hielo que contenga una alícuota de 1-2 ml de medio de células pulmonares frías.
4. Homogeneización del tejido pulmonar para matrices de perlas multiplex utilizando homogeneizador de perlas
- Preenfríe un tubo de tapón de rosca cónico de 2 ml que contenga 3 perlas estériles de zirconia/sílice de 2,3 mm. Añadir 200 μL de tampón de homogeneización en frío al tubo.
- Pesar el lóbulo, transferir el lóbulo al tubo cónico preenfriado que contiene las perlas y el tampón de homogeneización.
NOTA: Aproximadamente 50-100 mg de tejido homogeneizado en 200 μL de tampón serán suficientes para detectar la expresión de citoquinas y quimiocinas en la muestra.- Homogeneice el lóbulo usando un homogeneizador a base de cuentas (consulte la Tabla de materiales) a 4,000 rpm durante 2 min.
- Asegúrese de que el tejido esté completamente homogeneizado. Aumente el tiempo si es necesario.
- Después de la homogeneización, centrifugar el tubo en una microcentrífuga preenfriada (4 °C) a 15.870 x g durante 3 min.
- Transfiera los sobrenadantes a un microtubo preenfriado de 1,5 ml.
- Coloque la muestra directamente sobre hielo para su uso inmediato o guárdela a -80 °C para usarla en el futuro. Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación.
5. Disociación del tejido pulmonar y aislamiento unicelular
- Vierta el medio de células pulmonares de los lóbulos pulmonares restantes para evitar la dilución del tampón de disociación. Luego, inserte cuidadosamente una jeringa de 1 ml con 25G y una aguja de 5/8 que contenga 1 ml del tampón de disociación en el tejido pulmonar.
- Inyecte pequeñas fracciones (aproximadamente 1/4a 1/5ª) del tampón de disociación en cada lóbulo pulmonar e infle suavemente.
NOTA: La mayor parte del búfer se precipitará poco después de inflarse ya que el lóbulo ha sido extirpado. - Repita la inyección del tampón de disociación 1-2x.
- Incubar los lóbulos pulmonares con tampón de disociación durante 2 min a temperatura ambiente.
- Picar finamente los lóbulos pulmonares en trozos pequeños con tijeras de disección fina.
- Transfiera las piezas pulmonares picadas con el tampón de disociación a un tubo centrífugo de 15 ml. Suplemento con tampón de disociación adicional hasta un total de 6 mL. Vórtice vigorosamente durante 1 min.
- Incubar la muestra durante 45 min a 37 °C. Vórtice vigorosamente cada 7-8 min.
- Después de 45 minutos de incubación, vortex la muestra vigorosamente durante 1 minuto para obtener resultados óptimos.
- Disocie aún más la muestra pasando a través de un filtro de células de 100 μm para eliminar el tejido conectivo e intersticial residual, no deseado.
- Centrifugar la muestra durante 10 min a 380 x g, desechar el sobrenadante.
- Agregue 5 ml de medio de células pulmonares frías a la muestra. Resuspender el pellet celular mediante un vórtice suave.
- Centrifugar la muestra durante 10 min a 380 x g, desechar el sobrenadante.
- Agregue 1 ml de medio de células pulmonares frías. Resuspender el pellet celular mediante un vórtice suave.
- Pasar a través de un filtro de células de 100 μm y contar células.
6. Análisis citométrico de flujo para el nicho de células inmunes pulmonares
- Semilla 1-2 x 106 células/anticuerpo colocadas en una placa inferior redonda de 96 pocillos (3 juegos en total). Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
- Resuspender el pellet celular en 50 μL de PBS frío que contenga tinción viva/muerta reparable. Prepare la mancha de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Incubar las celdas a 4 °C durante 20 min protegidas de la luz. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
- Resuspender el pellet celular con 25 μL de tampón FACS frío que contenga 5 μg/ml de anticuerpo CD16/32 anti-ratón. Incubar a 4 °C durante 10-15 min.
- Añadir a las células 25 μL de tampón FACS frío que contenga las combinaciones de anticuerpos enumeradas en la Tabla 1 . Mezclar con un suave pipeteo.
NOTA: El volumen total del tampón FACS para la tinción de anticuerpos es de 50 μL. Por lo tanto, cuando se prepara una mezcla maestra de anticuerpos en 25 μL, la concentración de anticuerpos debe ser el doble de la concentración final. - Incubar las celdas a 4 °C durante 20 min protegidas de la luz. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
- Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
- Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Transfiera a un tubo FACS de fondo redondo de poliestireno de 5 ml que contenga 150 μL de tampón FAC adicional. Analice la muestra inmediatamente con un citómetro de flujo.
NOTA: La fijación celular mediante los siguientes pasos permite analizar las muestras más adelante. - Después del paso 6.7., resuspender la muestra con 100 μL de paraformaldehído al 1% en PBS.
- Incubar la muestra a 4 °C durante 15 min protegida de la luz. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
- Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
- Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Conservar las células a 4 °C, protegidas de la luz. Analizar la muestra en un plazo de 72 h.
7. Conjuntos de perlas multiplex para la detección de citoquinas y quimiocinas
NOTA: Se utilizaron paneles multiplex de quimiocinas proinflamatorias e inflamación disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales) para determinar la expresión de quimiocinas y citocinas en los pulmones después de la inducción de tMCAO de acuerdo con el protocolo del fabricante, que se ha descrito en detalle13.
- En resumen, descongelar los analitos en hielo si se almacenaron a -80 °C después de la homogeneización del tejido. Centrifugar la muestra a 590 x g durante 2 min a 4 °C antes de utilizarla para extraer cualquier tejido residual.
- Genere una curva estándar diluyendo en serie el cóctel estándar (C7) que está a una concentración conocida de 10 ng / ml en 7 patrones (C1-6) con el último estándar siendo solo el tampón de ensayo (C0).
- Una vez que todos los reactivos se hayan calentado a temperatura ambiente, agregue 25 μL de cada patrón y 25 μL de tampón de ensayo a una placa de pocillos de 96 en el fondo de V.
- A cada pocillo de muestra, agregue 25 μL de homogeneizado pulmonar (analito) y 25 μL de tampón de ensayo a una placa de pocillos de 96 en el fondo de V
- Vortex las perlas pre-recubiertas vigorosamente, luego agregue 25 μL de perlas pre-recubiertas a cada uno de los pocillos estándar y de muestra.
- Selle la placa y protéjala de la luz cubriéndola con papel de aluminio. Agitar la placa a 110 rpm durante 2 h a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 230 x g durante 5 min. Añadir 200 μL de tampón de lavado a 1x (la solución madre es 20x, diluir a 1x con agua). Incubar durante 1 min.
- Centrifugar a 230 x g durante 5 min. Resuspender el patrón y muestrear con anticuerpos de detección de 25 μL.
- Selle y cubra la placa para protegerla de la luz. Agitar la placa a 110 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Agregue 25 μL de estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) a cada patrón y muestree bien.
- Selle y cubra la placa para protegerla de la luz. Agitar a 110 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.
- Gire la placa a 230 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el estándar y las muestras en 1x tampón de lavado.
- Transfiera a un tubo FACS de fondo redondo de poliestireno bien etiquetado de 5 ml que contenga 150 μL adicionales de 1x tampón de lavado.
- Determine la intensidad de fluorescencia de la señal de PE para los patrones y las muestras utilizando un citómetro de flujo.
- Construya una curva estándar para cada quimiocina y citoquina utilizando la intensidad media de fluorescencia (MFI) de PE contra las concentraciones predeterminadas.
- Determine la concentración de cada quimiocina y citoquina utilizando la curva estándar y la IMF de cada muestra. El panel multiplex proporciona un software de análisis de datos que se puede utilizar para determinar la concentración de cada analito. El peso del lóbulo apical/superior se utiliza para determinar la concentración de citoquinas o quimiocinas por miligramo de tejido.
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Representative Results
Recientemente informamos que la inducción isquémica del accidente cerebrovascular en ratones altera la composición de las células inmunes de los pulmones11. Específicamente, la isquemia cerebral transitoria aumentó los porcentajes de macrófagos alveolares, neutrófilos y CD11b + DC, mientras que disminuyó los porcentajes de células T CD4 +, células T CD8 +, células B, células NK y eosinófilos en el compartimiento pulmonar. Además, la alteración celular correspondió a niveles significativamente disminuidos de quimiocinas múltiples en los pulmones. Aquí se describe un método para el aislamiento y la identificación de diferentes poblaciones de células inmunes en el compartimiento pulmonar. Los resultados representativos mostrados aquí fueron de ratones que se habían sometido a la inducción de tMCAO y una operación simulada.
Identificamos 13 poblaciones diferentes de células inmunes en los pulmones (L1-L13) utilizando 3 conjuntos de combinaciones de anticuerpos con cada conjunto que contiene 5-7 anticuerpos (Figura 1). Las células muertas se excluyeron utilizando una tinción VIVA/MUERTA en cada conjunto. Los anticuerpos y marcadores para distinguir diferentes tipos de células inmunes se enumeran en la Tabla 1. Los macrófagos alveolares e intersticiales, CD103+ DCs, CD11b+ DCs y eosinófilos fueron identificados en el Conjunto 1 (Figura 1A,B). Los monocitos proinflamatorios y neutrófilos se identificaron en el Conjunto 2 (Figura 1C). Durante las respuestas inflamatorias, los monocitos migran al sitio de la inflamación, donde estas células se diferencian en células presentadoras de antígenos derivados de monocitos (mo-APCs)14. La regulación a la baja de Ly6C y CCR2 es característica de la diferenciación de monocitos, que puede evaluarse utilizando el Conjunto 215. Las células T CD4+, las células T CD8+, las células B, las DC plasmocitoides, las células NK y las células NKT se identificaron mediante el Conjunto 3 (Figura 1D).
Para determinar la calidad de nuestro protocolo de aislamiento de células individuales, comparamos el número de células viables y células inmunes CD45+ aisladas usando el método manual con las células aisladas usando un disociador de tejido disponible comercialmente (ver Tabla de materiales), que a menudo se usa para aislar células de tejidos 16,17,18,19,20 . En este último protocolo, los lóbulos pulmonares se transfirieron a un tubo específico para disociadores (ver Tabla de materiales) después de la inyección del tampón de disociación, y el tejido se digirió utilizando el programa 37C_m_LDK_1. El número total de células viables, el porcentaje de células CD45+ y el número total de células CD45+ obtenidas fueron comparables entre los dos métodos (Figura 2A-C). El porcentaje de muerte celular entre las células CD45+ utilizando ambos protocolos fue ~ 10% (Figura 2D). Estos resultados sugieren que el protocolo presentado aquí permite la recuperación celular con alto rendimiento y calidad sin la ayuda de un disociador de tejido automatizado.
Se utilizó un ensayo múltiple disponible comercialmente junto con el análisis citométrico de flujo para determinar la concentración de 13 quimiocinas utilizando 25 μL de muestra (Figura 3). FSC/SSC identificó por primera vez dos tamaños diferentes de cuentas (Figura 3A). Cada perla está recubierta con 6-7 anticuerpos primarios, que podrían distinguirse por la intensidad de fluorescencia en el canal APC (Figura 3B). El nivel de quimiocinas en la muestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia en el canal de PE, que podría determinarse mediante MFI (Figura 3C). Al comparar el valor de MFI de cada quimiocina con la curva estándar construida con concentraciones conocidas de quimiocina, se puede determinar la concentración en la muestra (por mg de tejido).
Figura 1: Identificación de 13 tipos de células inmunes de los pulmones después de la digestión tisular con colagenasa D después de un accidente cerebrovascular isquémico. Los tejidos pulmonares se extirparon 24 h después de la operación tMCAO o simulada, las células inmunes en los pulmones se analizaron mediante citometría de flujo, definida por marcadores de superficie enumerados en la Tabla 1. (A) En el conjunto de anticuerpos 1, las células viables CD45+ (*) se controlaron primero en Siglec F y CD11b para identificar los macrófagos alveolares (L1), que expresaban CD11c y MHC II, y los eosinófilos (L2), que no expresaban CD11c y MHC II. (B) Las células dentro de la población Siglec F- (**) en A fueron entonces activadas para determinar la expresión de CD103 y CD11b. CD103+ CD11b- (***). Las células se controlaron aún más para determinar la expresión de CD11c y MHC II. Los CD103+ DC expresaron CD11c y MHC II (L3) pero no expresaron CD64. La población CD11b hi (****) se limitó aún más para determinar la expresión de CD64 y MHC II. Los CD CD11b+ expresaron MHC II pero no CD64 (L4), mientras que los macrófagos intersticiales (L5) expresaron ambos marcadores. (C) En el conjunto de anticuerpos 2, las células viables CD45+ en A fueron activadas para determinar la expresión de CD11b y Ly6C. Las células Ly6C hi (*) representaron los monocitos indiferenciados que mantuvieron un alto nivel de expresión de CCR2 (L6, gráfico medio), mientras que las células bajas de Ly6C (**) contenían una población mixta de monocitos diferenciadores que eran Ly6G- (L6, gráfico derecho) y neutrófilos Ly6G+ (L7). (D) En el conjunto de anticuerpos 3, las células viables CD45+ en A fueron activadas para determinar la expresión de CD11c y B220 para identificar células B (L8) y DCs plasmocitoides (L9). La población CD11c y B220- (*) se activó para determinar la expresión de CD4 y CD8 para identificar las células T CD4+ (L10) y las células T CD8+ (L11). La población CD4- CD8- (**) se limitó aún más para determinar la expresión de NK1.1 y TCRb para identificar células NK (L12) y células NKT (L13). Se muestran gráficos representativos de 12 ratones C57BL / 6J después de tMCAO y operación simulada. Partes de la figura han sido reimpresas de literatura previamente publicada11 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación entre el método de disociación manual y el uso de disociador tisular para aislar células individuales de los pulmones. (A-C) Se compararon el número total de células, el porcentaje de células CD45+ y el número total de células CD45+. Se muestran los resultados combinados de 3 experimentos independientes. NS: no estadísticamente significativo. (D) Gráficos representativos para determinar el porcentaje de células CD45+ muertas después del aislamiento. Se muestran gráficos representativos de 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El accidente cerebrovascular isquémico suprime la producción de múltiples quimiocinas en los pulmones. (A-C) Gráficos representativos que muestran la determinación del nivel de 13 quimiocinas en los pulmones mediante matriz de perlas múltiples. (A) Se utilizó la puerta FSC/SSC para identificar las cuentas A y B con diferentes tamaños. (B) Los anticuerpos primarios recubiertos en las perlas podrían distinguirse por la intensidad de fluorescencia en el canal APC. (C) El nivel de quimiocinas en la muestra fue proporcional a la intensidad de fluorescencia en el canal de PE. Se muestran gráficos representativos de 12 ratones C57BL / 6J después de una operación simulada. (D) Los tejidos pulmonares se homogeneizaron 24 h después de la operación tMCAO o simulada. El nivel de 13 quimiocinas en los pulmones de animales individuales se determinó mediante una matriz de perlas múltiples. Los datos mostrados son resultados combinados de tres experimentos independientes con n = 11-12 animales por grupo. *, p < 0,05; **, p < 0,01; , P < 0,001. NS, no estadísticamente diferente. Partes de la figura han sido reimpresas de literatura previamente publicada11 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo | Clon | Tipo de célula inmune | Población | Expresión del marcador de superficie |
| CD45-FITC | 30-F11 | Macrófagos alveloares | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinófilos | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DC | L3 | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ DC | L4 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II+ |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | Macrófagos intersticiales | L5 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Vivo/muerto-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monocitos/moDCs | L8 | CD45+ CD11b hi Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Neutrófilos | L9 | CD45+ CD11b hi Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Vivo/muerto-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | DCs plasmocitoides | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | Células B | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | Células T CD4+ | L10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | Células T CD8+ | L11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 | RA3-6B2 | Células NK | L12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1.5 | Células de la NKT | L13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| Vivo/muerto-APC/Cy7 |
Tabla 1: Marcadores de superficie y combinaciones de anticuerpos para determinar las células inmunes aisladas de los pulmones después de tMCAO.
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Discussion
Los protocolos descritos aquí permiten la identificación de tipos de células inmunes pulmonares y la expresión de quimiocinas o citoquinas en el mismo ratón. Si se desea un estudio histopatológico, se puede extraer y fijar un lóbulo individual para ese propósito antes de proceder a los pasos de aislamiento de células individuales. Una limitación de este método es que este enfoque puede no ser adecuado en algunos entornos de enfermedad si se prevé que el cambio en la composición de las células inmunes y la expresión de quimiocinas y / o citoquinas se distribuyan de manera desigual entre los diferentes lóbulos de los pulmones. Por ejemplo, algunas bacterias, como Mycobacterium tuberculosis, muestran predilección por infectar ciertos lóbulos del pulmón21. En este caso, puede ser necesaria una comparación entre lóbulos.
La concentración, el tiempo de incubación y la temperatura del protocolo de aislamiento de células individuales de los pulmones afectan críticamente la recuperación de las células inmunes de los pulmones. La calidad de la colagenasa D es crítica para obtener resultados óptimos y debe probarse si se utiliza una fuente diferente de colagenasa D. La digestión excesiva de los tejidos resulta en un aumento de la muerte celular; mientras que, la digestión insuficiente de los tejidos causa un bajo rendimiento de las células inmunes, especialmente macrófagos y DC.
Utilizamos 3 combinaciones de anticuerpos para determinar 13 poblaciones de células inmunes en los pulmones, con cada conjunto que contiene 5-7 anticuerpos y una tinción VIVA / MUERTA. Los anticuerpos en cada conjunto pueden combinarse si el número de células obtenidas de las muestras es limitado. Sin embargo, un problema importante que surge cuando se aumenta el número de anticuerpos es que la compensación de la señal de fluorescencia en el citómetro de flujo puede ser un desafío, especialmente cuando se distinguen las células del linaje mieloide en condiciones inflamatorias. Se pueden usar cócteles de anticuerpos adicionales para identificar otras células inmunes innatas dentro de la suspensión unicelular, como las células linfoides innatas y las células T γδ, que contribuyen a la respuesta inmune en los pulmones22,23. Dado que se toma un lóbulo del pulmón para la matriz múltiple, el número exacto de cada tipo de célula en los pulmones no se puede determinar y comparar definitivamente, y esto constituye una limitación de este método. Para abordar esto, se puede aislar un número definido de células de los pulmones de ratones simulados e inducidos por tMCAO. En este caso, el número absoluto de cada tipo de célula inmune se puede comparar con precisión entre los dos grupos. Además, este método no permite determinar la localización de las células inmunes en el pulmón. Esto se puede lograr realizando inmunohistoquímica en secciones pulmonares.
En conclusión, este protocolo se utilizó para investigar el efecto del accidente cerebrovascular isquémico en la inmunidad pulmonar, pero también se puede utilizar para estudiar otros modelos de enfermedad, como la infección y las alergias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención P20 GM109098 de los NIH y el Programa de Premios a la Innovación de Praespero a Edwin Wan. Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en la WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, que cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 y P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
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