I dette arbejde leverer vi en protokol til biofunktionalisering af magnetiske nanomaterialer med antistoffer til specifik cellemålretning. Som eksempler bruger vi jern nanotråde til at målrette kræftceller.
Magnetiske nanomaterialer har fået stor opmærksomhed i forskellige biomedicinske anvendelser. Biofunktionalisering af disse nanomaterialer med specifikke målretningsmidler er et afgørende aspekt for at forbedre deres effektivitet i diagnostik og behandlinger, samtidig med at bivirkningerne minimeres. Fordelen ved magnetiske nanomaterialer sammenlignet med ikke-magnetiske er deres evne til at reagere på magnetfelter på en kontaktfri måde og over store afstande. Dette gør det muligt at guide eller akkumulere dem, mens de også kan overvåges. For nylig blev magnetiske nanotråde (NW’er) med unikke funktioner udviklet til biomedicinske applikationer. Det store magnetiske moment af disse NW’er muliggør en mere effektiv fjernbetjening af deres bevægelse med et magnetfelt. Dette er blevet brugt med stor succes inden for kræftbehandling, lægemiddellevering, cellesporing, stamcelledifferentiering eller magnetisk resonansbilleddannelse. Derudover giver NW-fabrikationen ved skabelonassisteret elektrokemisk aflejring en alsidig metode med tæt kontrol over NW-egenskaberne. Især jern NW’er og jern-jernoxid (kerne-shell) NW’er er velegnede til biomedicinske anvendelser på grund af deres høje magnetisering og lave toksicitet.
I dette arbejde leverer vi en metode til at biofunktionalisere jern/jernoxid NW’er med specifikke antistoffer rettet mod en specifik celleoverflademarkør, der er overudtrykt i et stort antal kræftceller. Da metoden udnytter jernoxidoverfladens egenskaber, er den også anvendelig til superparamagnetiske jernoxidnanopartikler. NW’erne er først belagt med 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silan (APTES), der fungerer som en linker, som antistofferne er kovalent bundet til. APTES-belægningen og antistofbiofunktionaliseringen er bevist ved elektronenergitabsspektroskopi (EELS) og zetapotentialemålinger. Derudover testes antigeniciteten af antistofferne på NW’erne ved anvendelse af immunudfældning og western blot. Den specifikke målretning af de biofunktionaliserede NW’er og deres biokompatibilitet undersøges ved konfokal mikroskopi og et cellelevedygtighedsassay.
En unik egenskab ved magnetiske nanomaterialer er deres evne til at reagere på magnetfelter1, som med fordel kan udnyttes til at aktivere dem på mange måder, mens de også kan overvåges for eksempel ved magnetisk resonansbilleddannelse (MRI). Ved anvendelse af et vekslende magnetfelt ved høj frekvens kan de generere varme, hvilket kan fremkalde hypertermi, hvilket giver en terapeutisk mulighed1. En anden tilgang er fototermisk behandling, som kan realiseres med en nær infrarød (NIR) laser 2,3.
Blandt det store antal magnetiske nanomaterialer har jernoxid fået størst opmærksomhed i biologiske applikationer såsom magnetisk separation, hypertermi2,4, cellevejledning5, lægemiddelafgivelse 6,7,8 og som kontrastmiddel i MR 9,10. Dette skyldes deres høje biokompatibilitet 11,12, stor magnetisering 11,12, evne til at blive belagt 9,13,14,15, evne til at bære stoffer 2,16, evne til at blive funktionaliseret med lægemidler2,16 eller / og målretningsmidler 12,13,17,18, og evne til at konvertere optisk energi til varme2. For nylig startede MagForce i kliniske forsøg med kræftpatienter, der bruger jernoxidnanopartikler til hypertermibehandling19.
På det seneste er magnetiske nanotråde (NW’er) i stigende grad blevet udnyttet til biomedicinske applikationer 3,11,16,20,21,22. De har lignende egenskaber som magnetiske nanoperler, men tilbyder en anisotrop form og et meget stort magnetisk moment, hvilket muliggør en meget effektiv fjernbetjening af et magnetfelt23,24, inklusive lavfrekvent aktivering for at inducere magnetomekaniske effekter 25,26,27,28,29. Som følge heraf er NW’erne blevet implementeret til forskellige biologiske anvendelser såsom exosomisolering30 cellesporing 21, kræftbehandling 3,11,16, lægemiddelafgivelse 16,31,32 og som et MR-kontrastmiddel 33.
Biofunktionaliserede magnetiske nanomaterialer med specifik cellemålretningsevne har stort potentiale for biomedicinske anvendelser og inden for præcisionsmedicin34,35. For at fastgøre disse målretningsmidler kræves der en overfladeændring på nanomaterialerne. Typisk har de brug for en belægning, der giver en funktionel gruppe, som letter fastgørelsen af behandlingsmidlerne. I litteraturen er der et stort antal organiske og uorganiske belægninger til magnetiske nanomaterialer. Baseret på den funktionelle gruppe, der kan immobiliseres til nanomaterialet, kan disse belægninger kategoriseres i fire hovedgrupper: molekyler baseret på carboxylsyregrupper, polymerer, histidin og molekyler baseret på silangrupper.
Molekylerne baseret på carboxylsyregrupper er en af overflademodifikationsmetoderne. Det udnytter den høje affinitet
mellem den negative carboxylsyregruppe på belægningen og den positive ladning på de magnetiske nanomaterialer36,37,38. Bindingsprocessen af en carboxylsyre til en metaloverflade kan involvere dannelsen af metalcarboxylatsalte eller vedhæftning af carboxylgruppen til metallet. For multisegmenterede NW’er, såsom jern / guld eller nikkel / guld NW’er, som har fremragende egenskaber til bioapplikationer39,40, kan denne type belægning imidlertid ikke påføres let. Det kræver to forskellige belægninger på samme tid: thiolgrupper til ændring af guldsegmenterne og carboxylgrupper til magnetiske segmenter (jern eller nikkel)38. Nogle eksempler på molekyler baseret på carboxylgrupper er hæmatoporfyrin, pimelsyre, palmitinsyre og 3-[(2-aminoethyl) dithio] propionsyre (AEDP)38. Overflademodifikationer af magnetiske nanomaterialer ved hjælp af polymerer giver nogle klare fordele. På grund af polymerernes store molekylvægt forbedrer det stabiliteten af det magnetiske nanomateriale i en opløsning38. Det vil imidlertid øge nanomaterialets størrelsebetydeligt 38. Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyethyleneimin (PEI), arginin-glycin-D asparaginsyre (RGD) og polyethylenglycol (PEG) er nogle eksempler på de mest almindeligt anvendte polymerer til overflademodifikationer. Hver enkelt har sine egne funktioner og bruger38. Den tredje overflademodifikationsmetode er anvendelse af en histidinbelægning. Histidin er et protein med en histidinaminosyresidekæde, der har en høj affinitet til et begrænset antal magnetiske nanomaterialer såsom nikkel38. Det kan anvendes til proteinrensningsprocesser 38,41,42. En histidinbelægning kan også påføres multisegmenterede NW’er, såsom nikkel / guld NW’er38. Silanisering af en nanomaterialeoverflade er en veletableret proces 38,43,44. Det er baseret på et siliciumatom bundet til enhver metaloxidoverflade gennem tre enkeltbindinger, og samtidig binder dette siliciumatom til den funktionelle gruppe i slutningen gennem en alkylkæde 38,43,44. Fordelen ved denne belægning er at tilvejebringe frie amingrupper, og den har evnen til at belægge både magnetiske og ikke-magnetiske materialer38,45, såsom henholdsvis nikkel og guld. Derfor er anvendelse af molekyler baseret på saltvandsgruppen en praktisk rute til biofunktionalisering af multisegmenterede NW’er. Nogle eksempler på molekyler baseret på silangrupper er (3-aminopropyl) triethoxysilan (APTES) og (3-aminopropyl) trimethoxysilan (APTMS)38,45.
Tilsætningen af et målretningsmiddel til belægningen kan spille en væsentlig rolle i både diagnose og behandling af syge celler og samtidig minimere bivirkningerne på sundt væv46,47. Tilsætningen af et målretningsmiddel på overfladen af nanomaterialer forbedrer både cellulær selektiv binding og internalisering gennem endocytosereceptorer7. Uden disse målretningsligander interagerer nanomaterialer uspecifikt med cellemembraner, som binder med en lavere hastighed sammenlignet med nanomaterialerne med liganderne48. En af udfordringerne ved at målrette kræftvæv er deres karakteristiske lighed med sundt væv. Derfor afhænger målretningens succes hovedsageligt af at bestemme den passende ligand, der skal bruges som et biologisk mål49,50. Forskellige målretningsmidler er blevet anvendt til at dirigere nanomaterialer til kræftceller48,51 (f.eks. CD44 på grund af dets høje ekspression i kræftceller sammenlignet med raske celler52,53,54,55).
Målretningsagenter kan kategoriseres i tre hovedgrupper baseret på de komponenter, de er lavet af, og deres kompleksitet: aptamerbaseret målretning, ligandbaseret målretning og antistofbaseret målretning. Aptamerer er korte kemisk syntetiserede strenge af DNA eller RNA-oligonukleotider, der foldes i to- og tredimensionelle strukturer, hvilket gør dem i stand til at målrette mod et specifikt antigen, oftest proteiner56. Ligandbaseret målretning omfatter peptider og korte aminosyrekæder57. Antistofbaseret målretning indebærer anvendelse af et helt antistof eller antistoffragmenter, såsom enkeltkædede variable fragmenter eller antigenbindende fragmenter51. Brug af denne metode har den fordel, at den besidder to bindingssteder med en høj bindingsaffinitet til dets specifikke målantigen, hvilket giver det en overordentlig høj selektivitet58. Bindingsstederne er analoge med en lås og antigenet med en nøgle58.
I dette arbejde blev de anvendte NW’er fremstillet ved elektrodeposition på aluminiumoxidmembraner, en metode beskrevet detaljeret i en tidligere publikation59. Fokus her er på at frigive disse jern-jernoxid (kerne-shell) NW’er fra membranerne og biofunktionalisere dem med specifikke antistoffer for at give en målretningsevne. Antistofferne kan ikke binde direkte til jern-jernoxid NW’erne og kræver en linker. Belægning af NW’erne med APTES giver frie amingrupper, der muliggør kovalent binding via carboxylgruppen på antistofferne (figur 1). Fordelen ved APTES-belægningen er dens evne til at arbejde for både magnetiske21 og ikke-magnetiske60-materialer , såsom jern / guld eller nikkel / guld NWS45. Alle belægnings- og biofunktionaliseringstrin, der er forklaret i denne protokol, kan generelt anvendes med ethvert jern / jernoxidnanomateriale. Jern / jernoxid NW’er blev brugt her som et eksempel. Resultaterne viser, at de antistoffunktionaliserede NW’er har en høj antigenicitet over for specifikke celleoverfladereceptorer, som kan bruges til forskellige applikationer. Eksempler omfatter celleseparation, lægemiddelafgivelse, specifik kræftcellebehandling ved hjælp af fototermiske og / eller magnetomekaniske behandlinger.
Som med enhver nanomaterialefremstillings- og belægningsmetode kræves en høj kvalitet af de anvendte opløsninger. Frigivelses- (1 M NaOH) og funktionaliseringsløsninger (MES) kan genbruges flere gange. Det er dog meget vigtigt at kontrollere deres pH-værdi, inden du starter en ny proces. I frigivelsestrinnet skal vask af NW’erne med NaOH udføres mindst fire gange. Jo bedre vask, jo bedre stabilitet af NW’erne og jo mindre er de aggregerede. Oxidlaget forbedrer NW’ernes stabilitet ved nedsænkning i ethanol eller vand63.
Diameteren og længden af NW’erne blev påvirket efter belægning med APTES og antistoffer. Her steg diameteren fra 41, 5 nm til 70 nm, og længden faldt fra 2, 5 μm til 1, 6 μm på grund af sonikeringstrinnene, der bryder NW’erne. Derfor er det vigtigt karakterisere NW’ernes morfologi efter biofunktionaliseringstrinnet.
Fastgørelsen af antistofferne til NW’erne afhænger af den kovalente interaktion mellem amingruppen (på APTES) og carboxylgruppen (på antistoffet). Derfor er bekræftelse af tilstedeværelsen af APTES-belægningen et vigtigt skridt, som vi brugte EELS-kortlægning til. Belægningsmetoden er sikker og ligetil. Det behøver ikke høje temperaturer eller lange inkubationstider. APTES-belægning fungerer også som en linker for at muliggøre kovalent binding af andre antistoffer eller proteiner, der har en carboxylgruppe.
I tilfælde af biofunktionalisering af NW’erne med et antistof kan antigeniciteten af antistoffernes bindingssteder efter biofunktionaliseringsprocessen påvirkes. IP- og WB-metoden kan bruges til at undersøge dette problem. Brug af biofunktionaliseringsmetoden nævnt i denne protokol vil gøre det muligt for antistofferne at binde til NW’erne med høj antigenicitet til en specifik cellereceptor. Desuden tilføjede biofunktionalisering af NW’erne med antistoffer evnen til at målrette cellerne med receptoren af interesse, CD44 her. Dette blev bekræftet ved konfokal mikroskopi. Selvom biokompatibiliteten af de ubelagte NW’er var høj (>95%), forbedrede tilføjelse af APTES-belægning eller antistoffer til NW’erne deres biokompatibilitet 100%.
Endvidere er belægnings- og biofunktionaliseringsprotokollen effektiv, økonomisk og reproducerbar. Den bør kunne anvendes på ethvert andet nanomateriale af jern-jernoxid, hvorved koncentrationen af både belægningen og de tilknyttede antistoffer bør optimeres på grundlag af nanomaterialets overfladeareal og masse. Denne protokol kan udføres sikkert ved omgivelsesforhold i det generelle laboratorium. Biofunktionaliseringen har forbedret nanomaterialets biokompatibilitet og dets målretningsevne betydeligt. Generelt er NW’erne ekstremt lovende materialer til nanomedicinske anvendelser (herunder multimodale eller kombinatoriske behandlinger, celledetektion eller vejledning og biologisk sensing). Kombineret med biofunktionalisering, som beskrevet her, kan specifik cellemålretning opnås for øget præcision og effektivitet.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).
2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
Colon cancer cells – HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |