이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.
자성 나노 물질은 다양한 생물 의학 응용 분야에서 큰 주목을 받았습니다. 특정 표적화제로 이러한 나노 물질을 생체 기능화하는 것은 부작용을 최소화하면서 진단 및 치료에서 효능을 향상시키는 데 중요한 측면입니다. 비자성 물질에 비해 자성 나노 물질의 이점은 비접촉식 방식으로 먼 거리에서 자기장에 반응할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 안내하거나 축적할 수 있으며 모니터링도 가능합니다. 최근에는 생물 의학 응용 분야를 위해 고유한 기능을 가진 자기 나노와이어(NW)가 개발되었습니다. 이러한 NW의 큰 자기 모멘트는 자기장에 의한 움직임을 보다 효율적으로 원격 제어할 수 있도록 합니다. 이것은 암 치료, 약물 전달, 세포 추적, 줄기 세포 분화 또는 자기 공명 영상에서 큰 성공을 거두었습니다. 또한 템플릿 보조 전기화학 증착에 의한 NW 제조는 NW 특성을 엄격하게 제어할 수 있는 다양한 방법을 제공합니다. 특히 철 NW 및 산화철(코어 쉘) NW는 높은 자화와 낮은 독성으로 인해 생물 의학 응용 분야에 적합합니다.
이 연구에서 우리는 많은 수의 암세포에서 과발현되는 특정 세포 표면 마커에 대한 특정 항체로 철/산화철 NW를 생체 기능화하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 산화철 표면의 특성을 활용하기 때문에 초상자성 산화철 나노 입자에도 적용할 수 있습니다. NW는 먼저 링커 역할을 하는 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane(APTES)으로 코팅되며, 항체는 이 링커에 공유 결합되어 있습니다. APTES 코팅 및 항체 생체 기능화는 전자 에너지 손실 분광법(EELS) 및 제타 전위 측정에 의해 입증되었습니다. 또한, NW에 대한 항체의 항원성은 면역침전 및 웨스턴 블롯을 사용하여 테스트됩니다. 생체 기능성 NW의 특정 표적화와 생체 적합성은 공초점 현미경 및 세포 생존도 분석으로 연구됩니다.
자성 나노 물질의 독특한 특성은 자기장1에 반응하는 능력이며, 이는 여러 가지 방법으로 그들을 작동시키는 데 유익하게 활용 될 수 있으며, 예를 들어 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 모니터링 될 수도 있습니다. 고주파에서 교류 자기장을 가할 때 열을 발생시켜 온열요법을 유발할 수 있어 치료 옵션1을 제공할 수 있습니다. 또 다른 접근법은 근적외선(NIR) 레이저 2,3으로 실현할 수 있는 광열 처리입니다.
많은 수의 자성 나노 물질 중에서 산화철은 자기 분리, 고열2,4, 세포 유도5, 약물 전달 6,7,8 및 MRI 9,10의 조영제와 같은 생물학적 응용 분야에서 가장 큰 주목을 받았습니다. 이는 높은 생체 적합성 11,12, 큰 자화11,12, 코팅 능력 9,13,14,15, 약물 운반 능력2,16, 약물 2,16 또는 표적 제제12,13,17로 기능화 된 능력 때문입니다,18 및 광학 에너지를 열로 변환하는 기능2. 최근 MagForce는 온열요법 치료를 위해 산화철 나노입자를 사용하여 암 환자를 대상으로 임상 시험을 시작했습니다19.
최근에, 자석 nanowires (NWs)는 생물 의학 응용을 위해 점점 더 이용되고 있다 3,11,16,20,21,22. 이들은 자성 나노 비드와 유사한 특성을 갖지만 이방성 모양과 매우 큰 자기 모멘트를 제공하여 자기장23,24에 의한 매우 효율적인 원격 제어를 가능하게하며, 자기 기계적 효과를 유도하는 저주파 작동을 포함합니다 25,26,27,28,29. 결과적으로, NW는 엑소좀 분리(30) 세포 추적(21), 암 치료(3,11,16), 약물 전달(16,31,32) 및 MRI 조영제(33)와 같은 다양한 생물학적 응용 분야에 구현되었습니다.
특정 세포 표적화 능력을 가진 생체 기능성 자성 나노 물질은 생물 의학 응용 분야 및 정밀 의학 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다34,35. 이러한 표적화를 부착하기 위해서는 나노 물질에 표면 개질이 필요합니다. 일반적으로 처리제의 부착을 용이하게 하는 작용기를 제공하는 코팅이 필요합니다. 문헌에는 자성 나노 물질에 대한 많은 유기 및 무기 코팅이 있습니다. 나노 물질에 고정될 수 있는 작용기를 기반으로 이러한 코팅은 카르복실산기를 기반으로 하는 분자, 고분자, 히스티딘 및 실란기를 기반으로 하는 분자의 네 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다.
카르복실산기를 기반으로 하는 분자는 표면 개질 방법 중 하나입니다. 높은 친화력을 활용
코팅의 음극 카르복실산 그룹과 자성 나노 물질36,37,38의 양전하 사이. 금속 표면에 대한 카르복실산의 결합 공정은 금속-카르복실레이트 염의 생성 또는 카르복실기의 금속에 대한 접착을 포함할 수 있습니다. 그러나, 철/금 또는 니켈/금 NW와 같은 다중 세그먼트 NW의 경우, 바이오 응용 분야에 대한 우수한 특성을 갖는다39,40, 이러한 유형의 코팅은 쉽게 적용될 수 없다. 동시에 두 가지 다른 코팅이 필요합니다: 금 세그먼트를 수정하기 위한 티올기와 자성 세그먼트(철 또는 니켈)를 위한 카르복실기(38). 카르복실기를 기반으로 하는 분자의 몇 가지 예로는 헤마토포르피린, 피멜산, 팔미트산 및 3-[(2-아미노에틸)디티오] 프로피온산(AEDP)38이 있습니다. 고분자를 사용한 자성 나노 물질의 표면 개질은 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 중합체의 분자량이 크기 때문에, 용액(38)에서 자성 나노물질의 안정성을 향상시킨다. 그러나, 나노 물질(38)의 크기를 현저하게 증가시킬 것이다. 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌이민(PEI), 아르기닌-글리신-D 아스파르트산(RGD) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 표면 개질에 가장 일반적으로 사용되는 폴리머의 몇 가지 예입니다. 각각 고유한 기능이 있으며38을 사용합니다. 세 번째 표면 개질 방법은 히스티딘 코팅을 사용하는 것입니다. 히스티딘은 니켈38과 같은 제한된 수의 자성 나노 물질에 높은 친화력을 갖는 히스티딘 아미노산 곁사슬을 가진 단백질입니다. 단백질 정제 공정 38,41,42에 사용할 수 있습니다. 히스티딘 코팅은 또한 니켈/금 NW와 같은 다중-분절된 NWs에 적용될 수 있다38. 나노 물질 표면의 실란화는 잘 확립 된 공정 (38,43,44)입니다. 그것은 3 개의 단일 결합을 통해 임의의 금속 산화물 표면에 연결된 실리콘 원자를 기반으로하며,이 실리콘 원자는 알킬 사슬 (38,43,44)을 통해 말단의 작용기에 결합합니다. 이 코팅의 장점은 유리 아민기를 제공하고 있으며 니켈 및 금과 같은 자성 및 비자성 물질38,45를 각각 코팅할 수 있습니다. 따라서 식염수를 기반으로 하는 분자를 사용하는 것은 다중 세그먼트 NW를 생체 기능화하는 실용적인 경로입니다. 실란기를 기반으로 하는 분자의 몇 가지 예는 (3-아미노프로필) 트리에톡시실란(APTES) 및 (3-아미노프로필) 트리메톡시실란(APTMS)38,45입니다.
코팅에 표적제를 첨가하는 것은 병든 세포의 진단 및 치료 모두에서 중요한 역할을 할 수 있으며, 동시에 건강한 조직에 대한 부작용을 최소화할 수 있다(46,47). 나노 물질의 표면에 표적 물질을 첨가하면 세포 내 세포 내 수용체를 통한 세포 선택적 결합과 내재화가 모두 향상된다7. 이러한 표적화 리간드가 없으면, 나노 물질은 세포막과 비특이적으로 상호 작용하며, 이는 리간드(48)를 갖는 나노 물질에 비해 더 낮은 비율로 결합합니다. 암 조직을 표적으로 삼을 때 어려운 점 중 하나는 건강한 조직과의 특징적인 유사성입니다. 그러므로, 표적화의 성공은 주로 생물학적 표적49,50으로 사용할 적절한 리간드를 결정하는 데 달려 있다. 다양한 표적화제는 나노 물질을 암세포(48,51)로 유도하기 위해 사용되어 왔다(예를 들어, CD44는 건강한 세포(52,53,54,55)에 비해 암세포에서 높은 발현으로 인해).
표적화제는 성분과 복잡성에 따라 압타머 기반 표적화, 리간드 기반 표적화, 항체 기반 표적화의 세 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다. 압타머는 화학적으로 합성된 DNA 또는 RNA-올리고뉴클레오티드의 짧은 가닥으로 2차원 및 3차원 구조로 접혀 있어 특정 항원, 대부분 단백질56을 표적으로 삼을 수 있다. 리간드-기반 표적화는 펩티드 및 짧은 아미노산 사슬(57)을 포함한다. 항체-기반 표적화는 전체 항체, 또는 항체 단편, 예컨대 단일-사슬 가변 단편 또는 항원-결합 단편(51)의 사용을 수반한다. 이 방법을 사용하는 것은 특이적 표적 항원에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 2개의 결합 부위를 갖는 장점이 있으며, 이는 매우 높은 선택성(58)을 제공한다. 결합 부위는 자물쇠와 유사하고 항원은 열쇠(58)와 유사하다.
이 작업에서, 사용된 NW는 산화알루미늄 멤브레인 상에 전착에 의해 제조되었으며, 이 방법은 이전 간행물59에서 상세히 기술되었다. 여기서 초점은 이러한 산화철(코어-쉘) NW를 멤브레인에서 방출하고 특정 항체로 생체 기능화하여 표적화 능력을 제공하는 것입니다. 항체는 산화철-철 NW에 직접 결합할 수 없으며 링커가 필요합니다. NW를 APTES로 코팅하면 유리 아민기가 제공되어 항체의 카르복실기를 통한 공유 결합이 가능합니다(그림 1). APTES 코팅의 장점은 철/금 또는 니켈/금 NWs45와 같은 자성21 및 비자성60 재료 모두에 대해 작동할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜에서 설명하는 모든 코팅 및 생체 기능화 단계는 일반적으로 모든 철/산화철 나노 물질과 함께 사용할 수 있습니다. 여기서는 철/산화철 NW를 예로 들었습니다. 결과는 항체 기능화된 NW가 다른 신청을 위해 이용될 수 있는 특정한 세포 표면 수용체에 높은 antigenicity가 있다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 세포 분리, 약물 전달, 광열 및/또는 자기 기계적 처리를 사용한 특정 암세포 치료가 있습니다.
모든 나노 물질 제조 및 코팅 방법과 마찬가지로 사용되는 용액의 고품질이 필요합니다. 방출(1M NaOH) 및 기능화(MES) 용액은 여러 번 재사용할 수 있습니다. 그러나 새로운 공정을 시작하기 전에 pH 값을 확인하는 것이 매우 중요합니다. 방출 단계에서, NaOH로 NW를 세척하는 것은 적어도 4 회 수행되어야한다. 세척이 좋을수록 NW의 안정성이 향상되고 응집이 적습니다. 산화물 층은 에탄올 또는 물(63)에 침지할 때 NW의 안정성을 강화한다.
NW의 직경과 길이는 APTES와 항체로 코팅한 후 영향을 받았습니다. 여기서 직경은 41.5 nm에서 70 nm로 증가했으며 NW를 파괴하는 초음파 처리 단계로 인해 길이는 2.5 μm에서 1.6 μm로 감소했습니다. 따라서 생체 기능화 단계 후 NW의 형태를 특성화하는 것이 필수적입니다.
NW에 대한 항체의 부착은 아민기(APTES에서)와 카르복실기(항체에서) 사이의 공유 상호작용에 의존합니다. 따라서 APTES 코팅의 존재를 확인하는 것은 EELS 매핑을 사용한 중요한 단계입니다. 코팅 방법은 안전하고 간단합니다. 고온이나 긴 배양 시간이 필요하지 않습니다. 또한 APTES 코팅은 링커로 작용하여 카르복실기를 가진 다른 항체 또는 단백질의 공유 결합을 가능하게 합니다.
항체로 NW를 생체기능화하는 경우, 생체기능화 과정 후 항체 결합 부위의 항원성에 영향을 미칠 수 있습니다. IP 및 WB 방법을 사용하여 이 문제를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜에 언급된 생체 기능화 방법을 사용하면 항체가 특정 세포 수용체에 대한 높은 항원성을 갖는 NW에 결합할 수 있습니다. 또한, 항체로 NW를 생체 기능화하면 관심 수용체인 CD44로 세포를 표적으로 삼을 수 있는 능력이 추가되었습니다. 이것은 컨포칼 현미경으로 확인되었습니다. 코팅되지 않은 NW의 생체 적합성은 높았지만(>95%), NW에 APTES 코팅 또는 항체를 첨가하면 생체 적합성이 100% 향상되었습니다.
또한 코팅 및 생체 기능화 프로토콜은 효율적이고 경제적이며 재현 가능합니다. 다른 산화철 나노 물질에 적용 할 수 있어야하며, 코팅과 부착 된 항체의 농도는 나노 물질의 표면적과 질량에 따라 최적화되어야합니다. 이 프로토콜은 일반 실험실의 주변 조건에서 안전하게 수행할 수 있습니다. 생체 기능화는 나노 물질의 생체 적합성과 표적화 능력을 크게 향상시켰습니다. 일반적으로 NW는 나노 의학 응용 분야(다중 모드 또는 조합 처리, 세포 검출 또는 유도, 생물학적 감지 포함)에 매우 유망한 재료입니다. 여기에 설명된 바와 같이 생체 기능화와 결합하여 정밀도와 효능을 높이기 위해 특정 세포 표적화를 달성할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 간행물에 보고된 연구는 King Abdullah University of Science and Technology(KAUST)의 지원을 받았습니다.
2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
Colon cancer cells – HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |