Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

Abstract

תנועתיות חיונית להישרדותם ולהצלחתם של מינים חיידקיים רבים. מתודולוגיות רבות קיימות כדי לנצל תנועתיות כדי להבין נתיבי איתות, כדי לבהיר את הפונקציה וההרכבה של חלקים flagellar, ולבחון ולהבין דפוסי תנועה. כאן אנו מדגימים שילוב של שלוש מתודולוגיות אלה. תנועתיות בגר רך היא העתיקה ביותר, המציעה מבחר חזק לבידוד מוטציות מדכאות רווח-של-תפקוד בזנים לקויי תנועתיות, שם תנועתיות משוחזרת באמצעות מוטציה שנייה. טכניקת קשירת התא, המשמשת תחילה כדי להדגים את האופי הסיבובי של המנוע flagellar, ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעה של משפיעי איתות על מהירות המנוע ואת יכולתה לעבור כיוון סיבובי. בדיקת "מעבר הגבול" היא עדכנית יותר, שבה חיידקי שחייה יכולים להיות מוכנים לעבור לנוע באופן קולקטיבי כנחיל. בשילוב, פרוטוקולים אלה מייצגים גישה שיטתית ועוצמתית לזיהוי רכיבים של מכונות תנועתיות, ולאפיון תפקידם בהיבטים שונים של שחייה ונחילה. הם יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד תנועתיות במינים חיידקיים אחרים.

Introduction

חיידקים מעסיקים נספחים רבים לתנועה ופיזור בנישות האקולוגיות שלהם1. תנועתיות המונעת על ידי פלאגלה היא המהירה שבהן, מקדמת קולוניזציה של אזורים נוחים בתגובה לאותות סביבתיים, ותורמת באופן משמעותי ליכולת הפתוגנית של מינים מסוימים2,3. חיידקים מוכים יכולים לשחות בנפרד בנוזל בתפזורת, או נוהרים כקולקטיב על פני משטח חצי מוצק4. פלאגלה חוץ-תאית מתחברת ומונעת על ידי מנועים סיבוביים המוטמעים בממברנה, אשר רותמים את העוצמה של שיפועי יונים כדי ליצור מומנט שגורם לסיבוב1,2,4,5,6,7,8. ב- E. coli, שהמנועים שלו פועלים על מומנט קבוע9, ניתן לסווג את פלט המנוע במונחים של מהירות סיבובית ומיתוג הרוטור בין כיווני נגד כיוון השעון (CCW) ובכיוון השעון (CW). סיבוב CCW מקדם היווצרות של חבילת flagellar קוהרנטית המניעה את התא קדימה (ריצה), בעוד מתג ארעי בכיוון הסיבוב (CW) גורם לחבילה להתפרק באופן חלקי או מלא10, והתא כדי לכוון מחדש את כיוון השחייה שלו (ליפול). אי קולי בדרך כלל לרוץ לשנייה ליפול במשך עשירית שנייה. תדירות המיתוג של הרוטור או 'הטיית הנפילה' נשלטת על ידי מערכת איתות chemotaxis, שבה chemoreceptors transmembrane לזהות אותות כימיים חיצוניים ולהעביר אותם באמצעות זרחן למנוע flagellar להאריך ריצות בתגובה למשוך, או לדכא אותם בתגובה כימיקלים רעילים11,12. תנועתיות השחייה נמדת ב-0.3% אגר רך.

במהלך ההמולה, חיידקים מנווטים על משטח מוצק למחצה כקולקטיב צפוף, שבו חבילות של חיידקים זורמות בתנועה מסתחררת רציפה2,13,14,15. נחילי E. coli מציגים פיזיולוגיה כימוסנסורית שונה (הטיית טבילה נמוכה יותר), מהירויות גבוהות יותר, וסובלנות גבוהה יותר לאנטי מיקרוביאלים מעל תאים שוחים בנוזל בתפזורת16,17. נחילים משתנים בפריסתם של שפע של אסטרטגיות המסייעות לתנועה, כולל ייצור פעילי שטח, היפרפלציה, והארכות תאים2. נחיל מציע חיידקים יתרון תחרותי הן מבחינה אקולוגית והן בסביבה קלינית18,19,20. ישנן שתי קטגוריות של חיידקים נוהרים: נחילים ממוזגים, אשר יכול לנחיל רק על מדיה מוצק עם 0.5-0.8% אגר, ונחילים חזקים, אשר יכול לנווט על פני ריכוזי אגר גבוהיםיותר 21.

קיימים מגוון של חקירות כדי לחקור תנועתיות שחייה והרגולציה שלה. כאשר הוא נפגע ממוטציות או מתנאים סביבתיים, תנועתיות עצמה מציעה מבחר חזק לזיהוי מוטציות מדכאות רווח-של-פונקציה. מדכאים אלה יכולים להיות חוזרים מקוריים של המוטציה המקורית, או חוזרים מדומים, שבהם מוטציה שנייה משחזרת את הפונקציונליות. מוטציות כאלה ניתן לזהות על ידי ריצוף גנום שלם (WGS). חלופה לבחירת מדכאים משוחדים היא אסטרטגיית מוטה של מוטגנסיס ממוקדת (למשל, מוטאגנסיס PCR). מתודולוגיות אלה שופכות לעתים קרובות אור על התפקוד או הרגולציה הסביבתית של מנגנון תנועתיות. אם המטרה היא ללמוד פונקציה מוטורית, אז שיקום תנועתיות מסוג פראי כפי שנמדד אגר רך לא בהכרח להצביע על שיקום של תפוקת מנוע מסוג בר. הבדיקה הקשורה לתא, שבה תאים מחוברים למשטח זכוכית על ידי flagellum יחיד וסיבוב של גוף התא מנוטר לאחר מכן, יכול להיות הבדיקה הראשונית של בחירה להערכת התנהגות מוטורית. למרות מתודולוגיות מתוחכמות יותר זמינים כעת כדי לפקח על תכונות מנוע, הגדרת המצלמה במהירות גבוהה הנדרשת ויישום של חבילות תוכנה לניתוח תנועה להגביל את השימוש הנרחב שלהם22,23,24,25. ההסרה הקשורה לתא דורשת רק להטות את הדגלה, ומאפשרת חיבור של הסיבים הקצרים למגלשת זכוכית, ואחריה צילום סיבוב גוף התא. למרות שמהירויות המנוע המתועדות נמוכות במיון זה בגלל העומס הגבוה שגוף התא מפעיל על הפלסטלום, ניסיון זה בכל זאת תרם לתובנות יקרות ערך על תגובות כימיות26,27,28,29, ונשאר כלי חקירה תקף כפי שנדון להלן.

תנועתיות נוהרת מציבה בפני החוקרים מערכת אתגרים שונה. מבחר מדכאי ההשגה עובד רק בנחילים המייצרים פעילי שטח בשפע ונוהרים בקלות13. פעילי שטח שאינם מפיקים כגון E. coli הם בררניים ביחס לבחירה של אגר, הרכב מדיה ולחות שלהסביבה 2,13,14,21. לאחר קביעת תנאי ההמולה, חוצה הגבול17 הוא מתודולוגיה שימושית לחקור את היכולת של נחיל לנווט בתנאים חדשים / קשים. למרות הפרוטוקולים המוצגים להלן מתייחסים E. coli, הם יכולים להיות מותאמים בקלות ליישום במינים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד מוטציות מדכאות בזנים חסרי תנועתיות

הערה: השתמש בשיטה זו כ'מלכוד הכל ' רחב כדי לזהות את האופי הכללי של פגם תנועתיות.

  1. הכנת צלחת אגר רכה
    הערה: רך אגר, המכונה גם תנועתיות - או לשחות אגר, הוא אגר אחוז נמוך (~ 0.2-0.35% w / v), ארוך המשמש כדי assay chemotaxis31,32.
    1. יש להוסיף 3 גרם של bacto-agar (0.3% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול בנפח 2 ליטר. מוסיפים לבקבוקית 1 ליטר של ddH2O (מים מזוקקים כפולים) ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.
    2. כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).
    3. אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר הטמפרטורה מגיעה כ 50 °C (50 °F), לשפוך 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ), ולאפשר אגר מותך להגדיר עם מכסה במקום לפחות 1 שעה, לשימוש בתוך 16 שעות.
  2. הכנת תרבות, חיסון ובידוד של מוטנטים מדכאים
    הערה: E. coli מחוסן במרכז של מדיה עשירה בחומרים מזינים מוצק עם אגר רך לצרוך חומרים מזינים באופן מקומי, יצירת שיפוע מתזונה שהם עוקבים. כשהם נעים החוצה, מופיעות 'טבעות' מוגדרות (איור 1A), הקשורות לכימותרפיה ספציפית שהחיידקים מגיבים לה. פגמים במערכת chemotaxis או רכיבים מבניים של מנוע flagella יכול לסכן את הביצועים ב- assay זה. לעתים קרובות, מוטנטים עם יתרון תנועתיות מתעוררים במהלך ההקרנה, וניתן לראות אותם מגיחים מנקודות בודדות או ממספר נקודות לאורך הפריפריה של הטבעת, משם הם "מתלקחים" החוצה (איור 1C). ישימו לב שהקצה החיצוני ביותר של חזית השחייה מנוגד בקלות לאגר הבתולה הרכה הלא מכובסת.
    1. לגדל תרביות לילה של זן תנועתיות-לקוי הרצוי ב 5 מ"ל של מרק לנוקס (LB; 10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, ו 5 g / L NaCl, שולחן חומרים) ב 30 °C עם רעד אופקי (220 r.p.m.). למחרת, תת-תרבות (1:100 דילול) ב- LB טרי, גדל באותם תנאים לשלב מעריכי (OD600 של 0.6).
    2. לחסן 6 μL של התרבות למרכז צלחת אגר רך (1.1) באמצעות pipette, דוחף את הקצה סטרילי טעון לתוך אגר לגרש בעדינות את התוכן. מעבירים ל-30 מעלות צלזיוס ודגרה (איור 1B),עד ל ניכרים "התלקחויות" תנועתיות, הנובעות מנקודת החיסון או מהפריפריה של טבעות תנועתיות, בדרך כלל ב-24-36 שעות(איור 1C).
      הערה: בבוחות תנועתיות, לחסן זן מסוג פראי לצד המבודדים המוטנטיים לשם השוואה. זן בר זה יציג את הטבעות הכימיות הקונצנטריות האופייניות (איור 1A) וימלא את הצלחת בתוך 8-10 שעות.
    3. השתמש בלולאת תיל סטרילית כדי להרים את התאים מאזור 'התלקחות' ולפגוע כדי לטהר מושבות בודדות על צלחת אגר קשה LB (LB מוכן כנ"ל, מגובש עם 15 גרם / L bacto-אגר).
    4. בחרו מושבות בודדות מצלחת הפס באמצעות לולאת תיל סטרילית וטוהרו מחדש על ידי פסים למושבות בודדות כדי להבטיח בידוד של מבודד מושבה 'טהורה'.
  3. אישור, ואפיון של מוטציות מדכאות
    1. אשר שהמוטנטים המבודדים החזירו את תנועתיותם. הכן לוחות אגר רכים (1.1), ותרבויות לזנים מעניינים (כמו ב-1.2.1), כולל סוג פראי ומתח 'חסר תנועתיות' התחלתי להשוואה.
    2. לחסן את הצלחות (כמו 1.2.2) ודגור ב 30 °C (8-10 שעות.
    3. להקליט את הקוטר של הטבעת החיצונית ביותר (קצה המעגל) ולהשוות כדי לקבוע מי של מבודדים יש תנועתיות משוחזרת באופן משמעותי.
      הערה: מומלץ לצלם צלחות לאורך כל מהלך הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בהתקן "דלי של אור"30, שבו מצלמה דיגיטלית מותקנת מעל מקור אור להארה טובה יותר כדי למדוד את הקוטר של מושבת השחייה ולהבדיל אותו אגר לא קוטבי.
    4. הנבדק אומת מבודד ל- WGS כנדרש, ומאפשר 'כיסוי רצף' מספיק כדי לזהות באופן חיובי את המוטציות ששיקמו פונקציה מסוג בר.

2. כימות התנהגות מוטורית פלאגלה באמצעות קשירת תאים

הערה: השתמש בשיטה זו כאשר נראה שהתנהגות רגילה של ריצה-נופלת (chemotaxis) נפגעת.

  1. הכנת תרבות וגזלת דגלה
    1. הכן תרבות שלב מעריכית של זן העניין כמתואר בשלב 1.2.1.
    2. פלט 10 מ"ל של תאים לפי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות לפני הוצאה חוזרת ב 10 מ"ל של מאגר תנועתיות מעוקר מסנן (MB; 10 mM אשלגן פוספט חוצץ [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      הערה: MB תומך תנועתיות, אבל אינו תומך בצמיחה חיידקית
    3. חזור על שלב 2.1.2 פעמיים נוספות לפני ususpending הכדור הסופי ב 1 מ"ל של MB.
    4. מעבירים את ההשעיה של התא למזרק של 1 מ"ל ומצמידים מחט 23G לסוף. להרכיב מזרק זהה / מחט מנגנון ולחבר את השניים יחד באמצעות 6 אינץ 'של צינורות פוליאתילן (קוטר פנימי של 0.58 מ"מ) נדן בחוזקה על כל קצה מחט.
    5. גנו את הדגלה (הם שבירים ונשברים בקלות) על ידי העברת מתלה התא בעדינות הלוך ושוב ממזרק אחד לשני 50x, עם הפסקות של דקה אחת בין כל 10 מעברים.
    6. צנטריפוגה התאים הגוזלים ב 2,000 x g במשך 3 דקות resuspend בנפח סופי של 500 μL של MB.
  2. הכנת שקופיות וקשירת תאים
    1. הכן תא קיבוע תאים על-ידי ערימת כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית בגודל 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1 מ"מ, המופרדת באמצעות סרט דו-צדדי(איור S1).
    2. לשטוף את התא עם 0.01% (w/v) פתרון פולי-ליסין על ידי החלה על החלק העליון של התא. הטה את הקצה התחתון (כיסוי ריק עם שקופית המיקרוסקופ) על מגב משימות (נייר טישו) כדי לעזור לצייר פתרון דרך התא(איור S1). לאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. לשטוף את התא שלוש פעמים עם 40 μL של MB באמצעות כמתואר בשלב 2.2.2
    4. הוסף 40 μL של השעיית תא גיהון (מוכן לעיל) לחלק העליון של התא ודגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר כיסוי.
    5. יש לשטוף בעדינות את התא עם 40 μL של MB כמו ב 2.2.3 כדי להסיר תאים לא מחוברים.
  3. הקלטה וכימות סיבוב תאים
    1. העבר את שקופית המיקרוסקופ העמוסה בתאים קשורים לשלב המיקרוסקופ.
    2. באמצעות מיקרוסקופיה משולבת פאזה ומטרה 100x, לסרוק את האוכלוסייה עבור תאים קבועים במקום, ומסתובב על ציר אחד, כלומר, סיבובים חלקים על נקודה קבועה במקום להציג בזווית שבה התא נע פנימה והחוצה של המוקד (וידאו 1).
    3. השתמש במיקרוסקופ מסחרי ובמצלמה משויכת. פתח את התוכנה המשויכת, ודא שתאי העניין נמצאים במוקד ולחץ על רכישת וידאו כדי להקליט את סיבוב התא למשך דקה אחת (ב- 10 פריימים לשנייה ומעלה).
    4. מהפעלת וידאו, לכמת את מספר הסיבובים המלאים לדקה ואת מספר הפעמים שהתא משנה כיוון (תדירות מיתוג).
      הערה: מהירויות סיבוב ותדירות מיתוג עשויות להיות מהירות מדי לאמוד אחר עין ולכן מומלץ להשתמש בתוכנת וידאו המציעה הפעלה איטית / עדינה, או מאמצת מערכת תוכנה אוטומטית לכימות דפוסי סיבוב33. חלופה תהיה להגדיל את הצמיגות של MB באמצעות תאית מתיל (או סוכן דומה) כדי לעזור להאט ולפתור את הסיבוב של חיידקים מהירים יותר או לפצות כאשר מצלמות עם קצבי מסגרת נמוכים נמצאים בשימוש.
    5. חזור על שלב 2.3.2 עם שכפולים ביולוגיים כדי להרכיב ייצוג של אוכלוסיית העניין.

3. הכנת נחילים בבדיחת מעבר גבול

הערה: השתמש בשיטה זו להערכת ההשפעה של מוטציה או תנאי על תנועתיות קבוצתית. נחיל אגר מתייחס אגר שבו האחוז הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של אגר רך. באגר רך (0.3 %), תאים שוחים בנפרד בתוך אגר. באגר נחיל (0.5% ומעלה), התאים נעים כקבוצה על פני השטח. בעוד לוחות נחיל חייב לשמש כמפורט כאן, צלחות שחייה יש חיי מדף ארוכים יותר, והוא עשוי לשמש במשך כמה ימים. ההעדפה האישית שלנו היא להשתמש בעוד 1-2 ימים.

  1. הכנת אגר נחיל
    1. הוסף 5 גרם של אגר אייקן (0.5% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול של 2 ליטר. מוסיפים 1 ליטר של ddH2O לבקבוק ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.
    2. כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).
    3. אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה כדי למנוע בועות אוויר באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר כ 50 °C (50 °F), להוסיף גלוקוז מעוקר מסנן לריכוז סופי של 0.5 %.
    4. יוצקים 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומאפשרים להגדיר בטמפרטורת החדר לפחות 14 שעות ולא יותר מ 20 שעות. אין לאחסן לשימוש עתידי.
  2. חיסון ודגורה של לוחות נחיל
    1. לחסן 6 μL של תרבות מעריכית בינונית (מוכן כמו 1.2) על ידי תצפית על גבי אגר.
    2. משאירים את המכסה למשך 5-10 דקות ומחליפים כאשר האינוקולום התייבש לתוך משטח אגר.
    3. דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 8 שעות. הימנע הפיתוי לבדוק את התקדמות הנחיל על ידי הסרת המכסה, שכן זה יתרום לייבוש של אגר ולפגום נחילים.
      הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם פנוטיפ המתח. מוטציות מבודדות מסוימות עלולות לפגוע ביכולת הנחיל ויחייבו אחוז מופחת של אגר או תקופה ממושכת יותר של דגירה.
  3. הכנת לוחות אסי של מעבר גבול
    הערה: בדיקת ישבן זו משתמשת בצלחת פטרי מותאמת, שבה חלוקת פלסטיק (גבול) יוצרת שני תאים, ולא אחד(איור 2A). כל תא יכול להיות מוכן ללא תלות בשני, ומציע תנאים שונים לנחיל, לפני "חיבור" בין השניים. בהתאם לתכנון ניסיוני, ניתן להכין את התא הראשון (המיועד משמאל) עם אגר שחייה (0.3% w/v) או אגר נחיל (0.5% w/v) שממנו החיידקים יכולים לנדוד מעבר לגבול לתא הימני המכיל אגר נחיל +/- כל תוספת או אתגר נדרשים (למשל, אנטיביוטיקה). נדידה על כל אגר נמדדת /בהשוואה בדרך כלל על ידי רישום הקוטר הרחב ביותר של קולוניזציה חיידקית (מקצה לקצה) מנקודת החיסון המקורית.
    1. הכן אגר שחייה כמתואר ב-1.1 במידת הצורך.
    2. הכן אגר נחיל כמתואר ב 3.1.
    3. יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר נחיל (עם תוספי הרצוי במידת הצורך) לתא הימני של צלחת פטרי כפולה (100 מ"מ x 15 מ"מ), עד לנקודה שבה הוא מאוזן עם מחיצת הפלסטיק בין התאים, אך לא עולה על גדותיו לשמאל(איור 2B).
    4. לאחר שהאגאר התקשה, מלאו את התא השמאלי ב-30 מ"ל של שחייה או אגר נחיל, שוב עד כדי מגע עם חלוקת הפלסטיק(איור 2C). לפני שהוא קובע, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לגרור בעדינות את הגר מעבר לגבול כדי לחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה ~ 1 מ"מ המשתרע על כל אורך החלוקה (איור 2D).
    5. אפשר לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר (3.1).
      הערה: שיטה חלופית ליצירת גשר היא לאפשר אגר התא השמאלי להתייבש ולאחר מכן לאט pipette ~ 100 μL של אגר נחיל מותך לאורך מחיצת הפלסטיק לגשר בין שני התאים (3.4). לחסן את הצלחות על התא השמאלי כמפורט לעיל לשחייה (1.2.2) או נחיל (3.2) אגר, לפני הדגירה ב 30 °C (12-16 שעות), או עד נחילים עשו התקדמות מספקת מעל התא הימני כדי לאפשר השוואות בין זנים של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבידוד של פסאודו-חוזרים בזן E. coli אשר תנועתיות נפגעת על ידי רמות גבוהות של מולקולת האיתות c-di-GMP, פורט בעבודה האחרונה מהמעבדה שלנו34. זן זה (JP1442) טפח שתי מוטציות: ΔyhjH ו ΔycgR. YhjH הוא הזרחן הפעיל ביותר שמשפיל את C-di-GMP ב- E. coli. היעדר YhjH מוביל רמות גבוהות c-di-GMP ועיכוב תנועתיות. YcgR הוא מחולל C-di-GMP. במתחם עם c-di-GMP, YcgR נקשרת לרוטור flagellar כדי לגרום תחילה לסיבוב מנוע CCW ולאחר מכן להקטין את מהירות המנוע. קשירת תאים וחרוזים הראו כי התנהגות מוטורית חזרה לשגרה במוטנט הכפול, אך תנועתיות בגר רך לא34. לכן, פרסנו את שלב 1 של הפרוטוקול כדי לבודד נורים פסאודו-חוזרים במוטנט הכפול(איור 1C). רוב המוטציות הממופות על ידי WGS (פלטפורמת HiSeq 4000, PE 2 x 150 setup34) ל- rssB, אשר מקודד עבור חלבון רגולטור תגובה / מתאם שבדרך כלל מכוון את ClpXP פרוטאז למקד σS להשפלה34. אחד מהחזרים הללו, שהפגין תנועתיות קרובה לסוג פראי (AW405, השווה איור 1A,D),שימש להפקת תוצאות מייצגות לשלב 2 ו-3 של סעיף הפרוטוקול, תוך שימוש כפקדים הן על ההורה המוטנטי הכפול שלה (איור 1B) והן על זן פראי איזוגני (איור 1A).

עבור שלב 2 של מקטע הפרוטוקול, לכידות וידאו נותחו כדי לחשב סיבובים לדקה (כל סיבוב של 360° שלם) ו- CWהטיה (שבריר מנועי הזמן מסתובבים בכיוון CW, או הטיה נופלת). ה-ΔyhjH הראה פחות סיבובים לדקה והטיה נמוכה יותר של CW בהשוואה לסוג הפראי, כצפוי (איור 3). הן המוטציההכפולה Δ yhjH Δ YCGR והן מדכא שלה הראו התנהגות מוטורית הדומה לסוג פראי, תצפיות הנתמכות על ידי ניתוח קודם באמצעות אסייס 'חרוז' ברזולוציה גבוהה יותר המפורטת בהקדמה לעיל בעבודההקודמת 34.

בשלב 3 של סעיף הפרוטוקול, נעשה שימוש ב-assay חוצי הגבול(איור 2)כדי להשוות את היכולות של סוג הבר והמדכא מבודד, תחילה לנחיל, ולאחר מכן לחצות את הגבול ולנועול על אגר בתוספת קנאמיצין. התוצאות מראות כי שני הזנים הגיעו לגבול בזמן דומה (נתונים שלא הוצגו) המצביעים על שיעורים דומים של נחיל מנקודת חיסון זהה. עם זאת, הצלבה של הנחיל מימין (אנטיביוטיקה) התא היה שולי, אבל בעקביות גדול יותר עבור סוג הבר מאשר המדכא ב 20 מיקרוגרם / mL kanamycin(איור 4). ההבדל בין שני הזנים היה בולט יותר ב 40 מיקרוגרם / mL kanamycin. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שהמוטציות ב-rssB ששיקמו את תנועתיותן על לוחות אגררכים (איור 1D),משפיעות לרעה על העמידות האנטיביוטית של זן המדכא במהלך ההסתערות(איור 4).

Figure 1
איור 1: עשייה רכה-אגרה והופעה של זיקוקי מדכא.
הלוחות מכילים LB מוצק עם 0.3 % w / v אגר. זני E. coli חוסנו במרכז כל צלחת ודגרו ב 30 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות, למעט C, אשר היה דגירה במשך 16 שעות (A) סוג פראי E. coli (AW405). (B)גרסה לקויה תנועתיות ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (ג)כמו ב', למעט זמני דגירה ארוכים יותר. החצים מצביעים על 'זיקוקים' נעים מהר יותר המתעוררים בטבעת ההיקפית של מושבת השחייה המתרחבת. (ד)מדכא מבודד מהתלקחות ב- C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמטי להקמת בסיס לוחיות מעבר גבול.
(A)יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר נחיל (עם אנטיביוטיקה רצויה) לתוך החדר הימני של צלחת פטרי מחולקת עד לרמה עם מחיצת פלסטיק ולאפשר להגדיר עם מכסה סגור. (B)מלא את התא השמאלי עם ~ 30 מ"ל של שחייה או אגר נחיל עד לנקודת המגע עם החלק העליון של מחיצת הפלסטיק. (C)השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לגרור בעדינות את אגר הנחיל המותך מעבר לגבול, ובכך לחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה ~ 1 מ"מ ולאפשר להגדיר עם מכסה סגור. (D)אפשר לצלחת להתייבש עוד יותר בטמפרטורת החדר למשך הלילה לפני חנק התא השמאלי עם המתח הרצוי, ודגרה ב 30 °C .. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תכונות מוטוריות של זנים שונים כפי שנמדדו בטכניקת קשירת התאים.
סוג פראי (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442), והמדכא שלה (JP1836) גדלו ב- LB ב 30 °C עד שלב בינוני מעריכי לפני קשירה. (A)סיבובים לדקה (הושלמו 360° סיבובים), ו - (B)הטיה CW (שבריר של מנועי זמן לסובב בכיוון CW). סטיית תקן של הממוצע (±). 20 תאים קשורים נצפו במשך 60 שניות בכל זן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התקפות חוצות גבולות.
תרביות שלב מעריכיות של E. coli מסוג בר (AW405) ומוטנט המדכא (JP1836) חוסנו במיקום המצוין (*) בתא השמאלי של הלוח המחולק המכיל מדיה נחיל, ודגר ב 30 °C (50 °F). הם הגיעו לגבול בזמנים דומים. הלוחות דוגרו במשך 6 שעות נוספות, שבמהלכן נחצה הנחיל אל התא הימני, שבו נווספה התקשורת לקנאמיצין (קאן; המספרים מצביעים על מיקרוגרם/מ"ל). הצלחות מייצגות שלושה שכפולים ביולוגיים שכל אחד מהם נעשה בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הכנת שקופית תא לקשירת תאים. (א)הנח שתי חתיכות של סרט דו- צדדי לפני (B) באמצעות סכין גילוח כדי לקצץ את העודף. (C)לקלף את השכבה העליונה כדי לחשוף את הדבק לפני (D)הצמדת כיסוי ולחץ עליו בעדינות למיקום (מסומן על ידי [ ), להבטיח את כל האוויר נדחף מתוך הממשק בין כיסוי וקלטת להלן. (E)דגימת עומס (מוצגת כאן עם צבע טעינת DNA [30% v / v גליצריל, 0.25% w / v ברומופנול כחול, ו 0.25% w / v קסילן ציאנול] הוסיף כדי לסייע בהדמיה) לחלק העליון של הערוץ שנוצר (חץ) בעוד (F) שקוע על נקי, רקמה משימות לנגב כדי לעזור לצייר את הפתרון דרך התא כמו הרקמה סופג את הנוזל (חץ) בערוץ ומושך אותו דרך. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

וידאו 1: סיבוב של תאי אי-קולי קשורים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2: נחיל E. coli פעיל שצולם תחת הגדלה של פי 60, מדגים את התנועה המסתובבת האופיינית לו מאחורי קצה החזית הנעה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבידוד והאפיון של מוטציות מדכאות תרמו בהצלחה לזיהוי מרכיבים מרכזיים של מערכת הכימוטקסי35,36,37, כמו גם את המכונות המוטוריות עצמן38,39,40. בעת השימוש בפרוטוקול 1, חשוב לכלול שכפולים עצמאיים מרובים כדי להבטיח בידוד של ספקטרום גדול של מוטציות אפשריות שיכולות לפצות על אובדן תנועתיות. הגדלת מספר החיידקים על ידי פסים של התרבות בשורה ולא נקודה, יכול לשפר את הסיכויים לייצר מדכאים41. בידוד של אותה מוטציה (כפי שנקבע על ידי ריצוף DNA) מספר פעמים מגביר את הביטחון באותנטיות שלה. WGS תמיד יחשוף את נוכחותם של מוטציות אחרות בגנום. לכן חשוב לאמת את התוצאות על ידי טרנסולציה (במידת האפשר) המוטציה המזוהה בחזרה לרקע המקורי של תנועתיות לקויה. הגישה המוטנטית המדכאת מושרשת בשיקום הפונקציה באמצעות מוטציה משנית, כך שמגבלה של שיטה זו היא שאם גן מבני קריטי נמחק, כלומר, כזה העומד בבסיס המסלול או המבנה כולו, ייתכן שאין היקף לפיצוי. למרות היותנו שיטה ישנה, העבודה האחרונה שלנו34 מדגימה את התועלת המתמשכת שלה בהבהרת מסלולים חדשים התורמים תנועתיות חיידקית.

לכימות של פלט מוטורי, הגישה של קשירת תאים נותרה כלי נגיש אוניברסלית הדורש רק מיקרוסקופ עם קובץ מצורף למצלמה. קשירת תאים כבר שימשה במספר מגוון של מינים חיידקיים כולל סלמונלה42, פסאודומונס43, סטרפטוקוקוס44 ורודובקטריה33. הצלחת הפרוטוקול מותנית במידה רבה בהטמה נכונה ובהצמדה של תאים. גיזום אגרסיבי מדי או השמטת ההפסקה בין מזמרה (2.1.5) נוטה לקדם גיזום לא עקבי או לא שלם של חוטים, וכתוצאה מכך תאים או תאים שאינם רוטיים קשורים על ציר מוטה. הרלוונטיות המתמשכת של פרוטוקול זה נותרה בעינה, למרות אימוץ חרוזים ברזולוציה גבוהה יותר על ידי קבוצות מחקר רבות (כולל שלנו). המגבלה העיקרית של חרוז אסד נובעת מהצורך של החרוז לדבוק חוט החיידקים של עניין. טכניקה זו נהנתה מאוד ממחקרים ב- E. coli שזיהו אלל 'דביק' פלאפלין, המאפשרדבקות 45. הגרסה הדביקה עדיפה גם על ההסתה הקשורה לתא. גרסה כזו עדיין לא זמינה עבור רוב החיידקים המנוכרים. המצב מסובך עוד יותר עם כמה אורגניזמים בעלי חלבונים flagellin מרובים46, ובמקרה של Vibrio sp., גם בעל נדן membranous47. קשירת תאים יכולה להתבצע גם באמצעות נוגדן אנטי-פלאקלין ספציפי למין או נוגדן לתג אפיטופ מהונדס.

בעוד חיידקים יכולים לשחות מיד עם הכניסה למדיום נוזלי, זה לא נכון של נחיל, שבו תאים חייבים להיות מוכנים תחילה למצב נחיל. מגע פני השטח מפעיל שינוי פיזיולוגי הנדרש לתאים ליזום נחיל48,49,50,51, וכתוצאה מכך שלב השהיה והצטברות של צפיפות תאים גבוהה. שינויים פיזיולוגיים כוללים שיפוץ של מערכת chemotaxis ב E. coli16, והתאמות כגון התא ו / או hyperflagellation עבור חיידקים אחרים13,14,21. בהתחשב בשינויים הפיזיולוגיים הנדרשים כדי ליזום נחיל, אנו מכים הערת אזהרה על מחקרים שניסו לחקות היבטים נבחרים של נחיל - כגון צפיפות גבוהה או אורך תאים מוגבר - פשוט על ידי ריכוז תרביות תאים פלנקטוניים כדי להגדיל את הצפיפות, ו / או גרימת התא באמצעות אנטיביוטיקה המעכבת חלוקת תאים52,53. אם משתמשים בהארכת תאים כסמן, אנו מזהירים גם כי בהשוואה לתאים פלנקטוניים, יש רק עלייה שולית באורך הממוצע של תאים שנפוחים בסלמונלה או E. coli54. קשה יותר לבסס מבדינות נחיל מאשר לשחות. המשתנים כוללים את המקור המסחרי של אגר המשמש לביסוס המדיה (אגר אייקן המיוחד חיוני להסתערות ב- E. coli, ואילו אגר Difco הסטנדרטי יותר תומך נחיל לכל החיידקים האחרים), שימוש במדיה עשירה לעומת מינימלית(E. coli וסלונלה דורשים תוספי גלוקוז), והכי קריטי הסביבה לחות2,13,14,21. מתורבים, שמירה על לחות אופטימלית יכולה להיות המתסכלת ביותר. [אופטימיזציה מצוינת, שיטתית, לנחיל באורגניזם של בחירה(פסאודומונס ארוגינוזה)הודגמה על ידי מוראלס-סוטו ועמיתים לעבודה55.] התקשורת הנחיל חייב להיות לח מספיק כדי לקדם נחיל אבל לא כל כך לח כמו לאפשר התפשטות פסיבית / הזזה, אשר ניתן לטעות בקלות עבור נחיל פעיל56. לכן זה קריטי כי נחילים להיבדק תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את דפוסי התנועה המובהקים הקשורים תנועתיות קולקטיבית זו (וידאו 2). הטמפרטורה היא גם שיקול חשוב לאופטימיזציה של בדיקת הנחיל. טמפרטורות גבוהות יותר, למשל 37 °C (50 °F), ייבש את הצלחות מוקדם יותר מ 30 °C (50 °F). שימוש באינקובטור עם בקרת לחות (~ 70-80%) יכול לעזור למתן בעיות אלה, כולל שינויים עונתיים שיכולים להשפיע על טמפרטורות הבנייה הפנימית והלחות. לאחר שהוקם בהצלחה, פרוטוקול 3 מספק דרך רבת עוצמה לחקור את אחד ההיבטים המעניינים ביותר של חיידקים נוהרים, עמידות גבוהה לאנטיביוטיקה17. כל הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן להחיל על אורגניזמים חדשים כדי לזהות מסלולים המציינים ולשלוט תנועתיות תיווך flagella.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM118085 ובחלקו על ידי קרן רוברט וולש (מענק F-1811 ל- R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 159 חיידקים כימוטקסיה Escherichia coli פלאגלה מנוע סיבובי תנועתיות שחייה נחיל חישת פני השטח תנועתיות פני השטח
חקירת תנועתיות מונחית <em>פלאגלה באשריצ'יה קולי</em> על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter