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Biology

एक श्रृंखला में तीन स्थापित तकनीकों को लागू करके एस्चेरिचिया कोलाई में फ्लैगेला-चालित गतिशीलता की जांच

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

कई बैक्टीरिया अपने पर्यावरण को नेविगेट करने और व्यक्तिगत रूप से और सामूहिक रूप से अनुकूल परिवेश को उपनिवेश बनाने के लिए फ्लैगेला-चालित गतिशीलता का उपयोग करते हैं। यहां प्रदर्शित तीन स्थापित तरीकों का उपयोग है जो तैराकी और झुंड गतिशीलता में योगदान देने वाले घटकों/रास्तों की पहचान करने के लिए एक चयन उपकरण के रूप में गतिशीलता का दोहन करते हैं ।

Abstract

गतिशीलता कई जीवाणु प्रजातियों के अस्तित्व और सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। सिग्नलिंग रास्तों को समझने, फ्लैगलर भागों के फ़ंक्शन और असेंबली को स्पष्ट करने और आंदोलन के पैटर्न की जांच करने और समझने के लिए गतिशीलता का फायदा उठाने के लिए कई तरीके मौजूद हैं। यहां हम इनमें से तीन पद्धतियों का संयोजन प्रदर्शित करते हैं । नरम आगर में गतिशीलता सबसे पुरानी है, जो गतिशीलता-बिगड़ा उपभेदों में लाभ-कार्य दमन म्यूटेशन को अलग करने के लिए एक मजबूत चयन की पेशकश करती है, जहां गतिशीलता को दूसरे उत्परिवर्तन के माध्यम से बहाल किया जाता है। सेल-टेदरिंग तकनीक, पहले फ्लैगलर मोटर की रोटरी प्रकृति को प्रदर्शित करने के लिए नियोजित, मोटर गति पर सिग्नलिंग प्रभावकों के प्रभाव और घूर्णन दिशा को स्विच करने की क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। "सीमा पार" परख और अधिक हाल ही में है, जहां तैराकी बैक्टीरिया एक झुंड के रूप में सामूहिक रूप से आगे बढ़ने में संक्रमण के लिए primed किया जा सकता है । संयोजन में, ये प्रोटोकॉल गतिशीलता मशीनरी के घटकों की पहचान करने और तैराकी और झुंड के विभिन्न पहलुओं में उनकी भूमिका की विशेषता के लिए एक व्यवस्थित और शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। उन्हें अन्य जीवाणु प्रजातियों में गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

बैक्टीरिया अपने पारिस्थितिक निकस में आंदोलन और फैलाव के लिए कई उपांगों को नियोजित करते हैं1. फ्लैगेला-चालित गतिशीलता इनमें से सबसे तेज़ है, जो पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में अनुकूल स्थानों के उपनिवेशीकरण को बढ़ावा देता है, और कुछ प्रजातियों2, 3की रोगजनक क्षमता में महत्वपूर्ण योगदानदेताहै। फ्लैगलेटेड बैक्टीरिया थोक तरल में व्यक्तिगत रूप से तैर सकते हैं, या एक अर्ध-ठोस सतह 4 पर एक सामूहिक के रूप में झुंड कर सकतेहैं। झिल्लीमें एम्बेडेड रोटरी मोटर्स द्वारा एक्सट्रासेलुलर फ्लैगेला संलग्न और संचालित होता है, जो आयन ग्रेडिएंट की शक्ति का उपयोग टोक़ उत्पन्न करने के लिए करता है जो रोटेशन1,2, 4, 5,6,7, 8का कारणबनताहै। ई. कोलाईमें, जिनकी मोटर्स एक निरंतर टोक़9पर चलती हैं, मोटर आउटपुट को घूर्णन गति और काउंटर-क्लॉकवाइज (सीसीडब्ल्यू) और दक्षिणावर्त (सीडब्ल्यू) दिशाओं के बीच रोटर के स्विचन के मामले में वर्गीकृत किया जा सकता है। सीसीडब्ल्यू रोटेशन एक सुसंगत फ्लैगलर बंडल के गठन को बढ़ावा देता है जो सेल को आगे (रन) को आगे बढ़ाता है, जबकि घूर्णन दिशा (सीडब्ल्यू) में एक क्षणिक स्विच बंडल को आंशिक रूप से या पूरी तरह से10को अलग करने का कारण बनता है, और सेल अपनी तैराकी दिशा (टम्बल) को फिर से उन्मुख करने के लिए। ई. कोलाई आम तौर पर एक दूसरे के लिए चलाने के लिए और एक दूसरे के दसवें के लिए टंबल । रोटर या 'टम्बल पूर्वाग्रह' की आवृत्ति को स्विच करना केमोटैक्सिस सिग्नलिंग सिस्टम द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें ट्रांसमेम्ब्रान केमोरेसेप्टर बाहरी रासायनिक संकेतों का पता लगाते हैं और उन्हें फास्फोरेले के माध्यम से फ्लैगर मोटर के माध्यम से संचारित करते हैं ताकि आकर्षित करने वालों के जवाब में रन का विस्तार किया जा सके, या विषाक्त रसायनों के जवाब में उन्हें दबाया जा सके11,12। तैराकी गतिशीलता 0.3% नरम आगार में परख की गई है।

झुंड के दौरान, बैक्टीरिया एक घने सामूहिक के रूप में एक अर्ध-ठोस सतह पर नेविगेट करते हैं, जहां बैक्टीरिया के पैक निरंतर घूमता गति2,13,14, 15में प्रवाहित होते हैं। ई. कोलाई झुंड बदल केमोसेंसोरी फिजियोलॉजी (कम टम्बल पूर्वाग्रह), उच्च गति, और थोक तरल16,17में तैराकी कोशिकाओं पर रोगाणुरोधी के लिए उच्च सहिष्णुता का प्रदर्शन । स्अर्स अपनी ढेरों रणनीतियों की तैनाती में भिन्न होते हैं जो सर्फेक्टेंट उत्पादन, हाइपरफ्लेवेलेशन और सेल विस्तार2सहित आंदोलन को सहायता करते हैं। झुंड18 , 19,20दोनों पारिस्थितिक और नैदानिक सेटिंग्स में बैक्टीरियाको प्रतिस्पर्धीलाभ प्रदान करता है। झुंड बैक्टीरिया की दो श्रेणियां हैं: शीतोष्ण झुंड, जो केवल मीडिया पर 0.5-0.8% आगर के साथ जम सकता है, और मजबूत झुंड, जो उच्च आगार सांद्रता21में नेविगेट कर सकते हैं।

तैराकी गतिशीलता और उसके नियमन से पूछताछ करने के लिए विभिन्न प्रकार की परख मौजूद हैं। उत्परिवर्तन या पर्यावरणीय स्थितियों से बिगड़ा होने पर, गतिशीलता ही लाभ-कार्य दमन उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए एक मजबूत चयन प्रदान करती है। ये दमन मूल उत्परिवर्तन, या छद्म-revertants के वास्तविक revertants हो सकते हैं, जहां एक दूसरा उत्परिवर्तन कार्यक्षमता को पुनर्स्थापित करता है। इस तरह के म्यूटेंट की पहचान पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) द्वारा की जा सकती है। निष्पक्ष दमन चयन का एक विकल्प एक पक्षपातपूर्ण लक्षित म्यूटागेनेसिस रणनीति (उदाहरण के लिए, पीसीआर म्यूटागेनिस) है। ये पद्धतियां अक्सर गतिशीलता तंत्र के कार्य या पर्यावरणीय नियमन पर प्रकाश डालते हैं। यदि लक्ष्य मोटर फ़ंक्शन का अध्ययन करना है, तो नरम एगर में मापा जाने वाला जंगली प्रकार की गतिशीलता की बहाली जरूरी नहीं कि जंगली प्रकार के मोटर उत्पादन की बहाली का संकेत दे सके। सेल-टेदरिंग परख, जिसमें कोशिकाओं को एक ही ध्वजारोहण द्वारा एक कांच की सतह से जोड़ा जाता है और कोशिका शरीर के घूर्णन की बाद में निगरानी की जाती है, मोटर व्यवहार का आकलन करने के लिए पसंद की प्रारंभिक परख हो सकती है। यद्यपि मोटर गुणों की निगरानी के लिए अब अधिक परिष्कृत पद्धतियां उपलब्ध हैं, लेकिन गति विश्लेषण के लिए आवश्यक हाई-स्पीड कैमरा सेट-अप और सॉफ्टवेयर पैकेजों का उपयोग उनके व्यापक उपयोग22,23,24, 25को सीमित करता है। सेल-टेदरिंग परख के लिए केवल यह आवश्यक है कि फ्लैगेला को कतराया जाए, जिससे छोटे फिलामेंट्स को ग्लास स्लाइड में लगाव हो, जिसके बाद सेल शरीर के रोटेशन को वीडियोटेप किया जाता है। यद्यपि दर्ज की गई मोटर गति इस परख में कम है क्योंकि सेल शरीर फ्लैगेलम पर उच्च लोड करता है, फिर भी इस परख ने केमोटाटिकप्रतिक्रियाओं26, 27, 28,29में मूल्यवान अंतर्दृष्टि में योगदान दिया है, औरनीचेचर्चा के अनुसार एक वैध खोजी उपकरण बना हुआ है।

झुंड गतिशीलता शोधकर्ताओं के लिए चुनौतियों का एक अलग सेट बन गया है । लाभ के कार्य दमन का चयन केवल झुंड में काम करता है जो प्रचुर सर्फेक्टेंट और झुंड का उत्पादन आसानी से13करते हैं। ई कोलाई जैसे सर्फेक्टेंट गैर-उत्पादक पर्यावरण2,13,14,21 के आगर, मीडिया संरचना और आर्द्रता की पसंद के संबंध में दुराग्रहीहैं। एक बार झुंड की स्थिति स्थापित कर रहे हैं, सीमा पार परख17 एक झुंड की क्षमता से पूछताछ करने के लिए नए/कठोर परिस्थितियों नेविगेट करने के लिए एक उपयोगी पद्धति है । हालांकि नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल ई. कोलाईसे संबंधित हैं, उन्हें अन्य प्रजातियों में आवेदन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. गतिशीलता की कमी उपभेदों में दबाने वाले म्यूटेंट का अलगाव

नोट: गतिशीलता दोष की सामान्य प्रकृति की पहचान करने के लिए इस विधि का उपयोग एक व्यापक 'कैच-ऑल' के रूप में करें।

  1. सॉफ्ट-अगर प्लेट तैयार करना
    नोट: सॉफ्ट-एगर, जिसे गतिशीलता या तैरना-आगर भी कहा जाता है, एक कम प्रतिशत एगर (~ 0.2-0.35% w/v), लंबे समय से केमोटैक्सिस31,32को परखने के लिए उपयोग किया जाता है।
    1. 3 ग्राम बैक्टो-एगर (0.3% w/v) और 20 ग्राम पौंड को 2 एल राउंड बॉटम फ्लास्क में जोड़ें। फ्लास्क में डीडीएच 2 ओ (डबल-डिस्टिल्ड वॉटर) के1एल जोड़ें और एक हलचल रॉड और चुंबकीय सरगर्मी प्लेट का उपयोग करके निलंबन को समान रूप से मिलाएं।
    2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
    3. ऊपर के रूप में रॉड/प्लेट का उपयोग कर कोमल आंदोलन के साथ शांत करने के लिए अनुमति दें । जब तापमान लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, तो बाँझ पेट्री व्यंजन (100 मिमी x 15 मिमी) में 25 एमएल डालें, और पिघले हुए एगर को कम से कम 1 घंटे के लिए ढक्कन के साथ सेट करने की अनुमति दें, 16 घंटे के भीतर उपयोग के लिए।
  2. संस्कृति की तैयारी, टीका, और दमनक म्यूटेंट का अलगाव
    नोट: ई. कोलाई पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया के केंद्र में टीका नरम आगर के साथ जम स्थानीय रूप से पोषक तत्वों का उपभोग, एक पोषक तत्व ढाल है कि वे पालन बनाने । जैसे ही वे जावक होते हैं, परिभाषित 'छल्ले' दिखाई देते हैं(चित्रा 1 ए),जो बैक्टीरिया के जवाब में विशिष्ट रसायन से संबंधित होते हैं। या तो केमोटैक्सिस प्रणाली या फ्लैगेला मोटर के संरचनात्मक घटकों में दोष इस परख में प्रदर्शन से समझौता कर सकते हैं। अक्सर, स्क्रीनिंग के दौरान एक गतिशीलता लाभ वाले म्यूटेंट उत्पन्न होते हैं, और रिंग की परिधि के साथ एकल या कई बिंदुओं से उभरते हुए देखे जा सकते हैं, जहां से वे 'भड़कते'(चित्रा 1C)। एक नोटिस जाएगा कि तैराकी के मोर्चे के सबसे बाहरी किनारे uncolonized कुंवारी नरम आगर के खिलाफ आसानी से विरोधाभासों ।
    1. लेनोक्स शोरबा (एलबी; 10 ग्राम/एल ट्राइप्टोन, 5 जी/एल खमीर निकालने, और 5 जी/एल एनएसीएल, सामग्री की तालिका)में क्षैतिज मिलाते हुए (220 आरपी.पी..m.) के 5 एमएल में वांछित गतिशीलता की कमी वाले तनाव की रातोंरात संस्कृतियों को बढ़ाएं। अगले दिन, ताजा पौंड में उप-संस्कृति (1:100 कमजोर पड़ने) एक ही शर्तों के तहत घातीय चरण(०.६ के ओडी ६००) के लिए बढ़ रही है ।
    2. एक पिपेट का उपयोग करके एक नरम-आगर प्लेट (1.1) के केंद्र में संस्कृति के 6 माइक्रोन को टीका लगाते हैं, जो सामग्री को धीरे-धीरे निष्कासित करने के लिए एगर में लोड किए गए बाँझ टिप को धक्का देते हैं। 30 डिग्री सेल्सियस और इनक्यूबेट(चित्रा 1 B)में स्थानांतरित करें, जब तक कि गतिशीलता 'फ्लेयर्स' स्पष्ट न हो, टीका बिंदु या गतिशीलता के छल्ले की परिधि से निकलती है, आमतौर पर 24-36 एच(चित्रा 1 सी)में।
      नोट: गतिशीलता परख में, तुलना के लिए उत्परिवर्ती आइसोलेट्स के साथ एक जंगली प्रकार के तनाव को टीका लगाते हैं। यह जंगली प्रकार का तनाव विशेषता गाढ़ा केमोटेक्टिक छल्ले(चित्रा 1A) दिखाएगाऔर 8-10 घंटे के भीतर प्लेट भरेगा।
    3. एक बाँझ तार लूप का उपयोग करने के लिए ' भड़कना ' क्षेत्र और लकीर से कोशिकाओं को उठाने के लिए एक पौंड हार्ड आगर प्लेट पर एकल कालोनियों को शुद्ध (ऊपर के रूप में तैयार पौंड, 15 जी के साथ जम/
    4. एक बाँझ तार पाश का उपयोग कर लकीर प्लेट से एकल कालोनियों उठाओ और एक ' शुद्ध ' कॉलोनी अलग के अलगाव सुनिश्चित करने के लिए एकल कालोनियों के लिए लकीर द्वारा फिर से शुद्ध ।
  3. पुष्टि, और दमनक म्यूटेंट की विशेषता
    1. पुष्टि करें कि अलग-थलग दबाने वाले उत्परिवर्ती (ओं) ने गतिशीलता बहाल कर दी है। नरम-आगर प्लेटें (1.1), और ब्याज के उपभेदों के लिए संस्कृतियों (1.2.1 के रूप में), जंगली प्रकार और तुलना के लिए शुरू 'गतिशीलता की कमी' तनाव सहित तैयार करें।
    2. प्लेटों को टीका लगाएं (जैसा कि 1.2.2 में) और 8-10 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. सबसे बाहरी अंगूठी (सर्कल के किनारे) के व्यास को रिकॉर्ड करें और यह स्थापित करने की तुलना करें कि किस आइसोलेशन ने काफी हद तक गतिशीलता बहाल की है।
      नोट: यह सिफारिश की जाती है कि प्लेटों को प्रयोग के समय-पाठ्यक्रम के दौरान फोटो खिंचवाने के लिए। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, "प्रकाश की बाल्टी" डिवाइस30का उपयोग करें, जहां तैरने वाले कॉलोनी के व्यास को मापने और इसे अनकोलोनाइज्ड एगर से अलग करने के लिए बेहतर रोशनी के लिए एक प्रकाश स्रोत के ऊपर एक डिजिटल कैमरा रखा गया है।
    4. विषय सत्यापित डब्ल्यूजीएस को आवश्यकतानुसार अलग करता है, जिससे पर्याप्त 'अनुक्रम कवरेज' की अनुमति मिलती है ताकि जंगली प्रकार के कार्य को बहाल करने वाले म्यूटेशन की सकारात्मक पहचान की जा सके।

2. सेल टेदरिंग के माध्यम से फ्लैगेला मोटर व्यवहार की मात्रा निर्धारित करना

नोट: इस विधि का उपयोग तब करें जब सामान्य रन-टम्बल व्यवहार (केमोटैक्सिस) से समझौता किया जा सकता है।

  1. संस्कृति की तैयारी और ध्वज कतरनी
    1. चरण 1.2.1 में वर्णित ब्याज के तनाव की एक घातीय चरण संस्कृति तैयार करें।
    2. फिल्टर-स्टरलाइज्ड मोटिविटी बफर (एमबी; के 10 एमएल में रीसस्टपेंडिंग से पहले 3 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं की 10 मिलीएल 10 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट बफर [0.0935 एम के2एचपीओ4,0.0065 एम केएच2पीओ4,पीएच 7.0], 0.1 एमएम ईडीटीए [पीएच 7.0], 10 एमएम एनएसीएल, 75 एम एम केसीएल)।
      नोट: एमबी गतिशीलताका समर्थन करताहै, लेकिन बैक्टीरियल विकास का समर्थन नहीं करता है
    3. एमबी के 1 एमएल में अंतिम गोली को फिर से खर्च करने से पहले दो बार कदम दोहराएं।
    4. सेल सस्पेंशन को 1 एमएल सिरिंज में ट्रांसफर करें और अंत में 23G सुई अटैच करें । एक समान सिरिंज/सुई उपकरण इकट्ठा और पॉलीथीन ट्यूबिंग के 6 इंच के माध्यम से दोनों को एक साथ देते है (०.५८ मिमी के भीतरी व्यास) कसकर प्रत्येक सुई टिप पर म्यान ।
    5. फ्लैगेला कतरनी (वे नाजुक हैं और आसानी से टूटते हैं) धीरे-धीरे सेल निलंबन को एक सिरिंज से दूसरे 50x तक आगे और पीछे से गुजरते हैं, जिसमें हर 10 पास के बीच 1 मिनट रुकता है।
    6. 3 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर कतरनी कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और एमबी के 500 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में रीसुस्पेंड करें।
  2. स्लाइड तैयारी और सेल टेदरिंग
    1. डबल-तरफा टेप(चित्रा S1)से अलग 3 इंच x 1 इंच ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 18 मिमी x 18 मिमी कवरस्लिप को स्टैक करके एक सेल फिक्सेशन चैंबर तैयार करें।
    2. चैंबर के ऊपर पर आवेदन करके 0.01% (w/v) पॉली-lysine समाधान के साथ कक्ष फ्लश करें। चैंबर(चित्रा S1)के माध्यम से समाधान आकर्षित करने में मदद करने के लिए एक टास्क वाइपर (ऊतक कागज) पर नीचे किनारे (माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ कवरलिप फ्लश) झुकाव । फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    3. चरण 2.2.2 में वर्णित एमबी के 40 माइक्रोन के साथ कक्ष को तीन बार धोएं
    4. कक्ष के शीर्ष पर कतरनी सेल निलंबन (ऊपर तैयार) के 40 μL जोड़ें और कोशिकाओं को कवरस्लिप से जुड़ने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    5. धीरे-धीरे असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए 2.2.3 के रूप में एमबी के 40 माइक्रोन के साथ कक्ष फ्लश करें।
  3. सेल रोटेशन रिकॉर्डिंग और मात्राकरण
    1. टेथर्ड कोशिकाओं से भरी माइक्रोस्कोप स्लाइड को माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें।
    2. चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी और 100x उद्देश्य का उपयोग करके, उन कोशिकाओं के लिए जनसंख्या को स्कैन करें जो जगह में तय हैं, और एक ही धुरी पर घूर्णन करते हैं, यानी, एक कोण पर पेश करने के बजाय एक निश्चित बिंदु पर चिकनी घूर्णन जिसमें सेल फोकस में और बाहर चलता है(वीडियो 1)।
    3. एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप और संबद्ध कैमरे का उपयोग करें। संबद्ध सॉफ्टवेयर खोलें, यह सुनिश्चित करें कि ब्याज की कोशिकाएं ध्यान में हैं और एक मिनट के लिए सेल रोटेशन रिकॉर्ड करने के लिए वीडियो अधिग्रहण पर क्लिक करें (प्रति सेकंड या उससे अधिक 10 फ्रेम पर)।
    4. वीडियो प्लेबैक से, प्रति मिनट पूर्ण घूर्णन की संख्या और सेल की दिशा (आवृत्ति स्विचकरने) की संख्या की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: घूर्णन गति और स्विचिंग आवृत्ति आंखों से गेज करने के लिए बहुत तेज हो सकती है इसलिए वीडियो सॉफ्टवेयर का उपयोगकरने की सिफारिश की जाती है जो धीमी गति से/ एक विकल्प के लिए मिथाइल सेल्यूलोज (या इसी तरह के एजेंट) का उपयोग कर एमबी की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए धीमी गति से मदद और तेजी से बैक्टीरिया के रोटेशन को हल करने या क्षतिपूर्ति जब कम framerates के साथ कैमरों का उपयोग कर रहे है होगा ।
    5. ब्याज की आबादी का प्रतिनिधित्व संकलित करने के लिए जैविक प्रतिकृति के साथ चरण 2.3.2 दोहराएं।

3. सीमा पार परख में झुंड की तैयारी

नोट: समूह गतिशीलता पर उत्परिवर्तन या स्थिति के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग करें। झुंड-आगर आगर को संदर्भित करता है जहां प्रतिशत आमतौर पर नरम-आगर की तुलना में अधिक होता है। नरम आगर (0.3%) में, कोशिकाएं आगर के अंदर व्यक्तिगत रूप से तैरती हैं। झुंड आगर (0.5% और उससे ऊपर) में, कोशिकाएं सतह पर एक समूह के रूप में आगे बढ़ती हैं। जबकि झुंड प्लेटों यहां विस्तृत के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, तैरना प्लेटों एक लंबे समय तक शेल्फ जीवन है, और कई दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारी व्यक्तिगत पसंद 1-2 दिनों में उपयोग करना है।

  1. झुंड आगर की तैयारी
    1. एक 2 एल गोल नीचे फ्लास्क करने के लिए Eiken आगर (०.५% w/v) और पौंड के 20 ग्राम के 5 जी जोड़ें । फ्लास्क में डीडीएच 2 ओ के1एल जोड़ें और एक हलचल रॉड और चुंबकीय सरगर्मी प्लेट का उपयोग करके निलंबन को समान रूप से मिलाएं।
    2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
    3. ऊपर के रूप में रॉड/प्लेट का उपयोग कर किसी भी हवा बुलबुले से बचने के लिए कोमल आंदोलन के साथ शांत करने के लिए अनुमति दें । जब लगभग 50 डिग्री सेल्सियस, 0.5% की अंतिम एकाग्रता के लिए फिल्टर-निष्फल ग्लूकोज जोड़ें।
    4. बाँझ पेट्री व्यंजन (100 मिमी x 15 मिमी) में 25 एमएल डालें और कम से कम 14 घंटे और 20 घंटे से अधिक समय तक कमरे के तापमान पर सेट करने की अनुमति दें। भविष्य के उपयोग के लिए स्टोर न करें।
  2. झुंड प्लेटों का टीका और इनक्यूबेशन
    1. एगर के शीर्ष पर खोलना द्वारा एक मध्य घातीय संस्कृति (1.2 में के रूप में तैयार) के 6 μL टीका।
    2. ढक्कन को 5-10 मिनट के लिए छोड़ दें और जब आरोहण सतह में सूख गया हो तो बदलें।
    3. 8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। ढक्कन को हटाकर झुंड प्रगति का निरीक्षण करने के प्रलोभन से बचें, क्योंकि यह आगर को सुखाने और झुंड को ख़राब करने में योगदान देगा।
      नोट: इनक्यूबेशन समय तनाव फेनोटाइप के आधार पर भिन्न हो सकता है। कुछ अलग उत्परिवर्तन झुंड की क्षमता में बाधा डाल सकते हैं और आगर के कम प्रतिशत या इनक्यूबेशन की एक अधिक लंबी अवधि की आवश्यकता होगी ।
  3. सीमा पार परख प्लेटों की तैयारी
    नोट: यह परख एक संशोधित पेट्री डिश का उपयोग करती है, जहां एक प्लास्टिक डिवाइड (सीमा) एक(चित्रा 2A)के बजाय दो कक्षों बनाता है। प्रत्येक कक्ष को दूसरे से स्वतंत्र रूप से तैयार किया जा सकता है, जो दोनों को 'जोड़ने' से पहले झुंड के लिए अलग-अलग शर्तों की पेशकश करता है। प्रायोगिक डिजाइन के आधार पर, पहले कक्ष (नामित बाएं) या तो तैरने वाला (०.३% w/v) या झुंड आगर (०.५% w/v) के साथ तैयार किया जा सकता है जहां से बैक्टीरिया सीमा पार झुंड आगर वाले सही कक्ष में स्थानांतरित कर सकते हैं +/-किसी भी आवश्यक पूरक या चुनौती (जैसे, एंटीबायोटिक्स) । या तो आगर पर प्रवासन आम तौर पर मापा जाता है/टीका के मूल बिंदु से जीवाणु उपनिवेशीकरण (किनारे से किनारे) के व्यापक व्यास रिकॉर्डिंग द्वारा तुलना की जाती है ।
    1. यदि आवश्यक हो तो 1.1 में वर्णित तैरना एगर तैयार करें।
    2. 3.1 में वर्णित झुंड आगर तैयार करें।
    3. एक दोहरे डिब्बे पेट्री डिश (१०० मिमी x 15 मिमी) के दाहिने कक्ष में झुंड आगर के ~ 30 एमएल डालो, जहां यह कक्षों के बीच प्लास्टिक डिवाइडर के साथ स्तर है, लेकिन बाईं ओर(चित्रा 2B)में बह नहीं है ।
    4. आगर के कठोर होने के बाद, बाएं कक्ष को ~ 30 एमएल तैरने या झुंड आगर के साथ भरें, फिर से प्लास्टिक विभाजन(चित्रा 2C)के संपर्क के बिंदु पर। सेट करने से पहले, एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करें धीरे से सीमा पर आगर खींचें करने के लिए एक ~ 1 मिमी लंबा आगर पुल है कि विभाजन की पूरी लंबाई(चित्रा 2 डी)के साथ दोनों पक्षों को जोड़ने के लिए ।
    5. कमरे के तापमान (3.1) पर प्लेट को सूखने दें।
      नोट: पुल बनाने का एक वैकल्पिक तरीका बाएं चैंबर आगार को सूखने की अनुमति देता है और फिर धीरे-धीरे दो कक्षों (3.4) को पाटने के लिए प्लास्टिक के डिवाइडर के साथ पिघला हुआ झुंड एगर का ~ 100 माइक्रोन पिपेट करता है। तैरने के लिए ऊपर विस्तृत के रूप में बाएं कक्ष पर प्लेटों टीका (1.2.2) या झुंड (3.2) आगर, 12-16 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग से पहले, या जब तक झुंड सही कक्ष पर पर्याप्त प्रगति की है ब्याज के उपभेदों के बीच तुलना की अनुमति है ।

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Representative Results

एक ई. कोलाई तनाव जिसका गतिशीलता संकेत अणु सी-di-जीएमपी के उच्च स्तर से बिगड़ा हुआ है में छद्म-revertants के अलगाव, हमारे प्रयोगशाला३४से हाल के काम में विस्तृत था । इस तनाव (JP1442) दो म्यूटेशन बंदरगाह:YhjH औरYcgR। YhjH सबसे सक्रिय फॉस्फोडिस्टेरेस है जो ई. कोलाईमें सी-डि-जीएमपी को नीचा दिखाता है । YhjH की अनुपस्थिति से सी-डी-जीएमपी स्तर और गतिशीलता का अवरोध बढ़ जाता है। वाईसीजीआर सी-डि-जीएमपी इफेक्टर है। सी-डी-जीएमपी के साथ परिसर में, वाईसीजीआर पहले सीसीडब्ल्यू मोटर रोटेशन को प्रेरित करने और बाद में मोटर गति को कम करने के लिए फ्लैगलर रोटर से बांधता है। सेल टेदरिंग और मनका परख से पता चला है कि मोटर व्यवहार दोहरे उत्परिवर्ती में सामान्य हो गया, फिर भी नरम आगर में गतिशीलता34नहीं थी। इसलिए, हमने दोहरे उत्परिवर्ती(चित्रा 1C)में छद्म-रीवर फ्लेयर्स को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल के चरण 1 को तैनात किया। डब्ल्यूजीएस (HiSeq 4000 प्लेटफ़ॉर्म, पीई 2 x 150 सेटअप34)द्वारा आरएसएसबीको मैप किए गए अधिकांश म्यूटेशन, जो एक प्रतिक्रिया नियामक/एडाप्टर प्रोटीन के लिए कोड हैं जो आम तौर पर सीएलपीएक्सपी प्रोटीज को गिरावट34के लिए σएस को लक्षित करने का निर्देश देते हैं। इन revertants में से एक है, जो जंगली प्रकार के करीब गतिशीलता प्रदर्शित (AW405, चित्रा 1A, Dकी तुलना), प्रोटोकॉल अनुभाग के चरण 2 और 3 के लिए प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, दोनों अपने दोहरे उत्परिवर्ती माता पिता(चित्रा 1B)और आइसोजेनिक जंगली प्रकार तनाव(चित्रा 1A)को नियंत्रित करता है के रूप में उपयोग कर ।

प्रोटोकॉल अनुभाग के चरण 2 के लिए, प्रति मिनट रोटेशन (प्रत्येक 360 डिग्री पूर्ण रोटेशन) की गणना करने के लिए वीडियो कैप्चर का विश्लेषण किया गया था, और सीडब्ल्यूपूर्वाग्रह (समय मोटर्स का अंश सीडब्ल्यू दिशा में घूमता है, या पूर्वाग्रह को टम्बल करता है)। 11yhjH प्रति मिनट कम घूर्णन और जंगली प्रकार की तुलना में एक कम CW पूर्वाग्रह दिखाया, के रूप में उंमीद(चित्रा 3)। दोनोंYhjH YcgR डबल उत्परिवर्ती और उसके दमन मोटर जंगली प्रकार के समान व्यवहार दिखाया, उच्च संकल्प ' मनका ' पिछले काम३४में ऊपर परिचय में विस्तृत परख का उपयोग कर पिछले विश्लेषण द्वारा समर्थित टिप्पणियों ।

प्रोटोकॉल अनुभाग के चरण 3 के लिए, सीमा पार परख(चित्रा 2)का उपयोग जंगली प्रकार की क्षमताओं की तुलना करने के लिए किया गया था और दमन को अलग-थलग कर दिया गया था, पहले झुंड में, और फिर सीमा पार जाने के लिए और आगर पर झुंड कनमाइसिन के साथ पूरक था। परिणाम बताते हैं कि दोनों उपभेद एक समान समय (डेटा नहीं दिखाए गए) पर सीमा पर पहुंच गए, जो एक समान टीका बिंदु से झुंड की समान दरों का संकेत देता है। हालांकि, सही (एंटीबायोटिक) कक्ष के लिए झुंड के पार से अधिक मामूली था, लेकिन लगातार 20 μg/mL kanamycin(चित्रा 4)पर दमन से जंगली प्रकार के लिए अधिक से अधिक है । दोनों उपभेदों के बीच अंतर ४० μg/mL kanamycin पर अधिक स्पष्ट किया गया था । साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि आरएसएसबी में म्यूटेशन जो नरम-आगर प्लेटों(चित्रा 1D)पर गतिशीलता बहाल करते हैं, झुंड(चित्रा 4)के दौरान दबाने वाले तनाव के एंटीबायोटिक प्रतिरोध को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: नरम-आगर गतिशीलता परख और दमनकर्ता flares के उद्भव।
प्लेटों में 0.3% w/v आगर के साथ एलबी जम जाता है। ई. कोलाई उपभेदों को प्रत्येक प्लेट के केंद्र में टीका लगाया गया था और सी को छोड़कर 8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसे 16 घंटे(ए)वाइल्ड-टाइप ई. कोलाई (AW405) के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था । (B)मोटिविटी-कमी वाले वैरिएंट ∆वाईएचजेएच ∆वाईसीजीआर (जेपी1442) । (ग)बी की तरह, अब इनक्यूबेशन समय को छोड़कर । तीर विस्तार तैरना कॉलोनी के परिधीय अंगूठी में उभर तेजी से चलती 'flares' को इंगित करते हैं। (घ)सी में एक भड़कने से अलग एक दमनक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक सीमा पार प्लेट परख की स्थापना के लिए योजनाबद्ध ।
(क)प्लास्टिक डिवाइडर के साथ स्तर तक एक विभाजित पेट्री डिश के दाहिने कक्ष में झुंड आगर के ~ 30 एमएल डालो और ढक्कन बंद के साथ सेट करने की अनुमति दें। (ख)प्लास्टिक डिवाइडर के ऊपर से संपर्क के बिंदु पर तैरने या झुंड आगर के ~ 30 एमएल के साथ बाएं कक्ष को भरें। (ग)सीमा पर पिघले हुए झुंड आगर को धीरे से खींचने के लिए एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करें, जिससे दोनों पक्षों को ~ 1 मिमी लंबा आगर पुल से जोड़ा जा सके और ढक्कन बंद के साथ सेट करने की अनुमति दी जा सके। (घ)प्लेट को वांछित तनाव के साथ बाएं कक्ष को नया रूप देने से पहले रात भर कमरे के तापमान पर आगे सूखने दें, और 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: सेल-टेदरिंग तकनीक द्वारा मापा गया विभिन्न उपभेदों के मोटर गुण।
वाइल्ड-प्रकार (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆वाईसीजीआर ∆yhjH (JP1442), और इसके दमन (JP1836) को एलबी में 30 डिग्री सेल्सियस से मध्य-घातीय चरण में टेदरिंग से पहले उगाया गया था। (ए)प्रति मिनट रोटेशन (360 डिग्री बदल जाता है), और(बी)CWपूर्वाग्रह (समय मोटर्स का अंश एक CW दिशा में घुमाते हैं)। मतलब (±) का मानक विचलन। प्रत्येक तनाव में 60 सेकंड के लिए 20 सीमित कोशिकाओं को देखा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सीमा पार परख ।
जंगली प्रकार ई. कोलाई (AW405) और दमन उत्परिवर्ती उत्परिवर्ती (JP1836) के मध्य घातीय चरण संस्कृतियों को झुंड मीडिया युक्त विभाजित प्लेट के बाएं डिब्बे में संकेतित स्थिति (*) पर टीका लगाया गया था, और 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था। वे तुलनीय समय पर सीमा पर पहुंच गए। प्लेटों को एक और 6 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसके दौरान झुंड सही कक्ष में पार हो गया, जिसमें मीडिया को कानमाइसिन (कान; संख्या μg/mL) के साथ पूरक किया गया था । प्लेटें तीन जैविक प्रतिकृति प्रत्येक ट्रिपलीकेट में किए गए के प्रतिनिधि हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: सेल टेदरिंग के लिए एक कक्ष स्लाइड की तैयारी। (क)अतिरिक्त को ट्रिम करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करके दो तरफा टेप के दो टुकड़े पहले(बी)को लेट जाएं । (ग)चिपकने वाले को बेनकाब करने के लिए शीर्ष परत को छीलना(डी)एक कवरस्लिप को चिपकाने और धीरे-धीरे इसे स्थिति में दबाने (द्वारा इंगित], यह सुनिश्चित करना कि सभी हवा को नीचे के कवरस्लिप और टेप के बीच इंटरफ़ेस से बाहर धकेल दिया जाए। (ई)लोड नमूना (डीएनए लोडिंग डाई के साथ यहां दिखाया गया है [30% v/v ग्लिसरोल, 0.25% w/v ब्रोमोफेनॉल नीला, और 0.25% w/v xylene सायनोल] बनाया चैनल (तीर) के शीर्ष में दृश्य सहायता करने के लिए जोड़ा गया है, जबकि(एफ)साफ पर angling, ऊतक कार्य पोंछ मदद करने के लिए चैंबर के माध्यम से समाधान आकर्षित के रूप में ऊतक चैनल में तरल (तीर) अवशोषित और यह के माध्यम से खींचता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: सीमित ई. कोलाई कोशिकाओं का रोटेशन । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: एक सक्रिय ई. कोलाई झुंड 60x आवर्धन के तहत फिल्माया, चलती सामने के किनारे के पीछे अपनी विशेषता घूमता गति का प्रदर्शन । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

दमनकार उत्परिवर्तनों के अलगाव और लक्षण वर्णन ने केमोटैक्सिस प्रणाली35 , 36,37के प्रमुख घटकों के साथ - साथ मोटर मशीनरी के साथ - साथ38,39,40के प्रमुख घटकों की पहचान करने में सफलतापूर्वक योगदान दिया है । प्रोटोकॉल 1 का उपयोग करते समय, संभावित उत्परिवर्तनों के एक बड़े स्पेक्ट्रम के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए कई स्वतंत्र प्रतिकृति शामिल करना महत्वपूर्ण है जो गतिशीलता के नुकसान की भरपाई कर सकता है। एक जगह के बजाय एक लाइन में संस्कृति लकीर द्वारा बैक्टीरिया की संख्या में वृद्धि, दमन४१पैदा करने की बाधाओं में सुधार कर सकते हैं । एक ही उत्परिवर्तन के अलगाव (डीएनए अनुक्रमण द्वारा निर्धारित के रूप में) कई बार अपनी प्रामाणिकता में विश्वास बढ़ जाती है । डब्ल्यूजीएस हमेशा जीनोम में अन्य उत्परिवर्तनों की उपस्थिति को प्रकट करेगा । इसलिए पहचाने गए उत्परिवर्तन को मूल गतिशीलता की कमी वाली पृष्ठभूमि में वापस ट्रांसड्यूस करके परिणामों को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है। दमन उत्परिवर्तन दृष्टिकोण एक माध्यमिक उत्परिवर्तन के माध्यम से समारोह को बहाल करने में निहित है, तो इस विधि की एक सीमा यह है कि अगर एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक जीन हटा दिया जाता है, यानी, एक है कि पूरे मार्ग या संरचना underpins, वहां मुआवजे के लिए कोई गुंजाइश नहीं हो सकती है । एक पुरानी विधि होने के बावजूद, हमारा हालिया काम34 नए रास्तों की स्पष्टता में अपनी सतत उपयोगिता को दर्शाता है जो बैक्टीरियल मोटिविटी में योगदान देते हैं।

मोटर आउटपुट के मात्राकरण के लिए, सेल-टेदरिंग दृष्टिकोण एक सार्वभौमिक रूप से सुलभ उपकरण बना हुआ है जिसमें कैमरा अटैचमेंट के साथ केवल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। साल्मोनेला42 , स्यूडोमोनस43, स्ट्रेप्टोकोकस44 और रोडोबैक्टर33सहित विभिन्न जीवाणु प्रजातियों में सेल टेदरिंग का उपयोग पहले ही कियाजाचुका है . प्रोटोकॉल की सफलता काफी हद तक उचित कतरन और कोशिकाओं के लगाव पर आकस्मिक है । बहुत आक्रामक रूप से कतरनी या कैंची (2.1.5) के बीच ठहराव को छोड़ने से फिलामेंट्स के असंगत या अधूरे कतरन को बढ़ावा मिलता है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-मोती कोशिकाएं या कोशिकाएं विषम धुरी पर सीमित होती हैं। कई अनुसंधान समूहों (हमारे सहित) द्वारा उच्च संकल्प मनका परख को अपनाने के बावजूद, इस प्रोटोकॉल की स्थायी प्रासंगिकता बनी हुई है। मनका परख की प्राथमिक सीमा मनका के लिए ब्याज के बैक्टीरिया के फिलामेंट का पालन करने की आवश्यकता से आती है। इस तकनीक को ई. कोलाई में अध्ययनों से बहुत लाभ हुआ है जिसने 'चिपचिपा' फ्लैगेलिन एलील की पहचान की है, जोपालन 45की सुविधा प्रदान करता है। चिपचिपा संस्करण भी सेल-टेदरिंग परख में बेहतर है। इस तरह के एक संस्करण अभी तक ध्वजांकित बैक्टीरिया के बहुमत के लिए उपलब्ध नहीं है । यह स्थिति और जटिल है कि कुछ जीवों में मल्टीपल फ्लैगेलिन प्रोटीन46होते हैं और विब्रियो एसपी के मामले में भी एक झिल्लीदार म्यान47होता है । सेल-टेदरिंग को एक प्रजाति-विशिष्ट एंटी-फ्लैगेलिन एंटीबॉडी या एक इंजीनियर एपिटोप टैग के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके भी किया जा सकता है।

जबकि बैक्टीरिया एक तरल माध्यम में परिचय पर तुरंत तैर सकते हैं, यह झुंड के सच नहीं है, जहां कोशिकाओं को पहले एक झुंड राज्य में प्रिड किया जाना चाहिए । सतह संपर्क कोशिकाओंके लिए48, 49, 50, 51को शुरू करने के लिए आवश्यक शारीरिक परिवर्तन को ट्रिगर करता है, जिसके परिणामस्वरूप अंतराल चरण और उच्च कोशिका घनत्व का निर्माण होता है। शारीरिक परिवर्तनों में ई कोलाई16 में केमोटैक्सिस प्रणाली का पुनः तैयार करना और अन्य बैक्टीरिया 13 ,14,21के लिए सेल विस्तार और/या हाइपरफ्लैगेलेशन जैसे अनुकूलन शामिल हैं । झुंड शुरू करने के लिए आवश्यक शारीरिक परिवर्तनों को देखते हुए, हम उन अध्ययनों के बारे में एक चेतावनी नोट पर प्रहार करते हैं जिन्होंने झुंड के चुनिंदा पहलुओं की नकल करने का प्रयास किया है - जैसे कि उच्च घनत्व या बढ़ी हुई कोशिका लंबाई - बस घनत्व बढ़ाने के लिए प्लैंक्टोनिक सेल संस्कृतियों को ध्यान में रखकर, और/या कोशिका विभाजन को बाधित करने वाले एंटीबायोटिकदवाओं के उपयोग से सेल विस्तार को प्रेरित करके५२,५३। यदि एक मार्कर के रूप में सेल विस्तार का उपयोग कर रहे हैं, तो हम यह भी सावधानी बरतते हैं कि प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं की तुलना में, साल्मोनेला या ई. कोलाई54में झुंड कोशिकाओं की औसत लंबाई में केवल मामूली वृद्धि हुई है। झुंड परख तैरने की तुलना में स्थापित करने के लिए कठिन हैं। चर में मीडिया को जमना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एगर का वाणिज्यिक स्रोत शामिल है (ई कोलाईमें झुंड के लिए विशेष आइकेन एगर आवश्यक है, जबकि अधिक मानक डिफ्को एगर अन्य सभी बैक्टीरिया के लिए झुंड का समर्थन करता है), अमीर बनाम न्यूनतम मीडिया का उपयोग(ई कोलाई और साल्मोनेला को ग्लूकोज पूरकता की आवश्यकता होती है), और सबसे गंभीर रूप से परिवेशआर्द्रता 2,13,14,21। इनमें से, इष्टतम आर्द्रता को बनाए रखना सबसे अधिक निराशाजनक हो सकता है। [पसंद के जीव(स्यूडोमोनास एरुगिनोसा)में झुंड के लिए एक उत्कृष्ट, व्यवस्थित, अनुकूलन मोरालेस-सोटो और सह-कार्यकर्ताओंद्वारा 55का प्रदर्शन किया गया है । झुंड मीडिया झुंड को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त रूप से नम होना चाहिए, लेकिन निष्क्रिय प्रसार/फिसलने की अनुमति देने के लिए इतना नम नहीं है, जो सक्रिय झुंड५६के लिए आसानी से गलत हो सकता है । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि इस सामूहिक गतिशीलता(वीडियो 2)से जुड़े आंदोलन के विशिष्ट पैटर्न की पुष्टि करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे झुंड की जांच की जाए। तापमान भी झुंड परख अनुकूलन के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। उच्च तापमान, उदाहरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस की तुलना में जल्दी सूख जाएगा। आर्द्रता नियंत्रण (~ 70-80%) के साथ एक इनक्यूबेटर का उपयोग करने से इन मुद्दों को कम करने में मदद मिल सकती है, जिसमें मौसमी परिवर्तन शामिल हैं जो आंतरिक निर्माण तापमान और आर्द्रता को प्रभावित कर सकते हैं। एक बार सफलतापूर्वक स्थापित होने के बाद, प्रोटोकॉल 3 झुंड बैक्टीरिया के सबसे दिलचस्प पहलुओं में से एक की जांच करने का एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए ऊंचा प्रतिरोध17। यहां वर्णित सभी प्रोटोकॉल नए जीवों पर लागू किए जा सकते हैं ताकि उन रास्तों की पहचान की जा सके जो फ्लैगेला मध्यस्थता की गतिशीलता को निर्दिष्ट और नियंत्रित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों GM118085 द्वारा समर्थित किया गया था और रॉबर्ट वेल्च फाउंडेशन (आर.M एच) को अनुदान एफ-1811) द्वारा भाग में।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

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References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

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जीव विज्ञान अंक 159 बैक्टीरिया केमोटैक्सिस एस्चेरिचिया कोलाई,फ्लैगेला रोटरी मोटर गतिशीलता तैराकी झुंड सतह संवेदन सतह गतिशीलता
एक श्रृंखला में तीन स्थापित तकनीकों को लागू करके <em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> में फ्लैगेला-चालित गतिशीलता की जांच
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Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

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