Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Исследование подвижности жгутиков у кишечной палочки путем применения трех установленных методов в серии

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Многие бактерии используют подвижность, управляемую жгутиками, чтобы ориентироваться в окружающей среде и колонизировать благоприятное окружение как индивидуально, так и коллективно. Здесь показано использование трех установленных методов, которые используют подвижность в качестве инструмента выбора для выявления компонентов / путей, способствующих плаванию и роевой подвижности.

Abstract

Подвижность имеет решающее значение для выживания и успеха многих видов бактерий. Существует множество методологий для использования подвижности для понимания сигнальных путей, выяснения функции и сборки жгутиков, а также для изучения и понимания моделей движения. Здесь мы демонстрируем сочетание трех из этих методологий. Подвижность в мягком агарове является самой старой, предлагая сильный отбор для выделения мутаций супрессора усиления функции у штаммов с нарушениями подвижности, где подвижность восстанавливается с помощью второй мутации. Метод клеточного троса, впервые использованный для демонстрации вращательной природы жгутикового двигателя, может быть использован для оценки влияния сигнальных эффекторов на скорость двигателя и его способность переключать направление вращения. Анализ «пересечения границы» является более недавним, где плавающие бактерии могут быть подготовлены к переходу в коллективное движение в качестве роя. В сочетании эти протоколы представляют собой систематический и мощный подход к выявлению компонентов механизмов подвижности и характеристике их роли в различных аспектах плавания и роения. Они могут быть легко адаптированы для изучения подвижности у других видов бактерий.

Introduction

Бактерии используют множество придатков для перемещения и рассеивания в своих экологических нишах1. Подвижность, управляемая жгутителями, является самой быстрой из них, способствуя колонизации благоприятных мест в ответ на сигналы окружающей среды и внося значительный вклад в патогенную способность некоторых видов2,3. Жгутиковые бактерии могут плавать индивидуально в объемной жидкости или роиться как коллектив над полутвердой поверхностью4. Внеклеточные жгутики прикрепляются и приводятся в движение роторными двигателями, встроенными в мембрану, которые используют мощность ионных градиентов для создания крутящегомомента,который вызывает вращение1,2,4,5,6,7,8. В E. coli,чьи двигатели работают с постоянным крутящим моментом9,мощность двигателя может быть классифицирована с точки зрения скорости вращения и переключения ротора между направлениями против часовой стрелки (CCW) и по часовой стрелке (CW). Вращение КНО способствует образованию когерентного жгутикового пучка, который продвигает ячейку вперед (бег), в то время как переходный переключатель в направлении вращения (CW) заставляет пучок разбираться частично или полностьюна 10,а клетка переориентировать свое направление плавания (кувыркаться). Кишечно-кишечное кишечное правило бегает в течение секунды и кувыркается в течение десятой доли секунды. Частота переключения ротора или «кувыркающееся смещение» контролируется сигнальной системой хемотаксиса, в которой трансмембранные хеморецепторы обнаруживают внешние химические сигналы и передают их через фосфорелай жгутиковый двигатель для продления пробегов в ответ на аттрактанты или подавления их в ответ на токсичные химические вещества11,12. Подвижность плавания анализируется в 0,3% мягкого агара.

Во время роения бактерии перемещаются по полутвердой поверхности в виде плотного коллектива, где стаи бактерий текут в непрерывном вихревом движении2,13,14,15. Рои E. coli демонстрируют измененную хемосенсорную физиологию (более низкое смещение падения), более высокие скорости и более высокую толерантность к противомикробным препаратам над клетками, плавающими в объемной жидкости16,17. Рои различаются в своем развертывании множества стратегий, которые помогают движению, включая производство поверхностно-активных добавок, гиперфлагелляцию и удлинение клеток2. Роение дает бактериям конкурентное преимущество как в экологических, так и в клинических условиях18,19,20. Существует две категории роящихся бактерий: умеренные рои, которые могут роиться только на средах, затвердевшие с 0,5-0,8% агара, и надежные рои, которые могут перемещаться по более высоким концентрациям агара21.

Существует множество анализов, чтобы исследовать подвижность плавания и ее регулирование. При нарушении мутаций или условий окружающей среды подвижность сама по себе предлагает сильный выбор для выявления мутаций-супрессоров усиления функции. Эти супрессоры могут быть подлинными ревертантами исходной мутации или псевдо-ревертантами, где вторая мутация восстанавливает функциональность. Такие мутанты могут быть идентифицированы путем секвенирования всего генома (WGS). Альтернативой непредвзятому выбору супрессора является предвзятая стратегия целенаправленного мутагенеза (например, мутагенез ПЦР). Эти методологии часто проливает свет на функцию или экологическую регуляцию аппарата моторики. Если цель состоит в том, чтобы изучить двигательную функцию, то восстановление подвижности дикого типа, измеренное в мягком агари, не обязательно может указывать на восстановление двигательной мощности дикого типа. Анализ клеточного привязки, в котором клетки прикрепляются к стеклянной поверхности одним жгутиком и впоследствии контролируется вращение тела клетки, может быть начальным анализом выбора для оценки двигательного поведения. Хотя в настоящее время доступны более сложные методологии для мониторинга свойств двигателя, требуемая высокоскоростная настройка камер и применение пакетов программного обеспечения для анализа движения ограничивают их широкое использование22,23,24,25. Анализ клеточного привязки требует только, чтобы жгутики были сстрижены, что позволяет прикрепить короткие нити к стеклянному слайду с последующей видеозаписью вращения тела клетки. Хотя зарегистрированные скорости двигателя низки в этом анализе из-за высокой нагрузки, которую тело клетки оказывает на жгутик, этот анализ, тем не менее, способствовал ценному пониманию хемотаксических реакций26,27,28,29и остается действительным инструментом исследования, как обсуждается ниже.

Роевая подвижность ставит перед исследователями другой набор проблем. Выбор супрессоров усиления функции работает только в роях, которые производят обильные поверхностно-активные вещества и роя легко13. Поверхностно-активные непроизводители, такие как E. coli, привередливы в отношении выбора агара, состава среды и влажности окружающей среды2,13,14,21. После того, как условия роения установлены, анализ пересечения границы17 является полезной методологией для опроса о способности роя ориентироваться в новых/суровых условиях. Хотя протоколы, представленные ниже, относятся к E. coli,они могут быть легко адаптированы для применения у других видов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выделение мутантов-супрессоров в штаммах с дефицитом подвижности

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод в качестве широкого «универсального» для определения общего характера дефекта моторики.

  1. Приготовление мягких агаровых пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий агар, также называемый моторильно-или плавательным агарем, представляет собой агар низкого процента (~0,2-0,35% мас./об.), долгое время используемый для анализа хемотаксиса31,32.
    1. Добавьте 3 г бактоагара (0,3% мас./об.) и 20 г LB в колбу с круглым дном 2 л. Добавьте в колбу 1 л ddH2O (двойная дистиллированная вода) и равномерно перемешайте суспензию с помощью стержня перемешивания и магнитной перемешивающей пластины.
    2. Автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
    3. Дайте остыть с мягким перемешиванием, используя стержень / пластину, как указано выше. Когда температура достигнет приблизительно 50 °C, налейте 25 мл в стерильные чашки Петри (100 мм х 15 мм) и дайте расплавленной агаровой крышке на место в течение не менее 1 ч для использования в течение 16 ч.
  2. Подготовка культуры, посев и выделение мутантов-супрессоров
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечная палочка, привитая в центре богатых питательными веществами сред, затвердеющих с мягким агару, потребляет питательные вещества локально, создавая градиент питательных веществ, за которым они следуют. По мере того, как они движутся наружу, появляются определенные «кольца»(рисунок 1A),которые связаны с конкретными химиоатрактантами, на которые реагируют бактерии. Дефекты либо в системе хемотаксиса, либо в структурных компонентах жгутикового двигателя могут поставить под угрозу производительность этого анализа. Часто мутанты с преимуществом подвижности возникают во время скрининга, и их можно увидеть выходящими из одиночных или из нескольких точек по периферии кольца, откуда они «вспыхивают»(рисунок 1С). Можно заметить, что самый внешний край плавательного фронта легко контрастирует с неколонизированным девственным мягким агаром.
    1. Выращивать в течение ночи культуры желаемого штамма с дефицитом подвижности в 5 мл бульона Леннокса (LB; 10 г / л триптона, 5 г / л дрожжевого экстракта и 5 г / л NaCl, таблица материалов)при 30 °C с горизонтальным встряхиванием (220 р.п.m.). На следующий день субкультуру (1:100 разведения) в свежем LB, растущую в тех же условиях до экспоненциальной фазы (OD600 0,6).
    2. Инокулируйте 6 мкл культуры в центр пластины мягкого агара (1.1) с помощью пипетки, проталкивая нагруженный стерильный наконечник в агар, чтобы мягко вытеснить содержимое. Перенос до 30 °C и инкубирование(рисунок 1B)до тех пор, пока не будут очевидны «вспышки» подвижности, исходящие из точки прививки или периферии колец подвижности, обычно через 24-36 ч(рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализах подвижности инокулируют штамм дикого типа вместе с мутантными изолятами для сравнения. Этот штамм дикого типа покажет характерные концентрические хемотактические кольца(рисунок 1А)и заполнит пластину в течение 8-10 ч.
    3. Используйте стерильную проволочную петлю, чтобы поднять клетки из области «вспышки» и процедить для очистки отдельных колоний на жесткой агаревой пластине LB (LB, приготовленный, как указано выше, затвердеть с 15 г / л бакто-агара).
    4. Выберите одиночные колонии из пластины полосы, используя стерильную проволочную петлю, и повторно очистите, расклеивая отдельные колонии, чтобы обеспечить изоляцию «чистого» изоляционного изолята колонии.
  3. Подтверждение и характеристика мутантов-супрессоров
    1. Подтвердите, что изолированные мутанты-супрессоры восстановили подвижность. Подготовьте мягкие агагаровые пластины (1.1) и культуры для интересующих штаммов (как в 1.2.1), включая штамм дикого типа и стартовый штамм с дефицитом подвижности для сравнения.
    2. Инокулируют пластины (как в 1.2.2) и инкубируют при 30 °С в течение 8-10 ч.
    3. Запишите диаметр самого внешнего кольца (края круга) и сравните, чтобы установить, какой из изолятов существенно восстановил подвижность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется фотографировать пластины на протяжении всего времени эксперимента. Для достижения наилучших результатов используют устройство30«ведро света», где над источником света установлена цифровая камера для лучшего освещения, чтобы измерить диаметр плавательной колонии и отличить ее от неколонизированного агара.
    4. Субъект проверяет изоляты в WGS по мере необходимости, что позволяет обеспечить достаточный «охват последовательности» для положительной идентификации мутаций, которые восстановили функцию дикого типа.

2. Количественная оценка двигательного поведения жгутиков с помощью клеточного троса

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод, когда нормальное поведение при падении (хемотаксис) кажется скомпрометированным.

  1. Приготовление культуры и стригущий жгутики
    1. Подготовьте экспоненциальную фазовую культуру интересующего штамма, как описано на этапе 1.2.1.
    2. Гранула 10 мл клеток центрифугированием при 2000 х г в течение 3 мин перед повторным суспендированием в 10 мл фильтруемого стерилизованного буфера подвижности (МБ; 10 мМ буфера фосфата калия [0,0935 М К2HPO4,0,0065 М KH2PO4,рН 7,0], 0,1 мМ ЭДТА [рН 7,0], 10 мМ NaCl, 75 мМ KCl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: MB поддерживает подвижность, но не поддерживает рост бактерий
    3. Повторите шаг 2.1.2 еще два раза, прежде чем повторно использовать конечную гранулу в 1 мл МБ.
    4. Переложите клеточную суспензию в шприц 1 мл и прикрепите к концу иглу 23G. Соберите идентичный шприц/игольчатый аппарат и прикрепите их вместе через 6 дюймов полиэтиленовой трубки (внутренний диаметр 0,58 мм), плотно обтянутой над каждым наконечником иглы.
    5. Срежь жгутики (они хрупкие и легко ломаются), осторожно передавая клеточную подвеску вперед и назад от одного шприца к другому 50x, с 1-минутными паузами между каждыми 10 проходами.
    6. Центрифугируют срезанные ячейки при 2000 х г в течение 3 мин и повторно суспендируют в конечном объеме 500 мкл МБ.
  2. Подготовка слайдов и клеточный трос
    1. Подготовьте камеру фиксации клеток, укладывая крышку 18 мм x 18 мм на стеклянный слайд микроскопа 3 дюйма x 1 дюйм x 1 мм, разделенный двусторонней лентой(рисунок S1).
    2. Промывайте камеру 0,01% (мас./об.) раствором полилизина, прикладывая к верхней части камеры. Наклоните нижний край (крышка вровень с замыкание с замыкание с загузкой микроскопа) на стеклоочиститель (папиросную бумагу), чтобы помочь провести раствор через камеру(рисунок S1). Затем инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Промыть камеру три раза с 40 мкл МБ, используя, как описано в шаге 2.2.2
    4. Добавьте 40 мкл суспензии со среженной клетки (подготовленной выше) в верхнюю часть камеры и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы ячейки могли прикрепиться к крышке.
    5. Осторожно промывайте камеру 40 мкл МБ, как в 2.2.3, чтобы удалить неприкрепленные ячейки.
  3. Регистрация и количественная оценка вращения клеток
    1. Перенесите слайд микроскопа, загруженный привязанными клетками, на ступень микроскопа.
    2. Используя фазоконтрастную микроскопию и 100-кратный объектив, сканируйте популяцию на наличие клеток, которые зафиксированы на месте и вращаются по одной оси, то есть плавное вращение в фиксированной точке, а не под углом, под которым клетка движется в фокус и выходит из него(Видео 1).
    3. Используйте коммерческий микроскоп и связанную с ним камеру. Откройте соответствующее программное обеспечение, убедитесь, что интересующе ячейки находятся в фокусе, и нажмите «Получение видео», чтобы записать вращение ячейки в течение одной минуты (со скоростью 10 кадров в секунду или выше).
    4. При воспроизведении видео количественно оцените количество полных оборотов в минуту и количество раз, когда ячейка меняет направление (частоту переключения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорости вращения и частота переключения могут быть слишком быстрыми, чтобы их можно было измерить на глаз, поэтому рекомендуется использовать программное обеспечение для видео, которое предлагает медленное / тонкое воспроизведение, или использует автоматизированную программную систему для количественной оценки паттерноввращения 33. Альтернативой может быть увеличение вязкости МБ с использованием метилцеллюлозы (или аналогичного агента), чтобы помочь замедлить и разрешить вращение более быстрых бактерий или компенсировать использование камер с низкой частотой кадров.
    5. Повторите шаг 2.3.2 с биологическими репликами для составления представления интересуемой популяции.

3. Подготовка роев в пограничном анализе

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод для оценки влияния мутации или состояния на групповую подвижность. Роевой агар относится к агару, где процент обычно выше, чем у мягкого агара. В мягком агари (0,3 %) клетки плавают индивидуально внутри агарова. В роевом агаре (0,5% и выше) клетки движутся группой по поверхности. В то время как роевые пластины должны использоваться, как подробно описано здесь, плавательные пластины имеют более длительный срок хранения и могут использоваться в течение нескольких дней. Мы лично предпочитаем использовать через 1-2 дня.

  1. Приготовление роевого агара
    1. Добавьте 5 г агара Эйкена (0,5% мас./об.) и 20 г LB в колбу с круглым дном 2 л. Добавьте в колбу 1 л ddH2O и равномерно перемешайте суспензию с помощью стержня перемешивания и магнитной перемешивающей пластины.
    2. Автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
    3. Дайте остыть с мягким перемешиванием, чтобы избежать пузырьков воздуха с помощью стержня / пластины, как указано выше. При приблизительно 50 °C добавляют стерилизованную фильтром глюкозу для конечной концентрации 0,5 %.
    4. В стерильные чашки Петри насыпать 25 мл (100 мм х 15 мм) и дать установить комнатную температуру не менее 14 ч и не более 20 ч. Не храните для будущего использования.
  2. Инокуляция и инкубация роевых пластин
    1. Инокулируют 6 мкл средне экспоненциальной культуры (приготовленной как в 1,2) путем пятнистости поверх агара.
    2. Оставьте крышку на 5-10 минут и замените, когда инокулят высохнет на поверхности агара.
    3. Инкубировать при 30 °C в течение 8 ч. Избегайте соблазна осмотреть прогресс роя, сняв крышку, так как это будет способствовать высыханию агара и ухудшит роение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от фенотипа штамма. Некоторые изолированные мутации могут препятствовать роевой способности и потребуют снижения процента агара или более длительного периода инкубации.
  3. Подготовка пробирных листов для пересечения границ
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе используется модифицированная чашка Петри, где пластиковое деление (граница) создает две камеры, а не одну(рисунок 2A). Каждая камера может быть подготовлена независимо от другой, предлагая различные условия для роения, прежде чем «соединить» их. В зависимости от экспериментальной конструкции, первая камера (обозначенная левой) может быть приготовлена либо с плавательным агаром (0,3% мас./об.), либо с роевым агаром (0,5% мас./об.), откуда бактерии могут мигрировать через границу в правую камеру, содержащую роевой агар +/- любую необходимую добавку или вызов (например, антибиотики). Миграцию на любом агарове обычно измеряют/сравнивают путем регистрации самого широкого диаметра бактериальной колонизации (от края до края) от исходной точки инокуляции.
    1. При необходимости приготовьте плавательный агар, как описано в 1.1.
    2. Приготовьте роевой агар, как описано в 3.1.
    3. Налейте ~30 мл роевого агара (с желаемым дополнением, если требуется) в правую камеру двухкамерной чашки Петри (100 мм х 15 мм), до такой степени, что она находится на одном уровне с пластиковым разделителем между камерами, но не переливается в левую(рисунок 2B).
    4. После того, как агар затвердеет, заполните левую камеру ~30 мл плавательного или роевого агара, снова до точки соприкосновения с пластиковым водоразделом(рисунок 2С). Перед тем, как он схлестнет, используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы осторожно перетащить агар через границу, чтобы соединить две стороны с помощью агарового моста высотой ~ 1 мм, который охватывает всю длину водораздела(рисунок 2D).
    5. Дайте пластине высохнуть при комнатной температуре (3,1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный метод создания моста заключается в том, чтобы дать агару левой камеры высохнуть, а затем медленно пипетку ~100 мкл расплавленного роевого агара вдоль пластикового разделителя для моста двух камер (3.4). Инокулируют пластины в левой камере, как описано выше, для плавания (1.2.2) или роя (3.2) агара перед инкубацией при 30 °C в течение 12-16 ч или до тех пор, пока рои не достигнут достаточного прогресса над правой камерой, чтобы можно было сравнивать интересующие штаммы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выделение псевдо-ревертантов в штамме E. coli, подвижность которого нарушается высокими уровнями сигнальной молекулы c-di-GMP, была подробно описана в недавней работе нашей лаборатории34. Этот штамм (JP1442) содержит две мутации: ΔyhjH и ΔycgR. YhjH является наиболее активной фосфодиэстеразой, которая разлагает c-di-GMP в E. coli. Отсутствие YhjH приводит к повышению уровня c-di-GMP и угнетению моторики. YcgR является c-di-GMP эффектором. В комплексе с c-di-GMP YcgR связывается с жгутиковым ротором, чтобы сначала индуцировать вращение двигателя CCW и впоследствии снижать скорость двигателя. Клеточный трос и бисерные анализы показали, что двигательное поведение вернулось к норме у двойного мутанта, но подвижность у мягкого агара недостигла 34. Итак, мы развернули шаг 1 протокола для изоляции псевдо-ревертантных вспышек в двойном мутанте(рисунок 1C). Большинство мутаций, сопоставленных WGS (платформа HiSeq 4000, PE 2 x 150 setup34)с rssB,который кодирует регулятор ответа / адаптор белка, который обычно направляет протеазу ClpXP на нацеливание σS для деградации34. Один из этих ревертантов, который демонстрировал подвижность, близкую к дикому типу (AW405, сравните рисунок 1A,D),использовался для получения репрезентативных результатов для этапов 2 и 3 раздела протокола, используя в качестве контроля как его двойной мутантный родитель(рисунок 1B),так и изогенный штамм дикого типа(рисунок 1A).

На этапе 2 раздела протокола были проанализированы видеозахваты для расчета поворотов в минуту (каждый полный поворот на 360 °) исмещения CW (доля времени вращения двигателей в направлении CW или смещения падения). ΔyhjH показал меньшее количество вращений в минуту и более низкое смещение CW по сравнению с диким типом, как и ожидалось(рисунок 3). Как двойной мутант ΔyhjH Δ ycgR, так и его супрессор показали двигательное поведение, похожее на дикий тип, наблюдения, подкрепленные предыдущим анализом с использованием анализа «шарика» с более высоким разрешением, подробно описанного во введении выше в предыдущей работе34.

Для шага 3 раздела протокола анализ пересечения границы(рисунок 2)использовался для сравнения способностей дикого типа и изолятора сначала роиться, а затем перемещаться через границу и роиться на агаре, дополненном канамицином. Результаты показывают, что оба штамма достигли границы в одно и то же время (данные не показаны), что указывает на сходные скорости роения из одинаковой точки прививки. Однако пересечение роя в правую (антибиотическую) камеру было незначительно, но последовательно больше для дикого типа, чем супрессор при 20 мкг/мл канамицина(рисунок 4). Разница между двумя штаммами была более выражена при 40 мкг/мл канамицина. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что мутации в rssB, которые восстанавливали подвижность на мягких агаровых пластинах(рисунок 1D),негативно влияют на антибиотикорезистентность штамма-супрессора во время роения(рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1: Анализы подвижности мягкого агара и появление супрессорных вспышек.
Пластины содержат LB, затвердев с 0,3 % мас./об агар. Штаммы E. coli прививали в центре каждой пластины и инкубировали при 30°C в течение 8 ч, за исключением C, который инкубировали в течение 16 ч.(A) E. coli дикого типа (AW405). (B) Моторико-дефицитный вариант ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (C)Как и в B, за исключением более длительного времени инкубации. Стрелки указывают на более быстро движущиеся «вспышки», возникающие на периферийном кольце расширяющейся плавательной колонии. (D) Подавитель, изолированный от вспышки в C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема настройки анализа пограничных плит.
(A) Налейте ~30 мл роевого агара (с нужным антибиотиком) в правую камеру разделенной чашки Петри до уровня пластикового разделителя и дайте установить с закрытой крышкой. (B) Заполните левую камеру ~30 мл плавательного или роевого агара до точки соприкосновения с верхней частью пластикового разделителя. (C) Используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы осторожно перетащить расплавленный роевой агар через границу, тем самым соединив две стороны агаровым мостом высотой ~ 1 мм и дать установить с закрытой крышкой. (D)Дайте пластине высохнуть при комнатной температуре в течение ночи, прежде чем прививать левую камеру желаемым штаммом и инкубировать при 30 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Двигательные свойства различных штаммов, измеренные методом клеточного тросирования.
Дикий тип (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442) и его супрессор (JP1836) выращивались в LB при 30 ° C до средней экспоненциальной фазы до привязки. (A)Вращения в минуту (завершенные повороты на 360°) и(B)Смещение CW (доля времени вращения двигателей в направлении CW). Стандартное отклонение среднего значения (±). 20 привязанных клеток наблюдались в течение 60 секунд в каждом штамме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализы пересечения границы.
Среднепроциценциальные фазовые культуры дикой кишечной палочки (AW405) и мутанта-супрессора (JP1836) инокулировали в указанном положении (*) в левом отсеке разделенной пластины, содержащей роевую жиму, и инкубировали при 30 °C. Они достигли границы в сопоставимые сроки. Пластины инкубировали еще 6 ч, в течение которых рой переходил в правую камеру, в которой жимы дополняли канамицином (кан; цифры указывают на мкг/мл). Пластины являются репрезентативными из трех биологических реплик, каждая из которых осуществляется в трех количествах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Подготовка слайда камеры для клеточного привязи. (A) Положите два куска двусторонней ленты перед(B)с помощью лезвия бритвы, чтобы обрезать лишнее. (C) Снимите верхний слой, чтобы обнажить клей перед(D),прикреплением крышки и аккуратным нажатием его на положение (обозначено [), гарантируя, что весь воздух выталкивается из границы раздела между крышкой и лентой внизу. (E)Образец нагрузки (показанный здесь с красителем для загрузки ДНК [30% v/v глицерина, 0,25% мас./v бромфенол-синего и 0,25% мас./v ксилол-цианол], добавленным для облегчения визуализации) в верхнюю часть созданного канала (стрелка) в то время как(F)рыть на чистую, тканевую протирку, чтобы помочь провести раствор через камеру, когда ткань поглощает жидкость (стрелку) в канале и втягивает ее насквозь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Видео 1: Вращение привязанных клеток E. coli. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Активный рой E. coli, снятый под 60-кратным увеличением, демонстрирующий его характерное вихревое движение за краем движущегося фронта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выделение и характеристика мутаций супрессоров успешно способствовали выявлению ключевых компонентов системы хемотаксиса35,36,37,а также самого моторного механизма38,39,40. При использовании Протокола 1 важно включить несколько независимых реплик, чтобы обеспечить выделение большого спектра возможных мутаций, которые могли бы компенсировать потерю подвижности. Увеличение количества бактерий путем пронизывания культуры в линию, а не в пятно, может улучшить шансы генерации супрессоров41. Выделение одной и той же мутации (определяемой секвенированием ДНК) многократно повышает уверенность в ее подлинности. WGS неизменно выявит наличие других мутаций в геноме. Поэтому важно проверить результаты, преобразуя (где это возможно) идентифицированную мутацию обратно в исходный фон с дефицитом подвижности. Мутантный подход-супрессор коренится в восстановлении функции посредством вторичной мутации, поэтому ограничение этого метода заключается в том, что если удаляется критический структурный ген, то есть тот, который лежит в основе всего пути или структуры, может не быть возможности для компенсации. Несмотря на то, что это старый метод, наша недавняя работа34 демонстрирует его постоянную полезность в выяснении новых путей, которые способствуют бактериальной подвижности.

Для количественной оценки мощности двигателя подход клеточного модема остается универсально доступным инструментом, требующим только микроскопа с прикрепленной камерой. Клеточный трос уже использовался в различных видах бактерий, включая Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44и Rhodobacter33. Успех протокола во многом зависит от правильной сдвига и прикрепления клеток. Слишком агрессивная стриж или опущение паузы между сдвигами (2.1.5), как правило, способствует непоследовательному или неполному сдвигу нитей, в результате чего неподвижные клетки или клетки привязаны к наклонной оси. Непреходящая актуальность этого протокола сохраняется, несмотря на принятие бисероплетения с более высоким разрешением многими исследовательскими группами (включая нашу). Основное ограничение бисероплетения происходит из-за необходимости того, чтобы шарик прилипал к нити интересующих бактерий. Этот метод значительно выиграл от исследований на E. coli, которые идентифицировали «липкий» аллель жгутика, который облегчает адгезию45. Липкий вариант также превосходит в анализе клеточного привязки. Такой вариант пока недоступен для большинства жгутиковых бактерий. Ситуация еще более осложняется некоторыми организмами, обладающими множественными белками жгутика46,а в случае Vibrio sp. также обладающими перемягчатой оболочкой47. Клеточное привязание также может быть выполнено с использованием видоспецифического антифлагеллинового антитела или антитела к инженерной эпитопной метке.

В то время как бактерии могут плавать сразу после введения в жидкую среду, это не относится к роению, когда клетки должны быть сначала праймированы в роевое состояние. Поверхностный контакт вызывает физиологические изменения, необходимые клеткам для инициирования роения48,49,50,51,что приводит к фазе задержки и накоплению высокой плотности клеток. Физиологические изменения включают ремоделирование системы хемотаксиса в E. coli16и адаптации, такие как удлинение клеток и/или гиперфлагелляция для другихбактерий 13,14,21. Учитывая физиологические изменения, необходимые для инициирования роения, мы с осторожностью отмечаем исследования, которые пытались имитировать отдельные аспекты роения, такие как высокая плотность или увеличение длины клеток, просто концентрируя планктонные клеточные культуры для увеличения плотности и / или индуцируя удлинение клеток с помощью антибиотиков, которые ингибируют деление клеток52,53. Если в качестве маркера используется удлинение клеток, мы также предупреждаем, что по сравнению с планктонными клетками наблюдается лишь незначительное увеличение средней длины более теплых клеток у сальмонеллы или E. coli54. Роевые анализы труднее установить, чем плавательные анализы. Переменные включают коммерческий источник агара, используемого для затвердевания среды (специальный агар Эйкена необходим для роения в E. coli,тогда как более стандартный агар Difco поддерживает роение для всех других бактерий), использование богатых и минимальных сред(E. coli и Salmonella требуют добавок глюкозы) и наиболее критическую влажность окружающей среды2,13,14,21. Из них поддержание оптимальной влажности может быть самым разочаровывающим. [Отличная, методичная оптимизация для роения в организме выбора (Pseudomonas aeruginosa) была продемонстрирована Моралесом-Сото и его коллегами55.] Роевая среда должна быть достаточно влажной, чтобы способствовать роению, но не настолько влажной, чтобы обеспечить пассивное распространение / скольжение, которое может быть легко ошибочно принято за активное роение56. Поэтому крайне важно, чтобы рои были проверены под микроскопом, чтобы подтвердить различные паттерны движения, связанные с этой коллективной подвижностью(Видео 2). Температура также является важным фактором для оптимизации роевого анализа. Более высокие температуры, например, 37 ° C, высушат пластины раньше, чем при 30 ° C. Использование инкубатора с контролем влажности (~ 70-80%) может помочь смягчить эти проблемы, включая сезонные изменения, которые могут повлиять на внутреннюю температуру и влажность здания. После успешного создания протокол 3 обеспечивает мощный способ исследования одного из наиболее интересных аспектов роящихся бактерий, повышенной устойчивости к антибиотикам17. Все протоколы, описанные здесь, могут быть применены к новым организмам для выявления путей, которые определяют и контролируют опосредованную жгутиками подвижность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения GM118085 и частично Фондом Роберта Уэлча (грант F-1811 R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Биология Выпуск 159 Бактерии хемотаксис Кишечно-кишечное сучье сучье,рой подвижность плавание роение поверхностное зондирование подвижность поверхности
Исследование подвижности жгутиков у <em>кишечной палочки</em> путем применения трех установленных методов в серии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter