Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse Flagella-Driven Motility i Escherichia coli ved at anvende tre etablerede teknikker i en serie

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364

Summary

Mange bakterier bruger flagella-drevet motilitet til at navigere i deres miljø og kolonisere gunstige omgivelser både individuelt og som et kollektiv. Demonstreret her er brugen af tre etablerede metoder, der udnytter motilitet som et udvælgelsesværktøj til at identificere komponenter / veje, der bidrager til svømning og sværmende motilitet.

Abstract

Motilitet er afgørende for overlevelse og succes for mange bakteriearter. Mange metoder findes for at udnytte motilitet til at forstå signalveje, for at belyse funktionen og samlingen af flagellare dele og for at undersøge og forstå bevægelsesmønstre. Her demonstrerer vi en kombination af tre af disse metoder. Motilitet i blød agar er den ældste, der tilbyder et stærkt udvalg til isolering af gain-of-function suppressor mutationer i motilitetshæmmede stammer, hvor motilitet genoprettes gennem en anden mutation. Celletrikningsteknikken, der først blev anvendt til at demonstrere flagellarmotorens roterende karakter, kan bruges til at vurdere signaleffekternes indvirkning på motorhastigheden og dens evne til at skifte rotationsretning. Den "grænseovergang" analyse er nyere, hvor svømning bakterier kan primes til overgangen til at bevæge sig kollektivt som en sværm. I kombination repræsenterer disse protokoller en systematisk og kraftfuld tilgang til at identificere komponenter i motilitetsmaskineriet og til at karakterisere deres rolle i forskellige facetter af svømning og sværm. De kan let tilpasses til at studere motilitet i andre bakteriearter.

Introduction

Bakterier anvender mange vedhæng til bevægelse og spredning i deres økologiske nicher1. Flagella-drevet motilitet er den hurtigste af disse, fremme koloniseringen af gunstige lokaliteter som reaktion på miljøsignaler og bidrage væsentligt til visse arters patogene evne2,3. Flagellerede bakterier kan svømme individuelt i bulk væske, eller sværme som et kollektiv over en halvfast overflade4. Ekstracellulær flagella fastgøres til og drives af roterende motorer indlejret i membranen, som udnytter iongradienternes kraft til at generere drejningsmoment, der forårsager rotation1,2,4,5,6,7,8. I E. coli, hvis motorer kører med konstant drejningsmoment9, kan motoreffekten kategoriseres i rotationshastighed og skift af rotoren mellem mod uret (CCW) og med uret (CW) retninger. CCW-rotation fremmer dannelsen af et sammenhængende flagellarbundt, der driver cellen fremad (løb), mens en forbigående kontakt i rotationsretning (CW) får bundtet til at adskille enten delvist eller fuldt10, og cellen til at omlægge sin svømmeretning (tumble). E. coli kører typisk et sekund og tumler i en tiendedel af et sekund. Koblingsfrekvensen for rotoren eller »tumble bias« styres af chemotaxis-signalsystemet, hvor transmembrane-systemerne registrerer eksterne kemiske signaler og sender dem via fosfor til flagellarmotoren for at udvide kørsler som reaktion på tiltraktrens eller undertrykke dem som reaktion på giftige kemikalier11,12. Svømning motilitet er analyseret i 0,3% blød agar.

Under sværmer, bakterier navigere på en halvfast overflade som en tæt kollektiv, hvor pakninger af bakterier strøm i en kontinuerlig hvirvlende bevægelse2,13,14,15. E. coli sværme udviser ændret kemosensorisk fysiologi (lavere tumble bias), højere hastigheder, og højere tolerance over for antimikrobielle stoffer over celler svømmer i bulk væske16,17. Sværme varierer i deres indsættelse af en overflod af strategier, støtte bevægelse, herunder overfladeaktiv produktion, hyperflagellation, og celle forlængelse2. Swarming giver bakterier en konkurrencemæssig fordel i både økologiske og kliniske indstillinger18,19,20. Der er to kategorier af sværmende bakterier: tempererede sværme, som kun kan sværme på medier størknet med 0,5-0,8% agar og robuste sværme, som kan navigere på tværs af højere agarkoncentrationer21.

En række assays findes for at afhøre svømning motilitet og dens regulering. Når den er svækket af mutationer eller miljøforhold, tilbyder motiliteten i sig selv et stærkt udvalg til at identificere forstærkning af funktionsundertrykkermutationer. Disse undertrykkere kan være ægte revertants af den oprindelige mutation, eller pseudo-revertants, hvor en anden mutation genopretter funktionalitet. Sådanne mutanter kan identificeres ved hele genomsekvensering (WGS). Et alternativ til upartisk suppressor udvælgelse er en forudindtaget målrettet mutagenesis strategi (f.eks PCR mutagenesis). Disse metoder kaster ofte lys over motilitetsapparatets funktion eller miljøregulering. Hvis målet er at studere motorisk funktion, så restaurering af vilde-type motilitet målt i blød agar kan ikke nødvendigvis angive restaurering af vilde-type motoriske output. Celle-tøjring assay, hvor cellerne er knyttet til en glasoverflade af en enkelt flagellum og rotation af cellekroppen er efterfølgende overvåges, kan være den oprindelige analyse af valg til vurdering af motorisk adfærd. Selv om mere avancerede metoder er nu tilgængelige til at overvåge motoriske egenskaber, den nødvendige højhastighedskamera set-up og anvendelse af softwarepakker til bevægelse analyse begrænse deres udbredte brug22,23,24,25. Den celle-tøjring assay kræver kun, at flagella skal klippes, så fastgørelse af de korte filamenter til et glas dias, efterfulgt af videooptagelse rotation af cellehuset. Selv om de registrerede motorhastigheder er lave i denne analyse på grund af den høje belastning, som cellekroppen udøver på flagellum, har denne analyse ikke desto mindre bidraget til værdifuld indsigt i kemotaktiske reaktioner26,27,28,29, og forbliver et gyldigt efterforskningsværktøj som beskrevet nedenfor.

Sværmende motilitet udgør et andet sæt udfordringer for forskere. Udvælgelse af gain-of-funktion undertrykkere virker kun i sværme, der producerer rigelige overfladeaktive stoffer og sværm let13. Overfladeaktive ikke-producenter som E. coli er kræsne med hensyn til valget af agar , mediesammensætning og fugtighed i miljøet2,13,14,21. Når sværmende forhold er etableret, grænseovergangen assay17 er en nyttig metode til at afhøre muligheden for en sværm til at navigere nye / barske forhold. Selv om nedenstående protokoller vedrører E. coli, kan de let tilpasses til anvendelse i andre arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering af suppressor mutanter i motilitet-mangelfulde stammer

BEMÆRK: Brug denne metode som en bred 'catch-all' til at identificere den generelle karakter af motilitetsdefekten.

  1. Forberedelse af soft-agar plade
    BEMÆRK: Soft-agar, også kaldet motilitet- eller svømme-agar, er en lav procentdel agar (~ 0,2-0,35% w / v), længe brugt til at analysere chemotaxis31,32.
    1. Der tilsættes 3 g bacto-agar (0,3% w/v) og 20 g LB til en 2 L rund bundkolbe. Der tilsættes 1 L ddH2O (dobbeltdestilleret vand) til kolben, og suspensionen blandes jævnt med en omrørestang og magnetisk omrøringsplade.
    2. Autoklave i 20 min ved 121 °C.
    3. Lad det køle af med let omrøring ved hjælp af stangen/pladen som ovenfor. Når temperaturen når ca. 50 °C, hældes 25 mL i sterile petriskåle (100 mm x 15 mm), og den smeltede agar kan sættes med låg på plads i mindst 1 time til brug inden for 16 timer.
  2. Kulturforberedelse, podning og isolation af suppressor mutanter
    BEMÆRK: E. coli podet i midten af næringsrige medier størknet med blød agar forbruge næringsstoffer lokalt, hvilket skaber et næringsstof gradient, at de følger. Når bakterierne bevæger sig udad, vises de (figur 1A), som er relateret til specifikke kemoattratanter, som bakterierne reagerer på. Fejl i enten chemotaxis-systemet eller strukturelle komponenter i flagellamotoren kan kompromittere ydeevnen i denne analyse. Ofte, mutanter med en motilitet fordel opstår under screening, og kan ses på vej ud af enkelt eller fra flere punkter langs periferien af ringen, hvorfra de 'flare' ud (Figur 1C). Man vil bemærke, at den yderste kant af svømning front kontrast let mod den uncolonized jomfru blød agar.
    1. Vokse natten kulturer af den ønskede motilitet-mangelfuld stamme i 5 mL Lennox Bouillon (LB; 10 g / L tryptone, 5 g / L gær ekstrakt, og 5 g / L NaCl, Tabel over materialer) ved 30 °C med vandret rysten (220 r.p.m.). Den følgende dag, subkultur (1:100 fortynding) i frisk LB, vokser under de samme betingelser til eksponentiel fase (OD600 af 0,6).
    2. 6 μL af kulturen podes ind i midten af en blød agarplade (1.1) ved hjælp af en pipette, og den indlæste sterile spids skubbes ind i agaren for forsigtigt at udvise indholdet. Overførsel til 30 °C og inkubat(figur 1B), indtil motiliteten »flares« er tydelige, og som stammer fra motilitetsringenes podningspunkt eller periferi, typisk i 24-36 timer (figur 1C).
      BEMÆRK: I motilitetsanalyser vaccineres en stamme af vild type sammen med de mutante isolater til sammenligning. Denne stamme af vild type vil vise de karakteristiske koncentriske kemotaktiske ringe (figur 1A) og fylde pladen inden for 8-10 timer.
    3. Brug en steril trådsløjfe til at løfte cellerne fra 'flare'-regionen og striben for at rense enkelte kolonier på en LB hård agarplade (LB tilberedt som ovenfor, størknet med 15 g /L bacto-agar).
    4. Vælg enkelte kolonier fra stribepladen ved hjælp af en steril trådsløjfe, og re-rense ved striber for enkelte kolonier for at sikre isolering af en 'ren' koloniisolat.
  3. Bekræftelse og karakterisering af suppressor mutanter
    1. Bekræft, at den eller de isolerede suppressor-mutanter har genoprettet bevægeligheden. Der fremstilles bløde agarplader (1.1) og kulturer til belastninger af interesse (som i punkt 1.2.1), herunder vilde typer og startstammen "motilitetsdeficient" til sammenligning.
    2. Pladerne (som i 1.2.2) podes og inkuberes ved 30 °C i 8-10 timer.
    3. Registrer diameteren af den yderste ring (cirklens kant) og sammenlign for at fastslå, hvilke af isolaterne der har genoprettet motiliteten betydeligt.
      BEMÆRK: Det anbefales, at pladerne fotograferes i hele forsøgets forløb. For de bedste resultater, brug en "spand lys" enhed30, hvor et digitalt kamera er monteret over en lyskilde for bedre belysning til at måle diameteren af svømmekolonien og skelne den fra ikke-koloniseret agar.
    4. Forsøgsperson verificerede isolater til WGS efter behov, hvilket giver mulighed for tilstrækkelig 'sekvensdækning' til positivt at identificere de mutationer, der genoprettede funktionen af vild type.

2. Kvantificering af flagellamotorisk adfærd via celleoprindning

BEMÆRK: Brug denne metode, når normal run-tumble adfærd (chemotaxis) synes at være kompromitteret.

  1. Kulturforberedelse og flagellaskæring
    1. Der skal udarbejdes en eksponentiel fasekultur af interessebelastningen som beskrevet i trin 1.2.1.
    2. Pellet 10 mL celler ved centrifugering ved 2.000 x g i 3 minutter, før den genbruges i 10 mL filtersteriliseret motilitetsbuffer (MB; 10 mM kaliumphosphatbuffer [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      BEMÆRK: MB understøtter bevægelighed, men understøtter ikke bakterievækst
    3. Gentag trin 2.1.2 to gange mere, før den endelige pellet genbruges i 1 mL MB.
    4. Overfør celleaffjedringen til en 1 mL sprøjte og fastgør en 23G nål til enden. Saml en identisk sprøjte/nål apparater og fastgør de to sammen via 6 inches af polyethylen slange (indvendig diameter på 0,58 mm) tæt beklædt over hver nål spids.
    5. Klip flagellaen (de er skrøbelige og bryder let) ved forsigtigt at passere celleaffjedringen frem og tilbage fra den ene sprøjte til den anden 50x, med 1 min pauser mellem hver 10 passerer.
    6. Centrifuge de forskredne celler ved 2.000 x g i 3 min. og opsuges i et slutvolumen på 500 μL MB.
  2. Forberedelse af dias og celleopredning
    1. Forbered et cellefikseringskammer ved at stable et 18 mm x 18 mm coverlip over en 3 tommer x 1 tommer x 1 mm glasmikroskoprutsjebane adskilt af dobbeltsidet tape (Figur S1).
    2. Kammeret skylles med 0,01% (w/v) poly-lysinopløsning ved at påføre toppen af kammeret. Vip den nederste kant (coverlipet flugter med mikroskopdiaset) på en opgavevisker (silkepapir) for at hjælpe med at tegne opløsning gennem kammeret (Figur S1). Derefter inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
    3. Kammeret vaskes tre gange med 40 μL MB ved hjælp af som beskrevet i trin 2.2.2
    4. Der tilsættes 40 μL af den klippede celleophæng (tilberedt ovenfor) til toppen af kammeret og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, så cellerne kan fastgøres til dækslet.
    5. Kammeret skylles forsigtigt med 40 μL MB som i punkt 2.2.3 for at fjerne ubundne celler.
  3. Registrering og kvantificering af cellerotation
    1. Overfør mikroskopdiaset fyldt med tøjrede celler til mikroskopstadiet.
    2. Brug fasekontrastmikroskopi og et 100x mål, scan populationen for celler, der er fastgjort på plads, og roter på en enkelt akse,dvs.
    3. Brug et kommercielt mikroskop og tilhørende kamera. Åbn den tilknyttede software, sørg for, at celler af interesse er i fokus, og klik på videoopsamling for at optage cellerotationen i et minut (med 10 billeder pr. sekund eller højere).
    4. Fra videoafspilning kan du kvantificere antallet af komplette rotationer pr. minut og det antal gange, cellen skifter retning (skiftfrekvens).
      BEMÆRK: Rotationshastigheder og skiftfrekvens kan være for hurtige til at måle efter øje, så det anbefales at bruge videosoftware, der tilbyder langsom/fin afspilning, eller anvender et automatiseret softwaresystem til at kvantificere rotationsmønstre33. Et alternativ ville være at øge viskositeten af MB ved hjælp af methyl cellulose (eller lignende middel) til at hjælpe langsom og løse rotation af hurtigere bakterier eller kompensere, når kameraer med lave framerates er i brug.
    5. Gentag trin 2.3.2 med biologiske replikater for at udarbejde en repræsentation af den interessepopulation, der er af interesse.

3. Forberedelse af sværme i en grænseovergang assay

BEMÆRK: Brug denne metode til at vurdere virkningen af en mutation eller tilstand på gruppemotilitet. Swarm-agar refererer til agar, hvor procentdelen typisk er højere end for soft-agar. I blød agar (0,3 %), svømmer celler individuelt inde i agaren. I sværm agar (0,5% og derover), celler bevæger sig som en gruppe på overfladen. Mens sværmplader skal bruges som beskrevet her, har svømmeplader en længere holdbarhed og kan bruges i flere dage. Vores personlige præference er at bruge i 1-2 dage.

  1. Forberedelse af sværm agar
    1. Der tilsættes 5 g Eiken agar (0,5% w/v) og 20 g LB til en 2 L rund bundkolbe. Der tilsættes 1 L ddH2O til kolben, og suspensionen blandes jævnt med en omrørestang og magnetisk omrøringsplade.
    2. Autoklave i 20 min ved 121 °C.
    3. Lad det køle af med skånsom omrøring for at undgå luftbobler ved hjælp af stangen/pladen som ovenfor. Når der er ca. 50 °C, tilsættes filtersteriliseret glukose til en endelig koncentration på 0,5 %.
    4. Der hældes 25 mL i sterile petriskåle (100 mm x 15 mm) og der må indstilles ved stuetemperatur i mindst 14 timer og højst 20 timer. Må ikke opbevares til fremtidig brug.
  2. Podning og inkubation af sværmplader
    1. 6 μL af en middel eksponentiel kultur (tilberedt som i 1.2) ved at spotte oven på agaren.
    2. Lad låget stå i 5-10 minutter og udskift, når inoculumet er tørret ind i agaroverfladen.
    3. Inkuber ved 30 °C i 8 timer. Undgå fristelsen til at inspicere sværm fremskridt ved at fjerne låget, da dette vil bidrage til tørring af agar og forringe sværmer.
      BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere afhængigt af stammephoenotypen. Nogle isolerede mutationer kan hæmme sværmende evne og vil kræve en reduceret procentdel af agar eller en mere langvarig periode med inkubation.
  3. Fremstilling af assayplader ved grænseovergangen
    BEMÆRK: Denne analyse bruger en modificeret petriskål, hvor en plastskel (kant) skaber to kamre i stedet for et (figur 2A). Hvert kammer kan tilberedes uafhængigt af det andet og tilbyde forskellige betingelser for sværmer, før det 'forbinder' de to. Afhængigt af eksperimentelt design kan det første kammer (udpeget til venstre) fremstilles med enten svømme agar (0,3% w/v) eller sværm agar (0,5% w/v), hvorfra bakterierne kan migrere over grænsen til højre kammer, der indeholder sværm agar +/- ethvert påkrævet supplement eller udfordring (f.eks. antibiotika). Migration på enten agar måles typisk/sammenlignes ved at registrere den bredeste diameter af bakteriel kolonisering (kant til kant) fra det oprindelige podningspunkt.
    1. Forbered svømme agar som beskrevet i 1.1, hvis det kræves.
    2. Forbered sværm agar som beskrevet i 3,1.
    3. Hæld ~30 mL sværm agar (med ønsket tilskud, hvis det kræves) i højre kammer i en dobbelt-rum Petri parabol (100 mm x 15 mm), til det punkt, hvor det er niveau med plast skillevæg mellem kamre, men ikke overfyldte til venstre(Figur 2B).
    4. Når agaren er hærdet, fyldes venstre kammer med ~ 30 mL svømme eller sværm agar, igen til kontaktpunktet med plastskellet (Figur 2C). Før den går i gang, skal du bruge en steril pipettespids til forsigtigt at trække agaren over kanten for at forbinde de to sider med en ~ 1 mm høj agarbro, der spænder over hele længden af kløften (Figur 2D).
    5. Pladen tørrer ved stuetemperatur (3.1).
      BEMÆRK: En alternativ metode til at skabe bro er at lade venstre kammer agar tørre og derefter langsomt pipette ~ 100 μL smeltet sværm agar langs plast skillevæg at bygge bro mellem de to kamre (3,4). Pladerne på venstre kammer er podet som beskrevet ovenfor til svømning (1.2.2) eller sværm (3.2) agar, før de inkuberes ved 30 °C i 12-16 timer, eller indtil sværme har gjort tilstrækkelige fremskridt over højre kammer til at muliggøre sammenligninger mellem interessestammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isoleringen af pseudo-revertanter i en E. coli stamme, hvis motilitet er svækket af høje niveauer af signalmolekylet c-di-GMP, blev beskrevet i det seneste arbejde fra vores laboratorium34. Denne stamme (JP1442) husede to mutationer: ΔyhjH og ΔycgR. YhjH er den mest aktive phosphodiesterase, der nedbryder c-di-GMP i E. coli. Fravær af YhjH fører til forhøjede c-di-GMP niveauer og hæmning af motilitet. YcgR er en c-di-GMP-effektor. I komplekset med c-di-GMP binder YcgR sig til den flagellare rotor for først at fremkalde CCW-motorrotation og efterfølgende reducere motorhastigheden. Celle tøjring og perle assays viste, at motorisk adfærd tilbage til normal i dobbelt mutant, men motilitet i blød agar ikke34. Så vi indsat trin 1 i protokollen til at isolere pseudo-revertant flares i den dobbelte mutant (Figur 1C). Størstedelen af de mutationer, der er kortlagt af WGS (HiSeq 4000 platform, PE 2 x 150 setup34) til rssB, hvilke koder for et responsregulator / adapterprotein, der normalt leder ClpXP protease til at målrette σS for nedbrydning34. Et af disse revertanter, som udviste motilitet tæt på vildtype (AW405, sammenlign figur 1A,D), blev brugt til at generere repræsentative resultater for trin 2 og 3 i protokolafsnittet, idet det som kontrol anvendte både sin dobbelte mutante forælder (Figur 1B) og isogen stamme af vild type (Figur 1A).

For trin 2 i protokolafsnittet blev videooptagelser analyseret for at beregne rotationer pr. minut (hver 360 ° komplet rotation) og CWBias (den brøkdel af tiden, hvor motorer roterer i en CW-retning eller tumler bias). ΔyhjH viste færre rotationer pr. minut og en lavere CW-bias sammenlignet med vildtypen som forventet (figur 3). Både ΔyhjH ΔycgR dobbelt mutant og dens suppressor viste motorisk adfærd svarende til vild-type, observationer understøttet af en tidligere analyse ved hjælp af højere opløsning 'perle' analyse beskrevet i indledningen ovenfor i tidligere arbejde34.

For trin 3 i protokolafsnittet blev grænseovergangsanalysen (figur 2) brugt til at sammenligne evnerne hos den vilde type og suppressorisolatet, først for at sværme og derefter for at bevæge sig over grænsen og sværme på agar suppleret med kanamycin. Resultaterne viser, at begge stammer nåede grænsen på et lignende tidspunkt (data ikke vist), der angiver lignende sværmende fra et identisk podningspunkt. Imidlertid var krydsning af sværmen til højre (antibiotisk) kammer marginalt, men konsekvent større for den vilde type end suppressoren ved 20 μg/mL kanamycin (Figur 4). Forskellen mellem de to stammer var mere udtalt ved 40 μg/mL kanamycin. Tilsammen tyder disse data på, at mutationerne i rssB, der genoprettede motiliteten på soft-agar plader (Figur 1D), har en negativ indvirkning på antibiotikaresistensen af suppressorstammen under sværmende (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Blød-agar motilitet assays og fremkomsten af suppressor flares.
Pladerne indeholder LB størknet med 0,3 % w/v agar. E. coli-stammer blev podet i midten af hver plade og inkuberet ved 30°C i 8 timer, undtagen C, som blev inkuberet i 16 timer (A) Wild-type E. coli (AW405). (B) Motilitetsdeficient variant ∆yhjHycgR (JP1442). (C)Som i B, undtagen længere inkubationstider. Pile peger på hurtigere bevægelige 'flares', der dukker op ved den perifere ring i den ekspanderende svømmekoloni. (D) En suppressor isoleret fra en flare i C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk til opsætning af en grænseovergang plade analyse.
(A) Hæld ~ 30 mL sværm agar (med det ønskede antibiotikum) i højre kammer af en delt petriskål indtil niveau med plast skillevæg og lad det indstille med låg lukket. (B) Fyld venstre kammer med ~ 30 mL svømme eller sværm agar til kontaktpunktet med toppen af plast skillevæg. (C) Brug en steril pipettespids til forsigtigt at trække den smeltede sværm agar over grænsen og derved forbinde de to sider med en ~ 1 mm høj agarbro og lad den indstille med låg lukket. d) Lad pladen tørre yderligere ved stuetemperatur natten over, før den poder venstre kammer med den ønskede belastning, og inkuber ved 30 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Motoriske egenskaber af forskellige stammer målt ved celle-tøjring teknik.
Wild-type (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgRyhjH (JP1442), og dens suppressor (JP1836) blev dyrket i LB ved 30 °C til midten af eksponentiel fase før tøjring. (A) Rotationer pr. minut (fuldførte 360° sving) og (B)CW-bias (brøkdel af tidsmotorer roterer i CW-retning). Middelværdiafvigelsens standardafvigelse (±). 20 tøjrede celler blev observeret i 60 sek. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Grænseovergangsanalyser.
Mellem eksponentielle fasekulturer af vildtype E. coli (AW405) og suppressormutanten (JP1836) blev podet på den angivne position (*) i venstre rum på den delte plade, der indeholder sværmmedier, og inkuberet ved 30 °C. De nåede grænsen på sammenlignelige tidspunkter. Pladerne blev inkuberet i yderligere 6 timer, hvor sværmen krydsede over til højre kammer, hvor medierne blev suppleret med kanamycin (Kan; tal angiver μg/mL). Pladerne er repræsentative for tre biologiske replikater, der hver især udføres i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Forberedelse af et kammerdias til celleopredning. (A) Læg to stykker dobbeltsidet tape før (B) ved hjælp af et barberblad til at trimme væk overskydende. (C) Skræl det øverste lag væk for at eksponere klæbemidlet før (D) ved at anbringe en coverlip og forsigtigt trykke det på plads (angivet med [ ), hvilket sikrer, at al luft skubbes ud af grænsefladen mellem coverlip og tape nedenfor. (E)Belastningsprøve (vist her med DNA-belastningsfarvning [30% v/v glycerol 0,25% w / v bromophenol blå, og 0,25% w / v xylen cyanol] tilføjet for at støtte visualisering) i toppen af den skabte kanal (pil), mens(F)lystfiskeri på ren, væv opgave tørre at hjælpe trække opløsningen gennem kammeret som vævet absorberer væsken (pil) i kanalen og trækker den igennem. Klik her for at downloade dette tal.

Video 1: Rotation af tøjrede E. coli celler. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: En aktiv E. coli sværm filmet under 60x forstørrelse, der viser sin karakteristiske hvirvlende bevægelse bag kanten af den bevægelige front. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Isolation og karakterisering af suppressormutationer har med succes bidraget til at identificere nøglekomponenter i chemotaxis-systemet35,36,37, samt selve motormaskineriet38,39,40. Mens du bruger protokol 1, er det vigtigt at inkludere flere uafhængige replikater for at sikre isolering af et stort spektrum af mulige mutationer, der kan kompensere for tabet af motilitet. At øge antallet af bakterier ved at stribe kulturen i en linje snarere end et sted, kan forbedre oddsene for at generere undertrykkere41. Isolering af den samme mutation (som bestemt af DNA-sekventering) flere gange øger tilliden til dens ægthed. WGS vil altid afsløre tilstedeværelsen af andre mutationer i genomet. Det er derfor vigtigt at verificere resultaterne ved at transducere (hvor det er muligt) den identificerede mutation tilbage i den oprindelige motilitets-mangelfulde baggrund. Den suppressor mutant tilgang er rodfæstet i at genoprette funktionen gennem en sekundær mutation, så en begrænsning af denne metode er, at hvis en kritisk strukturel gen er slettet, dvs en, der understøtter hele vejen eller struktur, kan der ikke være plads til kompensation. På trods af at være en gammel metode, viser vores seneste arbejde34 sin fortsatte nytte i belysning af nye veje, der bidrager til bakteriel motilitet.

For kvantificering af motoreffekten forbliver celle-tøjringsmetoden et universelt tilgængeligt værktøj, der kun kræver et mikroskop med en kameratilbehør. Celleoprindelse er allerede blevet anvendt i et forskelligt antal bakteriearter , herunder Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44og Rhodobacter33. Protokollens succes er i høj grad betinget af korrekt klipning og fastgørelse af celler. Hvis du klipper for aggressivt eller udelader pausen mellem saks (2.1.5), har det tendens til at fremme inkonsekvent eller ufuldstændig klipning af filamenter, hvilket resulterer i ikke-bevægelige celler eller celler bundet på en skæv akse. Den varige relevans af denne protokol er fortsat, på trods af vedtagelsen af den højere opløsning perle assay af mange forskergrupper (herunder vores). Den primære begrænsning af perleanalysen kommer fra behovet for, at perlen klæber til glødetråden af de af interessede bakterier. Denne teknik har i høj grad nydt godt af undersøgelser i E. coli, der identificerede en 'klæbrig' flagellin allel, som letter overholdelse45. Den klæbrige variant er også overlegen i celle-tøjring assay. En sådan variant er endnu ikke tilgængelig for de fleste flagellerede bakterier. Situationen er kompliceret yderligere med nogle organismer, der besidder flere flagellinproteiner46, og i tilfælde af Vibrio sp., der også besidder en membranøs kappe47. Celle-tøjring kan også udføres ved hjælp af en artsspecifik anti-flagellin antistof eller et antistof til en manipuleret epitop tag.

Mens bakterier kan svømme umiddelbart efter introduktionen til et flydende medium, gælder dette ikke for sværmer, hvor celler først skal primes til en sværmende tilstand. Overfladekontakt udløser en fysiologisk ændring, der kræves for celler til at indlede sværmer48,49,50,51, hvilket resulterer i en forsinkelse fase og en ophobning af høj celletæthed. Fysiologiske ændringer omfatter ombygning af chemotaxis-systemet i E. coli16og tilpasninger såsom celleforlængelse og/eller hyperflagellation for andre bakterier13,14,21. I betragtning af de fysiologiske ændringer, der kræves for at indlede sværmer, finder vi en advarsel om undersøgelser, der har forsøgt at efterligne udvalgte facetter af sværmer - såsom høj densitet eller øget cellelængde - blot ved at koncentrere planktoniske cellekulturer for at øge densiteten og / eller fremkalde celleforlængelse ved brug af antibiotika, der hæmmer celledeling52,53. Hvis du bruger celleforlængelse som en markør, advarer vi også om, at sammenlignet med planktoniske celler er der kun en marginal stigning i den gennemsnitlige længde af sværmceller i Salmonella eller E. coli54. Sværm assays er sværere at etablere end svømme assays. Variabler omfatter den kommercielle kilde til agar bruges til at størkne medierne (den særlige Eiken agar er afgørende for sværmer i E. coli, mens de mere standard Difco agar understøtter sværmer for alle andre bakterier), brug af rige versus minimal medier(E. coli og Salmonella kræver glukose tilskud), og mest kritisk omgivende luftfugtighed2,13,14,21. Af disse kan det være mest frustrerende at opretholde optimal luftfugtighed. [En fremragende, metodisk, optimering for sværmer i en organisme valg (Pseudomonas aeruginosa) er blevet påvist af Morales-Soto og kolleger55.] Sværm medier skal være tilstrækkelig fugtig til at fremme sværmer, men ikke så fugtig, at tillade passiv spredning / glidende, som let kan forveksles med aktive sværmer56. Det er derfor afgørende, at sværme kontrolleres under et mikroskop for at bekræfte de forskellige bevægelsesmønstre, der er forbundet med denne kollektive bevægelighed (Video 2). Temperatur er også en vigtig overvejelse for at optimere den sværmende analyse. Højere temperaturer, f.eks. Brug af en inkubator med fugtighedskontrol (~70-80%) kan hjælpe med at afhjælpe disse problemer, herunder sæsonmæssige ændringer, der kan påvirke interne bygningstemperaturer og fugtighed. Når det er lykkedes etableret, giver protokol 3 en effektiv måde at undersøge et af de mest interessante aspekter af sværmende bakterier, forhøjet resistens over for antibiotika17. Alle protokoller, der er beskrevet her, kan anvendes på nye organismer til at identificere veje, der specificerer og kontrollerer flagella medieret motilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud GM118085 og dels af Robert Welch Foundation (tilskud F-1811 til R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Biologi bakterier chemotaxis Escherichia coli flagella roterende motor motilitet svømning sværmer overflade sensing overflade motilitet
Undersøgelse Flagella-Driven Motility i <em>Escherichia coli</em> ved at anvende tre etablerede teknikker i en serie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J. D., Harshey, R. M.More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter