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Biology

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Abstract

Die Motilität ist entscheidend für das Überleben und den Erfolg vieler Bakterienarten. Es gibt viele Methoden, um die Motilität zu nutzen, um Signalwege zu verstehen, die Funktion und den Aufbau von Flagellenteilen aufzuklären und Bewegungsmuster zu untersuchen und zu verstehen. Hier demonstrieren wir eine Kombination von drei dieser Methoden. Die Motilität in weichem Agar ist die älteste und bietet eine starke Auswahl für die Isolierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen in motilitätseingeschränkten Stämmen, bei denen die Motilität durch eine zweite Mutation wiederhergestellt wird. Die Zellanbindetechnik, die zuerst verwendet wurde, um die rotierende Natur des Flagellenmotors zu demonstrieren, kann verwendet werden, um den Einfluss von Signaleffektoren auf die Motordrehzahl und ihre Fähigkeit, die Drehrichtung zu wechseln, zu bewerten. Der "Grenzübertritts"-Assay ist neuer, bei dem schwimmende Bakterien darauf vorbereitet werden können, sich kollektiv als Schwarm zu bewegen. In Kombination stellen diese Protokolle einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz dar, um Komponenten der Motilitätsmaschinerie zu identifizieren und ihre Rolle in verschiedenen Facetten des Schwimmens und Schwärmens zu charakterisieren. Sie können leicht angepasst werden, um die Motilität bei anderen Bakterienarten zu untersuchen.

Introduction

Bakterien verwenden viele Anhängsel zur Bewegung und Ausbreitung in ihren ökologischenNischen 1. Flagellengetriebene Motilität ist die schnellste von diesen, fördert die Besiedlung günstiger Orte als Reaktion auf Umweltsignale und trägt wesentlich zur pathogenen Fähigkeit einiger Artenbei 2,3. Gegeißelte Bakterien können einzeln in flüssiger Schüttung schwimmen oder als Kollektiv über eine halbfeste Oberflächeschwärmen 4. Extrazelluläre Flagellen haften an und werden von in die Membran eingebetteten Rotationsmotoren angetrieben, die die Kraft der Ionengradienten nutzen, um ein Drehmoment zu erzeugen, das eine Rotation1,2,4,5,6,7,8verursacht . Bei E. coli, deren Motoren mit einem konstanten Drehmoment9laufen , kann die Motorleistung in Bezug auf Drehzahl und Umschaltung des Rotors zwischen gegen den Uhrzeigersinn (CCW) und im Uhrzeigersinn (CW) kategorisiert werden. Die CCW-Rotation fördert die Bildung eines kohärenten Flagellenbündels, das die Zelle vorwärts treibt (Run), während ein transienter Schalter in Rotationsrichtung (CW) dazu führt, dass sich das Bündel entweder teilweise oder vollständig10zerlegt und die Zelle ihre Schwimmrichtung neu ausspricht (Tumble). E. coli laufen typischerweise für eine Sekunde und taumeln für eine Zehntelsekunde. Die Schaltfrequenz des Rotors oder "Tumble Bias" wird durch das Chemotaxis-Signalsystem gesteuert, wobei Transmembran-Chemorezeptoren externe chemische Signale erkennen und über Phosphorelay an den Flagellenmotor übertragen, um Läufe als Reaktion auf Lockstoffe zu verlängern oder sie als Reaktion auf toxische Chemikalien zu unterdrücken11,12. Die Schwimmmotilität wird in 0,3% weichem Agar untersucht.

Während des Schwärmens navigieren Bakterien auf einer halbfesten Oberfläche als dichtes Kollektiv, wo Bakterienpackungen in einer kontinuierlichen Wirbelbewegungströmen 2,13,14,15. E. coli-Schwärme zeigen eine veränderte chemosensorische Physiologie (niedrigere Tumble-Bias), höhere Geschwindigkeiten und eine höhere Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen über Zellen, die in flüssiger Schüttung schwimmen16,17. Schwärme unterscheiden sich in der Anwendung einer Vielzahl von Strategien, die die Bewegung unterstützen, einschließlich Tensidproduktion, Hyperflagellation und Zelldehnung2. Schwärmen bietet Bakterien einen Wettbewerbsvorteil sowohl im ökologischen als auch im klinischen Umfeld18,19,20. Es gibt zwei Kategorien von Schwarmbakterien: gemäßigte Schwärme, die nur auf Medien schwärmen können, die mit 0,5-0,8% Agar erstarrt sind, und robuste Schwärmer, die über höhere Agarkonzentrationen navigieren können21.

Es gibt eine Vielzahl von Assays, um die Schwimmmotilität und ihre Regulierung zu untersuchen. Wenn sie durch Mutationen oder Umweltbedingungen beeinträchtigt wird, bietet die Motilität selbst eine starke Auswahl für die Identifizierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen. Diese Suppressoren können echte Revertanten der ursprünglichen Mutation oder Pseudo-Revertanten sein, bei denen eine zweite Mutation die Funktionalität wiederherstellt. Solche Mutanten können durch Whole Genome Sequencing (WGS) identifiziert werden. Eine Alternative zur unvoreingenommenen Suppressorauswahl ist eine verzerrte gezielte Mutagenesestrategie (z. B. PCR-Mutagenese). Diese Methoden beleuchten oft die Funktion oder Umweltregulation des Motilitätsapparates. Wenn das Ziel darin besteht, die motorische Funktion zu untersuchen, bedeutet die Wiederherstellung der Wildtyp-Motilität, wie sie in weichem Agar gemessen wird, nicht unbedingt auf die Wiederherstellung der Wildtyp-Motorleistung. Der Cell-Tethering-Assay, bei dem Zellen durch ein einzelnes Flagellum an einer Glasoberfläche befestigt werden und anschließend die Rotation des Zellkörpers überwacht wird, kann der erste Assay der Wahl zur Beurteilung des motorischen Verhaltens sein. Obwohl heute ausgefeiltere Methoden zur Überwachung der Motoreigenschaften zur Verfügung stehen, begrenzen die erforderliche Einrichtung von Hochgeschwindigkeitskameras und die Anwendung von Softwarepaketen für die Bewegungsanalyse ihre weit verbreitete Verwendung22,23,24,25. Der Zell-Tethering-Assay erfordert nur, dass die Flagellen geschert werden, so dass die kurzen Filamente an einem Glasobjektträger anhaften, gefolgt von einer Videoaufzeichnung der Rotation des Zellkörpers. Obwohl die aufgezeichneten Motordrehzahlen in diesem Assay aufgrund der hohen Belastung, die der Zellkörper auf das Flagellum ausübt, niedrig sind, hat dieser Assay dennoch zu wertvollen Erkenntnissen über chemotaktische Reaktionen26,27,28,29beigetragen und bleibt ein gültiges Untersuchungsinstrument, wie unten beschrieben.

Die Schwarmmotilität stellt Forscher vor andere Herausforderungen. Die Auswahl von Gain-of-Function-Suppressoren funktioniert nur in Schwärmen, die reichlich Tenside produzieren und leichtschwärmen 13. Tensid-Nichtproduzenten wie E. coli sind anspruchsvoll in Bezug auf die Wahl des Agars, die Medienzusammensetzung und die Feuchtigkeit der Umgebung2,13,14,21. Sobald die Schwarmbedingungen festgelegt sind, ist der Grenzübergangsassay17 eine nützliche Methode, um die Fähigkeit eines Schwarms zu untersuchen, sich unter neuen/rauen Bedingungen zurechtzufinden. Obwohl sich die unten vorgestellten Protokolle auf E. colibeziehen, können sie leicht für die Anwendung bei anderen Arten angepasst werden.

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Protocol

1. Isolierung von Suppressormutanten in motilitätsarmen Stämmen

HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode als umfassenden "Catch-All", um die allgemeine Art des Motilitätsdefekts zu identifizieren.

  1. Soft-Agar-Plattenzubereitung
    HINWEIS: Weich-Agar, auch als Motilitäts- oder Schwimm-Agar bezeichnet, ist ein Agar mit niedrigem Prozentsatz (~ 0,2-0,35% w / v), das seit langem zur Untersuchung von Chemotaxis31,32verwendet wird.
    1. 3 g Bacto-Agar (0,3% w/v) und 20 g LB in einen 2 L Rundkolben geben. 1 L ddH2O (doppelt destilliertes Wasser) in denKolbengeben und die Suspension mit einem Rührstab und einer magnetischen Rührplatte gleichmäßig mischen.
    2. Autoklav für 20 min bei 121 °C.
    3. Mit der Stange/Platte wie oben beschrieben mit sanftem Rühren abkühlen lassen. Wenn die Temperatur etwa 50 °C erreicht, gießen Sie 25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) und lassen Sie das geschmolzene Agar mindestens 1 h lang mit Deckel einstellen, um es innerhalb von 16 h zu verwenden.
  2. Kulturvorbereitung, Impfung und Isolierung von Suppressormutanten
    HINWEIS: E. coli, die in der Mitte nährstoffreicher Medien geimpft sind, die mit weichem Agar verfestigt sind, verbrauchen Nährstoffe lokal und erzeugen einen Nährstoffgradienten, dem sie folgen. Wenn sie sich nach außen bewegen, erscheinen definierte "Ringe" (Abbildung 1A), die mit bestimmten Chemoattraktantien verwandt sind, auf die die Bakterien reagieren. Defekte im Chemotaxis-System oder in strukturellen Komponenten des Flagellenmotors können die Leistung in diesem Assay beeinträchtigen. Oft entstehen Mutanten mit einem Motilitätsvorteil während des Screenings und können von einzelnen oder von mehreren Punkten entlang der Peripherie des Rings gesehen werden, von wo aus sie "ausflackern"(Abbildung 1C). Man wird feststellen, dass der äußerste Rand der Schwimmfront leicht mit dem unbesiellten jungfräulichen weichen Agar kontrastiert.
    1. Über Nacht Kulturen des gewünschten motilitätsarmen Stammes in 5 ml Lennoxbrühe (LB; 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl, Materialtabelle)bei horizontalem Schütteln (220 U/a.m) züchten. Am folgenden Tag Subkultur (1:100 Verdünnung) in frischer LB, unter den gleichen Bedingungen bis zur exponentiellen Phase (OD600 von 0,6) wachsend.
    2. 6 μL der Kultur werden mit einer Pipette in die Mitte einer Soft-Agar-Platte (1.1) geimpft und die beladene sterile Spitze in das Agar gedrückt, um den Inhalt vorsichtig auszustoßen. Übergabe auf 30 °C und Inkubation (Abbildung 1B), bis Motilitäts-"Fackeln" sichtbar sind, die vom Impfpunkt oder der Peripherie der Motilitätsringe ausgehen, typischerweise in 24-36 h (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Bei Motilitätstests wird ein Wildtypstamm neben den mutierten Isolaten zum Vergleich geimpft. Dieser Wildtyp-Stamm zeigt die charakteristischen konzentrischen chemotaktischen Ringe (Abbildung 1A) und füllt die Platte innerhalb von 8-10 h.
    3. Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Zellen aus der "Flare" -Region zu heben und einzelne Kolonien auf eine LB-Hartagarplatte zu reinigen (LB wie oben vorbereitet, erstarrt mit 15 g / L Bacto-Agar).
    4. Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer sterilen Drahtschlaufe aus der Streifenplatte und reinigen Sie sie erneut, indem Sie für einzelne Kolonien streifen, um die Isolierung eines "reinen" Kolonieisolats zu gewährleisten.
  3. Bestätigung und Charakterisierung von Suppressormutanten
    1. Vergewissern Sie sich, dass die isolierte(n) Suppressormutante(n) die Motilität wiederhergestellt haben. Bereiten Sie Weichagarplatten (1.1) und Kulturen für interessante Stämme (wie in 1.2.1) vor, einschließlich Wildtyp und des beginnenden "Motilitätsmangel"-Stammes zum Vergleich.
    2. Die Platten impfen (wie in 1.2.2) und bei 30 °C für 8-10 h inkubieren.
    3. Zeichnen Sie den Durchmesser des äußersten Rings (Rand des Kreises) auf und vergleichen Sie, um festzustellen, welche der Isolate die Motilität im Wesentlichen wiederhergestellt haben.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Platten während des gesamten Zeitraums des Experiments zu fotografieren. Für beste Ergebnisse verwenden Sie ein "Eimer Licht" Gerät30, wo eine Digitalkamera über einer Lichtquelle für eine bessere Beleuchtung montiert ist, um den Durchmesser der Schwimmkolonie zu messen und sie von unkolonisiertem Agar zu unterscheiden.
    4. Die Probanden verifizierten Isolate für WGS nach Bedarf, was eine ausreichende "Sequenzabdeckung" ermöglicht, um die Mutationen, die die Wildtypfunktion wiederherstellten, positiv zu identifizieren.

2. Quantifizierung des motorischen Verhaltens von Flagellen durch Zellanbindeung

HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, wenn das normale Run-Tumble-Verhalten (Chemotaxis) beeinträchtigt zu sein scheint.

  1. Kulturvorbereitung und Flagellenscherung
    1. Bereiten Sie eine exponentielle Phasenkultur des interessierenden Stammes vor, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.
    2. Pellet 10 mL Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 3 min vor dem Wiederauffüllen in 10 mL filtersterilisiertem Motilitätspuffer (MB; 10 mM Kaliumphosphatpuffer [0,0935 MK2HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      HINWEIS: MB unterstützt die Motilität, aber nicht das Bakterienwachstum
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 noch zwei weitere Male, bevor Sie das endgültige Pellet in 1 ml MB erneut verwenden.
    4. Die Zellsuspension in eine 1-ml-Spritze überführen und am Ende eine 23G-Nadel befestigen. Stellen Sie eine identische Spritze / Nadelvorrichtung zusammen und befestigen Sie die beiden zusammen über 6 Zoll Polyethylenschlauch (Innendurchmesser von 0,58 mm), der fest über jeder Nadelspitze ummantelt ist.
    5. Scheren Sie die Flagellen (sie sind zerbrechlich und brechen leicht), indem Sie die Zellsuspension sanft von einer Spritze zur anderen 50x hin und her geben, mit 1 Min. Pausen zwischen 10 Durchgängen.
    6. Zentrifugieren Sie die scherten Zellen bei 2.000 x g für 3 min und resuspendieren Sie in einem Endvolumen von 500 μL MB.
  2. Diavorbereitung und Zellanbindeung
    1. Bereiten Sie eine Zellfixierkammer vor, indem Sie einen 18 mm x 18 mm abdeckungsartigen Abdeckr über einen 3 Zoll x 1 Zoll x 1 mm Glasmikroskopobjektträger stapeln, der durch doppelseitiges Klebeband getrennt ist (Abbildung S1).
    2. Spülen Sie die Kammer mit 0,01% (w/v) Polylysinlösung, indem Sie sie auf die Oberseite der Kammer auftragen. Neigen Sie den unteren Rand (den Abdeckrbündchen bündig mit dem Objektträger) auf einen Taskwischer (Seidenpapier), um die Lösung durch die Kammer zu ziehen (Abbildung S1). Dann bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
    3. Waschen Sie die Kammer dreimal mit 40 μL MB wie in Schritt 2.2.2 beschrieben
    4. 40 μL der scherten Zellsuspension (oben vorbereitet) an die Oberseite der Kammer geben und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren, damit sich die Zellen am Abdeckr anheften können.
    5. Spülen Sie die Kammer vorsichtig mit 40 μL MB wie in 2.2.3, um nicht befestigte Zellen zu entfernen.
  3. Aufzeichnung und Quantifizierung der Zellrotation
    1. Übertragen Sie den mit angebundenen Zellen beladenen Objektträger in den Mikroskopstand.
    2. Scannen Sie die Population mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie und eines 100-fachen Objektivs nach Zellen, die an Ort und Stelle fixiert sind und sich um eine einzige Achse drehen, d. H. Glatte Rotationen an einem festen Punkt, anstatt sich in einem Winkel zu präsentieren, in dem sich die Zelle in und aus dem Fokus bewegt (Video 1).
    3. Verwenden Sie ein handelsübliches Mikroskop und die zugehörige Kamera. Öffnen Sie die zugehörige Software, stellen Sie sicher, dass die interessierendsten Zellen im Fokus sind, und klicken Sie auf die Videoaufnahme, um die Zellrotation für eine Minute (bei 10 Bildern pro Sekunde oder höher) aufzuzeichnen.
    4. Quantifizieren Sie bei der Videowiedergabe die Anzahl der vollständigen Umdrehungen pro Minute und die Häufigkeit, mit der die Zelle die Richtung ändert (Schaltfrequenz).
      HINWEIS: Rotationsgeschwindigkeiten und Schaltfrequenzen können zu schnell sein, um mit dem Auge gemessen zu werden, daher wird empfohlen, Videosoftware zu verwenden, die eine langsame / feine Wiedergabe bietet, oder ein automatisiertes Softwaresystem zur Quantifizierung von Rotationsmusternverwendet 33. Eine Alternative wäre, die Viskosität des MB mit Methylcellulose (oder einem ähnlichen Mittel) zu erhöhen, um die Rotation schnellerer Bakterien zu verlangsamen und aufzulösen oder zu kompensieren, wenn Kameras mit niedrigen Bildraten verwendet werden.
    5. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 mit biologischen Replikaten, um eine Darstellung der interessierenden Population zu erstellen.

3. Vorbereitung von Schwärmen in einem grenzüberschreitenden Assay

HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, um die Auswirkungen einer Mutation oder eines Zustands auf die Gruppenmotilität zu bewerten. Schwarm-Agar bezieht sich auf Agar, bei dem der Prozentsatz typischerweise höher ist als der von Weichem Agar. Bei weichem Agar (0,3 %) schwimmen die Zellen einzeln im Inneren des Agars. Bei Schwarmagar (0,5% und mehr) bewegen sich Zellen als Gruppe auf der Oberfläche. Während Schwarmplatten wie hier beschrieben verwendet werden müssen, haben Schwimmplatten eine längere Haltbarkeit und können mehrere Tage verwendet werden. Unsere persönliche Präferenz ist es, in 1-2 Tagen zu verwenden.

  1. Zubereitung von Schwarmagar
    1. 5 g Eiken-Agar (0,5 % w/v) und 20 g LB in einen 2-L-Rundkolben geben. 1 L ddH 2 O in denKolbengeben und die Suspension mit Rührstab und magnetischer Rührplatte gleichmäßig mischen.
    2. Autoklav für 20 min bei 121 °C.
    3. Mit sanftem Rühren abkühlen lassen, um Luftblasen mit der Stange / Platte wie oben beschrieben zu vermeiden. Bei ca. 50 °C filtersterilisierte Glukose für eine Endkonzentration von 0,5 % hinzufügen.
    4. 25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) gießen und mindestens 14 h und nicht mehr als 20 h auf Raumtemperatur einstellen lassen. Nicht für die zukünftige Verwendung aufbewahren.
  2. Impfung und Inkubation von Schwarmplatten
    1. Impfen Sie 6 μL einer mittel exponentiellen Kultur (vorbereitet wie in 1.2), indem Sie auf dem Agar aufflecken.
    2. Lassen Sie den Deckel für 5-10 min ab und ersetzen Sie ihn, wenn das Inokum in die Agaroberfläche getrocknet ist.
    3. Bei 30 °C für 8 h inkubieren. Vermeiden Sie die Versuchung, den Schwarmfortschritt zu überprüfen, indem Sie den Deckel entfernen, da dies zum Trocknen des Agars beiträgt und das Schwärmen beeinträchtigt.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Stammphänotyp variieren. Einige isolierte Mutationen können die Schwarmfähigkeit beeinträchtigen und erfordern einen reduzierten Prozentsatz an Agar oder eine längere Inkubationszeit.
  3. Erstellung von grenzüberschreitenden Assay-Platten
    HINWEIS: Dieser Assay verwendet eine modifizierte Petrischale, bei der eine Kunststoffscheide (Grenze) zwei Kammern anstelle einer erzeugt(Abbildung 2A). Jede Kammer kann unabhängig von der anderen vorbereitet werden und bietet unterschiedliche Bedingungen für das Schwärmen, bevor die beiden "verbunden" werden. Je nach experimentellem Design kann die erste Kammer (links bezeichnet) entweder mit Schwimmagar (0,3% w/v) oder Schwarmagar (0,5% w/v) vorbereitet werden, von wo aus die Bakterien über die Grenze in die rechte Kammer wandern können, die Schwarmagar +/- jede erforderliche Ergänzung oder Herausforderung (z. B. Antibiotika) enthält. Die Migration auf beiden Agaren wird typischerweise gemessen / verglichen, indem der breiteste Durchmesser der Bakterienbesiedlung (von Rand zu Rand) vom ursprünglichen Impfpunkt aufgezeichnet wird.
    1. Bereiten Sie bei Bedarf Schwimmagar wie in 1.1 beschrieben vor.
    2. Bereiten Sie Schwarmagar wie in 3.1 beschrieben vor.
    3. Gießen Sie ~ 30 ml Schwarmagar (bei Bedarf mit gewünschter Ergänzung) in die rechte Kammer einer Petrischale mit zwei Fächern (100 mm x 15 mm), bis zu dem Punkt, an dem sie mit dem Kunststoffteiler zwischen den Kammern gleich ist, aber nicht in die linke überläuft (Abbildung 2B).
    4. Nachdem das Agar ausgehärtet ist, füllen Sie die linke Kammer mit ~ 30 ml Schwimm- oder Schwarmagar, wieder bis zur Kontaktstelle mit der Kunststoffscheide (Abbildung 2C). Bevor es sich festzieht, ziehen Sie das Agar vorsichtig über den Rand, um die beiden Seiten mit einer ~ 1 mm hohen Agarbrücke zu verbinden, die sich über die gesamte Länge der Trennlinie erstreckt (Abbildung 2D).
    5. Die Platte bei Raumtemperatur (3.1) trocknen lassen.
      HINWEIS: Eine alternative Methode zur Herstellung einer Brücke besteht darin, das linke Kammeragar trocknen zu lassen und dann langsam ~ 100 μL geschmolzenes Schwarmagar entlang des Kunststoffteilers zu pipetetten, um die beiden Kammern zu überbrücken (3.4). Impfen Sie die Platten in der linken Kammer wie oben beschrieben für Schwimm- (1.2.2) oder Schwarm-Agar (3.2), bevor Sie bei 30 °C für 12-16 h inkubieren oder bis die Schwärme über der rechten Kammer ausreichende Fortschritte gemacht haben, um Vergleiche zwischen interessierenden Stämmen zu ermöglichen.

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Representative Results

Die Isolierung von Pseudo-Revertanten in einem E. coli-Stamm, dessen Motilität durch hohe Konzentrationen des Signalmoleküls c-di-GMP beeinträchtigt wird, wurde in neueren Arbeiten aus unserem Labor34detailliert beschrieben. Dieser Stamm (JP1442) wies zwei Mutationen auf:Δ yhjH und ΔycgR. YhjH ist die aktivste Phosphodiesterase, die c-di-GMP in E. coliabbaut. Das Fehlen von YhjH führt zu erhöhten c-di-GMP-Spiegeln und einer Hemmung der Motilität. YcgR ist ein c-di-GMP-Effektor. Im Komplex mit c-di-GMP bindet YcgR an den Flagellenrotor, um zunächst die CCW-Motorrotation zu induzieren und anschließend die Motordrehzahl zu verringern. Zellanbinde- und Perlentests zeigten, dass sich das motorische Verhalten in der Doppelmutante wieder normalisierte, die Motilität in weichem Agar jedoch nicht34. Also haben wir Schritt 1 des Protokolls eingesetzt, um Pseudo-Revertant-Fackeln in der Doppelmutante zu isolieren (Abbildung 1C). Die Mehrheit der Mutationen, die von WGS (HiSeq 4000-Plattform, PE 2 x 150 Setup34)auf rssB abgebildet wurden,das für ein Reaktionsregulator/Adapterprotein kodiert, das normalerweise die ClpXP-Protease anleitet, um σS für den Abbau34anzusprechen. Einer dieser Revertanten, der eine Motilität nahe dem Wildtyp aufwies (AW405, vergleiche Abbildung 1A,D),wurde verwendet, um repräsentative Ergebnisse für Die Schritte 2 und 3 des Protokollabschnitts zu generieren, wobei sowohl sein doppelt mutierter Elternteil (Abbildung 1B) als auch sein isogener Wildtypstamm(Abbildung 1A)als Kontrollen verwendet wurden.

Für Schritt 2 des Protokollabschnitts wurden Videoaufnahmen analysiert, um Drehungen pro Minute (jede 360°-Komplettdrehung) und CWBias (der Bruchteil der Zeit, in der sich Motoren in CW-Richtung drehen, oder Tumble Bias) zu berechnen. Die ΔyhjH zeigte erwartungsgemäß weniger Umdrehungen pro Minute und eine geringere CW-Verzerrung im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung 3). Sowohl die ΔyhjH ΔycgR-Doppelmutante als auch ihr Suppressor zeigten ein motorisches Verhalten ähnlich dem Wildtyp, Beobachtungen, die durch eine frühere Analyse mit dem höher auflösenden "Perlen"-Assay unterstützt wurden, der in der Einleitung oben in früheren Arbeiten34beschrieben wurde.

Für Schritt 3 des Protokollabschnitts wurde der Grenzübertrittsassay (Abbildung 2) verwendet, um die Fähigkeiten des Wildtyps und des Suppressorisolats zu vergleichen, zuerst zu schwärmen und sich dann über die Grenze zu bewegen und auf Agar zu schwärmen, das mit Kanamycin ergänzt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Stämme die Grenze zu einem ähnlichen Zeitpunkt erreichten (Daten nicht gezeigt), was auf ähnliche Schwarmraten von einem identischen Impfpunkt hinweist. Die Überquerung des Schwarms in die rechte (antibiotische) Kammer war jedoch marginal, aber für den Wildtyp durchweg größer als der Suppressor bei 20 μg/ml Kanamycin (Abbildung 4). Der Unterschied zwischen den beiden Stämmen war bei 40 μg/ml Kanamycin ausgeprägter. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass die Mutationen in rssB, die die Motilität auf Weichagarplatten wiederherstellten (Abbildung 1D), die Antibiotikaresistenz des Suppressorstamms während des Schwärmens negativ beeinflussen (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Weich-Agar-Motilitätstests und Auftreten von Suppressor-Flares.
Die Platten enthalten LB, das mit 0,3 % W/V-Agar erstarrt ist. E. coli-Stämme wurden in der Mitte jeder Platte geimpft und bei 30 °C für 8 h inkubiert, mit Ausnahme von C, das für 16 h inkubiert wurde. (A) Wildtyp E. coli (AW405). (B) Motilitätsdefizitäre Variante ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (C) Wie in B, mit Ausnahme längerer Inkubationszeiten. Pfeile zeigen auf sich schneller bewegende "Fackeln", die am peripheren Ring der expandierenden Schwimmkolonie auftauchen. (D) Ein Suppressor, der von einer Fackel in C isoliert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung für die Einrichtung eines Grenzübergangsplattenassays.
(A) Gießen Sie ~ 30 ml Schwarmagar (mit gewünschtem Antibiotikum) in die rechte Kammer einer geteilten Petrischale bis zur Höhe mit dem Kunststoffteiler und lassen Sie es mit geschlossenem Deckel abstellen. (B) Füllen Sie die linke Kammer mit ~ 30 ml Schwimm- oder Schwarmagar bis zur Kontaktstelle mit der Oberseite des Kunststoffteilers. (C) Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um das geschmolzene Schwarmagar vorsichtig über den Rand zu ziehen, wodurch die beiden Seiten mit einer ~ 1 mm hohen Agarbrücke verbunden werden und mit geschlossenem Deckel abgesetzt werden können. (D) Lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur weiter trocknen, bevor Sie die linke Kammer mit der gewünschten Dehnung impfen und bei 30 °C inkubieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Motorische Eigenschaften verschiedener Stämme, gemessen mit der Cell-Tethering-Technik.
Wildtyp (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442) und sein Suppressor (JP1836) wurden vor dem Tethering in LB bei 30 °C bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet. (A) Umdrehungen pro Minute (abgeschlossene 360°-Drehungen) und (B)CW-Bias (Bruchteil der Zeit, in der sich Motoren in CW-Richtung drehen). Standardabweichung des Mittelwerts (±). 20 angebundene Zellen wurden für 60 Sekunden in jedem Stamm beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Grenzüberschreitende Assays.
Mittelexentielle Phasenkulturen von Wildtyp-E. coli (AW405) und der Suppressormutante (JP1836) wurden an der angegebenen Position (*) im linken Kompartiment der geteilten Platte, die Schwarmmedien enthält, geimpft und bei 30 °C inkubiert. Sie erreichten die Grenze zu vergleichbaren Zeiten. Die Platten wurden für weitere 6 h inkubiert, wobei der Schwarm in die rechte Kammer überging, in der das Medium mit Kanamycin (Kan; Zahlen geben μg/ml an) ergänzt wurde. Platten sind repräsentativ für drei biologische Replikate, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Vorbereitung eines Kammerträgers für das Zellanbindeten. (A) Legen Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband vor (B) mit einer Rasierklinge ab, um den Überschuss abzuschneiden. (C) Ziehen Sie die oberste Schicht ab, um den Klebstoff freizulegen, bevor Sie(D)einen Deckslip anbringen und ihn vorsichtig in Position drücken (gekennzeichnet durch [ ), um sicherzustellen, dass die gesamte Luft aus der Schnittstelle zwischen dem Deckdeckel und dem darunter liegenden Klebeband gedrückt wird. (E) Laden Sie die Probe (hier gezeigt mit DNA-Ladefarbstoff [30% v / v Glycerin, 0,25% w / v Bromphenolblau und 0,25% w / v Xylol cyanol] zur Unterstützung der Visualisierung) in die Oberseite des erzeugten Kanals (Pfeil), während (F) auf sauberes Gewebeaufgabentuch angelt wird, um die Lösung durch die Kammer zu ziehen, während das Gewebe die Flüssigkeit (Pfeil) im Kanal absorbiert und durchzieht. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.

Video 1: Rotation von angebundenen E. coli-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Ein aktiver E. coli-Schwarm, der unter 60-facher Vergrößerung gefilmt wurde und seine charakteristische Wirbelbewegung hinter dem Rand der sich bewegenden Front demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Die Isolierung und Charakterisierung von Suppressormutationen hat erfolgreich dazu beigetragen, Schlüsselkomponenten des Chemotaxis-Systems35,36,37sowie der Motormaschinen selbst zu identifizieren38,39,40. Bei der Verwendung von Protokoll 1 ist es wichtig, mehrere unabhängige Replikate einzubeziehen, um die Isolierung eines großen Spektrums möglicher Mutationen zu gewährleisten, die den Verlust der Motilität kompensieren könnten. Die Erhöhung der Anzahl der Bakterien, indem die Kultur in einer Linie und nicht an einem Punkt gestreift wird, kann die Wahrscheinlichkeit verbessern, Suppressoren zu erzeugen41. Die mehrfache Isolierung derselben Mutation (wie durch DNA-Sequenzierung bestimmt) erhöht das Vertrauen in ihre Authentizität. WGS wird ausnahmslos das Vorhandensein anderer Mutationen im Genom aufdecken. Es ist daher wichtig, die Ergebnisse zu überprüfen, indem die identifizierte Mutation (wenn möglich) in den ursprünglichen motilitätsdefizitären Hintergrund zurückgeführt wird. Der Ansatz der Suppressormutation wurzelt in der Wiederherstellung der Funktion durch eine sekundäre Mutation, so dass eine Einschränkung dieser Methode darin besteht, dass, wenn ein kritisches strukturelles Gen gelöscht wird, dh eines, das den gesamten Signalweg oder die Struktur untermauert, möglicherweise kein Spielraum für eine Kompensation besteht. Obwohl es sich um eine alte Methode handelt, zeigt unsere jüngste Arbeit34 ihren anhaltenden Nutzen bei der Aufklärung neuer Wege, die zur bakteriellen Motilität beitragen.

Für die Quantifizierung der Motorleistung bleibt der Cell-Tethering-Ansatz ein universell zugängliches Werkzeug, das nur ein Mikroskop mit Kameraaufsatz benötigt. Zellanbindeung wurde bereits in einer Vielzahl von Bakterienarten eingesetzt, darunter Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44und Rhodobacter33. Der Erfolg des Protokolls hängt weitgehend von der richtigen Scherung und Anheftung der Zellen ab. Zu aggressives Scheren oder Weglassen der Pause zwischen den Scheren (2.1.5) fördert tendenziell ein inkonsistentes oder unvollständiges Scheren von Filamenten, was zu nicht beweglichen Zellen oder Zellen führt, die auf einer schiefen Achse angebunden sind. Die anhaltende Relevanz dieses Protokolls bleibt bestehen, trotz der Einführung des höher auflösenden Perlenassays durch viele Forschungsgruppen (einschließlich unserer). Die primäre Einschränkung des Perlenassays ergibt sich aus der Notwendigkeit, dass die Perle am Filament der interessierenden Bakterien haftet. Diese Technik hat stark von Studien an E. coli profitiert, die ein "klebriges" Flagellin-Allel identifizierten, das die Einhaltung erleichtert45. Die klebrige Variante ist auch im Zell-Tethering-Assay überlegen. Eine solche Variante ist für die Mehrzahl der geißelten Bakterien noch nicht verfügbar. Die Situation ist noch komplizierter, da einige Organismen mehrere Flagellinproteine46und im Falle von Vibrio sp. auch eine membranöse Hülle47besitzen. Cell-Tethering kann auch mit einem speziesspezifischen Anti-Flagellin-Antikörper oder einem Antikörper gegen ein engineered Epitop-Tag durchgeführt werden.

Während Bakterien sofort nach dem Einbringen in ein flüssiges Medium schwimmen können, gilt dies nicht für das Schwärmen, bei dem die Zellen zuerst in einen Schwarmzustand gebracht werden müssen. Der Oberflächenkontakt löst eine physiologische Veränderung aus, die für Zellen erforderlichist,um das Schwärmen48,49,50,51einzuleiten, was zu einer Verzögerungsphase und einem Aufbau einer hohen Zelldichte führt. Physiologische Veränderungen umfassen den Umbau des Chemotaxis-Systems in E. coli16und Anpassungen wie Zelldehnung und/oder Hyperflagellation für andere Bakterien13,14,21. Angesichts der physiologischen Veränderungen, die erforderlich sind, um das Schwärmen zu initiieren, weisen wir auf Studien hin, die versucht haben, ausgewählte Facetten des Schwärmens nachzuahmen - wie hohe Dichte oder erhöhte Zelllänge - einfach durch Konzentration planktonischer Zellkulturen zur Erhöhung der Dichte und / oder Induktion der Zellverlängerung durch den Einsatz von Antibiotika, die die Zellteilung hemmen52,53. Wenn wir die Zelldehnung als Marker verwenden, warnen wir auch davor, dass es im Vergleich zu planktonischen Zellen nur eine marginale Zunahme der durchschnittlichen Länge von Schwarmzellen bei Salmonellen oder E. coli54gibt. Schwarm-Assays sind schwieriger zu etablieren als Schwimm-Assays. Zu den Variablen gehören die kommerzielle Quelle des Agars, das zur Verfestigung des Mediums verwendet wird (das spezielle Eiken-Agar ist für das Schwärmen in E. coliunerlässlich, während das Standard-Difco-Agar das Schwärmen für alle anderen Bakterien unterstützt), die Verwendung von reichen versus minimalen Medien(E. coli und Salmonellen erfordern eine Glukoseergänzung) und vor allem die Umgebungsfeuchtigkeit2,13,14,21. Von diesen kann die Aufrechterhaltung einer optimalen Luftfeuchtigkeit am frustrierendsten sein. [Eine ausgezeichnete, methodische Optimierung für das Schwärmen in einem Organismus der Wahl (Pseudomonas aeruginosa) wurde von Morales-Soto und Mitarbeitern55nachgewiesen.] Schwarmmedien müssen ausreichend feucht sein, um das Schwärmen zu fördern, aber nicht so feucht, dass sie passives Streuen/ Gleiten ermöglichen, was leicht mit aktivem Schwärmen verwechselt werden kann56. Es ist daher wichtig, schwärme unter einem Mikroskop zu überprüfen, um die unterschiedlichen Bewegungsmuster zu bestätigen, die mit dieser kollektiven Motilität verbunden sind (Video 2). Die Temperatur ist auch eine wichtige Überlegung für die Optimierung des Schwarmtests. Höhere Temperaturen, zum Beispiel 37 °C, trocknen die Platten früher aus als bei 30 °C. Die Verwendung eines Inkubators mit Feuchtigkeitskontrolle (~ 70-80%) kann dazu beitragen, diese Probleme zu mildern, einschließlich saisonaler Veränderungen, die sich auf die Innentemperaturen und die Luftfeuchtigkeit auswirken können. Einmal erfolgreich etabliert, bietet Protokoll 3 eine leistungsstarke Möglichkeit, einen der interessantesten Aspekte von Schwarmbakterien zu untersuchen, die erhöhte Resistenz gegen Antibiotika17. Alle hier beschriebenen Protokolle können auf neue Organismen angewendet werden, um Wege zu identifizieren, die flagellenvermittelte Motilität spezifizieren und kontrollieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant GM118085 und teilweise durch die Robert Welch Foundation (Grant F-1811 an R.M.H.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

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Biologie Ausgabe 159 Bakterien Chemotaxis Escherichia coli Flagellen Drehmotor Motilität Schwimmen Schwärmen Oberflächensensorik Oberflächenmotilität
Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in <em>Escherichia coli</em> durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie
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Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

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