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Biology

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Abstract

La motilità è fondamentale per la sopravvivenza e il successo di molte specie batteriche. Esistono molte metodologie per sfruttare la motilità per comprendere i percorsi di segnalazione, per chiarire la funzione e l'assemblaggio delle parti flagellari e per esaminare e comprendere i modelli di movimento. Qui dimostriamo una combinazione di tre di queste metodologie. La motilità nell'agar morbido è la più antica, offrendo una forte selezione per isolare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione nei ceppi compromessi dalla motilità, dove la motilità viene ripristinata attraverso una seconda mutazione. La tecnica di tethering cellulare, utilizzata per la prima volta per dimostrare la natura rotante del motore flagellare, può essere utilizzata per valutare l'impatto degli effettori di segnalazione sulla velocità del motore e la sua capacità di cambiare direzione rotazionale. Il saggio "border-crossing" è più recente, dove i batteri del nuoto possono essere innescati per passare a muoversi collettivamente come uno sciame. In combinazione, questi protocolli rappresentano un approccio sistematico e potente per identificare i componenti del macchinario di motilità e per caratterizzare il loro ruolo in diverse sfaccettature del nuoto e dello sciame. Possono essere facilmente adattati per studiare la motilità in altre specie batteriche.

Introduction

I batteri impiegano molte appendici per il movimento e la dispersione nelle loro nicchie ecologiche1. La motilità guidata dalla flagella è la più veloce di queste, promuovendo la colonizzazione di località favorevoli in risposta ai segnali ambientali e contribuendo in modo significativo alla capacità patogena di alcunespecie 2,3. I batteri flagellati possono nuotare individualmente in liquido sfuso o sciamare collettivamente su una superficie semi-solida4. La flagella extracellulare si attacca e viene guidata da motori rotanti incorporati nella membrana, che sfruttano la potenza dei gradienti ionici per generare coppia che causala rotazione 1,2,4,5,6,7,8. In E. coli, i cui motori funzionano a una coppia costante 9 , l'uscita del motore può essere classificata in termini di velocità di rotazione e commutazione del rotore tra direzioni antiorario (CCW) e in senso orario (CW). La rotazione CCW promuove la formazione di un fascio flagellare coerente che spinge la cella in avanti (corsa), mentre un interruttore transitorio in direzione rotazionale (CW) fa sì che il fascio si smonti parzialmente o completamente10e la cella riorienti la sua direzione di nuoto (tumble). E. coli in genere corre per un secondo e cade per un decimo di secondo. La frequenza di commutazione del rotore o "tumble bias" è controllata dal sistema di segnalazione chemiotassi, in cui i chemorecettori transmembrana rilevano segnali chimici esterni e li trasmettono tramite fosforelay al motore flagellare per estendere le corse in risposta agli attrattori, o sopprimerle in risposta asostanze chimiche tossiche 11,12. La motilità del nuoto viene saggiata in un agar morbido dello 0,3%.

Durante lo sciame, i batteri navigano su una superficie semi-solida come un collettivo denso, dove branchi di batteri srotoleggiano in un movimento vorticosocontinuo 2,13,14,15. Gli sciami di E. coli mostrano una fisiologia chemiosensoriale alterata (distorsione della caduta inferiore), velocità più elevate e maggiore tolleranza agli antimicrobici sulle cellule che nuotano nel liquido sfuso16,17. Gli sciami variano nella loro implementazione di una pletora di strategie che aiutano il movimento, tra cui la produzione di tensioattivi, l'iperflagellazione e l'allungamento cellulare2. Lo sciame offre ai batteri un vantaggio competitivo sia in contesti ecologici checlinici 18,19,20. Ci sono due categorie di batteri brulicanti: sciami temperati, che possono sciamare solo su supporti solidificati con agar 0,5-0,8%, e sciami robusti, che possono navigare attraverso concentrazioni di agar piùelevate 21.

Esistono una varietà di saggi per interrogare la motilità del nuoto e la sua regolazione. Se compromessa da mutazioni o condizioni ambientali, la motilità stessa offre una forte selezione per identificare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione. Questi soppressori possono essere veri revertanti della mutazione originale, o pseudo-revertanti, dove una seconda mutazione ripristina la funzionalità. Tali mutanti possono essere identificati dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Un'alternativa alla selezione imparziale del soppressore è una strategia di mutagenesi mirata distorta (ad esempio, mutagenesi PCR). Queste metodologie spesso fanno luce sulla funzione o sulla regolazione ambientale dell'apparato di motilità. Se l'obiettivo è quello di studiare la funzione motoria, allora il ripristino della motilità di tipo selvaggio misurata in agar morbido potrebbe non indicare necessariamente il ripristino della produzione motoria di tipo selvaggio. Il saggio di tethering cellulare, in cui le cellule sono attaccate a una superficie di vetro da un singolo flagello e la rotazione del corpo cellulare viene successivamente monitorata, può essere il saggio iniziale di scelta per valutare il comportamento motorio. Sebbene siano ora disponibili metodologie più sofisticate per monitorare le proprietà del motore, la necessaria configurazione e applicazione di pacchetti software per l'analisi del movimento limita il loro usodiffuso 22,23,24,25. Il saggio di tethering cellulare richiede solo che la flagella sia tranciata, consentendo l'attacco dei filamenti corti a uno scivolo di vetro, seguito da una videoregistrazione della rotazione del corpo cellulare. Sebbene le velocità motorie registrate siano basse in questo saggio a causa dell'elevato carico che il corpo cellulare esercita sul flagello, questo saggio ha comunque contribuito a preziose intuizioni sulle risposte chemiotattiche26,27,28,29e rimane un valido strumento investigativo come discusso di seguito.

La motilità brulicante pone una serie diversa di sfide ai ricercatori. La selezione dei soppressori di guadagno di funzione funziona solo in sciami che producono abbondanti tensioattivi e sciamiprontamente 13. I non produttori tensioattivi come E. coli sono esigenti per quanto riguarda la scelta dell'agar, la composizione dei media e l'umiditàdell'ambiente 2,13,14,21. Una volta stabilite le condizioni di sciame, il saggio di attraversamento dellafrontiera 17 è una metodologia utile per interrogare la capacità di uno sciame di navigare in condizioni nuove / difficili. Sebbene i protocolli presentati di seguito riguardino E. coli, possono essere facilmente adattati per l'applicazione in altre specie.

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Protocol

1. Isolamento dei mutanti soppressori in ceppi carenti di motilità

NOTA: Utilizzare questo metodo come un ampio "catch-all" per identificare la natura generale del difetto di motilità.

  1. Preparazione piastra soft-agar
    NOTA: Soft-agar, noto anche come motilità o agar da bagno, è un agar a bassa percentuale (~0,2-0,35% w/v), a lungo usato per saggiare chemiotassi31,32.
    1. Aggiungere 3 g di bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O (acqua a doppia distillazione) al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.
    2. Autoclave per 20 min a 121 °C.
    3. Lasciare raffreddare con delicata agitazione utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando la temperatura raggiunge circa 50 °C, versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare che l'agar fuso si metta con coperchio in posizione per almeno 1 h, da utilizzare entro 16 ore.
  2. Preparazione della cultura, inoculazione e isolamento dei mutanti soppressori
    NOTA: E. coli inoculato al centro di mezzi ricchi di nutrienti solidificati con agar morbido consumano nutrienti localmente, creando un gradiente nutritivo che seguono. Mentre si spostano verso l'esterno, compaiono "anelli" definiti (Figura 1A), che sono correlati a specifici chemioatattanti a cui i batteri rispondono. Difetti nel sistema chemiotassi o componenti strutturali del motore flagella possono compromettere le prestazioni in questo saggio. Spesso, i mutanti con un vantaggio di motilità sorgono durante lo screening e possono essere visti emergere da singoli o da più punti lungo la periferia dell'anello, da dove "divampano"(Figura 1C). Si noterà che il bordo più esterno del fronte di nuoto contrasta prontamente con l'agar morbido vergine non colato.
    1. Coltivare colture notturne del ceppo desiderato carente di motilità in 5 mL di Brodo di Lennox (LB; 10 g/L di triptono, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L NaCl, Tabella dei Materiali)a 30 °C con scuotimento orizzontale (220 r.p.m.). Il giorno seguente, la sottocultura (diluizione 1:100) in LB fresco, crescendo nelle stesse condizioni fino alla fase esponenziale (OD600 di 0,6).
    2. Inoculare 6 μL della coltura al centro di una piastra di agar morbido (1.1) utilizzando una pipetta, spingendo la punta sterile caricata nell'agar per espellere delicatamente il contenuto. Trasferimento a 30 °C e incubare (Figura 1B), fino a quando i "brillamenti" di motilità sono evidenti, emanando dal punto di inoculazione o dalla periferia degli anelli di motilità, tipicamente in 24-36 h(Figura 1C).
      NOTA: Nei saggi di motilità, inoculare un ceppo di tipo selvatico insieme agli isolati mutanti per il confronto. Questo ceppo di tipo selvatico mostrerà i caratteristici anelli chemiotattici concentrici(Figura 1A)e riempirà la piastra entro 8-10 ore.
    3. Utilizzare un filo-loop sterile per sollevare le cellule dalla regione e dalla striscia "flare" per purificare singole colonie su una piastra di agar duro LB (LB preparata come sopra, solidificata con bacto-agar da 15 g/L).
    4. Scegli singole colonie dalla piastra di striscia usando un anello di filo sterile e purificale striature per singole colonie per garantire l'isolamento di una colonia "pura" isolata.
  3. Conferma e caratterizzazione dei mutanti soppressori
    1. Verificare che i mutanti soppressori isolati abbiano ripristinato la motilità. Preparare piastre di agar morbido (1.1) e colture per ceppi di interesse (come al punto 1.2.1), compresi i tipi selvatici e il ceppo iniziale "carente di motilità" per il confronto.
    2. Inoculare le piastre (come in 1.2.2) e incubare a 30 °C per 8-10 h.
    3. Registrare il diametro dell'anello più esterno (bordo del cerchio) e confrontare per stabilire quale degli isolati ha sostanzialmente ripristinato la motilità.
      NOTA: Si raccomanda di fotografare le lastre durante tutto il corso del tempo dell'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un dispositivo "secchiello diluce" 30, in cui una fotocamera digitale è montata sopra una sorgente luminosa per una migliore illuminazione per misurare il diametro della colonia di nuoto e distinguerla dall'agar non raggruppato.
    4. Soggetto isolato in WGS come richiesto, consentendo una sufficiente "copertura della sequenza" per identificare positivamente le mutazioni che hanno ripristinato la funzione di tipo selvaggio.

2. Quantificare il comportamento motorio della flagella tramite il tethering cellulare

NOTA: utilizzare questo metodo quando il normale comportamento run-tumble (chemiotaxis) sembra essere compromesso.

  1. Preparazione della cultura e tosatura della flagella
    1. Preparare una cultura di fase esponenziale del ceppo di interesse come descritto al passaggio 1.2.1.
    2. Pellet 10 mL di cellule per centrifugazione a 2.000 x g per 3 minuti prima di rimescolare in 10 mL di Motiliity Buffer sterilizzato con filtro (MB; Tampone fosfato di potassio da 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl da 10 mM, 75 mM KCl).
      NOTA: MB supporta la motilità, ma non supporta la crescita batterica
    3. Ripetere il passaggio 2.1.2 altre due volte prima di rimospendere il pellet finale in 1 mL di MB.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml e attaccare un ago 23G all'estremità. Assemblare un identico apparato siringa/ago e fissare i due insieme tramite 6 pollici di tubi di polietilene (diametro interno di 0,58 mm) strettamente infilati su ogni punta dell'ago.
    5. Tosare la flagella (sono fragili e si rompono facilmente) passando delicatamente la sospensione cellulare avanti e indietro da una siringa all'altra 50x, con 1 min di pausa tra ogni 10 passaggi.
    6. Centrifugare le cellule tranciate a 2.000 x g per 3 minuti e rimombidare in un volume finale di 500 μL di MB.
  2. Preparazione delle diapositive e tethering cellulare
    1. Preparare una camera di fissazione delle celle impilando un coverslip da 18 mm x 18 mm su uno scivolo da microscopio in vetro da 3 pollici x 1 pollice x 1 mm, separato da nastro a doppia parte (Figura S1).
    2. Sciacquare la camera con soluzione di polilisina 0,01% (w/v) applicandosi sulla parte superiore della camera. Inclinare il bordo inferiore (il coverslip flush con lo scivolo del microscopio) su un tergicristallo (carta velina) per aiutare a disegnare la soluzione attraverso la camera (Figura S1). Quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
    3. Lavare la camera tre volte con 40 μL di MB utilizzando come descritto al passaggio 2.2.2
    4. Aggiungere 40 μL della sospensione cellulare tranciata (preparata sopra) nella parte superiore della camera e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al coperchio.
    5. Sciacquare delicatamente la camera con 40 μL di MB come in 2.2.3 per rimuovere le celle non attaccate.
  3. Registrazione e quantificazione della rotazione cellulare
    1. Trasferire lo scivolo del microscopio caricato con celle tethered allo stadio del microscopio.
    2. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e un obiettivo 100x, scansionare la popolazione alla ricerca di cellule fissate in posizione e ruotare su un singolo asse, o cioè rotazioni lisce su un punto fisso piuttosto che presentarsi con un angolo in cui la cella si muove in uscita e fuori fuoco (Video 1).
    3. Utilizzare un microscopio commerciale e la fotocamera associata. Aprire il software associato, assicurarsi che le celle di interesse siano a fuoco e fare clic sull'acquisizione video per registrare la rotazione delle celle per un minuto (a 10 fotogrammi al secondo o superiore).
    4. Dalla riproduzione video, quantificare il numero di rotazioni complete al minuto e il numero di volte in cui la cella cambia direzione (frequenza di commutazione).
      NOTA: Le velocità di rotazione e la frequenza di commutazione possono essere troppo veloci per essere misurate a occhio, quindi si consiglia di utilizzare un software video che offre una riproduzione lenta / fine o adotta un sistema software automatizzato per quantificare i patternrotazionali 33. Un'alternativa sarebbe aumentare la viscosità dell'MB usando la cellulosa metile (o agente simile) per aiutare a rallentare e risolvere la rotazione di batteri più veloci o compensare quando sono in uso telecamere con bassi framerate.
    5. Ripetere il passaggio 2.3.2 con repliche biologiche per compilare una rappresentazione della popolazione di interesse.

3. Preparazione di sciami in un saggio di attraversamento della frontiera

NOTA: Utilizzare questo metodo per valutare l'impatto di una mutazione o condizione sulla motilità di gruppo. Swarm-agar si riferisce all'agar dove la percentuale è tipicamente superiore a quella di soft-agar. Nell'agar morbido (0,3 %), le cellule nuotano individualmente all'interno dell'agar. Nell'agar dello sciame (0,5% e oltre), le cellule si muovono come gruppo sulla superficie. Mentre le piastre dello sciame devono essere utilizzate come descritto in dettaglio qui, le piastre da bagno hanno una durata di conservazione più lunga e possono essere utilizzate per diversi giorni. La nostra preferenza personale è da utilizzare in 1-2 giorni.

  1. Preparazione dell'agar sciame
    1. Aggiungere 5 g di agar Eiken (0,5% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.
    2. Autoclave per 20 min a 121 °C.
    3. Lasciare raffreddare con delicata agitazione per evitare bolle d'aria utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando si aggiungono circa 50 °C, aggiungere glucosio sterilizzato con filtro per una concentrazione finale dello 0,5 %.
    4. Versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare impostare a temperatura ambiente per almeno 14 ore e non più di 20 ore. Non conservare per un uso futuro.
  2. Inoculazione e incubazione di piastre sciame
    1. Inoculare 6 μL di una coltura medio-esponenziale (preparata come in 1,2) individuando sopra l'agar.
    2. Lasciare il coperchio spento per 5-10 minuti e sostituire quando l'inoculo si è asciugato nella superficie dell'agar.
    3. Incubare a 30 °C per 8 ore. Evita la tentazione di ispezionare i progressi dello sciame rimuovendo il coperchio, in quanto ciò contribuirà all'asciugatura dell'agar e compromette lo sciame.
      NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda del fenotipo di deformazione. Alcune mutazioni isolate possono ostacolare la capacità di sciame e richiederanno una ridotta percentuale di agar o un periodo di incubazione più prolungato.
  3. Preparazione di targhe di dosaggio transfrontaliere
    NOTA: Questo saggio utilizza una piastra di Petri modificata, in cui una divisione di plastica (bordo) crea due camere, anziché una (Figura 2A). Ogni camera può essere preparata indipendentemente dall'altra, offrendo condizioni diverse per lo sciame, prima di "collegare" le due. A seconda del design sperimentale, la prima camera (designata a sinistra) può essere preparata con agar da bagno (0,3% w/v) o agar sciame (0,5% w/v) da cui i batteri possono migrare attraverso il confine nella camera destra contenente agar sciame +/- qualsiasi integratore o sfida richiesta (ad esempio, antibiotici). La migrazione su entrambi gli agar viene tipicamente misurata/confrontata registrando il diametro più ampio della colonizzazione batterica (da bordo a bordo) dal punto originale di inoculazione.
    1. Preparare l'agar da bagno come descritto al punto 1.1, se necessario.
    2. Preparare l'agar dello sciame come descritto al punto 3.1.
    3. Versare ~30 mL di agar sciame (con l'integrazione desiderata se necessario) nella camera destra di una piastra di Petri a doppio compartimento (100 mm x 15 mm), al punto in cui è livellata con il divisore di plastica tra le camere, ma non traboccante a sinistra(Figura 2B).
    4. Dopo che l'agar si è indurito, riempire la camera sinistra con ~ 30 mL di agar da bagno o sciame, di nuovo al punto di contatto con il diviso di plastica(Figura 2C). Prima di impostarlo, utilizzare una punta sterile per trascinare delicatamente l'agar oltre il bordo per collegare i due lati con un ponte di agar alto ~ 1 mm che si estende per l'intera lunghezza della divisione (Figura 2D).
    5. Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (3.1).
      NOTA: Un metodo alternativo per creare il ponte è consentire all'agar della camera sinistra di asciugarsi e quindi pipettare lentamente ~ 100 μL di agar sciame fuso lungo il divisore di plastica per collegare le due camere (3.4). Inoculare le piastre sulla camera sinistra come sopra dettagliato per nuotare (1.2.2) o sciame (3.2) agar, prima di incubare a 30 °C per 12-16 ore, o fino a quando gli sciami non hanno fatto progressi sufficienti sulla camera destra per consentire confronti tra ceppi di interesse.

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Representative Results

L'isolamento degli pseudo-revertanti in un ceppo E. coli la cui motilità è compromessa da alti livelli della molecola di segnalazione c-di-GMP, è stato descritto in recente lavoro del nostro laboratorio34. Questo ceppo (JP1442) ha ospitato due mutazioni: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH è la fosfodiesterasi più attiva che degrada il c-di-GMP in E. coli. L'assenza di YhjH porta ad elevati livelli di c-di-GMP e all'inibizione della motilità. YcgR è un effettore c-di-GMP. In complesso con c-di-GMP, YcgR si lega al rotore flagellare per indurre prima la rotazione del motore CCW e successivamente diminuire la velocità del motore. Test di tethering cellulare e perline hanno mostrato che il comportamento motorio è tornato alla normalità nel doppio mutante, ma la motilità nell'agar morbidonon ha 34. Quindi, abbiamo implementato il passaggio 1 del protocollo per isolare i flare pseudo-revertanti nel doppio mutante (Figura 1C). La maggior parte delle mutazioni mappate da WGS (piattaforma HiSeq 4000, PE 2 x 150 setup34) a rssB, che codifica per un regolatore di risposta / proteina adattatore che normalmente indirizza la proteasi ClpXP al bersaglio σS per ladegradazione 34. Uno di questi revertanti, che mostrava motilità vicina al tipo selvaggio (AW405, confronta la figura 1A,D), è stato utilizzato per generare risultati rappresentativi per i gradini 2 e 3 della sezione del protocollo, utilizzando come controlli sia il suo doppio genitore mutante (Figura 1B) che il ceppo di tipo selvatico isogenico (Figura 1A).

Per il passaggio 2 della sezione del protocollo, le acquisizioni video sono state analizzate per calcolare le rotazioni al minuto (ogni rotazione completa di 360 °) e CWBias (la frazione dei motori del tempo ruota in direzione CW o distorsione di tumble). Il ΔyhjH ha mostrato meno rotazioni al minuto e una distorsione CW inferiore rispetto al tipo selvaggio, come previsto (Figura 3). Sia il doppio mutante ΔyhjH Δ ycgR che il suo soppressore hanno mostrato un comportamento motorio simile al tipo selvaggio, osservazioni supportate da un'analisi precedente utilizzando il saggio di "perline" ad alta risoluzione dettagliato nell'introduzione precedente nel lavoroprecedente 34.

Per il passaggio 3 della sezione del protocollo, il saggio border crossing (Figura 2) è stato utilizzato per confrontare le abilità del tipo selvaggio e dell'isolatore soppressore, prima per sciamare, e poi per spostarsi attraverso il confine e sciamare su agar integrato con kanamicina. I risultati mostrano che entrambi i ceppi hanno raggiunto il confine in un momento simile (dati non mostrati) indicando tassi simili di sciame da un punto di inoculazione identico. Tuttavia, il cross-over dello sciame alla camera destra (antibiotica) era marginalmente, ma costantemente maggiore per il tipo selvatico rispetto al soppressore a 20 μg/mL di kanamicina(Figura 4). La differenza tra i due ceppi era più pronunciata a 40 μg/mL di kanamicina. Insieme, questi dati suggeriscono che le mutazioni in rssB che hanno ripristinato la motilità sulle piastre di soft-agar (Figura 1D), hanno un impatto negativo sulla resistenza antibiotica del ceppo soppressore durante lo sciame (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Test di motilità soft-agar e comparsa di brillamenti soppressori.
Le piastre contengono LB solidificato con 0,3 % con agar. I ceppi di E. coli sono stati inoculati al centro di ogni piastra e incubati a 30°C per 8 ore, ad eccezione di C, che è stato incubato per 16 h.(A) E. coli di tipo selvatico (AW405). (B) Variante carente di motilità ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (C) Come in B, ad eccezione dei tempi di incubazione più lunghi. Le frecce indicano "razzi" in movimento più veloce che emergono sull'anello periferico della colonia di nuoto in espansione. (D) Un soppressore isolato da un flare in C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Schema per l'impostazione di un saggio sulla piastra di attraversamento della frontiera.
(A) Versare ~30 mL di agar sciame (con l'antibiotico desiderato) nella camera destra di una piastra di petri divisa fino al livello con il divisore di plastica e lasciare impostare con coperchio chiuso. (B) Riempire la camera sinistra con ~30 mL di agar da bagno o sciame fino al punto di contatto con la parte superiore del divisore di plastica. (C) Utilizzare una punta sterile per trascinare delicatamente l'agar dello sciame fuso oltre il bordo, collegando così i due lati con un ponte di agar alto ~1 mm e lasciare impostare con il coperchio chiuso. (D) Lasciare asciugare ulteriormente la piastra a temperatura ambiente durante la notte prima di inoculare la camera sinistra con la tensione desiderata e incubare a 30 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Proprietà motorie di vari ceppi misurate con la tecnica del tethering cellulare.
Wild-type (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442) e il suo soppressore (JP1836) sono stati coltivati in LB a 30 °C fino alla fase medio-esponenziale prima del tethering. (A) Rotazioni al minuto (curve completate a 360°) e(B)distorsioneCW (frazione di tempo i motori ruotano in direzione CW). Deviazione standard della media (±). Sono state osservate 20 cellule tethered per 60 secondi in ogni ceppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Saggi di attraversamento delle frontiere.
Le colture di fase medio-esponenziale di tipo selvaggio E. coli (AW405) e mutante soppressore (JP1836) sono state inoculate nella posizione indicata (*) nel compartimento sinistro della piastra divisa contenente mezzi di sciame e incubate a 30 °C. Hanno raggiunto il confine in momenti comparabili. Le piastre sono state incubate per altri 6 h, durante le quali lo sciame si è incrociato verso la camera destra, in cui il supporto è stato integrato con kanamicina (Kan; i numeri indicano μg/mL). Le piastre sono rappresentative di tre repliche biologiche ciascuna effettuata in triplice copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 1: Preparazione di uno scivolo da camera per il tethering cellulare. (A) Stendere due pezzi di nastro a doppia mano prima (B) utilizzando una lama di rasoio per tagliare l'eccesso. (C) Rimuovere lo strato superiore per esporre l'adesivo prima (D) apporre un coverslip e premerlo delicatamente in posizione (indicato da [ ), assicurando che tutta l'aria sia spinta fuori dall'interfaccia tra il coverslip e il nastro sottostante. (E) Campione di carico (qui mostrato con colorante di carico del DNA [30% v/v glicerolo, 0,25% w/v blu bromofenolo e 0,25% w/v xilene cianolo] aggiunto per facilitare la visualizzazione) nella parte superiore del canale creato (freccia) mentre(F)penzola su una salvietta pulita e tissutale per aiutare a disegnare la soluzione attraverso la camera mentre il tessuto assorbe il liquido (freccia) nel canale e lo disegna attraverso. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Video 1: Rotazione delle cellule E. coli tethered. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Uno sciame E. coli attivo filmato sotto l'ingrandimento di 60x, dimostrando il suo caratteristico movimento vorticoso dietro il bordo del fronte in movimento. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

L'isolamento e la caratterizzazione delle mutazioni soppressori hanno contribuito con successo all'identificazione dei componenti chiave del sistema chemiotassi35,36,37,nonché della macchina motorestessa 38,39,40. Durante l'utilizzo del protocollo 1, è importante includere più repliche indipendenti per garantire l'isolamento di un ampio spettro di possibili mutazioni che potrebbero compensare la perdita di motilità. Aumentare il numero di batteri striando la coltura in una linea piuttosto che in un punto, può migliorare le probabilità di generare soppressori41. L'isolamento della stessa mutazione (come determinato dal sequenziamento del DNA) più volte aumenta la fiducia nella sua autenticità. Il WGS rivelerà invariabilmente la presenza di altre mutazioni nel genoma. È quindi importante verificare i risultati trasducendo (ove possibile) la mutazione identificata nello sfondo originale carente di motilità. L'approccio mutante soppressore è radicato nel ripristino della funzione attraverso una mutazione secondaria, quindi una limitazione di questo metodo è che se un gene strutturale critico viene eliminato, cioè uno che sostiene l'intero percorso o struttura, potrebbe non esserci spazio per la compensazione. Pur essendo un vecchio metodo, il nostro recentelavoro 34 dimostra la sua continua utilità nella spiegazione di nuovi percorsi che contribuiscono alla motilità batterica.

Per la quantificazione dell'uscita del motore, l'approccio di tethering cellulare rimane uno strumento universalmente accessibile che richiede solo un microscopio con un attacco della fotocamera. Il tethering cellulare è già stato utilizzato in un numero diversificato di specie batteriche tra cui Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44e Rhodobacter33. Il successo del protocollo dipende in gran parte da una corretta tosatura e attaccamento delle cellule. La tosatura troppo aggressiva o l'omissione della pausa tra cesoie (2.1.5) tende a promuovere una tosatura incoerente o incompleta dei filamenti, con conseguente cellule non motili o cellule tethered su un asse inclinato. La rilevanza duratura di questo protocollo rimane, nonostante l'adozione del saggio di perline ad alta risoluzione da parte di molti gruppi di ricerca (tra cui il nostro). La limitazione primaria del saggio di perline deriva dalla necessità che il tallone aderisca al filamento dei batteri di interesse. Questa tecnica ha tratto grande beneficio dagli studi su E. coli che hanno identificato un allele flagellina "appiccicoso", che facilita l'aderenza45. La variante appiccicosa è anche superiore nel saggio di tethering cellulare. Tale variante non è ancora disponibile per la maggior parte dei batteri flagellati. La situazione è ulteriormente complicata con alcuni organismi che possiedono più proteine flagellina46, e nel caso di Vibrio sp., che possiedono anche una tona membranosa47. Il tethering cellulare può anche essere eseguito utilizzando un anticorpo anti-flagellina specifico per specie o un anticorpo contro un'etichetta epitopica ingegnerizzata.

Mentre i batteri possono nuotare immediatamente dopo l'introduzione in un mezzo liquido, questo non è vero per lo sciame, dove le cellule devono essere innescate per la prima volta in uno stato brulicante. Il contatto superficiale innesca un cambiamento fisiologico necessario affinché le cellule avviino lo sciame48,49,50,51, con conseguente fase di ritardo e accumulo di alta densità cellulare. I cambiamenti fisiologici includono il rimodellamento del sistema chemiotassi in E. coli16e adattamenti come l'allungamento cellulare e/o l'iperflagellazioneper altri batteri 13,14,21. Dati i cambiamenti fisiologici necessari per avviare lo sciame, colpiamo una nota cautelaria sugli studi che hanno tentato di imitare alcune sfaccettature dello sciame - come l'alta densità o l'aumento della lunghezza cellulare - semplicemente concentrando le colture cellulari planctoniche per aumentare la densità e / o inducendo l'allungamento cellulare mediante l'uso di antibiotici che inibiscono ladivisione cellulare 52,53. Se si utilizza l'allungamento cellulare come marcatore, si avverte anche che rispetto alle cellule planctoniche, c'è solo un aumento marginale della lunghezza media delle cellule brulicante in Salmonella o E. coli54. I saggi dello sciame sono più difficili da stabilire rispetto ai test di nuoto. Le variabili includono la fonte commerciale dell'agar utilizzato per solidificare i media (lo speciale agar Eiken è essenziale per sciamare in E. coli, mentre l'agar Difco più standard supporta lo sciame per tutti gli altri batteri), l'uso di mezzi ricchi rispetto a quelli minimi(E. coli e Salmonella richiedono il completamento del glucosio) e l'umidità ambientale più critica2,13,14,21. Di questi, mantenere l'umidità ottimale può essere il più frustrante. [Un'eccellente ottimizzazione metodica per sciamare in un organismo di scelta (Pseudomonas aeruginosa) è stata dimostrata da Morales-Soto e dai colleghi55.] I mezzi dello sciame devono essere sufficientemente umidi da promuovere sciami ma non così umidi da consentire la diffusione /scorrimento passivo, che può essere facilmente scambiato per sciame attivo56. È quindi fondamentale che gli sciami siano controllati al microscopio per confermare i distinti modelli di movimento associati a questa motilità collettiva (Video 2). La temperatura è anche una considerazione importante per ottimizzare il saggio di sciame. Temperature più elevate, ad esempio 37 °C, asciugheranno le piastre prima che a 30 °C. L'utilizzo di un incubatore con controllo dell'umidità (~ 70-80%) può aiutare a mitigare questi problemi, compresi i cambiamenti stagionali che potrebbero influire sulle temperature e sull'umidità interne dell'edificio. Una volta stabilito con successo, il protocollo 3 fornisce un modo potente per indagare uno degli aspetti più interessanti dei batteri brulicanti, elevata resistenza agli antibiotici17. Tutti i protocolli qui descritti possono essere applicati a nuovi organismi per identificare percorsi che specificano e controllano la motilità mediata da flagelli.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione gm118085 dei National Institutes of Health e in parte dalla Robert Welch Foundation (sovvenzione F-1811 a R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

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References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

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Biologia Numero 159 batteri chemiotassi Escherichia coli,flagella motore rotante motilità nuoto brulicante rilevamento superficiale motilità superficiale
Investigare la motilità guidata dalla Flagella in <em>Escherichia coli</em> applicando tre tecniche consolidate in una serie
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Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

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