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Biology

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Abstract

La motilidad es crucial para la supervivencia y el éxito de muchas especies bacterianas. Existen muchas metodologías para explotar la motilidad para comprender las vías de señalización, para dilucidar la función y el ensamblaje de las partes flagelares, y para examinar y comprender los patrones de movimiento. Aquí demostramos una combinación de tres de estas metodologías. La motilidad en el agar blando es la más antigua, ofreciendo una fuerte selección para aislar las mutaciones supresoras de ganancia de función en cepas con problemas de motilidad, donde la motilidad se restaura a través de una segunda mutación. La técnica de atado celular, empleada por primera vez para demostrar la naturaleza rotatoria del motor flagelar, se puede utilizar para evaluar el impacto de los efectores de señalización en la velocidad del motor y su capacidad para cambiar la dirección de rotación. El ensayo de "cruce de fronteras" es más reciente, donde las bacterias nadadoras se pueden preparar para la transición a moverse colectivamente como un enjambre. En combinación, estos protocolos representan un enfoque sistemático y poderoso para identificar los componentes de la maquinaria de motilidad, y para caracterizar su papel en diferentes facetas de la natación y el enjambre. Se pueden adaptar fácilmente para estudiar la motilidad en otras especies bacterianas.

Introduction

Las bacterias emplean muchos apéndices para el movimiento y la dispersión en sus nichos ecológicos1. La motilidad impulsada por flagelos es la más rápida de ellas, promoviendo la colonización de localizaciones favorables en respuesta a las señales ambientales, y contribuyendo significativamente a la capacidad patógena de algunas especies2,3. Las bacterias flageladas pueden nadar individualmente en líquido a granel, o enjambre como un colectivo sobre una superficie semisó sólida4. Los flagelos extracelulares se unen y son accionados por motores rotativos incrustados en la membrana, que aprovechan la potencia de los gradientes iónicos para generar un par que provocala rotación 1,2,4,5,6,7,8. En E. coli,cuyos motores funcionan a un par constantede 9,la salida del motor se puede clasificar en términos de velocidad de rotación y conmutación del rotor entre las direcciones en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) y en el sentido de las agujas del reloj (CW). La rotación CCW promueve la formación de un haz flagelar coherente que impulsa la célula hacia adelante (run), mientras que un interruptor transitorio en dirección rotacional (CW) hace que el haz se desmonte parcial o totalmente10,y la célula reoriente su dirección de natación (caída). E. coli típicamente corre por un segundo y cae por una décima de segundo. La frecuencia de conmutación del rotor o 'sesgo de caída' es controlada por el sistema de señalización quimiotaxis, en el que los quimiorreceptores transmembrana detectan señales químicas externas y las transmiten a través de fosforelay al motor flagelar para extender las corridas en respuesta a los atrayentes, o suprimirlas en respuesta a productos químicos tóxicos11,12. La motilidad de natación se ensaya en agar blando al 0,3%.

Durante el enjambre, las bacterias navegan en una superficie semisólida como un colectivo denso, donde los paquetes de bacterias fluyen en un movimiento continuo de remolino2,13,14,15. Los enjambres de E. coli exhiben fisiología quimiosensorial alterada (menor sesgo de caída), velocidades más altas y mayor tolerancia a los antimicrobianos sobre las células que nadan en líquido a granel16,17. Los enjambres varían en su despliegue de una gran cantidad de estrategias que ayudan al movimiento, incluyendo la producción de surfactante, hiperflagelación y elongación celular2. El enjambre ofrece a las bacterias una ventaja competitiva tanto en entornos ecológicos como clínicos18,19,20. Hay dos categorías de bacterias de enjambre: enjambres templados, que pueden enjambre sólo en medios solidificados con 0,5-0,8% de agar, y enjambres robustos, que pueden navegar a través de concentraciones de agar más altas21.

Existe una variedad de ensayos para interrogar la motilidad de la natación y su regulación. Cuando se ve afectada por mutaciones o condiciones ambientales, la motilidad en sí misma ofrece una fuerte selección para identificar mutaciones supresoras de ganancia de función. Estos supresores pueden ser revertientes genuinos de la mutación original, o pseudo-revertores, donde una segunda mutación restaura la funcionalidad. Tales mutantes pueden ser identificados por secuenciación del genoma completo (WGS). Una alternativa a la selección imparcial del supresor es una estrategia sesgada de la mutagénesis apuntada (e.g., mutagénesis de la polimerización en cadena). Estas metodologías a menudo arrojan luz sobre la función o la regulación ambiental del aparato de motilidad. Si el objetivo es estudiar la función motora, entonces la restauración de la motilidad de tipo salvaje medida en agar blando puede no indicar necesariamente la restauración de la salida del motor de tipo salvaje. El ensayo de atado celular, en el que las células se unen a una superficie de vidrio por un solo flagelo y la rotación del cuerpo celular se supervisa posteriormente, puede ser el ensayo inicial de elección para evaluar el comportamiento motor. Aunque ahora se dispone de metodologías más sofisticadas para supervisar las propiedades del motor, la configuración requerida de la cámara de alta velocidad y la aplicación de paquetes de software para el análisis de movimiento limitan su uso generalizado22,23,24,25. El ensayo de atado celular requiere solo que los flagelos estén cortados, lo que permite la unión de los filamentos cortos a un portaobjetos de vidrio, seguido de grabar en video la rotación del cuerpo celular. Aunque las velocidades registradas del motor sean bajas en este ensayo debido a la alta carga que el cuerpo celular ejerce sobre el flagelo, este ensayo ha contribuido sin embargo a información valiosa sobre las respuestas quimiotácticas26,27,28,29,y sigue siendo una herramienta de investigación válida como se discute a continuación.

La motilidad del enjambre plantea un conjunto diferente de desafíos a los investigadores. La selección de supresores de ganancia de función sólo funciona en enjambres que producen tensioactivos copiosos y enjambres fácilmente13. Los no productores de surfactantes como E. coli son exigentes con respecto a la elección del agar, la composición de los medios y la humedad del ambiente2,13,14,21. Una vez que se establecen las condiciones de enjambre, el ensayo de cruce de fronteras17 es una metodología útil para interrogar la capacidad de un enjambre para navegar por condiciones nuevas / duras. Aunque los protocolos presentados a continuación se relacionan con E. coli,pueden ser fácilmente adaptados para su aplicación en otras especies.

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Protocol

1. Aislamiento de mutantes supresores en cepas deficientes en motilidad

Nota : utilice este método como un amplio 'catch-all' para identificar la naturaleza general del defecto de motilidad.

  1. Preparación de placas de agar blando
    NOTA: El agar blando, también conocido como motilidad o agar nadador, es un agar de bajo porcentaje (~ 0.2-0.35% p / v), utilizado durante mucho tiempo para ensayar quimiotaxis31,32.
    1. Añadir 3 g de bacto-agar (0,3% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O (agua doble destilada) al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.
    2. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
    3. Dejar enfriar con agitación suave usando la varilla / placa como arriba. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 50 °C, vierta 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), y deje que el agar fundido se ajuste con la tapa en su lugar durante al menos 1 h, para su uso dentro de 16 h.
  2. Preparación de cultivo, inoculación y aislamiento de mutantes supresores
    NOTA: E. coli inoculada en el centro de medios ricos en nutrientes solidificados con agar blando consumen nutrientes localmente, creando un gradiente de nutrientes que siguen. A medida que se mueven hacia el exterior, aparecen "anillos" definidos (Figura 1A), que están relacionados con quimioatrayentes específicos a los que responden las bacterias. Los defectos en el sistema de quimiotaxis o los componentes estructurales del motor de flagelos pueden comprometer el rendimiento en este ensayo. A menudo, los mutantes con una ventaja de motilidad surgen durante el cribado, y se pueden ver emergiendo de puntos únicos o múltiples a lo largo de la periferia del anillo, desde donde 'estallan' hacia fuera (Figura 1C). Uno notará que el borde más externo del frente de natación contrasta fácilmente con el agar suave virgen no colonizado.
    1. Cultivar durante la noche cultivos de la cepa deficiente en motilidad deseada en 5 mL de Caldo Lennox (LB; 10 g/L triptona, 5 g/L de extracto de levadura, y 5 g/L de NaCl, Tabla de Materiales)a 30 °C con agitación horizontal (220 r.p.m.). Al día siguiente, sub-cultivo (dilución 1:100) en LB fresco, creciendo en las mismas condiciones a fase exponencial (OD600 de 0,6).
    2. Inocular 6 μL del cultivo en el centro de una placa de agar blando (1.1) usando una pipeta, empujando la punta estéril cargada en el agar para expulsar suavemente el contenido. Transferir a 30 °C e incubar (Figura 1B), hasta que la motilidad 'brotes' son evidentes, emanando del punto de inoculación o de la periferia de los anillos de motilidad, típicamente en 24-36 h (Figura 1C).
      NOTA: En ensayos de motilidad, inocular una cepa de tipo salvaje junto con los aislados mutantes para la comparación. Esta cepa de tipo salvaje mostrará los anillos quimiotácticos concéntricos característicos(Figura 1A)y llenará la placa dentro de 8-10 h.
    3. Use un lazo de alambre estéril para levantar las células de la región de "llamarada" y la raya para purificar colonias individuales en una placa de agar duro LB (LB preparado como el anterior, solidificado con 15 g / L bacto-agar).
    4. Recoger colonias individuales de la placa de raya utilizando un bucle de alambre estéril y volver a purificar por rayas para colonias individuales para asegurar el aislamiento de un aislado de colonia "pura".
  3. Confirmación, y caracterización de mutantes supresores
    1. Confirme que los mutantes supresores aislados han restaurado la motilidad. Preparar placas de agar blando (1.1) y cultivos para cepas de interés (como en 1.2.1), incluyendo el tipo salvaje y la cepa inicial "deficiente en motilidad" para la comparación.
    2. Inocular las placas (como en 1.2.2) e incubar a 30 °C durante 8-10 h.
    3. Registre el diámetro del anillo más externo (borde del círculo) y compare para establecer cuál de los aislados ha restaurado sustancialmente la motilidad.
      NOTA: Se recomienda que las placas sean fotografiadas a lo largo del tiempo-curso del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice un dispositivo de "cubo de luz"30,donde se monta una cámara digital sobre una fuente de luz para una mejor iluminación para medir el diámetro de la colonia de natación y distinguirla del agar no colonizado.
    4. El tema verificó aislantes a WGS según lo requerido, permitiendo suficiente " cobertura de la secuencia" para identificar positivamente las mutaciones que restauraron el salvaje-tipo función.

2. Cuantificación del comportamiento motor de los flagelos a través del atado celular

Nota : utilice este método cuando el comportamiento normal de correr-caída (quimiotaxis) parece estar comprometido.

  1. Preparación del cultivo y esquila de flagelos
    1. Preparar un cultivo de fase exponencial de la cepa de interés como se describe en el paso 1.2.1.
    2. Pellet 10 mL de células por centrifugación a 2.000 x g durante 3 min antes de resuspender en 10 mL de Tampón de Motilidad esterilizado por filtro (MB; tampón de fosfato de potasio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4,0,0065 M KH2PO4,pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      NOTA: MB apoya la motilidad, pero no apoya el crecimiento bacteriano
    3. Repetir el paso 2.1.2 dos veces más antes de volver a gastar el pellet final en 1 mL de MB.
    4. Transfiera la suspensión celular a una jeringa de 1 ml y coloque una aguja de 23G al extremo. Monte un aparato idéntico de jeringa/aguja y coloque los dos juntos a través de 6 pulgadas de tubo de polietileno (diámetro interior de 0,58 mm) firmemente envainado sobre cada punta de aguja.
    5. Esquile los flagelos (son frágiles y se rompen fácilmente) pasando suavemente la suspensión celular de un lado a otro de una jeringa a la otra 50x, con 1 min de pausa entre cada 10 pasadas.
    6. Centrifugar las células cizalladas a 2.000 x g durante 3 min y resuspend en un volumen final de 500 μL de MB.
  2. Preparación de diapositivas y atado celular
    1. Prepare una cámara de fijación celular apilando una cubierta de 18 mm x 18 mm sobre una corredera de microscopio de vidrio de 3 pulgadas x 1 pulgada x 1 mm, separada por cinta adhesiva de doble cara (Figura S1).
    2. Enjuague la cámara con solución de poli-lisina al 0,01% (p/v) aplicándola en la parte superior de la cámara. Incline el borde inferior (el cubrebocas al ras con la corredera del microscopio) sobre un limpiaparabrisas de tarea (papel tisú) para ayudar a dibujar la solución a través de la cámara (Figura S1). Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    3. Lavar la cámara tres veces con 40 μL de MB utilizando como se describe en el paso 2.2.2
    4. Añadir 40 μL de la suspensión de células cizalladas (preparada arriba) en la parte superior de la cámara e incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que las células se adhieran al cubrebocas.
    5. Enjuague suavemente la cámara con 40 μL de MB como en 2.2.3 para eliminar las células no unidas.
  3. Registro y cuantificación de la rotación celular
    1. Transfiera el portaobjetos del microscopio cargado con células atados a la etapa del microscopio.
    2. Usando microscopía de contraste de fase y un objetivo de 100x, escanee la población en busca de células que estén fijas en su lugar, y gire en un solo eje, es decir, rotaciones suaves en un punto fijo en lugar de presentarse en un ángulo en el que la célula se mueva dentro y fuera del enfoque (Video 1).
    3. Utilice un microscopio comercial y una cámara asociada. Abra el software asociado, asegúrese de que las celdas de interés estén enfocadas y haga clic en adquisición de video para grabar la rotación de celdas durante un minuto (a 10 cuadros por segundo o más).
    4. A partir de la reproducción de vídeo, cuantifique el número de rotaciones completas por minuto y el número de veces que la celda cambia de dirección (frecuencia de conmutación).
      NOTA: Las velocidades de rotación y la frecuencia de conmutación pueden ser demasiado rápidas para medir a simple vista, por lo que se recomienda utilizar un software de vídeo que ofrezca una reproducción lenta/fina, o que adopte un sistema de software automatizado para cuantificar los patrones de rotación33. Una alternativa sería aumentar la viscosidad del MB usando metilcelulosa (o agente similar) para ayudar a ralentizar y resolver la rotación de bacterias más rápidas o compensar cuando se utilizan cámaras con bajas tasas de fotogramas.
    5. Repita el paso 2.3.2 con réplicas biológicas para compilar una representación de la población de interés.

3. Preparación de enjambres en un ensayo de cruce de fronteras

NOTA: Utilice este método para evaluar el impacto de una mutación o condición en la motilidad del grupo. Enjambre-agar se refiere al agar donde el porcentaje es típicamente más alto que el del agar blando. En el agar blando (0,3 %), las células nadan individualmente dentro del agar. En el agar enjambre (0,5% y más), las células se mueven como un grupo en la superficie. Mientras que las placas de enjambre deben usarse como se detalla aquí, las placas de natación tienen una vida útil más larga y se pueden usar durante varios días. Nuestra preferencia personal es utilizar en 1-2 días.

  1. Preparación del agar enjambre
    1. Añadir 5 g de agar Eiken (0,5% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.
    2. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
    3. Deje enfriar con una agitación suave para evitar cualquier burbuja de aire usando la varilla / placa como se indicó anteriormente. Cuando sea aproximadamente 50 °C, añadir glucosa esterilizada por filtro para una concentración final del 0,5 %.
    4. Verter 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm) y dejar fijar a temperatura ambiente durante al menos 14 h y no más de 20 h. No almacenar para uso futuro.
  2. Inoculación e incubación de placas de enjambre
    1. Inocular 6 μL de un cultivo exponencial medio (preparado como en 1.2) manchando en la parte superior del agar.
    2. Deje la tapa apagada durante 5-10 minutos y reemplácela cuando el inóculo se haya secado en la superficie del agar.
    3. Incubar a 30 °C durante 8 h. Evite la tentación de inspeccionar el progreso del enjambre quitando la tapa, ya que esto contribuirá al secado del agar y perjudicará el enjambre.
      NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del fenotipo de la cepa. Algunas mutaciones aisladas pueden dificultar la capacidad de enjambre y requerirán un porcentaje reducido de agar o un período más prolongado de incubación.
  3. Preparación de placas de ensayo para cruzar la frontera
    NOTA: Este ensayo utiliza una placa de Petri modificada, donde una división plástica (borde) crea dos cámaras, en lugar de una(Figura 2A). Cada cámara se puede preparar independientemente de la otra, ofreciendo diferentes condiciones para el enjambre, antes de 'conectar' los dos. Dependiendo del diseño experimental, la primera cámara (designada a la izquierda) se puede preparar con agar de baño (0.3% p/v) o agar de enjambre (0.5% p/v) desde donde las bacterias pueden migrar a través de la frontera hacia la cámara derecha que contiene agar enjambre +/- cualquier suplemento o desafío requerido (por ejemplo, antibióticos). La migración en cualquiera de los agares se mide/compara típicamente registrando el diámetro más ancho de la colonización bacteriana (de borde a borde) desde el punto original de inoculación.
    1. Prepare el agar para nadar como se describe en 1.1 si es necesario.
    2. Preparar el agar enjambre como se describe en 3.1.
    3. Verter ~ 30 mL de agar enjambre (con la suplementación deseada si es necesario) en la cámara derecha de una placa de Petri de doble compartimento (100 mm x 15 mm), hasta el punto en que esté nivelado con el divisor de plástico entre las cámaras, pero no desbordando hacia la izquierda (Figura 2B).
    4. Después de que el agar se haya endurecido, llene la cámara izquierda con ~ 30 mL de agar de baño o enjambre, de nuevo hasta el punto de contacto con la división de plástico (Figura 2C). Antes de que se establezca, utilice una punta de pipeta estéril para arrastrar suavemente el agar sobre el borde para conectar los dos lados con un puente de agar de ~ 1 mm de altura que abarca toda la longitud de la división (Figura 2D).
    5. Dejar secar la placa a temperatura ambiente (3.1).
      NOTA: Un método alternativo de creación de puente es permitir que el agar de la cámara izquierda se seque y luego pipetee lentamente ~ 100 μL de agar enjambre fundido a lo largo del divisor de plástico para unir las dos cámaras (3.4). Inocular las placas en la cámara izquierda como se detalla anteriormente para nadar (1.2.2) o enjambre (3.2) agar, antes de incubar a 30 °C durante 12-16 h, o hasta que los enjambres hayan progresado lo suficiente sobre la cámara derecha para permitir comparaciones entre cepas de interés.

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Representative Results

El aislamiento de pseudo-revertores en una cepa de E. coli cuya motilidad se ve afectada por altos niveles de la molécula de señalización c-di-GMP, fue detallado en un trabajo reciente de nuestro laboratorio34. Esta cepa (JP1442) albergaba dos mutaciones: ΔyhjH y ΔycgR. YhjH es la fosfodiesterasa más activa que degrada c-di-GMP en E. coli. La ausencia de YhjH conduce a niveles elevados de c-di-GMP y a la inhibición de la motilidad. YcgR es un efector c-di-GMP. En complejo con c-di-GMP, YcgR se une al rotor flagelar para inducir primero la rotación del motor CCW y posteriormente disminuir la velocidad del motor. El atado celular y los ensayos de cuentas mostraron que el comportamiento motor volvió a la normalidad en el doble mutante, sin embargo, la motilidad en el agar blando no lo hizo34. Por lo tanto, implementamos el paso 1 del protocolo para aislar las llamaradas pseudo-revertentes en el doble mutante (Figura 1C). La mayoría de las mutaciones mapeadas por WGS (plataforma HiSeq 4000, PE 2 x 150 setup34)a rssB,que codifica para una proteína reguladora/adaptadora de respuesta que normalmente dirige la proteasa ClpXP a la σS para su degradación34. Uno de estos revertientes, que mostraba una motilidad cercana al de tipo salvaje (AW405, comparar figura 1A,D),se utilizó para generar resultados representativos para los pasos 2 y 3 de la sección de protocolo, utilizando como controles tanto su doble progenitor mutante(Figura 1B)como su cepa isógena de tipo salvaje(Figura 1A).

Para el paso 2 de la sección de protocolo, se analizaron las capturas de video para calcular las rotaciones por minuto (cada rotación completa de 360 °) y elsesgo CW (la fracción de tiempo que los motores giran en una dirección CW o sesgo de caída). El ΔyhjH mostró menos rotaciones por minuto y un menor sesgo de CW en comparación con el tipo salvaje, como se esperaba (Figura 3). Tanto el doble mutante ΔyhjH ΔycgR como su supresor mostraron un comportamiento motor similar al de tipo salvaje, observaciones apoyadas por un análisis previo utilizando el ensayo de 'perla' de mayor resolución detallado en la introducción anterior en trabajos anteriores34.

Para el paso 3 de la sección de protocolo, el ensayo de cruce de fronteras (Figura 2) se utilizó para comparar las capacidades del aislado de tipo salvaje y supresor, primero para enjambre, y luego para moverse a través de la frontera y enjambre en agar complementado con kanamicina. Los resultados muestran que ambas cepas llegaron a la frontera en un momento similar (datos no mostrados) lo que indica tasas similares de enjambre desde un punto de inoculación idéntico. Sin embargo, el cruce del enjambre a la cámara derecha (antibiótico) fue marginalmente, pero consistentemente mayor para el tipo salvaje que el supresor a 20 μg/mL de kanamicina(Figura 4). La diferencia entre las dos cepas fue más pronunciada a 40 μg/mL de kanamicina. En conjunto, estos datos sugieren que las mutaciones en rssB que restauraron la motilidad en las placas de agar blando(Figura 1D),impactan negativamente en la resistencia a los antibióticos de la cepa supresora durante el enjambre(Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Ensayos de motilidad de agar blando y aparición de llamaradas supresoras.
Las placas contienen LB solidificado con agar al 0,3 % p/v. Las cepas de E. coli se inocularon en el centro de cada placa y se incubaron a 30 °C durante 8 h, a excepción de C, que se incubó durante 16 h.(A)de tipo salvaje E. coli (AW405). (B)Variante deficiente en motilidad ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (C) Como en B, excepto tiempos de incubación más largos. Las flechas apuntan a 'bengalas' de movimiento más rápido que emergen en el anillo periférico de la colonia de natación en expansión. (D) Un supresor aislado de una llamarada en C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema para configurar un ensayo de placa de cruce de fronteras.
(A)Verter ~30 mL de agar enjambre (con antibiótico deseado) en la cámara derecha de una placa de Petri dividida hasta que esté nivelada con el divisor de plástico y dejar que se fije con la tapa cerrada. (B) Llene la cámara izquierda con ~ 30 mL de agar de natación o enjambre hasta el punto de contacto con la parte superior del divisor de plástico. (C) Utilice una punta de pipeta estéril para arrastrar suavemente el agar enjambre fundido sobre el borde, conectando así los dos lados con un puente de agar de ~ 1 mm de altura y deje que se establezca con la tapa cerrada. (D) Deje que la placa se seque aún más a temperatura ambiente durante la noche antes de inocular la cámara izquierda con la cepa deseada e incubar a 30 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Propiedades motoras de varias cepas medidas por la técnica de tethering celular.
De tipo salvaje (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442) y su supresor (JP1836) se cultivaron en LB a 30 °C a la fase exponencial media antes de la atadura. (A)Rotaciones por minuto (vueltas completadas de 360°), y(B)sesgo CW (fracción de motores de tiempo giran en una dirección CW). Desviación estándar de la media (±). 20 células atados fueron observadas por 60 sec en cada tensión. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensayos de cruce de fronteras.
Los cultivos de fase exponencial media de E. coli de tipo salvaje (AW405) y el mutante supresor (JP1836) se inocularon en la posición indicada (*) en el compartimento izquierdo de la placa dividida que contiene medios de enjambre, y se incubaron a 30 °C. Llegaron a la frontera en momentos comparables. Las placas se incubaron durante otras 6 h, durante las cuales el enjambre cruzó a la cámara derecha, en la que el medio se complementó con kanamicina (Kan; los números indican μg/mL). Las placas son representativas de tres réplicas biológicas cada una realizada por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura suplementaria 1: Preparación de una diapositiva de cámara para el atado celular. (A) Poner dos piezas de cinta de doble cara antes de (B) utilizando una cuchilla de afeitar para recortar el exceso. (C) Desprenda la capa superior para exponer el adhesivo antes de (D) colocar un cubrebocas y presionarlo suavemente en su posición (indicada por [ ), asegurando que todo el aire se empuje fuera de la interfaz entre el cubrebocas y la cinta debajo. (E)Muestra de carga (que se muestra aquí con tinte de carga de ADN [30% v / v glicerol, 0.25% w / v azul de bromofenol y 0.25% w / v xileno ciclón] agregado para ayudar a la visualización) en la parte superior del canal creado (flecha) mientras que(F)pesca con caña en la limpieza, limpie la tarea de tejido para ayudar a dibujar la solución a través de la cámara a medida que el tejido absorbe el líquido (flecha) en el canal y lo dibuja a través. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Vídeo 1: Rotación de células de E. coli atados. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Un enjambre activo de E. coli filmado bajo un aumento de 60x, demostrando su característico movimiento de remolino detrás del borde del frente móvil. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

El aislamiento y caracterización de mutaciones supresoras han contribuido con éxito a identificar componentes clave del sistema de quimiotaxis35,36,37,así como la propia maquinaria motora38,39,40. Durante el uso del Protocolo 1, es importante incluir múltiples réplicas independientes para asegurar el aislamiento de un amplio espectro de posibles mutaciones que podrían compensar la pérdida de motilidad. Aumentar el número de bacterias rayando el cultivo en una línea en lugar de un punto, puede mejorar las probabilidades de generar supresores41. El aislamiento de la misma mutación (según lo determinado por la secuenciación de ADN) varias veces aumenta la confianza en su autenticidad. WGS revelará invariablemente la presencia de otras mutaciones en el genoma. Por lo tanto, es importante verificar los resultados transduciendo (cuando sea posible) la mutación identificada de nuevo en el fondo original deficiente en motilidad. El enfoque mutante supresor tiene sus raíces en la restauración de la función a través de una mutación secundaria, por lo que una limitación de este método es que si se elimina un gen estructural crítico, es decir, uno que sustenta toda la vía o estructura, puede no haber margen para la compensación. A pesar de ser un método antiguo, nuestro trabajo reciente34 demuestra su utilidad continua en la elucidación de nuevas vías que contribuyen a la motilidad bacteriana.

Para la cuantificación de la salida del motor, el enfoque de atado celular sigue siendo una herramienta universalmente accesible que requiere solo un microscopio con un accesorio de cámara. El atado celular ya se ha utilizado en un número diverso de especies bacterianas, incluyendo Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44y Rhodobacter33. El éxito del protocolo depende en gran medida de la cizalladura y el apego adecuados de las células. La cizalladura demasiado agresiva u omitir la pausa entre tijeras (2.1.5) tiende a promover la cizalladura inconsistente o incompleta de los filamentos, lo que resulta en células no móviles o células atados en un eje sesgado. La relevancia duradera de este protocolo permanece, a pesar de la adopción del ensayo de cuentas de mayor resolución por muchos grupos de investigación (incluido el nuestro). La principal limitación del ensayo de perlas proviene de la necesidad de que la perla se adhiera al filamento de las bacterias de interés. Esta técnica se ha beneficiado enormemente de estudios en E. coli que identificaron un alelo flagelina 'pegajoso', lo que facilita la adherencia45. La variante pegajosa también es superior en el ensayo de atado celular. Tal variante aún no está disponible para la mayoría de las bacterias flageladas. La situación se complica aún más con algunos organismos que poseen múltiples proteínas flagelinas46,y en el caso de Vibrio sp., que también poseen una vaina membranosa47. El atado celular también se puede realizar utilizando un anticuerpo antiflagelina específico de la especie o un anticuerpo contra una etiqueta de epítopo diseñada.

Si bien las bacterias pueden nadar inmediatamente después de su introducción en un medio líquido, esto no es cierto para el enjambre, donde las células deben prepararse primero en un estado de enjambre. El contacto superficial desencadena un cambio fisiológico necesario para que las células inicien el enjambre48,49,50,51,lo que resulta en una fase de retraso y una acumulación de alta densidad celular. Los cambios fisiológicos incluyen la remodelación del sistema de quimiotaxis en E. coli16,y adaptaciones como el alargamiento celular y/o hiperflagelación para otras bacterias13,14,21. Dados los cambios fisiológicos requeridos para iniciar el enjambre, damos una nota de precaución sobre los estudios que han intentado imitar facetas selectas del enjambre , como la alta densidad o el aumento de la longitud celular , simplemente concentrando cultivos celulares planctónicos para aumentar la densidad, y / o induciendo el alargamiento celular mediante el uso de antibióticos que inhiben la división celular52,53. Si se utiliza el alargamiento celular como marcador, advertimos también que en comparación con las células planctónicas, sólo hay un aumento marginal en la longitud media de las células swarmer en Salmonella o E. coli54. Los ensayos de enjambre son más difíciles de establecer que los ensayos de natación. Las variables incluyen la fuente comercial del agar utilizado para solidificar el medio (el agar Eiken especial es esencial para el enjambre en E. coli,mientras que el agar Difco más estándar admite el enjambre para todas las demás bacterias), el uso de medios ricos frente a medios mínimos(E. coli y Salmonella requieren suplementos de glucosa), y más críticamente la humedad ambiental2,13,14,21. De estos, mantener una humedad óptima puede ser el más frustrante. [Una excelente, metódica, optimización para el enjambre en un organismo de elección (Pseudomonas aeruginosa) ha sido demostrada por Morales-Soto y sus compañeros de trabajo55.] Los medios de enjambre deben ser lo suficientemente húmedos como para promover el enjambre, pero no tan húmedos como para permitir la propagación pasiva / deslizamiento, que puede confundirse fácilmente con enjambre activo56. Por lo tanto, es fundamental que los enjambres se revisen bajo un microscopio para confirmar los distintos patrones de movimiento asociados con esta motilidad colectiva (Video 2). La temperatura también es una consideración importante para optimizar el ensayo de enjambre. Las temperaturas más altas, por ejemplo 37 °C, secarán las placas antes que a 30 °C. El uso de una incubadora con control de humedad (~ 70-80%) puede ayudar a mitigar estos problemas, incluidos los cambios estacionales que podrían afectar las temperaturas internas del edificio y la humedad. Una vez establecido con éxito, el protocolo 3 proporciona una poderosa forma de investigar uno de los aspectos más interesantes de las bacterias enjambres, la resistencia elevada a los antibióticos17. Todos los protocolos descritos aquí se pueden aplicar a nuevos organismos para identificar las vías que especifican y controlan la motilidad mediada por flagelos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención GM118085 de los Institutos Nacionales de Salud y en parte por la Fundación Robert Welch (subvención F-1811 a R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

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Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En <em>Escherichia coli</em> mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie
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Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

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