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Genetics

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61367

Summary

CRISPR-Cas9ゲノム編集システムは、モデル種や非モデル種で使用されている使いやすいゲノムエディタです。ここでは、非モデルの糸状アスコマイセテ菌の交配遺伝子に早期停止コドンを導入するために使用されたこのシステムのタンパク質ベースのバージョンを提示する。

Abstract

CRISPR-Cas9ゲノム編集システムは、モデル種と非モデル種のゲノムに正確な変化を導入するために使用できる分子ツールです。この技術は、遺伝子ノックアウトやノックインから、標的となる場所での数ヌクレオチドの導入など、より具体的な変化まで、さまざまなゲノム編集アプローチに使用できます。ゲノム編集は、遺伝子の部分的な機能的特徴付け、トランスジェニック生物の産生、診断ツールの開発など、多くの用途に使用できます。以前に利用可能な遺伝子編集戦略と比較して、CRISPR-Cas9システムは新種で確立しやすいことを示しており、高効率と特異性を誇っています。その主な理由は、編集ツールがRNA分子を使用して目的の遺伝子または一連の配列を標的にし、標準的な塩基ペアルールを利用できることを考えると、標的分子の設計を簡単にするためです。他のゲノム編集システムと同様に、CRISPR-Cas9ベースの方法では、効率的かつ効果的な変換プロトコルと、標的RNAおよびDNA分子の設計のための良好な品質配列データへのアクセスも必要です。2013年にこのシステムが導入されて以来、サッカロミセス・セレビシエ、シロイヌナズナ、ショウジョウバエメラノガスター、ムスムスを含む様々なモデル種を遺伝子操作するために使用されてきました。その後、非モデル種に取り組む研究者は、このシステムを利用して、真菌の二次代謝、線虫の成長、植物の病原性などの多様なプロセスに関与する遺伝子の研究に使用しました。このプロトコルは、以下に詳述するCRISPR-Cas9ゲノム編集プロトコルを用いて、セラトシスシナ科に属する糸状吸入菌菌であるハンティエラ・オマネンシスの性周期に関与する遺伝子の切り捨てについて説明する。

Introduction

高品質の可用性の向上, 完全に組み立てられたゲノムとトランスクリプトームは、生物の配列で多種多様な生物学的プロセスを研究する能力を大幅に向上させました1.これは、モデル種と非モデル種の両方に当てはまり、その多くは生物学的プロセスのより多様な理解を提供する可能性があります。これらの種類のデータは、遺伝子発見、転写ネットワークの同定、全ゲノム比較とトランスクリプトーム比較の両方に使用することができ、それぞれが独自のアプリケーションセットを備えています。しかし、遺伝子は予測され、これまでにない速度で異なる機能的経路にアポイントトされ、推定的にリンクされているが、これらの遺伝子の機能的特徴付けは、多くの種で利用可能な分子ツールキットによって制限されたままである。これは特に、ゲノムデータが比較的生成しやすいが、さらなる分子特性が不可能に近い11,22である非モデル種の場合です。

真菌種の生物学にとって重要な特定の遺伝子の機能の部分的な特徴付けは、ノックアウトまたはノックアウト実験のいずれかによって達成され得る変異株3のフェノティピック分析が続く。これら2つのシステムは、少なくとも変換システムと遺伝子編集システムを含む遺伝子工学プロトコルの可用性に完全に依存しています。糸状菌4の様々な中で開発された様々な変換システムが数多く存在する。バイオリスミクスやエレクトロポレーションに依存する物理システムは、トリコデルマ・ハルジアナム5アスペルギルス・ニジェール66でそれぞれ開発されています。塩化カルシウムや酢酸リチウムなどの化学物質を利用するシステムがNeurospora crassa7で開発されています。最後に、トランスフォーメーションのためのアグロバクテリウム・トゥメファシエンスの使用に依存する生物学的システムは、セラトシスティス・アルビフダス8で正常に使用されている。

異なる変換プロトコルの利用可能性とは対照的に、ゲノム編集システムはあまり豊富ではありません。糸状菌で行われた従来の機能特性評価実験の多くは、ゲノム3内の標的領域または遺伝子に相同性の領域に隣接する選択可能なマーカーの形態で分割マーカーノックアウト構築物を利用した。この方法は、ノックアウト構築物と対象領域との間の相同的な組み換えである相同性指向(HR)DNA修復に依存する。この再結合イベントは、対象となる遺伝子を選択可能マーカーの配列に置換する結果となる。残念ながら、これはセルコスポラニコティネア10、アスペルギルスフミガトゥス11、グロスマンニア鎖骨12を含む多くの種で成功しましたが、相同組換えの割合は異なる真菌種間で非常に変動し、これは特定の種3では非効率的で時には使用できないプロトコルとなっています。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を利用するものを含む他のゲノム編集システムは、特に特定および標的化された変更を行う能力与えられた古いシステムにおいて大きな改善を示した。ZFNおよびタランはいずれもヌクレアーゼタンパク質と、特定のヌクレオチド配列13を認識することができるタンパク質から構成される。認識すると、ヌクレアーゼは、特定の突然変異の導入を容易にすることができる二本鎖DNA切断を誘導する。ゲノム変化をもたらすためには、塩基配列を認識するタンパク質領域を実験ごとに特異的に設計する必要があります。この編集を導くタンパク質核酸相互作用への依存のため、ノックアウトまたはノックイン実験ごとに標的分子を設計・製造することは困難であり、労働集約的な14,15。,15これらの課題を例示する、これらのシステムを用いたゲノム編集を行った糸状菌はごくわずかである。一つの例は、米爆菌、マグナパルテオリザエ16で開発されたTALENsベースのシステムです。

ゲノム編集の分野における最大の革命は、RNA分子によって導かれるエンドヌクレアーゼによる目的の配列の標的切断を可能にするゲノムエディタであるCRISPR-Cas9システムの発見とその後の開発でした。これは、CRISPR-Cas9システムの主な利点は、目的の領域を標的とするRNA分子に依存していることから、タンパク質と核酸の相互作用に依存していた以前に開発されたゲノムエディタの大きな改善でした。これは、システムがRNAとDNAの相互作用に依存していることを意味し、したがって、各実験15を設計する際に標準的な塩基対の規則を利用することができる。

ここで詳述されるCRISPR-Cas9システムは、単一のガイドRNA(sgRNA)、Cas9酵素およびドナーDNA(dDNA)17の3つの主要な17構成要素から構成される。sgRNAは、プロトスペンサーと呼ばれる20ヌクレオチド領域と、足場18と呼ばれる長い領域から構成される。プロトスペイサー領域は、編集システムをターゲット領域に誘導するために使用され、実験ごとに再設計されます。足場は、Cas9酵素に物理的に結合してリボヌクレオプロテイン(RNP)を形成するRNAの領域であり、標的となる領域に関係なく同一である。Cas9酵素は、標的DNAの切断を物理的に促進し、この領域19を同定するためのガイドとしてプロトスパサーを用いる。最後のコンポーネントである dDNA はオプションであり、その使用は特定の実験20に依存します。dDNAはCas9酵素によって切断される領域に特異的に挿入されるべき配列を保持し、したがって、遺伝子がゲノムに導入されている遺伝子ノックイン実験や、目的の遺伝子を置き換えるために抗生物質耐性遺伝子または他の選択可能なマーカーが導入されている遺伝子ノックアウト実験に最適です。dDNAは、ゲノムに新しい配列を導入するような方法で設計することもできます。例えば、以下に詳述するように、遺伝子切り捨てが必要な場合に目的の遺伝子の特定の領域にフレーム内停止コドンを導入することができる21。その他のアプリケーションは、機能的ドメイン22などの遺伝子の特定の領域の突然変異、またはタグ付け配列23の導入を含む。

CRISPR-Cas9システムを使用する主な利点は、その汎用性24です。この適応性の一例は、Cas9酵素が、使用されている特定の変換系に応じて、その3つの形態のDNA、RNAまたはタンパク質の1つで宿主細胞に導入され得ることです。DNA形態で導入される場合、cas9遺伝子は、選択マーカーとともにプラスミドに含まれることが多く、sgRNAを発現させるカセットと、必要に応じて、dDNA配列25をコードするカセットである。このシステムの主な利点は、単一の構成体のみを細胞に変換する必要があり、正常な変換により、CRISRP-Cas9媒介ゲノム編集に必要なすべてのコンポーネントが存在することを保証することです。しかし、この方法は、宿主種の発現システムの利用可能性に依存している。Cas9がDNA損傷を正常に誘導するためには、高レベルで発現する必要があり、したがって、適切で潜在的に特異的なプロモーターが必要です。このようなプロモーターがまだ開発されていない非モデル種の場合、これは損なう要因であり、RNAまたはタンパク質形態でCas9を導入する能力がより魅力的な選択肢である可能性があります。RNAを細胞に導入することは、特にRNAが不安定であり、変換プロセスを生き残れない可能性があるという問題をもたらします。さらに、DNAまたはRNA形態のいずれかで導入する場合、Cas9遺伝子配列は、特定の宿主系17での使用のためにコドン最適化される必要がある。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のcas9遺伝子は、哺乳動物宿主細胞では働かない場合があり、哺乳動物細胞での使用のためにコドン最適化されたcas9遺伝子は、植物細胞では働かない場合がある。これらの課題はすべて、Cas9のタンパク質形態を用いて克服することができ、これは、sgRNAと共に、RNPに組み立て、宿主細胞26、27,27に変換することができる。このシステムは、内因性発現系やコドン最適化に依存しないため、非モデル種の大部分で機能するはずです。タンパク質系系の欠点は、アグロバクテリウム媒介性伝達のようなDNAベースの変換系と互換性がないことである。したがって、タンパク質ベースの方法が機能するためには、プロトプラストやバイオリスミクスに依存するものなどの変換プロトコルが利用可能である必要があります。このRNP系システムは、糸状菌、フザリウムオキシスポルム26およびムコールサーシネロイト27において正常に使用されている。

ハンティエラオマネンシスは、セラトシスシダーセ科の一員で、傷を負ったての木質植物28によく見られる国際的な真菌である。この種28、29、30には高品質のゲノムおよびトランスクリプトームデータが利用可能であるが2930変換またはゲノム編集プロトコルは開発されていない。,現在までに、H.オマネンシスに関する研究は、その性的サイクル29、31,31の基礎となる遺伝的構成要素に焦点を当ててきた。この真菌は典型的なヘテロトアニック性周期を呈し、MAT1-1とMAT1-2交配型31の分離株間で性的生殖が排他的に起こる。対照的に、MAT1-2は、密接に関連するハンティエラ・モニリフォルミの独立した性的生殖が可能であり、MAT1-1パートナー31の不在の場合には性的サイクルを完了する。この性的能力の違いは、少なくとも部分的には、交配遺伝子の大きな違いのために、Mat1-2-7、H.オマネンシスが完全な長さと無傷のコピーを収容し、一方で遺伝子はH.モニリフォルミ29、31,31でひどく切り捨てられると考えられている。さらに性生殖におけるこの遺伝子の役割を特徴付けるために、H.オマネンシスMAT1-2-7遺伝子は、H.モニリホルミ2121に見られる切り捨てを模倣するために切り捨てられた。

以下のプロトコルは、タンパク質 ベースの CRISPR-Cas9ゲノム編集システムを用いた MAT1-2-7 遺伝子の変換と切り捨てについて詳述している。このプロトコルは、相同組換えベースの遺伝子置換およびプラスミドベースのCRISPR-Cas9ゲノム編集のアプローチが失敗した後に開発された。

Protocol

1. sgRNAの設計と合成

  1. sgRNAの一部を形成する潜在的なプロトスペーサー領域を特定するには、使用されているプログラムの検索機能を使用して、5' NGG 3' 三つ子の対象遺伝子を手動で検索します。これらの三つ子を PAM シーケンスとしてアセトします。
    注: PAM およびプロトスペースのシーケンスを検索して注釈を付けるさまざまなソフトウェア プログラムが用意されています。
    1. 識別された各 PAM シーケンスの 20 bp アップストリームを選択し、これらのシーケンスに潜在的なプロトスペースとしてコメントを付けます。
  2. 1 つのプロトスペースを決定するには、次のフィルタリング手順を実行して、低品質のシーケンスを破棄します。
    1. 潜在的なプロトスペーサの特異性をテストするには、PAM配列とプロトスペーサを1つの配列に組み合わせて、ゲノム全体に対するBLASTnクエリとして使用します。標的領域以外のゲノム内の任意の領域と類似性を示すプロトスペイサーを廃棄する(図1A)。
    2. RNA分子がCas9酵素に結合するための正しい3D構造に折り畳まれるようにするために、Cas9酵素に固有のプロトスペーサーと足場配列を含む結合配列を作成します。
      1. 組み合わされた各プロトススペースス-足場配列をRNA二次構造予測ツール(材料表)にアップロードします。
      2. 最小の自由エネルギーと中心の二次構造を比較して結果を分析します。
        注:理想的なプロトスペーサ候補は、同一の最小の自由エネルギーと心の二次構造を持つことになります。両方の二次構造は、5つのリング構造によって中断された3つのステムループで構成されるべきです。構造はまた、プロトスペースを表す領域を除いて、構造全体にわたって高い結合確率(赤で示される)を示す必要があります(図1B)。実際のエネルギー値は関係ありません。
    3. 対象となる特定のリージョンに最も近い候補を選択して、上記のフィルタリング手順に合格した候補から最終的な候補を選択します。
  3. 単一のRNA分子としてsgRNAを合成するには、使用される特定のCas9酵素と互換性のあるsgRNA合成キット(材料表s)を使用する(例えば、 レンサ球菌のpyogenesからCas9)。
    注: 以下の手順は、使用する sgRNA 合成キットに依存する場合があります。別のキットが使用された場合は、製造元の指示に従ってください。あるいは、sgRNAを、予め合成してオーダーすることができる。RNAを使用する場合は、ヌクレアーゼフリー試薬と使い捨て薬を使用してください。
    1. 上記のステップ 1.3 で選択した 20 bp のプロトスペースが 5' の終わりに G を収容しない場合は、この領域に G を追加します。
    2. T7プロモーター配列をターゲット配列の5'末端に追加します。このシーケンスは標準であり、5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3' です。
    3. ターゲット シーケンスの 3' 末尾に 14 nt のオーバーラップ シーケンスを追加します。このシーケンスはキット固有で、ここで使用されるキット用の5' GTTTTAGAGCTAGA 3' です。
    4. 得られたフラグメント5'TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGAをオーダーし、選択したプロトスペーサを表す(N)20を使用して、あらかじめ合成されたプロトスペーサを表す(材料表)。20 20
    5. 製造者のプロトコル(材料表)に従い、2μLの水、10μLの反応緩衝液、5μLの合成プロトスペーサー配列、0.1 M DTTの1μLおよび2μLのトランスクリプト酵素を室温で組み合わせます。
    6. この溶液を37°Cで30分間インキュベートし、氷に移します。
    7. 30 μLの水と2 μLのDNase Iを加え、37°Cで混合してインキュベートし、さらに15分間インキュベートします。
    8. 得られたsgRNAを2%アガロースゲルで可視化します。

2. sgRNAの インビトロ 切断能力の試験

注: この手順はオプションですが、推奨されます。

  1. 選択したsgRNAが標的とする部位の配列を有する断片を増幅するプライマーを設計し、標準的なDNAポリメラーゼを用いて領域を増幅する。
    注:可能であれば、ターゲット部位で切断が標準的なアガロースゲル上で互いに容易に区別することができる非常に異なるサイズの2つの断片を生成するような方法でプライマーを設計する。
  2. 上記合成した30 nM sgRNAからなる溶液、30 nM Cas9タンパク質、10x反応バッファー、10μLの水を10分間、20分間、結合したsgRNA-Cas9リボヌクレオプロテイン(RNP)を組み立てます。
  3. 標的領域のPCR産物をRNP溶液に加えて、3nMの最終濃度に添加することにより、sgRNAの切断能力を試験します。
    1. 37°Cで15分間インキュベートします。
    2. 溶液に3μgのプロテイナーゼKと2μgのRNaseを加えて、切断反応を停止し、室温で10分間インキュベートします。
    3. 得られたDNA断片を2%アガロースゲルで可視化します。sgRNAは、期待サイズの2つのバンドがゲルに観察される場合の インビボ 実験に適している。

3. dDNAの設計と合成

  1. 標的とされるゲノム領域との相補性を持つ3つの領域-5'および3'領域と選択可能なマーカーを収容する中間領域で構成されるdDNAを設計する(材料表図2)。
    注: この選択可能なマーカーには、他の特定のシーケンスを追加することもできます。この特定の実験では、選択マーカーの直前に停止コドン配列(5'TGA 3')を加え、インフレームストップコドンを遺伝子に導入した。dDNAは、事前合成をオーダーすることができます。あるいは、dDNAを段階的に使用して増幅および組み立てることができ、以下に詳述するPCRアプローチが重複する。
    1. 5'と3'の隣接する領域の約800 bpを増幅するプライマーを設計します。選択可能なマーカーのシーケンスを補意とする 20 nt のシーケンスを、5' 領域の逆プライマーと 3' 領域のフォワードプライマーに追加します。
    2. 選択可能なマーカーを増幅するプライマーを設計し、増幅された生成物が抵抗性遺伝子を収容し、また目的の種で働くことを知られているプロモーターを収容することを保証する。
  2. 高忠実度のDNAポリメラーゼ(材料表)を使用して、3つのdDNA領域を増幅します。編集中の生物のgDNAから5'と3'の領域を増幅する。関連するソースから選択可能なマーカーを増幅します。
    1. 単一の反応で、増幅された5'領域を選択マーカーと組み合わせ、長い範囲の高忠実度DNAポリメラーゼを使用して、領域全体を増幅する。
    2. 第2の単一の反応では、増幅された3'領域を選択マーカーと組み合わせ、長い範囲の高忠実度DNAポリメラーゼを使用して、領域全体を増幅する。
    3. 最後に、上記の 2 つの PCR 製品を 1 つの反応に組み合わせ、dDNA 配列全体を、長い範囲の高忠実度 DNA ポリメラーゼで増幅します。
    4. 1%アガロースゲル上のDNA断片を可視化します。2つ以上のフラグメントが生成された場合は、ゲル精製キットを用いてゲルから正しいサイズの断片を精製する。

4. プロトプラストの抽出

  1. コニディアを製造するには、1cm x 1 cmのミセリアで覆われた寒天ブロックを有する500 mLフラスコに200mLの新鮮な2%麦芽エキスブロス(MEB)を接種する。
    注:すべての真菌がコニディアを生成できるわけではありません。その場合、ミセリアも使用できます。これは通常、プロトコルでさらに高濃度の酵素を取り付ける必要があります。
    1. 25°Cの振盪インキュベーターで液体培養液を24~48時間120rpmで振盪してインキュベートする。
      注意:このインキュベーション時間と温度は 、H. オマネンシスに最適化されています。これは、他の種のために最適化する必要があります。
    2. コニディアを収穫する。滅菌実験布(例えば、ミラクロス)の層を通して液体培養物を濾過し、10分間4°Cで3,220 x g で50 mL遠心管と遠心分離機に対して、円筒懸濁液を移す。上清を捨てます。
    3. 5 mLの水とピペット10 μLの水を顕微鏡スライドに再懸濁し、カバースリップで覆います。40倍の倍率で複合顕微鏡を使用して視覚化し、コニディアのみが回収されたことを確認する(図3A)。
    4. 500 mL フラスコで、再懸濁されたコニディアの総容積で200 mLの新鮮な1%MEBを接種する。
    5. 25°Cの振盪インキュベーターで液体培養液を120rpmで最大12時間振盪してインキュベートします。
      注意: このインキュベーション時間は 、H. オマネンシスに最適化されています。これは、他の種のために最適化する必要があります。
    6. 胚芽を収穫するには、液体培養物を50mL遠心管に移し、遠心分離機を3,220 x g で4°Cで10分間移す。上清を捨てます。
    7. 1 Mソルビトールの10 mLまでで発芽を再懸濁します。
    8. 10 μLの胚芽液を顕微鏡スライドに入れ、カバースリップで覆います。40倍の倍率で複合顕微鏡を使用して視覚化し、胚芽のみが回収されたことを確認します(図3B)。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。-80°Cで1 Mソルビトールに胚芽を保管してください。
  2. 若い胚芽の細胞壁を取り消し、プロトプラストを放出するには、無菌50mLフラスコの様々な濃度で9mLの酵素をライジングする酵素の1mLを加える。
    注:異なる酵素濃度およびインキュベーション時間が使用され、 表1に記載されています。酵素および濃度は真菌によっても変わる可能性があり、種ごとに最適化する必要があります。
    1. 25°Cの振盪インキュベーターに胞子酵素溶液をインキュベートし、80rpmで2〜3時間振動する。
    2. 無菌実験室布の層を通してプロトプラスト溶液を濾過し、10分間4°Cで1,810 x g で遠心分離によってプロトプラストを収集します。上清を捨てます。
      メモ:プロトプラストは細胞壁のない細胞であるため、機械的な破壊に非常に敏感です。特にピペットの場合は、慎重に取り扱ってください。
    3. 200 μLのSTCバッファにプロトプラストペレットを慎重に再懸濁します(材料表)。
    4. プロトプラスト溶液のピペット10 μLを顕微鏡スライドに取り付け、カバースリップで覆います。40倍の倍率で複合顕微鏡を使用して視覚化し、プロトプラストのみが回収されたことを確認します(図3C)。
    5. ヘモサイトメーターを使用して、上記のステップで生成されたプロトプラストの数をカウントし、計算します。プロトプラスト溶液を約5 x 106 のプロトプラストを含むアリコートに希釈します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。プロトプラストを-80 °CのSTCバッファーに保管してください。

5. プロトプラストとPEG支援変換と変換性回復

  1. 変換を開始するには、約5 x 106 のプロトプラストをRNP溶液の単一のボリュームと、約6μgのdDNA断片と組み合わせます。
    メモ:プロトプラストは機械的な破壊に非常に敏感です。特にピペットの場合は、慎重に取り扱ってください。
    1. ピペットを使用して、作りたての30%PTC溶液をプロトプラスト溶液にゆっくりと滴下し、室温で20分間インキュベートします。
      注: この手順は、重要で重要な手順です。作りたてのPTC溶液を使用し、細胞表面全体に疎水性の層を作成し、できるだけゆっくりと均等に細胞の上に溶液をドロップすることを確認してください。
    2. プロトプラスト溶液に5mLの浸透制御培地(OCM)を加え、ピペットをゆっくりと穏やかに加え、溶液が完全に混合されていることを確認します。
    3. プロトプラスト溶液を25°Cの揺れインキュベーターにインキュベートし、一晩で80rpmで振盪します。
  2. 変換された分離物を選択するには、溶液を5つの空の60mm培養プレートに分割します。
    1. 各培養プレートに30 μg/mLハイグロマイシンBを添加したOCM寒天10mLを加え、各プレートをゆっくりと回転させて完全に混合します。
    2. 40 μg/mL ハイグロマイシン B を添加した浸透性制御培地寒天の 10 mL を追加する前に、寒天の第 1 層を設定します。
    3. 寒天の2番目の層は、単一の分離物が寒天の両方の層を介して成長するのを見ることができるまで、25°Cで培養物を設定し、インキュベートすることを可能にする。
  3. 正常に形質転換された分離株を回復するために、40 μg/mL ハイグロマイシン B を補った寒天層を介して成長可能な個々の分離株を、50 μg/mL ハイグロマイシン B (MEA-50) を加えた新鮮な麦芽エキス寒天 (MEA) プレートに移します。
    1. 生鮮文化を25°Cで5日間インキュベートし、毎日成長をチェックします。このメディアで持続的な成長が可能な文化は正常に変換され、さらなる研究に使用することができます。

6. dDNAの統合と安定性の確認

  1. dDNAが標的領域のゲノムに統合されたことを確認するために、予測された5'および3'インサート部位に隣接するプライマーを設計する(図2)。
    1. これら2つのプライマーセットと高忠実度DNAポリメラーゼを使用して2つのPCRを実行します。両方のPCRが期待されるサイズとシーケンスのアンプリコンを生成する場合、dDNAはターゲット領域に正常に統合されました。次に、dDNAの安定した集積について変異染色を評価する。
  2. dDNAが安定してゲノムに統合され、栄養成長の間に維持されることを確認するために、メディア転送試験を行う。
    1. MEA-50培地上で活発に成長している変異体分離物から無補充MEA培地に、骨髄で覆われた寒天のブロックを移す。25°Cで3日間インキュベートします。
    2. MEA培地上で成長している分離株からMEA-50培地にミセリアで覆われた寒天のブロックを移す。25°Cで3日間インキュベートします。
    3. このプロセスを繰り返します, 少なくとも 4 ラウンドの補充された培地に補充から積極的に成長しているミセリアを転送.
      注:多くの転写後に単離体がMEA-50培地上で持続的な成長が可能な場合、dDNAはゲノムに安定的に統合されており、栄養成長によって維持することができます。変異染色は、統合されたdDNAの単一のコピーの存在を評価することができる。
  3. dDNAが単一の場所でゲノムに統合されたことを確認するために、サザンブロット分析を行います。
    1. Hin dIIIおよびEcoRI制限酵素を使用して、各Hin変異株から合計30 μgのgDNAを製造者のプロトコルに従って消化します。
      注:制限酵素の選択は研究者次第ですが、制限酵素の認識部位がdDNA配列に存在しないことを確認してください。
    2. 消化したgDNAを0.75%アガロースゲルで分離し、標準的な手順32を使用してDNAをナイロン膜に移す。
    3. dDNA配列を標的とするプローブを用いて膜をハイブリダイゼーションに供する。
      1. dDNAの短い(300 bp)領域を増幅するようにプライマーを設計する。
      2. これらのプライマーを用いて、PCR DIG標識ミックスを用いてプローブを合成する。
      3. 新たに合成されたプローブを使用して、膜ハイブリダイゼーション、処理、視覚化を標準手順32を使用します。各レーンに1つのバンドしか見られない場合、dDNAはゲノム内の単一の位置にのみ存在します。変異株は、さらなるフェノティピック解析および機能的特性解析実験に使用できるようになりました。

変異株の7.フェヒーチピック解析

  1. MAT遺伝子の破壊が研究されている真菌の性的能力に影響を与えたかどうかを判断するために交配実験を行う。
    注:このステップは、研究されている特定の遺伝子および種に依存します。この場合、標的化している遺伝子は性生殖に関与していると考えられるため、交配試験が行われた。例えば、遺伝子が無性生殖に関与していると考えられるならば、心筋産生のようなものを測定することができる。
    1. 変異株のヘテロスアリック能力を試験するために、変異株と同様に反対交配型の株を有する新鮮なMEA培地を共に接種する。 オマネンシスの場合は、プレートの蓋を閉じたままにしますが、密封せず、室温で7日間インキュベートしてください。性的構造の生産を視覚的に評価する。
    2. 変異株のホモタール性能力を試験するために、変異株を有する新鮮なMEA培地を接種する。 オマネンシスの場合は、プレートの蓋を閉じたままにしますが、密封せず、室温で7日間インキュベートしてください。性的構造の生産を視覚的に評価する。
  2. 増殖速度実験を行い 、MAT 遺伝子の破壊が研究対象の菌の増殖速度に影響を及ぼしたかどうかを判断する。
    1. 巨大な無菌ピペットチップの裏側を寒天に挿入することで、突然変異型および野生型株の培養の積極的に成長するエッジから、骨髄で覆われた寒天プラグを作成します。
    2. これらの寒天プラグで新鮮なMEA培地を接種します。各カルチャの種類ごとに少なくとも 3 つのレプリケートが作成されていることを確認します。
    3. 20°Cで3日間の成長の後、2つの垂直直径での成長を測定する。
    4. 野生型と変異株のデータを比較します。

Representative Results

上述のプロトコルは、非モデルのアスコマイセテ 、H.オマネンシスからの交配遺伝子への早期停止コドンの導入を促進した。このプロセスはCRISPR-Cas9ゲノム編集システムのバージョンを利用し、このプロトコルの中で最も重要なステップの1つは、高品質のsgRNAの設計と合成です。 図1 は、この分子がA)が目的の遺伝子を特異的に標的とし、Cas9タンパク質と結合するために正確に折り畳まれるゲノムおよびB)折り畳みの他の領域とほとんど類似性を示していないような方法で設計された方法を示しています。sgRNAはまた、標的領域を効果的に切断することができるものでなければならない。標的領域の切断を標的とし、切断することを可能にするsgRNAの能力を インビトロで行い、予想されるサイズの2つの産物を生じさせる。

変換が成功したら、dDNAがゲノムに一度だけ統合され、期待される場所に確実に統合されるようにすることが重要です。 図 2 は、挿入部位を対象とする PCR プライマーの設計を示しており、これを使用して、正しい統合サイトの潜在的な変換剤をスクリーニングすることができます。5'と3'の挿入部位に隣接するプライマーを設計することにより、dDNAが正しい領域に挿入された場合にのみ増幅が可能です。 図4、MAT1-2-7 遺伝子に早期停止コドンを導入して正しい読み取りフレームに入れ、 遺伝子がH.モニリフォルミと同様の方法で切り捨てられることを確認したことを示している。さらに、サザンブロット解析では、dDNA構築物はゲノム内の単一部位にのみ統合されている。

プロトコルの成功は、変異株のフェノールト分析で確認された。MAT1-2-7破壊実験の場合、2つの独立した変異株が開発された。両方の分離株において、栄養放射状の増殖速度が有意に低下し、新しい交配遺伝子の多雄性効果を示唆する(図5)。さらに、変異型分離株は性的サイクルを完了することができなく、性的胞子を産生しない未熟な性的構造のみを産生する(図5)。これは、インキュベーションの数日以内に性的サイクル全体を完了した野生型分離株とは対照的でした(図5)。

Figure 1
図1:適切なsgRNA候補を選択する。
(A)適切なsgRNAは、ゲノムの標的領域と類似性を有する(この場合はMAT遺伝子配列で示される)。(B)適切なsgRNAは、一次ステップループ内に3つのステムループと5つのリングを有する、同一の最小の自由エネルギーおよび好ましくは二次構造を有する。さらに、構造の大部分は高い結合確率(濃いオレンジと赤で示される)を有し、より低い結合確率はプロトスペーサー領域(黒い三角形で示される)で見るべきです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:dDNAの設計、増幅、組み立て
第1および第2プライマーペア(PP1およびPP2)は、対象遺伝子の約800 bpアップストリーム(5')および800bp下流(3')を増幅するために使用される。PP1の逆プライマーおよびPP2のフォワードプライマーには、ハイグロマイシン耐性カセットに対する相同性の領域が含まれる。第3プライマーペアは、ハイグロマイシン耐性カセット全体を増幅する。段階的に、5'領域、ハイグロマイシン耐性カセットと3'領域で構成されるdDNA全体が組み立てられるまで、様々なアンプリコンが組み立てられる。細胞に変換すると、dDNAはCas9酵素が切断するように指示された領域で再結合し、それによって目的の遺伝子をハイグロマイシン耐性カセットに置き換える必要があります。PP4とPP5を使用して、dDNAが適切な場所のゲノムに正しく挿入されているかどうかを判断できます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:プロトプラスト抽出プロトコル中に重要な異なる細胞タイプ。
(A) コニディアはプロトコルの出発材料として使用されます。これらのコニディアは、彼らが(B)若い発芽になるまで発芽し、成長することが許される。若い胚芽の理想的な成長段階は、2つの黒い矢印によって示される。他の(B)に見られる他の菌糸は劣化のために成熟しすぎて、使用すべきではない。プロトコルの最後のステップは、黒い点線の円で示される(C)丸いプロトプラストのリリースです。これらの細胞はもはや細胞壁を持たないので、機械的破壊に非常に敏感である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4: TGA ストップ コドンをH. オマネンシスMAT1-2-7遺伝子にうまく統合した。
(A)全長H.オマネンシスMAT1-2-7遺伝子を、緑色の矢印で示すsgRNA標的部位を有する。(B) H. オマネンシス MAT1-2-7遺伝子内の sgRNA 標的部位の拡大図である。(C)H.オマネンシスMAT1-2-7遺伝子に相同な腕で横たわる停止コドンを示すdDNAの領域の拡大図である。C(D)サンガー配列クロマトグラムは、MAT1-2-7遺伝子へのストップコドンの正常な統合を示す。ウィルソンら 202021.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:(A)野生型分離物と(B)変異株との表現型の違いを示す。
各パネルの最初の3つの画像は、2つの分離タイプの性的能力の違いを示しています。野生型分離物は性的生殖中に成熟したアスコマタを形成し、アスコマタル首の先端からの胞子の滲出を伴うが、突然変異体は性的胞子を産生しない未熟な性的構造のみを形成する。各パネルの4番目の画像は、2つの分離型の成長速度と形態の違いを示しています。野生型分離物ははるかに速く、より多くの空中ミセリアで成長するが、突然変異体は遅く示し、寒天の中に沈んでいる。ウィルソンら 202021. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

反応 酵素濃度 劣化時間
A 1.250 mg/mL 180分
B 1.875 mg/mL 180分
C 2.500 mg/mL 150分
D 3.750 mg/mL 150分
E 4.375 mg/mL 120分
F 5.000 mg/mL 120分

表1:トリコデルマ・ハルジアナム由来の酵素を溶解した発芽/菌化液の分解異なる酵素濃度は、より長いインキュベーションを必要とする低濃度で、異なるインキュベーション期間に対応しています。

Discussion

H.オマネンシスの正常な変換およびMAT1-2-7遺伝子の編集を成功させるためのプロトコルは、ハイグロマイシンB21に対する耐性遺伝子と共にフレーム内早期停止コドンを導入することによって実証された。これは、CRISPR-Cas9ゲノム編集システムのタンパク質ベースのバージョンを使用して達成されました。実験では、sgRNAのインビトロ転写、dDNAのPCRベースの組み立て、および市販のCas9酵素を用いたこれら2つの核酸の共変化を、H.オマネンシスから抽出されたプロトプラストに組み込んだ。

他の多くの分子ツールの入手可能性に依存する他のプロトコルとは異なり、上記のプロトコルは、分子ツールボックスがまだかなり制限されている種でうまく使用することができます21.このプロトコルは、確立された変換システムとNGSデータの可用性(好ましくは全ゲノム配列)にのみ依存します。効果的な変換システムは、これを利用できない種で最適化を要する場合がありますが、さまざまな種類のプロトコルが利用できます。さらに、ゲノムデータは、最も不明瞭な種でもますます利用可能になりつつあり、まだ存在しない場合は デノボ を生成することが容易になっています。

プロトコルの長さを考えると、変更を導入できる手順やトラブルシューティングが必要な場合は、多くの手順があります。これは、種固有と見なされるステップに特に当てはまります。例えば、実験に重要な細胞タイプを生成するために、特定の温度で特定の時間に対して実施する必要があるインキュベーションステップが多くあります。したがって、これらのステップは、種固有の最適化を必要とします。可能であれば、特定の細胞または成長期の顕微鏡写真が、このプロトコルを別の種に移す手助けをするために提供されてきた(図1)。プロトプラストを放出するために真菌細胞の細胞壁を分解するために使用される酵素の種類および濃度は、研究されている真菌の種にも特異的である。このプロトコルでは、1つの酵素の分解源のみが使用され、一方、 フザリウム・バーチリオイド33のような種におけるプロトプラストの抽出には異なる酵素の組み合わせが必要である。このステップは細胞壁の化学製に完全に依存し、したがって種ベースに種に最適化する必要があります。

この方法は、式システムへの依存がないため、非モデル種を研究する人にとって特に重要です。CRISPR-Cas9ゲノム編集システムを確立する一般的な方法は、Cas9タンパク質、sgRNAだけでなく、選択した細胞に変換される1つまたは2つのプラスミドからdDNAを発現することです。この場合、Cas9は、研究されている特定の生物において高いレベルの発現が可能なプロモーターによって発現される必要がある。一般的なプロモーターは糸状菌類での使用のために開発されており、すべての種で互換性はありませんが、低レベルの発現を可能にし、例えば抗生物質耐性遺伝子を発現させるためにうまく使用することができます。しかし、これらのプロモーターは、高レベルの発現を許容しないことが多いため、Cas9タンパク質を発現するために使用することはできません。CRISPR-Cas9ゲノム編集システムのタンパク質ベースのバージョンを使用すると、この制限を克服し、sgRNAとdDNAが既に産生されたCas9酵素と共に細胞に変換することができます。

このタンパク質ベースのシステムの開発は、古典的なスプリットマーカーアプローチとプラスミドベースのCRISPR-Cas9システムの両方を使用してゲノム編集で多くの試みが失敗した後に起こった。効率は種によって異なりますが、スプリットマーカーアプローチはオルタナリアオルタナタ34、35、C.35ニコティアナエ36のような多様な種で100%の効率でうまく使用されています。34これに対し、80以上の独立した変換および統合イベントにもかかわらず、このシステムのH.オマネンシスの効率はゼロであった。同様に、プラスミドベースのCRISPR-Cas9システムは、トリコデルマ・レイセイ(>93%)17およびペニシリウム・クリソジン(最大100%)37において高効率で使用されている。3717これは、このシステムのH.オマネンシスの有用性とは対照的です。Cas9タンパク質の十分な発現は、ハウスキーピング遺伝子から予測される2種特異的プロモーターを含む多くの潜在的なプロモーターを試みたにもかかわらず、H.オマネンシスでは達成できなかった。したがって、このシステムはまったく使用できませんでした。しかし、CRISPR-Cas9システムのタンパク質ベースのバージョンを使用して、多くの独立した形質転換体を生み出し、そのうちの2つは統合されたdDNAを正しい場所に収容していました。さらに、この実験は一度だけ試みられ、このシステムが使用できる容易さをさらに示す成功を収めた。

このプロトコルの将来の用途は、その最適化とセラトシスシダーセ科の他の種での使用が含まれます。これらの種30、38、39に利用可能なNGSデータはすでに豊富であり3839その宿主特異性40に関する研究、成長率および病原性,41が実施されている。これらの研究は、これらのプロセスに関与すると考えられる遺伝子の機能的特徴付け、形質転換およびゲノム編集プロトコルの利用可能性により可能となる研究によって強化することができる。

結論として、非モデル種における重要な生物学的プロセスの根底にある遺伝子の徹底的な調査は、広範な生物学的資源および分子ツールキットの存在に依存しない使いやすいゲノム編集プロトコルの利用により、よりアクセスしやすくなってきています。非モデル種の研究は容易になりつつあり、モデル種で解明された標準的な生物学的プロセスからの新しい経路と興味深い逸脱の発見を可能にする。

Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

このプロジェクトは、プレトリア大学、科学技術省(DST)/国立研究財団(NRF)ツリーヘルスバイオテクノロジーの卓越性センター(CTHB)によって支援されました。このプロジェクトはさらに、BDウィングフィールド教授のDST/NRF SARChI委員長(グラント番号:98353)とAMウィルソン博士のNRF PhDバーサリー(108548)によってサポートされました。助成金保有者は、この作品で表明された意見、調査結果、結論または勧告は研究者のものであり、資金調達機関はこの点で一切の責任を負いません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany

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遺伝学 問題 160 ゲノム編集 CRISPR-Cas9 RNP 変換 性的生殖 菌類 ハンティエラオマネンシス
CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ <em>・ハンティエラオマネンシス</em>
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Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).

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