Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61367
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology, University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Summary

Het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem is een gebruiksvriendelijke genoomeditor die is gebruikt in model- en niet-modelsoorten. Hier presenteren we een eiwit-gebaseerde versie van dit systeem dat werd gebruikt om een voortijdige stop codon te introduceren in een paring gen van een niet-model filamenteuze ascomycete schimmel.

Abstract

Het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem is een moleculair instrument dat kan worden gebruikt om nauwkeurige veranderingen in te voeren in de genomen van zowel model- als niet-modelsoorten. Deze technologie kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van genoom bewerking benaderingen, van gen knock-outs en knockins om meer specifieke veranderingen, zoals de invoering van een paar nucleotiden op een gerichte locatie. Genoombewerking kan worden gebruikt voor een veelheid aan toepassingen, waaronder de gedeeltelijke functionele karakterisering van genen, de productie van transgene organismen en de ontwikkeling van diagnostische instrumenten. In vergelijking met eerder beschikbare genbewerkingsstrategieën is aangetoond dat het CRISPR-Cas9-systeem eenvoudig te vestigen is bij nieuwe soorten en beschikt over een hoge efficiëntie en specificiteit. De belangrijkste reden hiervoor is dat het bewerkingsinstrument een RNA-molecuul gebruikt om het gen of de volgorde van interesse te targeten, waardoor het ontwerp van doelmolecuuls eenvoudig wordt gemaakt, gezien het feit dat standaard basiskoppelregels kunnen worden uitgebuit. Net als bij andere genoombewerkingssystemen vereisen crispr-cas9-gebaseerde methoden ook efficiënte en effectieve transformatieprotocollen en toegang tot sequentiegegevens van goede kwaliteit voor het ontwerp van de targeting RNA- en DNA-moleculen. Sinds de invoering van dit systeem in 2013, is het gebruikt om een verscheidenheid aan modelsoorten genetisch te engineeren, waaronder Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster en Mus musculus. Vervolgens hebben onderzoekers die werken aan niet-modelsoorten gebruik gemaakt van het systeem en het gebruikt voor de studie van genen die betrokken zijn bij processen die zo divers zijn als secundair metabolisme bij schimmels, nematodegroei en ziekteresistentie bij planten, onder vele anderen. Dit onderstaande protocol beschrijft het gebruik van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingsprotocol voor de afbouw van een gen dat betrokken is bij de seksuele cyclus van Huntiella omanensis, een filamenteuze ascomycete schimmel die behoort tot de Ceratocystidaceae familie.

Introduction

De toenemende beschikbaarheid van hoogwaardige, volledig geassembleerde genomen en transcriptomen heeft het vermogen om een breed scala aan biologische processen in een reeks organismen te bestuderen sterk verbeterd1. Dit geldt zowel voor modelsoorten als voor niet-modelsoorten, waarvan er vele een meer divers begrip van biologische processen kunnen bieden. Dit soort gegevens kunnen worden gebruikt voor genontdekking, de identificatie van transcriptienetwerken en zowel hele genoom- als transcriptomevergelijkingen, die elk met hun eigen reeks toepassingen worden geleverd. Echter, terwijl genen worden voorspeld, geannoteerd en putatief gekoppeld aan verschillende functionele trajecten op een nooit eerder gezien tempo, de functionele karakterisering van deze genen blijft achter, beperkt door de moleculaire toolkits beschikbaar voor vele soorten. Dit is met name het geval voor de niet-modelsoorten, waar genomische gegevens relatief eenvoudig te genereren zijn, maar waar verdere moleculaire karakterisering bijna onmogelijk is geweest1,2.

Gedeeltelijke karakterisering van de functies van specifieke genen die belangrijk zijn voor de biologie van schimmelsoorten kan worden bereikt door knock-out- of knock-in-experimenten, gevolgd door fenotypische analyse van de gemuteerde stammen3. Deze twee systemen zijn volledig afhankelijk van de beschikbaarheid van protocollen voor genetische manipulatie, waaronder minimaal een transformatiesysteem en een genetisch bewerkingssysteem. Er zijn een aantal verschillende transformatiesystemen die zijn ontwikkeld in een verscheidenheid van filamenteuze schimmels4. Fysieke systemen zoals die welke afhankelijk zijn van biolistica en elektroporatie zijn ontwikkeld in Trichoderma harzianum5 en Aspergillus niger6, respectievelijk. Systemen die gebruik maken van chemische stoffen zoals calciumchloride of lithiumacetaat zijn ontwikkeld in Neurospora crassa7. Ten slotte zijn biologische systemen die afhankelijk zijn van het gebruik van Agrobacterium tumefaciens voor transformatie met succes gebruikt in Ceratocystis albifundus8.

In tegenstelling tot de beschikbaarheid van verschillende transformatieprotocollen zijn genoombewerkingssystemen minder overvloedig. Veel van de traditionele functionele karakterisering experimenten uitgevoerd in filamenteuze schimmels gebruikt een split marker knock-out constructie in de vorm van een selecteerbare marker geflankeerd door regio's van de homologie naar het doelgebied of gen in het genoom3. De methode is gebaseerd op homologie gericht (HR) DNA reparatie, die homologe recombinatie tussen de knock-out constructie en het gebied van belang faciliteiten. Deze recombinatiegebeurtenis resulteert in de vervanging van het gen van belang door de volgorde van de selecteerbare marker. Helaas, terwijl dit succesvol was in vele soorten, waaronder Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 en Grosmannia clavigera12, de tarieven van homologe recombinatie zijn zeer variabel voor verschillende schimmelsoorten, waardoor dit een inefficiënt en soms onbruikbaar protocol in bepaalde soorten3.

Andere genoombewerkingssystemen, waaronder systemen die gebruik maken van zink-vinger nucleases (ZFN's) en transcriptie activator-achtige effector nucleases (TALENs) vertegenwoordigden een grote verbetering ten opzichte van de oudere systemen, met name gezien hun mogelijkheden om specifieke en gerichte veranderingen aan te brengen13. Zowel ZFN's als TALENs bestaan uit een nuclease-eiwit en een eiwit dat in staat is om specifieke nucleotidesequenties13te herkennen. Na herkenning veroorzaakt de nuclease een dubbelstrengs DNA-breuk die de introductie van specifieke mutaties kan vergemakkelijken. Om genoomveranderingen tot stand te brengen, moet het eiwitgebied dat de nucleotidesequentie herkent, specifiek voor elk experiment worden ontworpen. Vanwege deze afhankelijkheid van eiwit-nucleïnezuur interacties om het bewerken, ontwerpen en produceren van de targeting moleculen voor elke knock-out of knockin experiment is moeilijk en arbeidsintensief14,15. Illustratief voor deze uitdagingen, zeer weinig filamenteuze schimmels zijn onderworpen aan genoom bewerken met behulp van deze systemen. Een voorbeeld is de TALENs-gebaseerde systeem dat werd ontwikkeld in de rijst blast schimmel, Magnaporthe oryzae16.

Misschien wel de grootste revolutie op het gebied van genoombewerking was de ontdekking en daaropvolgende ontwikkeling van het CRISPR-Cas9-systeem, een genoomeditor die het doel biedt voor het beoogde decolleté van een reeks van belang door een endonuclease die wordt geleid door een RNA-molecuul. Dit was een enorme verbetering ten opzichte van de eerder ontwikkelde genoomeditors die zich baseerden op eiwit-nucleïnezuurinteracties, omdat het grote voordeel van het CRISPR-Cas9-systeem is dat het afhankelijk is van een RNA-molecuul om zich te richten op de regio van belang. Dit betekent dat het systeem afhankelijk is van een RNA-DNA-interactie en dus standaard base pairing regels kunnen worden benut bij het ontwerpen van elk experiment15.

Het CRISPR-Cas9 systeem zoals hier beschreven bestaat uit drie belangrijke componenten: een enkele gids RNA (sgRNA), het Cas9 enzym en een donor DNA (dDNA)17. De sgRNA is samengesteld uit een 20 nucleotide regio genaamd de protospacer evenals een langere regio genaamd de steiger18. Het protospacer-gebied wordt gebruikt om het bewerkingssysteem naar het doelgebied te leiden en wordt dus voor elk experiment opnieuw ontworpen. Het schavot is het gebied van RNA dat zich fysiek bindt aan het Cas9 enzym om het ribonucleoprotein (RNP) te vormen en is dus identiek, ongeacht het te richten gebied. Het Cas9 enzym vergemakkelijkt fysiek het decolleté van het doel-DNA, met behulp van de protospacer als een gids om deze regio te identificeren19. Het laatste onderdeel, de dDNA, is optioneel en het gebruik ervan is afhankelijk van het specifieke experiment20. De dDNA herbergt de sequentie die specifiek moet worden ingevoegd in het gebied wordt gesneden door de Cas9 enzym, en is dus ideaal voor gen knockin experimenten waar een gen wordt geïntroduceerd in het genoom of voor gen knock-out experimenten waar een antibioticaresistentie gen of andere selecteerbare marker wordt geïntroduceerd ter vervanging van het gen van belang. De dDNA kan ook zodanig worden ontworpen dat nieuwe sequenties in het genoom worden geïntroduceerd. Zoals hieronder beschreven, is het bijvoorbeeld mogelijk om een in-frame stop codon in een bepaalde regio in te voeren in het gen van belang wanneer een genafruncation vereist is21. Andere toepassingen zijn de mutatie van specifieke gebieden van het gen, zoals een functioneel domein22, of de invoering van een tagging sequentie23.

Een groot voordeel van het gebruik van het CRISPR-Cas9 systeem is de veelzijdigheid24. Een voorbeeld van dit aanpassingsvermogen is dat het Cas9-enzym in een van de drie vormen- DNA, RNA of eiwit- in de gastheercel kan worden geïntroduceerd, afhankelijk van het specifieke transformatiesysteem dat wordt gebruikt. Wanneer het cas9-gen in DNA-vorm wordt geïntroduceerd, wordt het vaak opgenomen op een plasmid, samen met een selecteerbare marker, een cassette om het sgRNA uit te drukken en, indien nodig, een cassette die de dDNA-sequentie25codeert. Het belangrijkste voordeel van dit systeem is dat slechts één constructie in de cel moet worden omgezet en een succesvolle transformatie zorgt ervoor dat alle noodzakelijke componenten voor CRISRP-Cas9-gemedieerde genoombewerking aanwezig zijn. Deze methode is echter afhankelijk van de beschikbaarheid van een expressiesysteem voor de gastsoort. Om cas9 succesvol DNA-schade te laten veroorzaken, moet deze op hoog niveau worden uitgedrukt en is dus een geschikte en potentieel specifiek-specifieke promotor vereist. Voor niet-modelsoorten waar dergelijke promotors nog niet zijn ontwikkeld, kan dit een afbreuk doen aan de factor en dus kan de mogelijkheid om Cas9 in RNA- of eiwitvorm in te voeren een aantrekkelijkere optie zijn. De introductie van RNA in de cel brengt zijn eigen uitdagingen- in het bijzonder in dat RNA onstabiel is en het transformatieproces niet kan overleven. Bovendien kan het zijn dat de Cas9-gensequentie, wanneer deze in DNA- of RNA-vorm wordt geïntroduceerd, codon-geoptimaliseerd moet worden voor gebruik in het specifieke hostsysteem17. Het cas9-gen van Streptococcus pyogenes werkt bijvoorbeeld mogelijk niet in een zoogdierhostcel en een cas9-gen dat is codon-geoptimaliseerd voor gebruik in een zoogdiercel werkt mogelijk niet in een plantencel. Al deze uitdagingen kunnen worden overwonnen met behulp van de eiwitvorm van Cas9, die samen met het sgRNA kan worden geassembleerd in een RNP en kan worden omgezet in de gastheercel26,27. Dit systeem is niet afhankelijk van een endogene expressie systeem of codon optimalisatie en moet dus werken in de meerderheid van de niet-model soorten. Het nadeel van het eiwitgebaseerde systeem is dat het niet compatibel is met op DNA gebaseerde transformatiesystemen zoals Agrobacterium-gemedieerdeoverdracht. Om de eiwitgebaseerde methode te laten werken, moet dus een transformatieprotocol beschikbaar zijn, zoals dat welke afhankelijk zijn van protoplasten of biolistica. Dit RNP-gebaseerde systeem is met succes gebruikt in de filamenteuze schimmels, Fusarium oxysporum26 en Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, een lid van de Ceratocystidaceae familie, is een kosmopolitische schimmel vaak gevonden op vers gewonde houtachtige planten28. Hoewel er voor deze soort28, 29,30 , geen transformatie- of genoombewerkingsprotocollen beschikbaar zijn voor deze soort 28 ,29,30, zijn er geen transformatie- of genoombewerkingsprotocollen ontwikkeld. Tot op heden heeft het onderzoek naar H. omanensis zich gericht op de onderliggende genetische componenten van de seksuele cyclus29,31. Deze schimmel vertoont een typische heterothalische seksuele cyclus, waarbij seksuele voortplanting uitsluitend optreedt tussen isolaten van de MAT1-1 en MAT1-2 paringstypes31. Daarentegen zijn MAT1-2 isolaten van de nauw verwante Huntiella moniliformis in staat om onafhankelijke seksuele voortplanting te voltooien en een seksuele cyclus te voltooien bij afwezigheid van een MAT1-1 partner31. Dit verschil in seksuele vermogens wordt verondersteld te zijn, althans gedeeltelijk, te wijten aan een groot verschil in het paringsgen, MAT1-2-7, waar H. omanensis herbergt een volledige lengte en intacte kopie, terwijl het gen ernstig wordt afgekapt in H. moniliformis29,31. Om de rol van dit gen in de seksuele voortplanting verder te karakteriseren, werd het MAT1-2-7 gen van H. omanensis afgekapt om de truncation in H. moniliformis21na te bootsen.

Het onderstaande protocol beschrijft de transformatie van H. omanensis en de afbouw van het MAT1-2-7 gen met behulp van een eiwitgebaseerde versie van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem. Dit protocol werd ontwikkeld nadat de benaderingen van homologe recombinatiegebaseerde genvervanging en plasmid-gebaseerde CRISPR-Cas9 genoombewerking niet succesvol waren.

Protocol

1. Ontwerp en synthese van het sgRNA

  1. Om potentiële protospacer-regio's te identificeren die deel zullen uitmaken van het sgRNA, doorzoekt u handmatig het gen-van-belang voor 5' NGG 3' drieling, met behulp van de zoekfunctie in welk programma wordt gebruikt. Annoteren deze drieling als PAM sequenties.
    OPMERKING: Er zijn verschillende softwareprogramma's beschikbaar die de potentiële PAM- en protospacer-sequenties zoeken en annoteren.
    1. Selecteer de 20 bp stroomopwaarts van elk van de geïdentificeerde PAM sequenties en annoteren deze sequenties als potentiële protospacers.
  2. Als u wilt beslissen over één protospacer, voert u de volgende filterstappen uit om reeksen van lage kwaliteit te verwijderen.
    1. Om te testen op de specificiteit van de potentiële protospacers, combineer de PAM sequentie en protospacer in een enkele sequentie en gebruik het als een BLASTn-query tegen het hele genoom. Gooi protospacers die gelijkenis vertonen met een andere regio in het genoom dan het doelgebied(figuur 1A).
    2. Om ervoor te zorgen dat het RNA-molecuul in de juiste 3D-structuur vouwt voor binding aan het Cas9-enzym, maakt u een gecombineerde sequentie met inbegrip van de protospacer en de steigersequentie die specifiek is voor het Cas9-enzym.
      1. Upload elk van de gecombineerde protospacer-steigersequenties in een RNA secundaire structuurvoorspellingstool(Tabel van materialen).
      2. Analyseer de resultaten door het vergelijken van de minimale vrije energie en centroid secundaire structuren.
        LET OP: Ideale protospacer kandidaten hebben identieke minimale vrije energie en centroid secundaire structuren. Beide secundaire structuren moeten bestaan uit drie stengellussen, onderbroken door vijf ringstructuren. De structuren moeten ook gedurende de gehele structuur hoge bindende waarschijnlijkheden (rood) vertonen, met uitzondering van het gebied dat de protospacer vertegenwoordigt (figuur 1B). De werkelijke energiewaarden zijn niet relevant.
    3. Kies een definitieve kandidaat uit degenen die de bovenstaande filterstappen hebben doorstaan door de kandidaat te selecteren die het dichtst bij de specifieke regio ligt die het doelwit is.
  3. Om het sgRNA te synthetiseren als een enkel RNA-molecuul, gebruikt u een sgRNA-synthesekit(Table of Materials) die compatibel is met het specifieke Cas9-enzym dat zal worden gebruikt (bijvoorbeeld Cas9 van Streptococcus pyogenes).
    OPMERKING: De volgende stappen kunnen afhankelijk zijn van de gebruikte sgRNA-synthesekit. In het geval dat een andere kit wordt gebruikt, volg de instructies van de fabrikant. Als alternatief kan de sgRNA vooraf gesynthetiseerd worden besteld. Gebruik bij het werken met RNA nuclease-vrije reagentia en disposables.
    1. Als de 20 bp protospacer gekozen in stap 1.3 hierboven niet haven een G aan het einde van 5 ', voeg een G aan deze regio.
    2. Voeg de T7 promotor sequentie toe aan het 5' einde van de doelreeks. Deze sequentie is standaard en is 5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3'.
    3. Voeg een overlapvolgorde van 14 nt toe aan het einde van 3 van de doelreeks. Deze volgorde is kit-specifiek en is 5 'GTTTTAGAGCTAGA 3' voor de kit die hier wordt gebruikt.
    4. Bestel het resulterende fragment 5' TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, met (N)20 die de geselecteerde protospacer presynthesized(Table of Materials)vertegenwoordigt.
    5. Combineer volgens het protocol van de fabrikant (Tabel van materialen)de volgende reagentia bij kamertemperatuur: 2 μL water, 10 μL reactiebuffer, 5 μL gesynthetiseerde protospacer-sequentie, 1 μL van 0,1 M DTT en 2 μL transcriptaseenzym.
    6. Broed deze oplossing in op 37 °C gedurende 30 minuten en breng over op ijs.
    7. Voeg 30 μL water en 2 μL DNase I toe, meng en broed nog 15 minuten bij 37 °C.
    8. Visualiseer de resulterende sgRNA op een 2% agarose gel.

2. Het testen van de in vitro Decolleté Vermogen van het sgRNA

OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar wordt aanbevolen.

  1. Ontwerp primers die een fragment zal versterken dat de volgorde van de site herbergt die het gekozen sgRNA zal targeten en versterken met behulp van een standaard DNA polymerase.
    OPMERKING: Ontwerp indien mogelijk de primers zodanig dat het decolleté op de doellocatie twee fragmenten van zeer verschillende afmetingen zal produceren die gemakkelijk van elkaar kunnen worden onderscheiden op een standaard agarosegel.
  2. Monteer de gecombineerde sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) door een oplossing uit te broeden bestaande uit 30 nM sgRNA zoals hierboven gesynthetiseerd, 30 nM Cas9 eiwit, 10x reactiebuffer en 10 μL water bij 25 °C gedurende 10 minuten.
  3. Test het decolletévermogen van het sgRNA door het PCR-product van het doelgebied toe te voegen aan de RNP-oplossing aan een uiteindelijke concentratie van 3 nM.
    1. Broed de oplossing 15 min op 37 °C.
    2. Voeg 3 μg proteinase K en 2 μg RNase toe aan de oplossing om de decolletéreactie te stoppen en 10 minuten bij kamertemperatuur in te broeden.
    3. Visualiseer de resulterende DNA-fragmenten op een 2% agarose gel. Het sgRNA is geschikt voor in vivo experimenten als twee banden van de verwachte grootte op de gel worden waargenomen.

3. Ontwerp en synthese van de dDNA

  1. Ontwerp de dDNA die bestaat uit drie regio's: 5' en 3' regio's met een aanvulling op de beoogde genomische regio en een middengebied met een selecteerbare markering (Tabel van materialen, figuur 2).
    OPMERKING: Andere specifieke sequenties kunnen ook worden toegevoegd aan deze selecteerbare markering. Voor dit specifieke experiment werd vlak voor de selecteerbare marker een stopcodonsequentie (5' TGA 3') toegevoegd, waardoor een in-frame stop codon in het gen werd geïntroduceerd. De dDNA kan vooraf gesynthetiseerd worden besteld. Als alternatief kan de dDNA worden versterkt en geassembleerd met behulp van een stapsgewijze, overlappende PCR-benadering zoals hieronder beschreven.
    1. Ontwerp primers te versterken ongeveer 800 bp van de 5 'en 3 'flankerende regio's. Voeg 20 nt sequentie toe die complementair is aan de volgorde van de selecteerbare marker aan de reverse primer van de 5 regio en de voorwaartse primer van 3 regio.
    2. Ontwerp primers die de selecteerbare marker versterken, ervoor te zorgen dat het versterkte product herbergt de weerstand gen evenals een promotor bekend om te werken in de soorten van belang.
  2. Met behulp van een high-fidelity DNA polymerase (Tabel van materialen), versterken de drie dDNA regio's. Versterk de 5' en 3' regio's uit de gDNA van het organisme dat wordt bewerkt. Versterk de selecteerbare markering uit een relevante bron.
    1. Combineer in één reactie het versterkte 5'-gebied met de selecteerbare marker en versterk met behulp van een lange-afstands,high-fidelity DNA polymerase' de hele regio.
    2. Combineer in een tweede enkele reactie het versterkte 3'-gebied met de selecteerbare marker en versterk met behulp van een lange-afstands,high-fidelity DNA polymerase, de hele regio.
    3. Combineer ten slotte de twee voorgaande PCR-producten in één reactie en versterk de hele dDNA-sequentie met een lange-afstands-DNA-polymerase met een hoge- en hoge-getrouwheids-DNA-polyase.
    4. Visualiseer het DNA-fragment op een 1% agarose gel. In het geval dat twee of meer fragmenten worden geproduceerd, zuiveren de juiste grootte fragment van de gel met behulp van een gel zuivering kit.

4. Extractie van protoplasten

  1. Voor de productie van conidia, inenting 200 mL verse 2% mout extract bouillon (MEB) in een 500 mL kolf met een 1 cm x 1 cm mycelia bedekte agar blok.
    LET OP: Niet alle schimmels zijn in staat om conidia te produceren. In dat geval kan mycelia ook worden gebruikt. Dit vereist doorgaans hogere concentraties lysing enzym verder in het protocol.
    1. Broed de vloeibare cultuur in een schuddende couveuse bij 25 °C met schudden bij 120 rpm voor 24 - 48 uur.
      LET OP: Deze incubatietijd en temperatuur zijn geoptimaliseerd voor H. omanensis. Dit zal moeten worden geoptimaliseerd voor andere soorten.
    2. Om de conidia te oogsten; filter de vloeibare cultuur door een laag steriele laboratoriumdoek (bijvoorbeeld Miracloth), breng de conidiale suspensie over in 50 mL centrifugebuizen en centrifuge bij 3.220 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Gooi de supernatant weg.
    3. Resuspend de conidia in 5 mL water en pipet 10 μL van de conidia oplossing op een microscoop schuif en dek af met een coverslip. Visualiseer met behulp van een samengestelde microscoop onder 40x vergroting om ervoor te zorgen dat alleen conidia zijn teruggewonnen (figuur 3A).
    4. In een kolf van 500 mL intuleer 200 mL verse 1% MEB met het totale volume van de geresuspended conidia.
    5. Broed de vloeibare cultuur in een schuddende couveuse bij 25 °C met schudden bij 120 rpm voor maximaal 12 uur.
      LET OP: Deze incubatietijd is geoptimaliseerd voor H. omanensis. Dit zal moeten worden geoptimaliseerd voor andere soorten.
    6. Om de kiemlingen te oogsten, breng je de vloeibare cultuur over in 50 mL centrifugebuizen en centrifuge bij 3.220 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg.
    7. Resuspend de kiemlingen in maximaal 10 mL van 1 M sorbitol.
    8. Pipette 10 μL van de kiemoplossing op een microscoopdia en dek af met een coverslip. Visualiseer met behulp van een samengestelde microscoop onder 40x vergroting om ervoor te zorgen dat alleen kiemlingen zijn teruggevonden (figuur 3B).
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar kiemlingen in 1 M sorbitol bij -80 °C.
  2. Om de celwanden van de jonge kiemlingen te lyseren en de protoplasten vrij te geven, voegt u 1 ml van de kiemsussuspensie toe aan 9 mL lyserend enzym in verschillende concentraties in een steriele kolf van 50 mL.
    OPMERKING: Er worden verschillende enzymconcentraties en incubatietijden gebruikt en zijn te vinden in tabel 1. De enzymen en concentraties zijn ook waarschijnlijk variëren afhankelijk van de schimmel en zal moeten worden geoptimaliseerd voor elke soort.
    1. Broed de sporen-enzymoplossing in een schuddende couveuse bij 25 °C met 80 rpm voor 2 tot 3 uur.
    2. Filtreer de protoplastoplossing door een laag steriel laboratoriumdoek en verzamel de protoplasten door centrifugatie bij 1.810 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg.
      OPMERKING: Protoplasten zijn cellen zonder celwanden en zijn dus zeer gevoelig voor mechanische verstoring. Zorg ervoor dat ze zorgvuldig te behandelen, vooral bij pipetten.
    3. De protoplastpellet zorgvuldig opnieuw op te zetten in 200 μL STC-buffer(Tabel van materialen).
    4. Pipette 10 μL van de protoplastoplossing op een microscoopdia en dek af met een coverslip. Visualiseer met behulp van een samengestelde microscoop onder 40x vergroting om ervoor te zorgen dat alleen protoplasten zijn teruggevonden(figuur 3C).
    5. Met behulp van een hemocytometer, tellen en berekenen van het aantal protoplasten gegenereerd in de bovenstaande stappen. Verdun de protoplastoplossing tot aliquoten die ongeveer 5 x 106 protoplasten bevatten.
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar protoplasten in STC-buffer bij -80 °C.

5. Protoplast en PEG-ondersteunde transformatie en transformatief herstel

  1. Om de transformatie te beginnen, combineer ongeveer 5 x 106 protoplasten met een enkel volume van de RNP-oplossing en ongeveer 6 μg van het dDNA-fragment.
    LET OP: Protoplasten zijn zeer gevoelig voor mechanische verstoring. Zorg ervoor dat ze zorgvuldig te behandelen, vooral bij pipetten.
    1. Druppel met behulp van een pipet 1 mL van een vers bereide 30% PTC-oplossing langzaam op de protoplastoplossing en incubeer de oplossing 20 minuten bij kamertemperatuur.
      LET OP: Deze stap is een gevoelige en zeer belangrijke stap. Zorg ervoor dat u vers bereide PTC-oplossing gebruikt en laat de oplossing zo langzaam en gelijkmatig mogelijk over de cellen vallen, waardoor een hydrofobe laag over het celoppervlak ontstaat.
    2. Voeg 5 mL osmotisch controlemedium (OCM) toe aan de protoplastoplossing en pipet langzaam en voorzichtig om ervoor te zorgen dat de oplossing grondig wordt gemengd.
    3. Broed de protoplastoplossing in een schuddende couveuse bij 25 °C met schudden bij 80 rpm 's nachts.
  2. Als u de getransformeerde isolaten wilt selecteren, verdeelt u de oplossing in 5 lege 60 mm kweekplaten.
    1. Voeg 10 mL OCM agar toe aangevuld met 30 μg/mL hygromycine B aan elke kweekplaat en draai elke plaat langzaam om grondig te mengen.
    2. Laat de eerste laag agar instellen voordat u 10 mL osmotisch controlemedium agar toevoegt, aangevuld met 40 μg/mL hygromycine B.
    3. Laat de tweede laag van agar de culturen op 25 °C instellen en uitbroeden totdat enkele isolaten door beide lagen agar kunnen groeien.
  3. Om met succes getransformeerde isolaten te herstellen, breng je de individuele isolaten die kunnen groeien door de agarlaag aangevuld met 40 μg/mL hygromycine B over naar verse moutextract agar (MEA) platen aangevuld met 50 μg/mL hygromycine B (MEA-50).
    1. Broed de verse culturen 5 dagen lang uit op 25 °C en controleer dagelijks op groei. Culturen die in staat zijn om groei op deze media te ondersteunen zijn met succes getransformeerd en kunnen worden gebruikt voor verdere studie.

6. Bevestiging van de integratie en stabiliteit van de dDNA

  1. Om te bevestigen dat de dDNA is geïntegreerd in het genoom in het doelgebied, ontwerpt u primers die de voorspelde 5' en 3' wisselplaatplaatsen flankeren (figuur 2).
    1. Voer twee PCR's uit met behulp van deze twee primersets en een high-fidelity DNA polymerase. Als beide PCR's amplicons van verwachte grootte en volgorde opleveren, is de dDNA met succes geïntegreerd in het doelgebied. Beoordeel vervolgens de gemuteerde vlek op stabiele integratie van de dDNA.
  2. Om te bevestigen dat de dDNA stabiel in het genoom is geïntegreerd en tijdens vegetatieve groei zal worden gehandhaafd, voert u een mediatransfertest uit.
    1. Breng een blok met mycelial bedekte agar over van een actief groeiend mutantenisolaat op MEA-50 medium naar niet-aangevuld MEA-medium. Incubeer bij 25 °C gedurende 3 dagen.
    2. Breng een blok van mycelia bedekte agar van het isolaat groeien op MEA medium naar MEA-50 medium. Incubeer bij 25 °C gedurende 3 dagen.
    3. Herhaal dit proces, het overbrengen van actief groeiende mycelia van aangevuld naar ongesupplementd medium voor ten minste vier rondes.
      OPMERKING: Als het isolaat na vele overdrachten in staat is om na vele overdrachten een duurzame groei op mea-50-medium te houden, is de dDNA stabiel geïntegreerd in het genoom en kan deze worden gehandhaafd door vegetatieve groei. De gemuteerde vlek kan worden beoordeeld op de aanwezigheid van slechts één exemplaar van de geïntegreerde dDNA.
  3. Om te bevestigen dat de dDNA op één locatie in het genoom is geïntegreerd, voert u een zuidelijke vlekanalyse uit.
    1. Verteren in totaal 30 μg gDNA van elke gemuteerde stam met behulp van HindIII en EcoRI restrictieenzymen in overeenstemming met de protocollen van de fabrikant.
      OPMERKING: Terwijl de keuze van de beperking enzym is aan de onderzoeker, ervoor te zorgen dat de beperking enzym de herkenning site is niet aanwezig in de dDNA sequentie.
    2. Scheid de verteerde gDNA op een 0,75% agarose gel en breng het DNA over op een nylon membraan met behulp van standaardprocedures32.
    3. Onderwerp het membraan aan hybridisatie met behulp van een sonde gericht op de dDNA sequentie.
      1. Ontwerp primers om een korte (300 bp) regio van de dDNA te versterken.
      2. Met behulp van deze primers, synthetiseren van de sonde met behulp van een PCR DIG labeling mix.
      3. Gebruik de nieuw gesynthetiseerde sonde voor membraanhybrideisatie, behandeling en visualisatie met behulp van standaardprocedures32. Als slechts één band in elke rijstrook wordt gezien, is de dDNA slechts op één locatie in het genoom aanwezig. De mutant stam kan nu worden gebruikt voor verdere fenotypische analyse en functionele karakterisering experimenten.

7. Fenotypic analyse van de gemuteerde stammen

  1. Voer paringsexperimenten uit om te bepalen of de verstoring van het MAT-gen een effect had op de seksuele vermogens van de schimmel die wordt bestudeerd.
    OPMERKING: Deze stap is afhankelijk van het specifieke gen en de onderzochte soorten. In dit geval wordt het gen dat zich richt beschouwd als betrokken bij seksuele voortplanting en dus paringstests werden uitgevoerd. Als men bijvoorbeeld dacht dat het gen betrokken zou zijn bij de aeksuele voortplanting, dan zou zoiets als conidiale productie gemeten kunnen worden.
    1. Om de heterothalische vermogens van de gemuteerde stam te testen, co-inentuleer verse MEA-medium met een gemuteerde stam en een stam van tegenovergesteld paringstype. In het geval van H. omanensis, houd de deksels van de platen gesloten, maar niet verzegeld en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 7 dagen. Visueel beoordelen voor de productie van seksuele structuren.
    2. Om de homothalische vermogens van de mutantst te testen, inent inenten vers MEA-medium met een gemuteerde stam. In het geval van H. omanensis, houd de deksels van de platen gesloten, maar niet verzegeld en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 7 dagen. Visueel beoordelen voor de productie van seksuele structuren.
  2. Voer groeisnelheidsexperimenten uit om te bepalen of de verstoring van het MAT-gen een effect had op de groeisnelheid van de schimmel die wordt bestudeerd.
    1. Maak mycelial-bedekte agar pluggen van de actief groeiende rand van culturen van de mutant en wildtype stammen door het invoegen van de achterkant van een grote, steriele pipet tip in de agar.
    2. Inenting verse MEA medium met deze agar stekkers. Zorg ervoor dat ten minste drie replica's per elk cultuurtype worden gemaakt.
    3. Na 3 dagen groei bij 20 °C meet u de groei op twee loodrechte diameters.
    4. Vergelijk de gegevens van het wildtype en mutant stammen.

Representative Results

Het hierboven beschreven protocol vergemakkelijkte de introductie van een voortijdige stopcodon in een paringsgen van het niet-model ascomycete, H. omanensis. Dit proces maakte gebruik van een versie van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem en als zodanig is een van de belangrijkste stappen in dit protocol het ontwerp en de synthese van een hoogwaardig sgRNA. Figuur 1 laat zien hoe dit molecuul zo is ontworpen dat het A) specifiek gericht is op het gen van belang en weinig gelijkenis vertoont met andere regio's in het genoom en B) plooien correct om te binden met het Cas9-eiwit. Het sgRNA moet ook in staat zijn om het doelgebied effectief te klijpen. Het vermogen van het sgRNA te richten en zorgen voor het decolleté van het doelgebied werd uitgevoerd in vitro, waardoor twee producten van de verwachte grootte.

Zodra een succesvolle transformatie heeft plaatsgevonden, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de dDNA slechts eenmaal en op de verwachte plaats in het genoom is geïntegreerd. Figuur 2 illustreert het ontwerp van PCR-primers die zich richten op de invoegplaatsen, die kunnen worden gebruikt om de potentiële transformanten voor de juiste integratiesite te screenen. Door primers te ontwerpen die de 5' en 3' invoegplaatsen flankeren, is versterking alleen mogelijk als de dDNA op het juiste gebied wordt geplaatst. Figuur 4 illustreert dat de voortijdige stopcodon in het MAT1-2-7-gen in het juiste leesframe werd opgenomen, zodat het gen op dezelfde manier zou worden afgekapt als dat van H. moniliformis. Bovendien toonde de analyse van de zuidelijke vlek aan dat de dDNA-constructie slechts op één plaats in het genoom werd geïntegreerd.

Het succes van het protocol werd bevestigd na de fenotypische analyse van de mutantstammen. In het geval van het MAT1-2-7 disruptie-experiment werden twee onafhankelijke mutantstammen ontwikkeld. In beide isolaten werd de vegetatieve radiale groei aanzienlijk verlaagd, wat wijst op een pleiotropisch effect van het nieuwe paringsgen (figuur 5). Bovendien waren de mutanten isolaten niet in staat om een seksuele cyclus te voltooien, waardoor alleen onrijpe seksuele structuren werden geproduceerd die geen seksuele sporen produceerden(figuur 5). Dit was in tegenstelling tot wildtype isolaten, die de gehele seksuele cyclus voltooid binnen een paar dagen na incubatie (Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1: Het kiezen van een geschikte sgRNA kandidaat.
(A) Een geschikt sgRNA heeft alleen gelijkenis met het doelgebied van het genoom (in dit geval aangegeven door de MAT locussequentie). (B) Een geschikt sgRNA zal identieke minimale vrije energie en centroid secundaire structuren, met de drie stengel lussen en vijf ringen in de primaire stap lus. Bovendien zal het grootste deel van de structuur hoge bindende waarschijnlijkheden hebben (aangegeven in donkeroranje en rood), terwijl lagere bindende waarschijnlijkheden moeten worden gezien in het protospacer-gebied (aangegeven door de zwarte driehoeken). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Ontwerp, versterking en montage van de dDNA.
De eerste en tweede primerparen (PP1 en PP2) worden gebruikt om ongeveer 800 bp upstream (5') en 800 bp downstream (3') van het be belang gen te versterken. De omgekeerde primer van PP1 en de voorwaartse primer van PP2 omvatten gebieden van de homologie aan de hygromycine weerstand cassette. Het derde primerpaar versterkt de gehele hygromycine weerstandscassette. Stapsgewijs worden de verschillende amplicons geassembleerd totdat de gehele dDNA, bestaande uit de 5' regio, de hygromycine weerstandscassette en 3' regio, is geassembleerd. Wanneer de dDNA in de cel wordt omgezet, moet het opnieuw combineren in de regio waar het Cas9-enzym zal zijn gericht om te snijden, waardoor het gen van belang wordt vervangen door de hygromycine-resistentiecassette. PP4 en PP5 kunnen worden gebruikt om te bepalen of de dDNA correct in het genoom is ingebracht op de juiste locatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: De verschillende celtypen die belangrijk zijn tijdens het protoplastextractieprotocol.
aA) Conidia worden gebruikt als uitgangsmateriaal voor het protocol. Deze conidia mogen ontkiemen en groeien tot ze(B)jonge kiemlingen zijn. De ideale groeifase van de jonge kiemlingen wordt aangegeven door de twee zwarte pijlen. Andere mycelial strengen gezien op (B) zijn te volwassen voor degradatie en mag niet worden gebruikt. De laatste stap van het protocol is het vrijgeven van de (C)ronde protoplasten, aangegeven door de zwarte, gestippelde cirkels. Deze cellen hebben geen celwanden meer en zijn dus zeer gevoelig voor mechanische verstoring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: De succesvolle integratie van de TGA stop codon in het MAT1-2-7 gen van H. omanensis.
(A) Het H. omanensis MAT1-2-7 gen over de volledige lengte, met de sgRNA-doellocatie aangegeven door de groene pijl. (B) Een vergroot schema van de sgRNA-doellocatie binnen het H. omanensis MAT1-2-7-gen. (C) Een vergroot schema van een gebied van de dDNA met de stopcodon geflankeerd door armen homologe aan het MAT1-2-7 gen van H. omanensis. (D) Sanger sequentie chromatogram dat de succesvolle integratie van de stopcodon in het MAT1-2-7-gen aangeeft. Gewijzigd van Wilson et al. 202021. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: De fenotypische verschillen tussen (A) wildtype isolaten en (B) mutant isolaten.
De eerste drie afbeeldingen in elk paneel tonen de verschillen in de seksuele vermogens van de twee isolerende typen. Terwijl de wildtype isolaten volwassen ascomata vormen tijdens de seksuele voortplanting, compleet met de exsudatie van sporen uit de uiteinden van de ascoatale nek, vormen de mutante isolaten alleen onrijpe seksuele structuren die geen seksuele sporen produceren. De vierde afbeelding in elk paneel toont het verschil in groeisnelheid en morfologie van de twee isolaattypen. Terwijl het wildtype isolaat groeit veel sneller en met meer lucht mycelia, de mutant toont langzamer en wordt ondergedompeld in de agar. Gewijzigd van Wilson et al. 202021. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Reactie Enzymconcentratie Degradatietijd
A 1,250 mg/mL 180 min
B 1,875 mg/mL 180 min
C 2.500 mg/mL 150 min
D 3,750 mg/mL 150 min
E 4.375 mg/mL 120 min
F 5.000 mg/mL 120 min

Tabel 1: Afbraak van de kiem-/mycelia-oplossing met lyserende enzymen van Trichoderma harzianum. De verschillende enzymenconcentraties komen overeen met verschillende incubatieperioden, waarbij lagere concentraties langere incubaties vereisen.

Discussion

Het protocol voor de succesvolle transformatie van H. omanensis en het bewerken van het MAT1-2-7 gen werd aangetoond door de invoering van een in-frame premature stop codon samen met een gen voor resistentie tegen hygromycine B21. Dit werd bereikt met behulp van een eiwitgebaseerde versie van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem. Het experiment omvatte de in vitro transcriptie van de sgRNA, PCR-gebaseerde assemblage van de dDNA en de co-transformatie van deze twee nucleïnezuren met een commercieel verkrijgbaar Cas9-enzym in protoplasten gewonnen uit H. omanensis

In tegenstelling tot andere protocollen die afhankelijk zijn van de beschikbaarheid van vele andere moleculaire hulpmiddelen, kan het hierboven beschreven protocol met succes worden gebruikt bij soorten waarvoor de moleculaire gereedschapskist nog steeds vrij beperkt is21. Het protocol is alleen gebaseerd op een gevestigd transformatiesysteem en de beschikbaarheid van NGS-gegevens, bij voorkeur hele genoomsequentie. Hoewel een effectief transformatiesysteem enige optimalisatie kan verduren in een soort waarvoor dit niet beschikbaar is, zijn er veel verschillende protocollen beschikbaar voor een verscheidenheid aan soorten. Bovendien worden genoomgegevens steeds meer beschikbaar voor zelfs de meest obscure soorten en wordt het gemakkelijker om de novo te genereren als deze nog niet bestaat.

Gezien de lengte van het protocol zijn er veel stappen waarop wijzigingen kunnen worden ingevoerd en waar probleemoplossing nodig kan zijn. Dit geldt met name voor de stappen die als soortspecifiek worden beschouwd. Er zijn bijvoorbeeld veel incubatiestappen in dit protocol die moeten worden uitgevoerd bij specifieke temperaturen en gedurende specifieke tijdsduur om celtypen te genereren die belangrijk zijn voor het experiment. Deze stappen zouden dus soortspecifieke optimalisatie vereisen. Waar mogelijk zijn micrografen van de specifieke cellen of groeifasen verstrekt om te helpen bij de overdracht van dit protocol naar een andere soort (Figure 1). Het type en de concentratie van enzymen die worden gebruikt om de celwanden van de schimmelcellen te degraderen om de protoplasten vrij te geven, zullen ook specifiek zijn voor de soorten schimmels die worden bestudeerd. In dit protocol wordt slechts één bron van lysing enzymen gebruikt, terwijl verschillende enzymcombinaties nodig zijn voor de extractie van protoplasten bij soorten zoals Fusarium verticillioides33. Deze stap is volledig afhankelijk van het chemische merk van de celwand en zal dus moeten worden geoptimaliseerd op een soort tot soort basis.

Deze methode is bijzonder belangrijk voor degenen die niet-modelsoorten bestuderen, omdat er geen afhankelijkheid is van een expressiesysteem. Een populaire methode om het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem op te zetten is het cas9-eiwit, het sgRNA en de dDNA uit te drukken van een of twee plasmiden die worden omgezet in de cellen naar keuze. In dit geval moet de Cas9 worden uitgedrukt door een promotor die in staat is hoge niveaus van expressie in het specifieke organisme dat wordt bestudeerd. Algemene promotors zijn ontwikkeld voor gebruik in filamenteuze schimmels en hoewel ze niet compatibel zijn in alle soorten, ze maken een laag niveau expressie en kan met succes worden gebruikt om, bijvoorbeeld, antibioticaresistentie genen uit te drukken. Deze promotors staan echter vaak geen hoge expressieniveaus toe en kunnen dus niet worden gebruikt om het Cas9-eiwit uit te drukken. Met behulp van een eiwitgebaseerde versie van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem overwint deze beperking en kunnen het sgRNA en dDNA samen met een reeds geproduceerd Cas9-enzym in de cel worden omgezet.

De ontwikkeling van dit eiwitgebaseerde systeem voor gebruik in H. omanensis kwam na vele mislukte pogingen tot genoombewerking met behulp van zowel de klassieke split marker benadering als het plasmid-based CRISPR-Cas9 systeem. Hoewel de efficiëntie van soort tot soort verschilt, is de split marker-benadering met succes gebruikt met 100% efficiëntie bij soorten die zo divers zijn als Alternaria alternata34,35en C. nicotianae36. Daarentegen was de efficiëntie van dit systeem in H. omanensis nul, ondanks meer dan 80 onafhankelijke transformatie- en integratiegebeurtenissen. Ook het plasmid-based CRISPR-Cas9-systeem is met succes gebruikt met hoge efficiëntieverbeteringen in Trichoderma reesei (>93%)17 en Penicillium chrysogenum (tot 100%)37. Dit is, nogmaals, in tegenstelling tot het nut van dit systeem in H. omanensis. Voldoende expressie van het Cas9-eiwit was niet haalbaar in H. omanensis ondanks het proberen van een aantal potentiële promotors, waaronder twee soortspecifieke promotors voorspeld van huishoudgenen. Dit systeem kon dus helemaal niet worden gebruikt. Met behulp van de eiwitgebaseerde versie van het CRISPR-Cas9-systeem leverden ze echter veel onafhankelijke transformatoren op, waarvan er twee de geïntegreerde dDNA op de juiste locatie herbergden. Bovendien werd dit experiment slechts één keer geprobeerd en was het succesvol, wat het gemak illustreerde waarmee dit systeem kan worden gebruikt.

Toekomstige toepassingen van dit protocol omvatten de optimalisatie en het gebruik ervan in andere soorten van de Ceratocystidaceae. Er is al een schat aan NGS-gegevens beschikbaar voor deze soorten30,,38,,39 en er zijn studies uitgevoerd met betrekking tot hun gastheerspecificiteit40,groeipercentage en virulentie41. Deze studies kunnen worden versterkt door de functionele karakterisering van de genen waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij deze processen, onderzoek dat nu mogelijk zal worden door de beschikbaarheid van een transformatie- en genoombewerkingsprotocol.

Tot slot wordt grondig onderzoek naar de genen die ten grondslag liggen aan belangrijke biologische processen bij niet-modelsoorten toegankelijker dankzij de beschikbaarheid van gebruiksvriendelijke genoombewerkingsprotocollen die niet afhankelijk zijn van het bestaan van uitgebreide biologische hulpbronnen en moleculaire toolkits. Het bestuderen van niet-modelsoorten wordt steeds gemakkelijker en zal het mogelijk maken om nieuwe paden en interessante afwijkingen van de standaard biologische processen te ontdekken die zijn opgehelderd in modelsoorten.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit project werd ondersteund door de Universiteit van Pretoria, het Department of Science and Technology (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). Het project werd bovendien ondersteund door Prof BD Wingfield's DST/NRF SARChI leerstoel in Fungal Genomics (Grant number: 98353) en Dr AM Wilson's NRF PhD bursary (108548). De subsidiehouders erkennen dat adviezen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit werk worden verwoord, die van de onderzoekers zijn en dat de financieringsorganen in dit opzicht geen enkele aansprakelijkheid aanvaarden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

Genetica Genoombewerking CRISPR-Cas9 RNP Transformaties Seksuele voortplanting Schimmels Huntiella omanensis
CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete <em>Huntiella omanensis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, A. M., Wingfield, B. D.… More

Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter