Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-Cas9-Medierad genomredigering i den fintrådiga Ascomycete Huntiella omanensis

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61367
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology, University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Summary

CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet är en lättanvänd genomredigerare som har använts i modell- och icke-modellarter. Här presenterar vi en proteinbaserad version av detta system som användes för att införa en tidig stopp kodon i en parning gen av en icke-modell fintrådiga ascomycete svamp.

Abstract

CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet är ett molekylärt verktyg som kan användas för att införa exakta förändringar i såväl modells genom som icke-modellarter. Denna teknik kan användas för en mängd olika genomredigeringsmetoder, från genkna knockouts och knockins till mer specifika förändringar som införandet av några nukleotider på en riktad plats. Genomredigering kan användas för en mängd tillämpningar, inklusive delvis funktionell karakterisering av gener, produktion av transgena organismer och utveckling av diagnostiska verktyg. Jämfört med tidigare tillgängliga genredigeringsstrategier har CRISPR-Cas9-systemet visat sig vara lätt att etablera hos nya arter och har hög effektivitet och specificitet. Den främsta orsaken till detta är att redigeringsverktyget använder en RNA-molekyl för att rikta genen eller sekvensen av intresse, vilket gör målmolekyldesignen okomplicerad, med tanke på att standardregler för basparning kan utnyttjas. I likhet med andra genomredigeringssystem kräver CRISPR-Cas9-baserade metoder också effektiva och effektiva omvandlingsprotokoll samt tillgång till sekvensdata av god kvalitet för utformningen av inriktnings-RNA- och DNA-molekylerna. Sedan införandet av detta system i 2013, Det har använts för att genetiskt ingenjör en mängd olika modellarter, inklusive Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster och Mus musculus. Därefter har forskare som arbetar med icke-modellarter tagit vara på systemet och använt det för studier av gener som är involverade i så skilda processer som sekundär metabolism i svampar, nematodtillväxt och sjukdomsresistens hos växter, bland många andra. Detta protokoll som beskrivs nedan beskriver användningen av CRISPR-Cas9 genomet redigering protokollet för trunkering av en gen som deltar i den sexuella cykeln av Huntiella omanensis, en fintrådig ascomycete svamp som tillhör Ceratostidaceae familjen.

Introduction

Den ökande tillgången på högkvalitativa, helt monterade genom och transkriptomer har avsevärt förbättrat förmågan att studera en mängd olika biologiska processer i en rad organismer1. Detta gäller både modellarter och icke-modellarter, av vilka många kan erbjuda en mer varierad förståelse av biologiska processer. Dessa typer av data kan användas för genupptäckt, identifiering av transkriptionsnätverk och både hela genom- och transkriptomjämförelser, som alla kommer med sin egen uppsättning applikationer. Men medan gener förutspås, kommenterade och förmodade kopplade till olika funktionella vägar i en aldrig tidigare sett takt, den funktionella karakterisering av dessa gener kvar, begränsas av de molekylära verktygslådor som finns för många arter. Detta gäller särskilt för de icke-modellarter, där genomiska data är relativt lätta att generera men där ytterligare molekylär karakterisering har varit nära omöjligt1,2.

Partiell karakterisering av funktionerna hos specifika gener som är viktiga för biologin hos svamparter kan uppnås genom antingen knockout- eller knockin-experiment följt av fenotypisk analys av de muterade stammarna3. Dessa två system är helt beroende av att det finns gentekniska protokoll, som åtminstone omfattar ett omvandlingssystem och ett genetiskt redigeringssystem. Det finns ett antal olika omvandlingssystem som har utvecklats i en mängd filamentösa svampar4. Fysiska system som de som är beroende av biolistics och elektroporation har utvecklats i Trichoderma harzianum5 och Aspergillus niger6, respektive. System som utnyttjar kemikalier som kalciumklorid eller litiumacetat har utvecklats i Neurospora crassa7. Slutligen har biologiska system som är beroende av användning av Agrobacterium tumefaciens för omvandling framgångsrikt använts i Ceratocystis albifundus8.

I motsats till tillgången på olika omvandlingsprotokoll är genomredigeringssystemen mindre rikliga. Många av de traditionella funktionella karakterisering experiment som utförs i fintrådiga svampar utnyttjas en delad markör knockout konstruera i form av en valbar markör flankerad av regioner av homologi till målet regionen eller genen i arvsmassan3. Metoden bygger på homologi riktad (HR) DNA reparation, som anläggningar homologa rekombination mellan knockout konstruktion och den region av intresse. Denna rekombination händelse resulterar i ersättning av genen av intresse med sekvensen av den valbara markören. Tyvärr, medan detta var framgångsrik i många arter inklusive Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 och Grosmannia clavigera12, frekvensen av homolog rekombination är mycket varierande mellan olika svamparter, vilket gör detta till en ineffektiv och ibland oanvändbara protokoll i vissa arter3.

Andra genomredigeringssystem, inklusive de som använder sig av zink-finger nukleaser (ZFNs) och transkription activator-liknande effektor nukleaser (TALENs) utgjorde en stor förbättring på de äldre systemen, särskilt med tanke på deras förmåga att göra specifika och riktade förändringar13. Både ZFNs och TALENs består av ett nukleasprotein och ett protein som kan känna igen specifika nukleotidsekvenser13. Vid erkännande inducerar nukleas en dubbel strandade DNA-brytning som kan underlätta införandet av specifika mutationer. För att få till stånd genomförändringar måste proteinregionen som känner igen nukleotidsekvensen vara särskilt utformad för varje experiment. På grund av denna tillit till protein-nukleinsyra interaktioner för att styra redigering, utforma och producera målmolekyler för varje knockout eller knockin experiment är svårt ocharbetsintensiva 14,15. Belysande av dessa utmaningar, mycket få fintrådiga svampar har utsatts för genomet redigering med hjälp av dessa system. Ett exempel är DET TALENs-baserade systemet som utvecklades i risblästringssvampen, Magnaporthe oryzae16.

Förmodligen den största revolutionen på området för genomredigering var upptäckten och den efterföljande utvecklingen av CRISPR-Cas9-systemet- en genomredigerare som möjliggör riktad klyvning av en sekvens av intresse av en endonuclease som styrs av en RNA-molekyl. Detta var en enorm förbättring jämfört med de tidigare utvecklade arvsmassa redaktörer som förlitade sig på protein-nukleinsyra interaktioner som den stora fördelen med CRISPR-Cas9 systemet är att den bygger på en RNA-molekyl för att rikta den region av intresse. Detta innebär att systemet bygger på en RNA-DNA-interaktion och därmed kan standardbasparningsregler utnyttjas vid utformningen av varje experiment15.

CRISPR-Cas9-systemet som beskrivs här består av tre viktiga komponenter: en enda guide RNA (sgRNA), Cas9-enzymet och ett donator-DNA (dDNA)17. SgRNA består av en 20 nukleotidregion som kallas protospaceren as well as en längre region som kallas scaffolden18. Regionen protospacer används för att styra redigeringssystemet till målregionen och är därmed omgjord för varje experiment. Byggnadsställningen är den region av RNA som fysiskt binder till Cas9-enzymet för att bilda ribonukleoprotein (RNP) och är därmed identisk oavsett vilken region som ska riktas. Cas9-enzymet underlättar fysiskt klyvningen av mål-DNA, med hjälp av protospacern som en vägledning för att identifiera denna region19. Den sista komponenten, dDNA, är valfri och dess användning beror på det särskilda experimentet20. DDNA hyser den sekvens som specifikt bör införas i regionen som skärs av Cas9-enzymet, och är därmed idealisk för genknackningsexperiment där en gen införs i genomet eller för genknackningsexperiment där en antibiotikaresistensgen eller annan valbar markör införs för att ersätta den gen som är intresserad. DDNA kan också utformas på ett sådant sätt att nya sekvenser införs i arvsmassan. Till exempel, som beskrivs nedan, är det möjligt att införa en in-frame stop kodon i en viss region i genen av intresse när en gen trunkering krävs21. Andra tillämpningar inkluderar mutation av specifika regioner i genen, såsom en funktionell domän22, eller införandet av en taggning sekvens23.

En stor fördel med att använda CRISPR-Cas9-systemet är dess mångsidighet24. Ett exempel på denna anpassningsförmåga är att Cas9-enzymet kan introduceras i värdcellen i en av dess tre former- DNA, RNA eller protein- beroende på det särskilda omvandlingssystem som används. När den introduceras i DNA-form, ingår ofta cas9 genen på en plasmid tillsammans med en valbar markör, en kassett för att uttrycka sgRNA och, om nödvändigt, en kassett som kodar dDNA-sekvensen25. Den primära fördelen med detta system är att endast en enda konstruktion behöver omvandlas till cellen och framgångsrik omvandling säkerställer att alla nödvändiga komponenter för CRISRP-Cas9-medierad genomredigering är närvarande. Denna metod bygger dock på tillgängligheten av ett uttryckssystem för värdarten. För att Cas9 framgångsrikt ska kunna framkalla DNA-skador måste den uttryckas på höga nivåer, och därför krävs en lämplig och potentiellt specifik promotor. För icke-modellarter där sådana promotorer ännu inte har utvecklats kan detta vara en förringande faktor och därmed kan förmågan att införa Cas9 i RNA- eller proteinform vara ett mer attraktivt alternativ. Införandet av RNA i cellen ger sina egna utmaningar- särskilt i att RNA är instabil och kanske inte överlever omvandlingsprocessen. När den införs i antingen DNA- eller RNA-form kan gensekvensen i Cas9 dessutom behöva kodonoptimerad för användning i det särskilda värdsystemet17. Till exempel kan det hända att cas9-genen från Streptococcus pyogenes inte fungerar i en värdcell för däggdjur och en cas9-gen som har kodonoptimerats för användning i en däggdjurscell kanske inte fungerar i en växtcell. Alla dessa utmaningar kan övervinnas med hjälp av proteinformen av Cas9, som tillsammans med sgRNA kan sättas ihop till en RNP och omvandlas tillvärdcellen 26,27. Detta system är inte beroende av något endogent uttryckssystem eller kodonoptimering och bör därmed fungera i majoriteten av icke-modellarter. Nackdelen med det proteinbaserade systemet är att det inte är kompatibelt med DNA-baserade transformationssystem som Agrobacterium-medierad överföring. För att den proteinbaserade metoden ska fungera måste alltså ett transformationsprotokoll som de som förlitar sig på protoplaster eller biolistics finnas tillgängligt. Detta RNP-baserade system har framgångsrikt använts i de fintrådiga svamparna, Fusarium oxysporum26 och Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, en medlem av Ceratocystidaceae familjen, är en kosmopolitisk svamp ofta finns på nyligen sårade vedartadeväxter 28. Medan gendata av hög kvalitet och transkriptom finns tillgängliga för denna art28,29,30, har ingen omvandling eller genomredigeringsprotokoll utvecklats. Hittills har forskning om H. omanensis fokuserat på de underliggande genetiska komponenterna i sin sexuella cykel29,31. Denna svamp uppvisar en typisk heterothallic sexuell cykel, med sexuell reproduktion sker uteslutande mellan isolat av MAT1-1 och MAT1-2 parning typer31. Däremot ÄR MAT1-2 isolat av den närbesläktade Huntiella moniliformis kan oberoende sexuell reproduktion och slutföra en sexuell cykel i avsaknad av en MAT1-1 partner31. Denna skillnad i sexuella förmåga tros vara, åtminstone delvis, på grund av en stor skillnad i parning genen, MAT1-2-7, där H. omanensis hamnar en full längd och intakt kopia, medan genen är allvarligt trunkeras i H. moniliformis29,31. För att ytterligare karakterisera den här genens roll i sexuell reproduktion, avkortades MAT1-2-7-genen av H. omanensis för att efterlikna den trunkering som sågs i H. moniliformis21.

Protokollet nedan beskriver omvandlingen av H. omanensis och trunkering av MAT1-2-7 genen med hjälp av en proteinbaserad version av CRISPR-Cas9 genomet redigeringssystem. Detta protokoll har utvecklats efter att tillvägagångssätten för homolog rekombination-baserade gen ersätter och plasmid-baserade CRISPR-Cas9 genomet redigering misslyckades.

Protocol

1. Utformning och syntes av sgRNA

  1. För att identifiera potentiella protospacer-regioner som kommer att utgöra en del av sgRNA, sök manuellt genom gen-of-interest för 5'NGG 3'-trillingar, med hjälp av sökfunktionen i vilket program som används. Kommentera dessa trillingar som PAM-sekvenser.
    OBS: Olika programvaror finns tillgängliga som söker efter och kommentera de potentiella PAM och protospacer sekvenser.
    1. Välj 20 bp uppströms varje av de identifierade PAM-sekvenserna och anteckna dessa sekvenser som potentiella protospacers.
  2. Om du vill bestämma om en enda protospacer, utför följande filtreringssteg för att kasta låg kvalitet sekvenser.
    1. För att testa för specificiteten hos de potentiella protospacers, kombinera PAM-sekvensen och protospacer i en enda sekvens och använda den som en BLASTn-fråga mot hela genomet. Kassera eventuella protorymder som visar likhet med någon region i arvsmassan än målregionen (figur 1A).
    2. För att säkerställa att RNA-molekylen kommer att vikas in i rätt 3D-struktur för bindning till Cas9-enzymet, skapa en kombinerad sekvens inklusive protospacer och ställningen sekvens som är specifika för Cas9 enzym.
      1. Ladda upp var och en av de kombinerade protospacer-byggnadsställningar sekvenser i en RNA sekundär struktur förutsägelse verktyg( Tabell över material).
      2. Analysera resultaten genom att jämföra de minimala fria energi- och centroid sekundärstrukturerna.
        OBS: Ideal protospacer kandidater kommer att ha identiska minimal fri energi och centroid sekundära strukturer. Båda sekundära strukturer bör bestå av tre stam slingor, avbryts av fem ring strukturer. Strukturerna bör också uppvisa höga bindande sannolikheter (anges i rött) i hela strukturen, utom för den region som representerar protospacer (Figur 1B). De faktiska energivärdena är inte relevanta.
    3. Välj en slutlig kandidat bland dem som klarat ovanstående filtreringssteg genom att välja den kandidat som är närmast den specifika region som är målinriktad.
  3. För att syntetisera sgRNA som en enda RNA-molekyl, använd en sgRNA-synteskit (Table of Materials) som är kompatibel med det särskilda Cas9-enzym som kommer att användas (t.ex. Cas9 från Streptococcus pyogenes).
    OBS: Följande steg kan vara beroende av den sgRNA-syntessats som används. I händelse av att ett annat kit används, följ tillverkarens anvisningar. Alternativt kan sgRNA beställas försyntetiseras. Vid arbete med RNA ska du använda nukleasfria reagenser och engångsartiklar.
    1. Om 20 bp protospacer som valts i steg 1.3 ovan inte hyser ett G i 5'-änden, lägg till ett G till denna region.
    2. Lägg till T7 promotorn sekvensen till 5' slutet av målsekvensen. Denna sekvens är standard och är 5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3 '.
    3. Lägg till en 14 nt överlappningssekvens till 3' slutet av målsekvensen. Denna sekvens är kit-specifik och är 5' GTTTTAGAGCTAGA 3' för satsen som används här.
    4. Beställ det resulterande fragmentet 5' TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, med (N)20 som representerar den valda protospacer presynthesized (Table of Materials).
    5. I enlighet med tillverkarens protokoll (Table of Materials), kombinera följande reagenser vid rumstemperatur: 2 μL vatten, 10 μL reaktionsbuffert, 5 μL syntetiserad protospacer-sekvens, 1 μL av 0,1 M DTT och 2 μL av transkriptasenzym.
    6. Inkubera denna lösning vid 37 °C i 30 min och överför till is.
    7. Tillsätt 30 μL vatten och 2 μL DNase I, blanda och inkubera vid 37 °C i ytterligare 15 min.
    8. Visualisera den resulterande sgRNA på en 2% agarosgel.

2. Provning av sgRNA:s in vitro-förmåga

OBS: Detta steg är valfritt men rekommenderas.

  1. Design primers som kommer att förstärka ett fragment som hyser sekvensen av den plats som den valda sgRNA kommer att rikta och förstärka regionen med hjälp av en vanlig DNA-polymeras.
    OBS: Om möjligt, utforma primers på ett sådant sätt att klyvning vid målplatsen kommer att producera två fragment av mycket olika storlekar som lätt kan skiljas från varandra på en standard agarosgel.
  2. Montera det kombinerade ribonukleproteinet sgRNA-Cas9 (RNP) genom att inkubera en lösning som består av 30 nM sgRNA som syntetiseras ovan, 30 nM Cas9-protein, 10x reaktionsbuffert och 10 μL vatten vid 25 °C i 10 min.
  3. Testa sgRNA:s klyvningsförmåga genom att tillsätta PCR-produkten av målregionen i RNP-lösningen till en slutkoncentration på 3 nM.
    1. Inkubera lösningen vid 37 °C i 15 min.
    2. Tillsätt 3 μg proteinas K och 2 μg RNase till lösningen för att stoppa klyvningsreaktionen och inkubera i rumstemperatur i 10 min.
    3. Visualisera de resulterande DNA-fragmenten på en 2% agarosgel. SgRNA är lämpligt för in vivo-experiment om två band av förväntad storlek observeras på gelen.

3. Utformning och syntes av dDNA

  1. Utforma dDNA som skall bestå av tre regioner- 5' och 3' regioner med komplementaritet till att genomiska regionen är målinriktad och en mellanregion som hyser en valbar markör (Table of Materials, figur 2).
    OBS: Andra specifika sekvenser kan också läggas till denna valbara markör. För just detta experiment, en stop kodon sekvens (5' TGA 3 ') lades precis innan den valbara markören, och därigenom införa en in-frame stop kodon i genen. DDNA kan beställas presynthesized. Alternativt kan dDNA förstärkas och monteras med hjälp av en stegvis, överlappning PCR-metoden som beskrivs nedan.
    1. Designa primers för att förstärka cirka 800 bp av 5' och 3'-flankerande regioner. Lägg till 20 nt av sekvens som är komplement till den valbara markörens sekvens till 5' regionens omvänd primer och 3' regionens framåt primer.
    2. Design primers som förstärker den valbara markören, se till att den förstärkta produkten hyser resistens genen samt en promotor känd för att arbeta i art av intresse.
  2. Med hjälp av en high-fidelity DNA-polymeras( Tabell of Materials), förstärka de tre dDNA regioner. Förstärka 5'- och 3'-regionerna från gDNA av organismen som redigeras. Förstärka den valbara markören från en relevant källa.
    1. I en enda reaktion, kombinera den förstärkta 5'-regionen med den valbara markören och, med hjälp av en lång räckvidd, high-fidelity DNA-polymeras, förstärka hela regionen.
    2. I en andra enda reaktion, kombinera den förstärkta 3'-regionen med den valbara markören och, med hjälp av en lång räckvidd, high-fidelity DNA-polymeras, förstärka hela regionen.
    3. Slutligen, kombinera de två föregående PCR produkter till en enda reaktion och förstärka hela dDNA sekvens med en lång räckvidd, high-fidelity DNA polymeras.
    4. Visualisera DNA-fragmentet på en 1% agarosgel. I händelse av att två eller flera fragment produceras, rena korrekt storlek fragment från gelen med hjälp av en gel reningssats.

4. Utvinning av protoplaster

  1. För att producera conidia, inokulera 200 mL färsk 2% maltextrakt buljong (MEB) i en 500 mL kolv med en 1 cm x 1 cm mycelia-täckt agar block.
    OBS: Inte alla svampar har möjlighet att producera conidia. I så fall kan även mycelia användas. Detta kommer vanligtvis att kräva högre koncentrationer av lysning enzym ytterligare i protokollet.
    1. Inkubera den flytande kulturen i en skakande inkubator vid 25 °C med skakning vid 120 rpm i 24 - 48 h.
      OBS: Denna inkubationstid och temperatur har optimerats för H. omanensis. Detta kommer att behöva optimeras för andra arter.
    2. Att skörda conidia; filtrera vätskekulturen genom ett lager av steril laboratorieduk (t.ex. Miracloth), överför den conidial suspensionen i 50 mL centrifugrör och centrifug vid 3.220 x g vid 4 °C i 10 min. Kassera supernatanten.
    3. Resuspend conidia i 5 mL vatten och pipetten 10 μL av conidia lösningen på ett mikroskop glida och täck med ett täckskydd. Visualisera med hjälp av ett sammansatt mikroskop under 40x förstoring för att säkerställa att endast conidia har återfunnits (Figur 3A).
    4. I en 500 mL-kolv, inokulera 200 mL färsk 1% MEB med den totala volymen återanvänds conidia.
    5. Inkubera vätskekulturen i en skakande inkubator vid 25 °C med skakning vid 120 rpm i upp till 12 h.
      OBS: Denna inkubationstid har optimerats för H. omanensis. Detta kommer att behöva optimeras för andra arter.
    6. För att skörda germlingarna, överför den flytande kulturen i 50 mL centrifugrör och centrifug vid 3,220 x g vid 4 °C i 10 min. Kassera supernatanten.
    7. Resuspend germlingsna i upp till 10 mL av 1 M sorbitol.
    8. Pipett 10 μL av germlinglösningen på ett mikroskopglas och täck med ett täckskydd. Visualisera med hjälp av ett sammansatt mikroskop under 40x förstoring för att säkerställa att endast germlingar har återvunnits (Figur 3B).
      OBS: Protokollet kan pausas här. Förvara germlings i 1 M sorbitol vid -80 °C.
  2. För att lysa cellväggarna hos de unga germlingarna och frisläpp protoplasterna, tillsätt 1 mL av germlings suspensionen till 9 mL lysningsenzym vid olika koncentrationer i en steril 50 mL-kolv.
    OBS: Olika enzymkoncentrationer och inkubationstider används och finns i tabell 1. Enzymerna och koncentrationerna varierar sannolikt också beroende på svampen och kommer att behöva optimeras för varje art.
    1. Inkubera spore-enzymlösningen i en skakinkubator vid 25 °C med skakningar vid 80 rpm i 2 till 3 h.
    2. Filtrera protoplastlösningen genom ett lager av steril laboratorieduk och samla upp protoplasterna genom centrifugering vid 1 810 x g vid 4 °C i 10 min. Kassera supernatanten.
      OBS: Protoplaster är celler utan cellväggar och är därmed mycket känsliga för mekaniska störningar. Var noga med att hantera dem försiktigt, särskilt vid pipettering.
    3. Försiktigt resuspend protoplast pelleten i 200 μL av STC buffert (Tabell över material).
    4. Pipetter 10 μL av protoplastlösningen på ett mikroskopglas och täck med ett täckskydd. Visualisera med hjälp av ett sammansatt mikroskop under 40x förstoring för att säkerställa att endast protoplaster har återfunnits (Figur 3C).
    5. Med hjälp av en hemocytometer, räkna och beräkna antalet protoplaster som genereras i ovanstående steg. Späd ut protoplastlösningen i alikvoter som innehåller ca 5 x 106 protoplaster.
      OBS: Protokollet kan pausas här. Förvara protoplaster i STC-buffert vid -80 °C.

5. Protoplast och PEG-assisterad omvandling och transformant återhämtning

  1. För att börja omvandlingen, kombinera ungefär 5 x 106 protoplaster med en enda volym av RNP-lösningen och cirka 6 μg av dDNA-fragmentet.
    OBS: Protoplaster är mycket känsliga för mekaniska störningar. Var noga med att hantera dem försiktigt, särskilt vid pipettering.
    1. Med hjälp av en pipett droppas långsamt 1 mL av en nyberedd 30% PTC-lösning på protoplastlösningen och inkubera lösningen i rumstemperatur i 20 min.
      OBS: Detta steg är ett känsligt och mycket viktigt steg. Se till att använda nyberedd PTC-lösning och släpp lösningen över cellerna så långsamt och jämnt som möjligt, vilket skapar ett hydrofoba lager över cellytan.
    2. Tillsätt 5 mL osmotisk kontrollmedium (OCM) till protoplastlösningen och pipetten långsamt och försiktigt för att säkerställa att lösningen blandas ordentligt.
    3. Inkubera protoplastlösningen i en skakinkubator vid 25 °C med skakning vid 80 rpm över natten.
  2. Om du vill välja de transformerade isolaten delar du upp lösningen i 5 tomma 60 mm-odlingsplattor.
    1. Tillsätt 10 mL OCM-agar kompletterat med 30 μg/mL hygromycin B till varje odlingsplatta och rotera långsamt varje platta för att blanda ordentligt.
    2. Låt det första skiktet av agar ställa in innan du lägger till 10 mL osmotisk kontrollmedelgar kompletteras med 40 μg/mL hygromycin B.
    3. Låt det andra agarskiktet ställa in och inkubera kulturerna vid 25 °C tills enstaka isolat kan ses växa genom båda skikten av agar.
  3. För att återhämta framgångsrikt omvandlas isolat, överföra de enskilda isolat kan tillväxt genom agar skiktet kompletteras med 40 μg/mL hygromycin B till färska malt extrakt agar (MEA) plattor kompletteras med 50 μg/mL hygromycin B (MEA-50).
    1. Inkubera de färska kulturerna vid 25 °C i 5 dagar, kontrollera dagligen för tillväxt. Kulturer som kan upprätthålla tillväxt på dessa medier har framgångsrikt omvandlats och kan användas för vidare studier.

6. Bekräftelse av dDNA:s integration och stabilitet

  1. För att bekräfta att dDNA har integrerats i genomet vid målregionen, design primers som flankerar de förutspådda 5' och 3' insert platser (Figur 2).
    1. Utför två PCRs med hjälp av dessa två primer uppsättningar och en high-fidelity DNA polymeras. Om båda PCRs avkastning amplikoner av förväntad storlek och sekvens, dDNA var framgångsrikt integrerat i målregionen. Sedan, bedöma mutant fläcken för stabil integration av dDNA.
  2. För att kunna bekräfta att dDNA har blivit stably integrerat i arvsmassan och kommer att bibehållas under vegetativ tillväxt, utför ett mediaöverföringstest.
    1. Överför ett block av mycelial-täckt agar från en aktivt växande mutantisolering på MEA-50 medium till unsupplemented MEA medium. Inkubera vid 25 °C i 3 dagar.
    2. Överför ett block av mycelia-täckt agar från isolatet växer på MEA medium till MEA-50 medium. Inkubera vid 25 °C i 3 dagar.
    3. Upprepa denna process, överföra aktivt växande mycelia från kompletteras till unsupplemented medium för minst fyra omgångar.
      OBS: Om isolatet klarar av varaktig tillväxt på MEA-50 medium efter många överföringar har dDNA integrerats stabilt i arvsmassan och kan upprätthållas genom vegetativ tillväxt. Den muterade fläcken kan bedömas med för närvarande endast en enda kopia av den integrerade dDNA.
  3. För att bekräfta att dDNA har integrerats i arvsmassan på en enda plats, utför en Southern blot-analys.
    1. Smälta totalt 30 μg gDNA från varje mutantstam med hjälp av HindIII och EcoRI-restriktionsenzymer i enlighet med tillverkarens protokoll.
      OBS: Medan valet av restriktionsenzym är upp till forskaren, se till att begränsningsenzymets igenkänningsställe inte finns i dDNA-sekvensen.
    2. Separera det smälta gDNA på en 0,75% agarosgel och överför DNA:t till ett nylonmembran med hjälp av standardprocedurer32.
    3. Utsätta membranet för hybridisering med hjälp av en sond som riktar sig mot dDNA-sekvensen.
      1. Design primers för att förstärka en kort (300 bp) region i dDNA.
      2. Med hjälp av dessa primers, syntetisera sonden med hjälp av en PCR DIG märkning mix.
      3. Använd den nyligen syntetiserade sonden för membranhybritisering, behandling och visualisering med hjälp av standardprocedurer32. Om bara ett enda band ses i varje körfält, är dDNA närvarande på endast en enda plats i arvsmassan. Den muterade stammen kan nu användas för ytterligare fenotypisk analys och funktionella karakteriseringsexperiment.

7. Fenotypisk analys av de muterade stammarna

  1. Genomföra parningsexperiment för att avgöra om störningen av MAT-genen hade en effekt på svampens sexuella förmåga som studerades.
    OBS: Detta steg är beroende av den särskilda gen och art som studeras. I detta fall är den gen som riktar sig tros vara inblandade i sexuell reproduktion och därmed parning tester genomfördes. Om genen trodde, till exempel, att vara involverad i asexuell reproduktion, då något som conidial produktion kunde mätas.
    1. För att testa den muterade stammens heterothalliska kapacitet, co-inokulerar färskt MEA-medium med en mutant stam samt en stam av motsatt parningstyp. När det gäller H. omanensis, håll locken på plattorna stängda, men inte täta och inkubera i rumstemperatur i 7 dagar. Visuellt bedöma för produktion av sexuella strukturer.
    2. För att testa homothallic kapaciteten hos den muterade stammen, inokulera färskt MEA-medium med en mutant stam. När det gäller H. omanensis, håll locken på plattorna stängda, men inte täta och inkubera i rumstemperatur i 7 dagar. Visuellt bedöma för produktion av sexuella strukturer.
  2. Genomföra tillväxthastighetsexperiment för att avgöra om störningen av MAT-genen hade en effekt på tillväxttakten hos svampen som studeras.
    1. Skapa mycelialtäckta agarproppar från den aktivt växande kanten av kulturer av mutant- och vildtypsstammarna genom att sätta in baksidan av en stor, steril pipettspets i agaren.
    2. Inokulera färskt MEA-medium med dessa agar pluggar. Se till att minst tre replikat per varje kulturtyp görs.
    3. Efter 3 dagars tillväxt vid 20 °C, mät tillväxten på två vinkelräta diametrar.
    4. Jämför data från vildtyps- och mutantstammarna.

Representative Results

Det ovan beskrivna protokollet underlättade införandet av ett för tidigt stopp-kodon i en parningsgen från icke-modellen ascomycete, H. omanensis. Denna process utnyttjade en version av CRISPR-Cas9 genomet redigeringssystem och som sådan en av de viktigaste stegen i detta protokoll är utformningen och syntesen av en hög kvalitet sgRNA. Figur 1 visar hur denna molekyl utformades på ett sådant sätt att den A) specifikt riktar sig mot den gen av intresse och visar liten likhet med andra regioner i arvsmassan och B) veck korrekt för att binda med Cas9-proteinet. SgRNA måste också kunna klyver målregionen effektivt. SgRNA:s förmåga att rikta in sig på och möjliggöra klyvning av målregionen genomfördes in vitro, vilket gav två produkter av förväntad storlek.

När en framgångsrik omvandling har skett är det viktigt att se till att dDNA har integrerats i arvsmassan endast en gång och på den förväntade platsen. Bild 2 illustrerar utformningen av PCR-primers som riktar in i insättningsplatserna, som kan användas för att screena de potentiella transformanterna för rätt integrationsplats. Genom att grund- och primrar som flankerar 5' och 3' insättningsställena, är förstärkning endast möjlig om dDNA sätts in i rätt region. Figur 4 illustrerar att det förtidiga stopp-kodonet infördes i MAT1-2-7-genen i den korrekta avläsningsramen, vilket säkerställer att genen skulle trunkeras på ett liknande sätt som för H. moniliformis. Dessutom visade Southern blot-analys att dDNA-konstruktionen endast integrerades på en enda plats i arvsmassan.

Framgången för protokollet bekräftades på den fenotypiska analysen av mutantstammarna. När det gäller mat1-2-7 avbrott experimentet utvecklades två oberoende mutant stammar. I båda isolaten minskade den vegetativa radiella tillväxttakten signifikant, vilket tyder på en pleiotropisk effekt av den nya parningsgenen (Figur 5). Vidare var mutantisotalerna oförmögna att slutföra en sexuell cykel, producerar endast omogna sexuella strukturer som inte gav sexuell sporer (Figur 5). Detta var i motsats till wildtype isolat, som avslutade hela den sexuella cykeln inom några dagar efter inkubation (Figur 5).

Figure 1
Bild 1: Välja en lämplig sgRNA-kandidat.
(A) Ett lämpligt sgRNA kommer endast att ha likhet med målregionen för genomet (i detta fall indikeras av MAT locussekvensen). (B) En lämplig sgRNA kommer att ha identiska minimal fri energi och centroid sekundär strukturer, med de tre stam slingor och fem ringar i den primära steg slingan. Vidare kommer majoriteten av strukturen har höga bindande sannolikheter (anges i mörk orange och rött) medan lägre bindande sannolikheter bör ses vid protospacer regionen (anges av de svarta trianglar). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Utformning, förstärkning och montering av dDNA.
De första och andra primerparen (PP1 och PP2) används för att förstärka ungefär 800 bp uppströms (5') och 800 bp nedströms (3') av den gen av intresse. Den omvända primern av PP1 och den främre primern av PP2 inkludera regioner av homologi till hygromycin motstånd kassett. Det tredje primerparet förstärker hela hygromycinmotståndskassetten. På ett stegvis sätt är de olika amplikonerna sammansatta tills hela dDNA, som består av 5'-regionen, hygromycinmotståndskassetten och 3' region, monteras. När den omvandlas till cellen, bör dDNA rekombinera i den region där Cas9 enzymet kommer att ha riktats för att skära, och därmed ersätta genen av intresse med hygromycin resistens kassett. PP4 och PP5 kan användas för att avgöra om dDNA har satts in på rätt sätt i genomet på lämplig plats. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: De olika celltyperna som är viktiga under protoplastextraktionsprotokollet.
(A) Används Conidia som utgångsmaterial för protokollet. Dessa conidia tillåts gro och växa tills de är (B) unga germlings. Den ideala tillväxtfasen hos de unga germlingarna indikeras av de två svarta pilarna. Andra mycelialsträngar som ses på (B) är för mogna för nedbrytning och ska inte användas. Det sista steget i protokollet är utgivningen av (C) runda protoplaster, som indikeras av de svarta, prickade cirklarna. Dessa celler har inte längre cellväggar och är därmed mycket känsliga för mekaniska störningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Den framgångsrika integreringen av TGA-stopp-kodon i MAT1-2-7-genen av H. omanensis.
(A) Den fullängds H. omanensis MAT1-2-7 genen, med sgRNA målstället indikeras av den gröna pilen. (B) En förstorad schematisk av sgRNA målplatsen inom H. omanensis MAT1-2-7 genen. (C) En förstorad schematisk av en region i dDNA som visar stopp kodon flankerad av armar homologa till MAT1-2-7 genen av H. omanensis. (D) Sangersekvenskromatogram som anger den framgångsrika integreringen av stoppkodonen i GENEN MAT1-2-7. Modifierad från Wilson et al. 202021. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: De fenotypiska skillnaderna mellan (A) isolat av vildtyp och (B) mutanta isolat.
De tre första bilderna i varje panel visar skillnaderna i de två isolattypernas sexuella förmåga. Medan de wildtype isolaten bildar mogna ascomata under sexuell reproduktion, komplett med exudation av sporer från tips av de ascomatal halsarna, mutanten isolaten form endast omogna sexuella strukturer som inte producerar några sexuella sporer. Den fjärde bilden i varje panel visar skillnaden i tillväxthastighet och morfologi för de två isolattyperna. Medan wildtype isolatet växer mycket snabbare och med mer antenn mycelia, mutanten visar långsammare och är nedsänkt i agar. Modifierad från Wilson et al. 202021. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Reaktion Enzym Koncentration Nedbrytningstid
A 1,250 mg/mL 180 min
B 1,875 mg/mL 180 min
C 2,500 mg/mL 150 min
D 3,750 mg/mL 150 min
ᵉ 4,375 mg/mL 120 min
F 5.000 mg/mL 120 min

Tabell 1: Nedbrytning av germling/mycelialösningen med lysningsenzymer från Trichoderma harzianum. De olika enzymerkoncentrationerna motsvarar olika inkubationsperioder, med lägre koncentrationer som kräver längre inkubationer.

Discussion

Protokollet för framgångsrik omvandling av H. omanensis och redigering av MAT1-2-7 genen visades genom att införa en in-frame tidigt stopp kodon tillsammans med en gen för resistens mot hygromycin B21. Detta uppnåddes med hjälp av en proteinbaserad version av CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet. Experimentet medförde in vitro-transkription av sgRNA, PCR-baserad montering av dDNA och samomvandling av dessa två nukleinsyror med ett kommersiellt tillgängligt Cas9-enzym till protoplaster extraherade från H. omanensis

Till skillnad från andra protokoll som är beroende av tillgängligheten hos många andra molekylära verktyg, kan det protokoll som beskrivs ovan med framgång användas i arter för vilka den molekylära verktygslådan fortfarande är ganska begränsad21. Protokollet bygger endast på ett etablerat omvandlingssystem och tillgängligheten av NGS-data, helst hela genomsekvensen. Medan ett effektivt omvandlingssystem kan ta en del optimera i en art som detta inte är tillgänglig, det finns många olika protokoll tillgängliga för en mängd olika arter. Dessutom blir genomdata allt mer tillgängliga för även de mest obskyra arter och blir lättare att generera de novo om det inte redan finns.

Med tanke på protokollets längd finns det många steg vid vilka modifieringar kan införas och där felsökning kan vara nödvändig. Detta gäller särskilt de steg som anses vara arter specifika. Det finns till exempel många inkubationssteg i det här protokollet som måste genomföras vid specifika temperaturer och för specifika tidsperioder för att generera celltyper som är viktiga för experimentet. Dessa steg skulle därmed kräva artspecifik optimering. Där så är möjligt har mikrografier av de särskilda cellerna eller tillväxtfaserna tillhandahållits som hjälp vid överföring av detta protokoll till en annan art (Figure 1). Typ och koncentration av enzymer som används för att bryta ned svampcellscellernas cellväggar för att frigöra protoplasterna kommer också att vara specifika för den svampart som studeras. I detta protokoll används endast en källa till att man tar enzymer från, medan olika enzymkombinationer krävs för utvinning av protoplaster hos arter som Fusarium verticillioides33. Detta steg beror helt på den kemiska göra av cellväggen och kommer därmed att behöva optimeras på en art till art basis.

Denna metod är särskilt betydelsefull för dem som studerar icke-modellarter eftersom det inte finns någon tillit till ett uttryckssystem. En populär metod för att etablera CRISPR-Cas9 genomredigeringssystem är att uttrycka Cas9-proteinet, sgRNA samt dDNA från en eller två plasmider som omvandlas till de celler som valts. I detta fall behöver Cas9 uttryckas av en promotor som är kapabel till höga uttrycksnivåer i den särskilda organism som studeras. Allmänna initiativtagare har utvecklats för användning i fintrådiga svampar och även om de inte är kompatibla i alla arter, de gör det möjligt för låg nivå uttryck och framgångsrikt kan användas för att uttrycka till exempel antibiotikaresistens gener. Dessa initiativtagare tillåter dock ofta inte höga uttrycksnivåer och kan därmed inte användas för att uttrycka Cas9-proteinet. Med hjälp av en proteinbaserad version av CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet övervinner denna begränsning och gör att sgRNA och dDNA kan samtransformas till cellen med ett redan producerat Cas9-enzym.

Utvecklingen av detta proteinbaserade system för användning i H. omanensis kom efter många misslyckade försök till genomredigering med både den klassiska split markör tillvägagångssätt samt plasmid-baserade CRISPR-Cas9 systemet. Medan effektivitetsvinster skiljer sig åt från art till art, har split markör tillvägagångssätt framgångsrikt använts med 100% effektivitet i arter så olika som Alternaria alternata34,35, och C. nicotianae36. I motsats till detta system effektivitet i H. omanensis var noll, trots mer än 80 oberoende transformation och integration händelser. På samma sätt har det plasmidbaserade CRISPR-Cas9-systemet framgångsrikt använts med höga effektivitetsvinster i Trichoderma reesei (>93%)17 och Penicillium chrysogenum (upp till 100%)37. Detta är, återigen, i motsats till detta system användbarhet i H. omanensis. Tillräcklig uttryck för Cas9 proteinet var inte uppnåelig i H. omanensis trots att försöka ett antal potentiella initiativtagare, inklusive två art-specifika främjare förutspådde från hushållning gener. Således kunde detta system inte användas alls. Med hjälp av den proteinbaserade versionen av CRISPR-Cas9-systemet gav det dock många oberoende transformanter, varav två hyste den integrerade dDNA på rätt plats. Vidare var detta experiment försök endast en gång och var framgångsrik- ytterligare illustrerar den lätthet med vilken detta system kan användas.

Framtida tillämpningar av detta protokoll inkluderar dess optimering och användning i andra arter av Ceratocystidaceae. Det finns redan en mängd NGS-data tillgängliga för dessaarter 30,38,39 och studier angående deras värdsegenskap40, tillväxttakt och virulens41 har genomförts. Dessa studier kan stärkas genom den funktionella karakteriseringen av de gener som tros vara involverade i dessa processer, forskning som nu kommer att bli möjlig på grund av tillgången till en omvandling och genomredigeringsprotokoll.

Sammanfattningsvis blir grundlig undersökning av de gener som ligger bakom viktiga biologiska processer hos icke-modellarter allt mer tillgänglig tack vare tillgången till lättanvända genomredigeringsprotokoll som inte är beroende av förekomsten av omfattande biologiska resurser och molekylära verktygslådor. Att studera icke-modellarter blir lättare och kommer att möjliggöra upptäckten av nya vägar och intressanta avvikelser från de vanliga biologiska processer som har klarlagts i modellarter.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta projekt fick stöd av University of Pretoria, Institutionen för vetenskap och teknik (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). Projektet stöddes dessutom av Prof BD Wingfields DST/NRF SARChI-stol i Svampgenomik (Anslagsnummer: 98353) samt Dr AM Wilsons NRF PhD bursary (108548). Bidragsinnehavarna erkänner att åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta arbete är forskarnas och att finansieringsorganen inte accepterar något som helst ansvar i detta avseende.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

Genetik Genomredigering CRISPR-Cas9 RNP Transformationer Sexuell reproduktion Svampar Huntiella omanensis
CRISPR-Cas9-Medierad genomredigering i den fintrådiga Ascomycete <em>Huntiella omanensis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, A. M., Wingfield, B. D.… More

Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter