Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-Cas9-medieret Genom Redigering i filamentøse Ascomycete Huntiella omanensis

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61367
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology, University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Summary

CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet er en brugervenlig genomeditor, der er blevet brugt i modelarter og ikke-modelarter. Her præsenterer vi en protein-baseret version af dette system, der blev brugt til at indføre en for tidlig stop codon i et parringsgen af en ikke-model glødetråd ascomycete svamp.

Abstract

CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet er et molekylært værktøj, der kan bruges til at indføre præcise ændringer i genomer af både modelarter og ikke-modelarter. Denne teknologi kan bruges til en række genom redigering tilgange, fra gen knockouts og knockins til mere specifikke ændringer som indførelsen af et par nukleotider på et målrettet sted. Genomredigering kan bruges til en lang række anvendelser, herunder delvis funktionel karakterisering af gener, produktion af transgene organismer og udvikling af diagnostiske værktøjer. Sammenlignet med tidligere tilgængelige genredigeringsstrategier har CRISPR-Cas9-systemet vist sig at være let at etablere i nye arter og kan prale af høj effektivitet og specificitet. Den primære årsag til dette er, at redigeringsværktøjet bruger et RNA-molekyle til at målrette genet eller sekvensen af interesse, hvilket gør målmolekyledesign ligetil, da standardbaseparingsregler kan udnyttes. I lighed med andre genomredigeringssystemer kræver CRISPR-Cas9-baserede metoder også effektive transformationsprotokoller samt adgang til sekvensdata af god kvalitet til design af målrettede RNA- og DNA-molekyler. Siden indførelsen af dette system i 2013, det har været brugt til at genetisk manipulere en række forskellige modelarter, herunder Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster og Mus musculus. Efterfølgende har forskere, der arbejder på ikke-modelarter, udnyttet systemet og brugt det til undersøgelse af gener, der er involveret i så forskellige processer som sekundær metabolisme i svampe, nematodevækst og sygdomsresistens i planter, blandt mange andre. Denne protokol, der er beskrevet nedenfor, beskriver brugen af CRISPR-Cas9 genomredigeringsprotokollen til afkortning af et gen, der er involveret i den seksuelle cyklus af Huntiella omanensis, en glødelampe, en glødelampe ascomycete svamp, der tilhører Ceratocystidaceae-familien.

Introduction

Den stigende tilgængelighed af høj kvalitet, fuldt samlet genomer og transskriptoer har i høj grad forbedret evnen til at studere en bred vifte af biologiske processer i en række organismer1. Dette gælder både for modelarter såvel som ikke-modelarter, hvoraf mange kan give en mere forskelligartet forståelse af biologiske processer. Disse former for data kan bruges til genopdagelse, identifikation af transskriptionsnetværk og både hele genom- og transskriptionssammenligninger, som hver især kommer med deres eget sæt af applikationer. Men mens gener bliver forudsagt, kommenteret og angiveligt knyttet til forskellige funktionelle veje på en aldrig-før-set sats, den funktionelle karakterisering af disse gener er stadig bagud, begrænset af de molekylære toolkits til rådighed for mange arter. Dette er især tilfældet for de ikke-modelarter, hvor genomiske data er relativt let at generere, men hvor yderligere molekylær karakterisering har væretnæsten umuligt 1,2.

Delvis karakterisering af funktionerne i specifikke gener, der er vigtige for svampearters biologi, kan opnås ved enten knockout- eller knockin-eksperimenter efterfulgt af fænokomypisk analyse af de mutante stammer3. Disse to systemer er udelukkende afhængige af tilgængeligheden af genteknologi protokoller, herunder som minimum et transformationssystem og et genetisk redigeringssystem. Der er en række forskellige transformationssystemer, der er udviklet i en række forskellige filamentøse svampe4. Fysiske systemer som dem, der er afhængige af biolistik og elektroporation er blevet udviklet i Trichoderma harzianum5 og Aspergillus niger6, henholdsvis. Systemer, der anvender kemikalier såsom calciumchlorid eller lithiumacetat er blevet udviklet i Neurospora crassa7. Endelig er biologiske systemer, der er afhængige af anvendelse af Agrobacterium tumefaciens til transformation, med succes blevet anvendt i Ceratocystis albifundus8.

I modsætning til tilgængeligheden af forskellige transformationsprotokoller er genomredigeringssystemer mindre rigelige. Mange af de traditionelle funktionelle karakterisering eksperimenter udført i filamentøse svampe udnyttet en split markør knockout konstruere i form af en valgbar markør flankeret af regioner homologi til målregionen eller genet i genomet3. Metoden er afhængig af homologi rettet (HR) DNA reparation, hvilke faciliteter homolog rekombination mellem knockout konstruere og regionen af interesse. Denne rekombinationshændelse resulterer i udskiftning af det pågældende gen med sekvensen af den valgbare markør. Desværre, mens dette var en succes i mange arter, herunder Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 og Grosmannia clavigera12, satserne for homolog rekombination er meget varierende på tværs af forskellige svampearter, hvilket gør dette til en ineffektiv og undertiden ubrugelig protokol i visse arter3.

Andre genom redigeringssystemer, herunder dem, der gør brug af zink-finger nukleaser (ZFNs) og transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs) udgjorde en stor forbedring på de ældre systemer, især i betragtning af deres evner til at foretage specifikke og målrettede ændringer13. Både ZFN'er og TALEN'er består af et nukleaseprotein og et protein, der er i stand til at genkende specifikke nukleotidsekvenser13. Ved anerkendelse fremkalder nukleasen en dobbeltstrenget DNA-pause, der kan lette indførelsen af specifikke mutationer. For at skabe genomændringer skal proteinregionen, der genkender nukleotidsekvensen, være specielt designet til hvert eksperiment. På grund af denne afhængighed af protein-nukleinsyre interaktioner til at guide redigering, designe og producere målretning molekyler for hver knockout eller knockin eksperiment er vanskeligt og arbejdskrævende14,15. Illustrerende for disse udfordringer, meget få filamentøse svampe har været udsat for genom redigering ved hjælp af disse systemer. Et eksempel er DET TALENs-baserede system, der blev udviklet i ris blast svamp, Magnaporthe oryzae16.

Velsagtens den største revolution inden for genomredigering var opdagelsen og den efterfølgende udvikling af CRISPR-Cas9-systemet- en genomeditor, der giver mulighed for målrettet spaltning af en sekvens af interesse af en endonuclease, der styres af et RNA-molekyle. Dette var en enorm forbedring i forhold til de tidligere udviklede genomredaktører, der var afhængige af protein-nukleinsyre interaktioner som den største fordel ved CRISPR-Cas9-systemet er, at det er afhængig af et RNA-molekyle til at målrette området af interesse. Det betyder, at systemet er baseret på en RNA-DNA interaktion og dermed standard base parring regler kan udnyttes, når designe hvert eksperiment15.

CRISPR-Cas9 systemet som beskrevet her består af tre hovedkomponenter: en enkelt guide RNA (sgRNA), Cas9 enzymet og en donor DNA (dDNA)17. SgRNA består af en 20 nukleotid region kaldet protospacer samt en længere region kaldet stilladset18. Protospacer-regionen bruges til at guide redigeringssystemet til målområdet og er således redesignet for hvert eksperiment. Stilladset er den region RNA, der fysisk binder sig til Cas9 enzymet til at danne ribonucleoprotein (RNP) og dermed er identisk uanset den region, der skal målrettes. Cas9-enzymet letter fysisk spaltningen af mål-DNA'et ved hjælp af protospaceren som vejledning til at identificere denne region19. Den sidste komponent, dDNA, er valgfri, og dens anvendelse afhænger af det pågældende eksperiment20. DDNA rummer den sekvens, der specifikt skal indsættes i den region, der skæres af Cas9 enzymet, og er derfor ideel til gen knockin eksperimenter, hvor et gen er ved at blive indført i genomet eller for gen knockout eksperimenter, hvor en antibiotikaresistens gen eller andre valgbare markør er ved at blive indført for at erstatte genet af interesse. DDNA kan også udformes på en sådan måde, at der indføres nye sekvenser i genomet. Som beskrevet nedenfor er det f.eks.21 Andre anvendelser omfatter mutation af specifikke områder af genet, såsom en funktionel domæne22, eller indførelsen af en mærkning sekvens23.

En stor fordel ved at bruge CRISPR-Cas9-systemet er dets alsidighed24. Et eksempel på denne tilpasningsevne er, at Cas9 enzymet kan indføres i værtscellen i en af dens tre former- DNA, RNA eller protein- afhængigt af det særlige transformationssystem, der anvendes. Når det indføres i DNA-form, er kasse9-genet ofte inkluderet på en plasmid sammen med en valgbar markør, en kassette til at udtrykke sgRNA og om nødvendigt en kassette, der kodning af dDNA-sekvensen25. Den primære fordel ved dette system er, at kun en enkelt konstruktion skal omdannes til cellen og vellykket transformation sikrer, at alle de nødvendige komponenter til CRISRP-Cas9-medieret genom redigering er til stede. Denne metode er imidlertid afhængig af, at der findes et udtrykssystem for værtsarten. For at Cas9 kan fremkalde DNA-skader, skal det udtrykkes på et højt niveau, og derfor er der behov for en passende og potentielt specifik promotor. For ikke-modelarter, hvor sådanne initiativtagere endnu ikke er udviklet, kan dette være en fortræ mindre faktor, og derfor kan evnen til at indføre Cas9 i RNA eller proteinform være en mere attraktiv mulighed. Indførelsen af RNA i cellen bringer sine egne udfordringer - især i, at RNA er ustabil og måske ikke overlever transformationsprocessen. Desuden, når de indføres i enten DNA eller RNA form, Cas9 gensekvens kan være nødvendigt at codon-optimeret til brug i den særlige værtssystem17. For eksempel kan cas9 genet fra Streptococcus pyogenes ikke arbejde i en pattedyr værtscelle og en cas9 gen, der er blevet codon-optimeret til brug i et pattedyr celle kan ikke arbejde i en plantecelle. Alle disse udfordringer kan overvindes ved hjælp af proteinform cas9, som sammen med sgRNA kan samles i en RNP og omdannes til værtscelle26,27. Dette system er ikke baseret på noget endogent udtrykssystem eller codonoptimering og bør derfor fungere i de fleste ikke-modelarter. Ulempen ved det proteinbaserede system er, at det ikke er kompatibelt med DNA-baserede transformationssystemer som Agrobacterium-medieretoverførsel. For at den proteinbaserede metode kan fungere, skal der derfor være en transformationsprotokol som dem, der er afhængige af protoplast eller biolistik, til rådighed. Dette RNP-baserede system er med succes blevet anvendt i de filamentøse svampe, Fusarium oxysporum26 og Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, et medlem af Ceratocystidaceae familien, er en kosmopolitisk svamp ofte findes på frisk sårede woody planter28. Mens høj kvalitet genom og transskription data er tilgængelige for denneart 28,29,30, ingen transformation eller genom redigering protokoller er blevet udviklet. Til dato, forskning på H. omanensis har fokuseret på de underliggende genetiske komponenter i sin seksuellecyklus 29,31. Denne svamp udviser en typisk heterothallisk seksuel cyklus, med seksuel reproduktion, der udelukkende forekommer mellem isolater af MAT1-1 og MAT1-2 parringstyper31. I modsætning hertil mat1-2 isolater af de nært beslægtede Huntiella moniliformis er i stand til uafhængig seksuel reproduktion og fuldføre en seksuel cyklus i mangel af en MAT1-1 partner31. Denne forskel i seksuelle evner menes at være, i hvert fald delvist, på grund af en stor forskel i parring genet, MAT1-2-7, hvor H. omanensis havne en fuld længde og intakt kopi, mens genet er alvorligt afkortet i H. moniliformis29,31. For yderligere at karakterisere dette gens rolle i seksuel reproduktion, mat1-2-7 genet af H. omanensis blev afkortet for at efterligne afkortning set i H. moniliformis21.

Nedenstående protokol beskriver omdannelsen af H. omanensis og afkortningen af MAT1-2-7-genet ved hjælp af en proteinbaseret version af CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet. Denne protokol blev udviklet efter tilgange af homolog rekombinationsbaseret genudskiftning og plasmid-baserede CRISPR-Cas9 genom redigering mislykkedes.

Protocol

1. Design og syntese af sgRNA

  1. For at identificere potentielle protospacer regioner, der vil indgå i sgRNA, manuelt søge gennem gene-of-interesse for 5 'NGG 3' trillinger, ved hjælp af søgefunktionen i alt efter hvilket program der anvendes. Anmærk disse trillinger som PAM sekvenser.
    BEMÆRK: Forskellige softwareprogrammer er tilgængelige, der søger efter og anmærke de potentielle PAM og protospacer sekvenser.
    1. Vælg de 20 bp opstrøms for hver af de identificerede PAM sekvenser og anmærke disse sekvenser som potentielle protospacers.
  2. Hvis du vil vælge en enkelt protospacer, skal du udføre følgende filtreringstrin for at kassere sekvenser af lav kvalitet.
    1. Hvis du vil teste for specificiteten af de potentielle protospacers, skal du kombinere PAM-sekvensen og protospaceren i en enkelt sekvens og bruge den som en BLASTn-forespørgsel mod hele genomet. Protospacers, der viser lighed med en hvilken som helst region i genomet, bortset fra målområdet (figur 1A).
    2. For at sikre, at RNA-molekylet vil folde ind i den korrekte 3D-struktur til binding til Cas9-enzymet, skal du oprette en kombineret sekvens, der omfatter protospacer og stilladssekvensen, der er specifik for Cas9-enzymet.
      1. Upload hver af de kombinerede protospacer-stillads sekvenser i en RNA sekundær struktur forudsigelse værktøj (Tabel af Materialer).
      2. Analysere resultaterne ved at sammenligne den minimale frie energi og centroid sekundære strukturer.
        BEMÆRK: Ideelle protospacer kandidater vil have identiske minimal fri energi og centroid sekundære strukturer. Begge sekundære strukturer bør bestå af tre stilk sløjfer, afbrudt af fem ring strukturer. Strukturerne bør også udvise høje bindende sandsynligheder (angivet med rødt) i hele strukturen, bortset fra den region, der repræsenterer protospacer (figur 1B). De faktiske energiværdier er ikke relevante.
    3. Vælg en endelig kandidat blandt dem, der har bestået ovenstående filtreringstrin, ved at vælge den kandidat, der er tættest på den specifikke region, der målrettes mod.
  3. For at syntetisere sgRNA som et enkelt RNA-molekyle skal du bruge et sgRNA-syntesesæt (Tabel overMateriale), der er kompatibelt med det særlige Cas9-enzym, der skal anvendes (f.eks.
    BEMÆRK: Følgende trin kan være afhængige af det anvendte sgRNA-syntesesæt. Hvis der anvendes et andet sæt, skal du følge producentens anvisninger. Alternativt kan sgRNA bestilles præ-syntetiseret. Når du arbejder med RNA, skal du bruge nukleasefrie reagenser og engangsartikler.
    1. Hvis de 20 bp protospacer valgt i trin 1,3 ovenfor ikke havnen en G i 5 'ende, tilføje en G til denne region.
    2. Tilføj T7-arrangørsekvensen til 5'-enden af målsekvensen. Denne sekvens er standard og er 5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3'.
    3. Tilføj en 14 nt overlapningssekvens til 3' enden af målsekvensen. Denne sekvens er kit-specifik og er 5 'GTTTTAGAGCTAGA 3' for det kit, der anvendes her.
    4. Bestil det resulterende fragment 5' TTCTAATACGACTCACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, med (N)20, der repræsenterer den valgte protospacer forsyntetiseret (Materialetabel).
    5. I overensstemmelse med fabrikantens protokol (Tabel over Materialer)skal følgende reagenser ved stuetemperatur: 2 μL vand, 10 μL reaktionsbuffer, 5 μL syntetiseret protospacersekvens, 1 μL 0,1 M DTT og 2 μL transsentaseenzym.
    6. Denne opløsning inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, og den overføres til is.
    7. Der tilsættes 30 μL vand og 2 μL DNase I, blandes og inkuberes ved 37 °C i yderligere 15 min.
    8. Visualiser den resulterende sgRNA på en 2% agarose gel.

2. Test af sgRNA's in vitro-spaltningsevne

BEMÆRK: Dette trin er valgfrit, men anbefales.

  1. Design primere, der vil forstærke et fragment huser rækkefølgen af det sted, at den valgte sgRNA vil målrette og forstærke regionen ved hjælp af en standard DNA polymerase.
    BEMÆRK: Hvis det er muligt, designe primere på en sådan måde, at spaltning på målet stedet vil producere to fragmenter af meget forskellige størrelser, der let kan skelnes fra hinanden på en standard agarose gel.
  2. Den kombinerede sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) samles ved at inkubere en opløsning bestående af 30 nM sgRNA som syntetiseret ovenfor, 30 nM Cas9 protein, 10x reaktionsbuffer og 10 μL vand ved 25 °C i 10 min.
  3. SgRNA's sgRNA's sgRNA's sgRNA's sgRNA's spaltningsevne testes ved at tilføje PCR-produktet fra målområdet i RNP-opløsningen til en endelig koncentration på 3 nM.
    1. Opløsningen inkuberes ved 37 °C i 15 min.
    2. Der tilsættes 3 μg proteinase K og 2 μg RNase til opløsningen for at stoppe spaltningsreaktionen og inkubere ved stuetemperatur i 10 min.
    3. Visualiser de resulterende DNA-fragmenter på en 2% agarosegel. SgRNA er velegnet til in vivo-eksperimenter, hvis der observeres to bånd af den forventede størrelse på gelen.

3. Design og syntese af dDNA

  1. Design dDNA, der skal bestå af tre regioner- 5' og 3' regioner med komplementaritet til den genomiske region, der målrettes, og en mellemregion, der huser en valgbar markør (Tabel over Materialer, Figur 2).
    BEMÆRK: Andre specifikke sekvenser kan også føjes til denne valgbare markør. Til dette eksperiment blev der tilføjet en stop codonsekvens (5' TGA 3') lige før den valgbare markør, hvorved der blev indført en in-frame stop codon i genet. DDNA kan bestilles på forhånd. Alternativt kan dDNA forstærkes og samles ved hjælp af en trinvis, overlappende PCR-tilgang som beskrevet nedenfor.
    1. Design primere til at forstærke ca. 800 bp af de 5 ' og 3' flankerende regioner. Tilføj 20 nt sekvens, der supplerer den valgbare markør sekvens til 5 'regionens omvendte primer og 3's forward primer.
    2. Design primere, der forstærker den valgbare markør, der sikrer, at det forstærkede produkt huser modstandsgenet samt en promotor, der er kendt for at arbejde i de arter af interesse.
  2. Ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase (Tabel overMaterialer ), forstærke de tre dDNA regioner. Forstærke 5' og 3' regioner fra gDNA af organismen, der redigeres. Forstærke den markerede markør fra en relevant kilde.
    1. I en enkelt reaktion, kombinere den forstærkede 5 'region med den valgbare markør og ved hjælp af en langtrækkende, high-fidelity DNA polymerase, forstærke hele regionen.
    2. I en anden enkelt reaktion, kombinere den forstærkede 3 'region med valgbar markør og ved hjælp af en langtrækkende, high-fidelity DNA polymerase, forstærke hele regionen.
    3. Endelig kombinere de to foregående PCR produkter i en enkelt reaktion og forstærke hele dDNA sekvens med en langtrækkende, high-fidelity DNA polymerase.
    4. Visualiser DNA-fragmentet på en 1% agarosegel. I tilfælde af, at der produceres to eller flere fragmenter, renses det korrekt størrelse fragment fra gelen ved hjælp af en gel rensning kit.

4. Udvinding af protoplast

  1. For at producere conidia skal 200 ml frisk 2% maltekstraktbouillon (MEB) i en 500 ml kolbe med en 1 cm x 1 cm mycelia-dækket agarblok.
    BEMÆRK: Ikke alle svampe er i stand til at producere conidia. I så fald kan mycelia også bruges. Dette vil typisk kræve højere koncentrationer af lysing enzym yderligere i protokollen.
    1. Den flydende kultur inkuberes i en rystende inkubator ved 25 °C ved rystelser ved 120 omdrejning i 24 - 48 timer.
      BEMÆRK: Denne inkubationstid og temperatur er optimeret til H. omanensis. Dette skal optimeres til andre arter.
    2. At høste conidia; væskekulturen filtreres gennem et lag sterilt laboratorieklud (f.eks. Kassér supernatanten.
    3. Opspæl conidiaen i 5 ml vand og pipette 10 μL af conidiaopløsningen op på et mikroskopskreds og dæksel med en dæksel. Visualiser ved hjælp af et sammensat mikroskop under 40x forstørrelse for at sikre, at kun conidia er blevet inddrevet (Figur 3A).
    4. I en 500 ml kolbe, inokuler 200 ml frisk 1% MEB med det samlede volumen af resuspenderede conidia.
    5. Væskekulturen inkuberes i en rystende inkubator ved 25 °C ved omrystning ved 120 omdrejningstal i op til 12 timer.
      BEMÆRK: Denne inkubationstid er blevet optimeret til H. omanensis. Dette skal optimeres til andre arter.
    6. At høste kimlingerne overføres til 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved 3.220 x g ved 4 °C i 10 min. Kassér supernatanten.
    7. Opsaltning af kimerne i op til 10 ml 1 M sorbitol.
    8. Pipette 10 μL af kimopløsningen på et mikroskopskred og dæksel med en dæksel. Visualiser ved hjælp af et sammensat mikroskop under 40x forstørrelse for at sikre, at kun kimer er blevet genvundet (Figur 3B).
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Kimlingerne opbevares i 1 M sorbitol ved -80 °C.
  2. For at lyse cellevæggene i de unge kimer og frigive protoplasterne tilsættes 1 ml af kimsuspensionen til 9 ml lysingenzym i forskellige koncentrationer i en steril 50 ml kolbe.
    BEMÆRK: Der anvendes forskellige enzymkoncentrationer og inkubationstider, som findes i tabel 1. Enzymer og koncentrationer vil sandsynligvis også variere afhængigt af svampen og skal optimeres for hver art.
    1. Sporeenzymopløsningen inkuberes i en rystende inkubator ved 25 °C ved omrystning ved 80 omdrejning i 2 til 3 timer.
    2. Protoplastopløsningen filtreres gennem et lag sterilt laboratorieklud, og protoplasterne opsamres ved centrifugering ved 1.810 x g ved 4 °C i 10 min. Kassér supernatanten.
      BEMÆRK: Protoplaster er celler uden cellevægge og er derfor meget følsomme over for mekaniske forstyrrelser. Sørg for at håndtere dem omhyggeligt, især ved pipettering.
    3. Protoplastpellet skal forsigtigt opsbruges i 200 μL STC-buffer (Materialetabel).
    4. Pipette 10 μL af protoplastopløsningen på et mikroskopskreds og dække med en dæksel. Visualiser ved hjælp af et sammensat mikroskop under 40x forstørrelse for at sikre, at kun protoplaster er blevet inddrevet (Figur 3C).
    5. Ved hjælp af et hæmocytometer skal du tælle og beregne antallet af protoplaster, der genereres i ovenstående trin. Protoplastopløsningen fortyndes til aliquoter, der indeholder ca. 5 x 106 protoplaster.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Protoplaster opbevares i STC-buffer ved -80 °C.

5. Protoplast og PEG-assisteret transformation og transformantgenvinding

  1. For at begynde omdannelsen, kombinere ca 5 x 106 protoplasts med et enkelt volumen af RNP-opløsningen og ca 6 μg af dDNA fragment.
    BEMÆRK: Protoplaster er meget følsomme over for mekaniske forstyrrelser. Sørg for at håndtere dem omhyggeligt, især ved pipettering.
    1. Ved hjælp af en pipette drypper langsomt 1 ml af en friskfremtaget 30% PTC-opløsning på protoplastopløsningen og inkuberes opløsningen ved stuetemperatur i 20 min.
      BEMÆRK: Dette trin er et følsomt og meget vigtigt skridt. Sørg for at bruge frisklavet PTC-opløsning og slip opløsningen over cellerne så langsomt og jævnt som muligt, hvilket skaber et hydrofobt lag på tværs af celleoverfladen.
    2. Der tilsættes 5 ml osmotisk kontrolmedium (OCM) til protoplastopløsningen, og der pipetters langsomt og forsigtigt for at sikre, at opløsningen blandes grundigt.
    3. Protoplastopløsningen inkuberes i en rystende inkubator ved 25 °C ved rystelser ved 80 omdrejning natten over.
  2. For at vælge de transformerede isolater skal opløsningen opdeles i 5 tomme 60 mm kulturplader.
    1. Tilsæt 10 ml OCM agar suppleret med 30 μg/mL hygromycin B til hver kulturplade, og drej langsomt hver plade for at blande grundigt.
    2. Lad det første lag af agar indstilles, før der tilsættes 10 ml osmotisk kontrolmedium agar suppleret med 40 μg/ml hygromycin B.
    3. Lad det andet lag af agar indstille og inkubere kulturerne ved 25 °C, indtil enkelte isolater kan ses vokser gennem begge lag af agar.
  3. For at genvinde transformerede isolater skal de enkelte isolater, der kan vokse gennem agarlaget suppleret med 40 μg/ml hygromycin B, overføres til friske maltekstraktplader (MEA) suppleret med 50 μg/ml hygromycin B (MEA-50).
    1. De friske kulturer inkuberes ved 25 °C i 5 dage og kontrol dagligt for vækst. Kulturer, der er i stand til vedvarende vækst på dette medie, er blevet omdannet og kan bruges til yderligere studier.

6. Bekræftelse af integrationen og stabiliteten af dDNA

  1. For at bekræfte, at dDNA er blevet integreret i genomet i målregionen, skal du designe primere, der flankerer de forudsagte 5' og 3' skærsteder (figur 2).
    1. Udfør to PCR'er ved hjælp af disse to primer sæt og en high-fidelity DNA polymerase. Hvis begge PCR'er giver ampliconer af forventet størrelse og sekvens, blev dDNA integreret i målområdet. Vurder derefter den mutante plet for stabil integration af dDNA.
  2. For at bekræfte, at dDNA er blevet stabilt integreret i genomet og vil blive opretholdt under vegetativ vækst, udføre en medieoverførsel test.
    1. Overfør en blok af mycelial-dækket agar fra en aktivt voksende mutant isolat på MEA-50 medium til uudforsynet MEA medium. Inkuberes ved 25 °C i 3 dage.
    2. Overfør en blok af mycelia-dækket agar fra isolere vokser på MEA medium til MEA-50 medium. Inkuberes ved 25 °C i 3 dage.
    3. Gentag denne proces, overføre aktivt voksende mycelia fra suppleret til uleverandører medium i mindst fire runder.
      BEMÆRK: Hvis isolatet er i stand til vedvarende vækst på MEA-50 medium efter mange overførsler, er dDNA blevet stabilt integreret i genomet og kan opretholdes gennem vegetativ vækst. Den mutante plet kan vurderes for tilstedeværelsen af kun en enkelt kopi af den integrerede dDNA.
  3. For at bekræfte, at dDNA er blevet integreret i genomet på et enkelt sted, udføre en southern blot analyse.
    1. Fordøje i alt 30 μg gDNA fra hver mutant stamme ved hjælp af HindIII og EcoRI restriktion enzymer i overensstemmelse med producentens protokoller.
      BEMÆRK: Mens valget af restriktionsenzymet er op til forskeren, skal du sikre dig, at restenzymets genkendelsessted ikke er til stede i dDNA-sekvensen.
    2. Den fordøjede gDNA adskilles på en 0,75% agarosegel, og DNA'et overføres til en nylonmembran ved hjælp af standardprocedurer32.
    3. Æt membranen til hybridisering ved hjælp af en sonde, der er målrettet mod dDNA-sekvensen.
      1. Design primere til at forstærke en kort (300 bp) region af dDNA.
      2. Ved hjælp af disse primere, syntetisere sonden ved hjælp af en PCR DIG mærkning mix.
      3. Brug den nysynnede sonde til membranhybribilisering, behandling og visualisering ved hjælp afstandardprocedurer 32. Hvis der kun ses et enkelt bånd i hver vognbane, er dDNA kun til stede på et enkelt sted i genomet. Den mutante stamme kan nu bruges til yderligere fænotopyanalyse og funktionelle karakteriseringseksperimenter.

7. Fænootypisk analyse af mutantstammerne

  1. Udføre parringsforsøg for at afgøre, om afbrydelsen af MAT-genet havde en effekt på de seksuelle evner hos den svamp, der blev undersøgt.
    BEMÆRK: Dette trin afhænger af det pågældende gen og de arter, der undersøges. I dette tilfælde, det gen, der er rettet mod menes at være involveret i seksuel reproduktion og dermed parring test blev udført. Hvis genet menes, for eksempel, at være involveret i aseksuel reproduktion, så noget i retning af konidial produktion kunne måles.
    1. For at teste den mutante stammes heterothalliske egenskaber skal det friske MEA-medium med en mutant stamme samt en stamme af modsat parringstype. I tilfælde af H. omanensisskal pladerne opbevares, men ikke forsegles og inkuberes ved stuetemperatur i 7 dage. Visuelt vurdere for produktion af seksuelle strukturer.
    2. For at teste den mutante stammes homothalliske egenskaber skal der inokuleres frisk MEA-medium med en mutant stamme. I tilfælde af H. omanensisskal pladerne opbevares, men ikke forsegles og inkuberes ved stuetemperatur i 7 dage. Visuelt vurdere for produktion af seksuelle strukturer.
  2. Udfør vækstrateforsøg for at afgøre, om afbrydelsen af MAT-genet havde en effekt på vækstraten for den svamp, der undersøges.
    1. Opret mycelial-dækket agar stik fra aktivt voksende kanten af kulturer af mutant og wildtype stammer ved at indsætte bagsiden af en stor, steril pipette spids i agaren.
    2. Inokuler frisk MEA-medie med disse agarp propper. Sørg for, at der foretages mindst tre replikater pr. hver kulturtype.
    3. Efter 3 dages vækst ved 20 °C måles væksten på to vinkelrette diametre.
    4. Sammenlign dataene fra vildtype- og mutantstammerne.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet ovenfor lettet indførelsen af en for tidlig stop codon i en parring gen fra den ikke-model ascomycete, H. omanensis. Denne proces udnyttede en version af CRISPR-Cas9 genom redigeringssystem og som sådan et af de vigtigste skridt i denne protokol er design og syntese af en høj kvalitet sgRNA. Figur 1 viser, hvordan dette molekyle er udformet på en sådan måde, at det A) specifikt er rettet mod det gen af interesse og viser ringe lighed med andre regioner i genomet og B) folder korrekt for at binde med Cas9 protein. SgRNA'et skal også være i stand til effektivt at kløve målregionen. SgRNA's evne til at målrette og give mulighed for spaltning af målregionen blev udført in vitro, hvilket gav to produkter af den forventede størrelse.

Når en vellykket transformation har fundet sted, er det vigtigt at sikre, at dDNA kun har integreret sig i genomet én gang og på det forventede sted. Figur 2 illustrerer designet af PCR-primere, der er målrettet mod indsætningsstederne, som kan bruges til at screene de potentielle transformanter for det korrekte integrationswebsted. Ved at designe primere, der flankerer indsætningsstederne 5' og 3', er forstærkning kun mulig, hvis dDNA indsættes i det korrekte område. Figur 4 viser, at den tidlige stop-codon blev indført i MAT1-2-7-genet i den korrekte læseramme, hvilket sikrer, at genet afkortes på samme måde som H. moniliformis. Desuden viste Den Sydlige blotanalyse, at dDNA-konstruktionen kun var integreret på et enkelt sted i genomet.

Protokollens succes blev bekræftet ved fænotopyanalysen af mutantstammerne. I tilfælde af MAT1-2-7 disruption eksperiment, to uafhængige mutant stammer blev udviklet. I begge isolater blev den vegetative radiale vækstrate reduceret betydeligt, hvilket tyder på en pleiotropisk effekt af det nye parringsgen (Figur 5). Desuden var de mutante isolater ude af stand til at fuldføre en seksuel cyklus, hvilket kun producerede umodne seksuelle strukturer, der ikke producerede seksuelle sporer (figur 5). Dette var i modsætning til wildtype isolater, som afsluttede hele seksuel cyklus inden for et par dage efter inkubation (Figur 5).

Figure 1
Figur 1: At vælge en egnet sgRNA-kandidat.
(A) Et egnet sgRNA vil kun have lighed med genomets målregion (i dette tilfælde angivet med MAT-locus-sekvensen). MAT (B) En egnet sgRNA vil have identiske minimal fri energi og centroid sekundære strukturer, med de tre stilk sløjfer og fem ringe i det primære trin loop. Desuden vil størstedelen af strukturen have høje bindende sandsynligheder (angivet i mørk orange og rød), mens lavere bindende sandsynligheder skal ses i protospacerregionen (angivet af de sorte trekanter). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Design, forstærkning og samling af dDNA.
Det første og andet primerpar (PP1 og PP2) anvendes til at forstærke ca. 800 bp opstrøms (5') og 800 bp nedstrøms (3') af det pågældende gen. Den omvendte primer af PP1 og den forreste primer af PP2 omfatter regioner af homologi til hygromycin resistens kassette. Det tredje primerpar forstærker hele hygromycinresistenskassetten. Trinvist samles de forskellige ampliconer, indtil hele dDNA, der består af 5' regionen, hygromycinresistenskassettet og 3' regionen, er samlet. Når omdannet til cellen, dDNA bør rekombinere på det område, hvor Cas9 enzym vil have været rettet til at skære, og dermed erstatte genet af interesse med hygromycin modstand kassette. PP4 og PP5 kan bruges til at afgøre, om dDNA er blevet korrekt indsat i genomet på det relevante sted. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: De forskellige celletyper, der er vigtige under protoplastudvindingsprotokollen.
A) Conidia anvendes som udgangsmateriale for protokollen. Disse conidia får lov til at spire og vokse, indtil de er (B) unge kim. Den ideelle vækstfase af de unge kimer er angivet med de to sorte pile. Andre myceliale tråde ses på(B)er for modne til nedbrydning og bør ikke anvendes. Det sidste trin i protokollen er frigivelsen af (C) runde protoplasts, angivet af de sorte, stiplede cirkler. Disse celler har ikke længere cellevægge og er derfor meget følsomme over for mekaniske forstyrrelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vellykket integration af TGA stop codon i MAT1-2-7 genet af H. omanensis.
(A) Den fulde længde H. omanensis MAT1-2-7 gen, med sgRNA mål site angivet med den grønne pil. (B) En forstørret skematisk af sgRNA-målstedet inden for H. omanensis MAT1-2-7 genet. (C) En forstørret skematisk af en region af dDNA, der viser stop codon flankeret af våben homolog til MAT1-2-7 genet af H. omanensis. (D) Sanger sekvens kromatogram angiver en vellykket integration af stop codon i MAT1-2-7 genet. Ændret fra Wilson et al. 202021. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Fænootypiske forskelle mellem (A) wildtype isolater og (B) mutant isolater.
De første tre billeder i hvert panel viser forskellene i de seksuelle evner af de to isolerede typer. Mens wildtype isolater form modne ascomata under seksuel reproduktion, komplet med ekssudation af sporer fra spidsen af de ascomatale halse, mutant isolater danner kun umodne seksuelle strukturer, der ikke producerer nogen seksuelle sporer. Det fjerde billede i hvert panel viser forskellen i vækstrate og morfologi for de to isolattyper. Mens wildtype isolat vokser meget hurtigere og med mere antenne mycelia, mutant viser langsommere og er nedsænket i agar. Ændret fra Wilson et al. 202021. Klik her for at se en større version af dette tal.

Reaktion Enzymkoncentration Nedbrydningstid
A 1.250 mg/ml 180 min.
B 1.875 mg/ml 180 min.
C 2.500 mg/ml 150 min.
D 3.750 mg/ml 150 min.
E 4.375 mg/ml 120 min.
F 5.000 mg/ml 120 min.

Tabel 1: Nedbrydning af kim-/myceliaopløsningen med lysingenzymer fra Trichoderma harzianum. De forskellige enzymer koncentrationer svarer til forskellige inkubationsperioder, med lavere koncentrationer kræver længere inkubationer.

Discussion

Protokollen for en vellykket transformation af H. omanensis og redigering af MAT1-2-7 genet blev demonstreret ved at indføre en in-frame for tidlig stop codon sammen med et gen for resistens over for hygromycin B21. Dette blev opnået ved hjælp af en proteinbaseret version af CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet. Forsøget indebar in vitro transskription af sgRNA, PCR-baserede samling af dDNA og co-transformation af disse to nukleinsyrer med en kommercielt tilgængelig Cas9 enzym i protoplaster udvundet af H. omanensis

I modsætning til andre protokoller, der er afhængige af tilgængeligheden af mange andre molekylære værktøjer, kan den protokol, der er beskrevet ovenfor, med succes anvendes i arter, for hvilke den molekylære værktøjskasse stadig er retbegrænset 21. Protokollen bygger kun på et etableret transformationssystem og tilgængeligheden af NGS-data, helst hele genomsekvensen. Mens en effektiv transformation system kan tage nogle optimering i en art, som dette ikke er tilgængeligt, der er mange forskellige protokoller til rådighed for en række arter. Desuden bliver genomdata mere og mere tilgængelige for selv de mest obskure arter og bliver lettere at generere de novo, hvis de ikke allerede eksisterer.

I betragtning af protokollens længde er der mange trin, hvor der kan indføres ændringer, og hvor fejlfinding kan være nødvendig. Dette gælder især for de trin, der betragtes som artsspecifikke. For eksempel er der mange inkubationstrin i denne protokol, der skal udføres ved bestemte temperaturer og i bestemte længder for at generere celletyper, der er vigtige for eksperimentet. Disse trin vil således kræve artsspecifik optimering. Hvor det er muligt, er der fremlagt mikrografer af de pågældende celler eller vækstfaser for at hjælpe med at overføre denne protokol til en anden art (Figure 1). Typen og koncentrationen af enzymer, der anvendes til at nedbryde cellevæggene i svampecellerne for at frigive protoplasterne, vil også være specifik for de svampearter, der undersøges. I denne protokol anvendes kun én kilde til lysingenzymer fra, mens forskellige enzymkombinationer er nødvendige for ekstraktion af protoplaster hos arter som Fusarium verticillioider33. Dette trin afhænger helt af cellevæggens kemiske fabrik og skal derfor optimeres på grundlag af arter til arter.

Denne metode er særlig vigtig for dem, der studerer ikke-model arter, da der ikke er tillid til et udtrykssystem. En populær metode til etablering af CRISPR-Cas9 genom redigeringssystem er at udtrykke Cas9 protein, sgRNA samt dDNA fra en eller to plasmider, der omdannes til de celler af valg. I dette tilfælde skal Cas9 udtrykkes af en promotor, der er i stand til at give et højt udtryksniveau i den pågældende organisme, der undersøges. Der er udviklet generelle initiativtagere til brug i filamentale svampe, og selv om de ikke er kompatible i alle arter, giver de mulighed for lavt niveau udtryk og kan med held bruges til at udtrykke f.eks. Disse initiativtagere tillader imidlertid ofte ikke høje udtryksniveauer og kan derfor ikke bruges til at udtrykke Cas9-proteinet. Ved hjælp af en proteinbaseret version af CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet overvinder denne begrænsning og gør det muligt at omdanne sgRNA og dDNA til cellen med et allerede produceret Cas9-enzym.

Udviklingen af dette proteinbaserede system til brug i H. omanensis kom efter mange mislykkede forsøg på genomredigering ved hjælp af både den klassiske split markør tilgang samt plasmid-baserede CRISPR-Cas9 system. Mens effektivitetsgevinster varierer fra art til art, split markør tilgang er blevet anvendt med succes med 100% effektivitet i arter så forskellige som Alternaria alternata34,35,og C. nicotianae36. I modsætning hertil var effektiviteten af dette system i H. omanensis nul, på trods af mere end 80 uafhængige transformations- og integrationsbegivenheder. På samme måde er det plasmidbaserede CRISPR-Cas9-system med succes blevet anvendt med høj effektivitet i Trichoderma reesei (>93%)17 og Penicillium chrysogenum (op til 100%)37. Dette er igen, i modsætning til dette system nytte i H. omanensis. Tilstrækkeligt udtryk for Cas9 protein var ikke opnåeligt i H. omanensis trods forsøger en række potentielle initiativtagere, herunder to artsspecifikke initiativtagere forudsagt fra husholdning gener. Dette system kunne således slet ikke anvendes. Ved hjælp af den proteinbaserede version af CRISPR-Cas9-systemet gav mange uafhængige transformanter, hvoraf to husede den integrerede dDNA på den rigtige placering. Desuden blev dette eksperiment kun forsøgt én gang og var en succes- yderligere illustrerer den lethed, hvormed dette system kan bruges.

Fremtidige anvendelser af denne protokol omfatter dens optimering og anvendelse i andre arter af Ceratocystidaceae. Der foreligger allerede et væld af NGS-data for dissearter 30,38,39 ogundersøgelser vedrørende deres værtsspecificitet40, vækstrate og virulence41 er blevet gennemført., Disse undersøgelser kan styrkes ved den funktionelle karakterisering af de gener, der menes at være involveret i disse processer, forskning, som nu vil blive muligt på grund af tilgængeligheden af en transformation og genom redigering protokol.

Afslutningsvis vil jeg sige, at en grundig undersøgelse af de gener, der ligger til grund for vigtige biologiske processer i ikke-modelarter, bliver mere tilgængelig takket være tilgængeligheden af brugervenlige genomredigeringsprotokoller, der ikke er afhængige af eksistensen af omfattende biologiske ressourcer og molekylære værktøjssæt. Det bliver lettere at studere ikke-modelarter og vil gøre det muligt at opdage nye veje og interessante afvigelser fra de biologiske standardprocesser, der er belyst i modelarter.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af University of Pretoria, Institut for Videnskab og Teknologi (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). Projektet blev desuden støttet af prof. BD Wingfields DST/NRF SARChI stol i Svampegenomforskning (Tilskudsnummer: 98353) samt Dr. AM Wilsons NRF PhD-bursary (108548). Støttemodtagerne anerkender, at udtalelser, konklusioner og konklusioner eller henstillinger, der kommer til udtryk i dette stykke arbejde, er forskernes, og at finansieringsorganerne påtager sig noget som helst ansvar i denne henseende.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

Genetik Genom redigering CRISPR-Cas9 RNP Transformationer Seksuel reproduktion Svampe Huntiella omanensis
CRISPR-Cas9-medieret Genom Redigering i filamentøse Ascomycete <em>Huntiella omanensis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, A. M., Wingfield, B. D.… More

Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter