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Neuroscience

सी एलिगेंस में बड़े एक्सोफर वेसिकल्स में वीवो न्यूरोनल एग्रीगेट और ऑर्गेनेल एक्सट्रूस में स्कोरिंग के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61368
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल झिल्ली-बाध्य बहिर्मंडल के रूप में सी एलिगेंस कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बड़े कुल और/या ऑर्गेनेल एक्सट्रूज़न (~ 4 माइक्रोन) का पता लगाने और क्वांटिटेशन के लिए दृष्टिकोणों का वर्णन करता है । हम इस मलबे निष्कासन तंत्र के विच्छेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए आवश्यक उपभेदों, विकास की स्थिति, स्कोरिंग मानदंड, समय और माइक्रोस्कोपी विचारों का वर्णन करते हैं ।

Abstract

गलतुस् हुआ प्रोटीन और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की विषाक्तता निर्णायक कारक हैं जो प्रजातियों में उम्र से जुड़े कार्यात्मक न्यूरोनल गिरावट और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग को बढ़ावा देते हैं। यद्यपि इन न्यूरोटॉक्सिक चुनौतियों को लंबे समय से सेल-आंतरिक माना जाता है, लेकिन अब काफी सबूत इस बात का समर्थन करते हैं कि एक न्यूरॉन में उत्पन्न होने वाले मानव रोग प्रोटीन पड़ोसी कोशिकाओं में दिखाई दे सकते हैं, एक घटना जो मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में फैले विकृति को बढ़ावा देने के लिए प्रस्तावित है।

सी एलिगेंस वयस्क न्यूरॉन्स जो एकत्रित प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, बड़े (~ 4 माइक्रोन) झिल्ली से घिरे वेसिकल्स को बाहर निकाल सकते हैं जिसमें एकत्रित प्रोटीन, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम्स शामिल हो सकते हैं। इन बड़े वेसिकल्स को "एक्सोफर्स" कहा जाता है और एक्सोसोम्स से अलग होते हैं (जो लगभग 100x छोटे होते हैं और विभिन्न बायोजेनेसिस होते हैं)। एक्सोफर्स में सेलुलर मलबे को फेंकना एक संरक्षित तंत्र द्वारा हो सकता है जो एक मौलिक, लेकिन पूर्व में गैर-मान्यता प्राप्त, न्यूरोनल प्रोटेओस्टेसिस और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण की शाखा है, जो उन प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक है जिनके द्वारा मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में फैलता है।

जबकि एक्सोफर्स का ज्यादातर उन जानवरों में अध्ययन किया गया है जो टच न्यूरॉन्स के भीतर उच्च कॉपी ट्रांसजेनिक म्हेरी व्यक्त करते हैं, ये प्रोटोकॉल फ्लोरोफेरेनेसिस के अध्ययन में फ्लोरोसेंटली टैग किए गए ऑर्गेनेल्स या न्यूरॉन्स के विभिन्न वर्गों में रुचि के अन्य प्रोटीन का उपयोग करके समान रूप से उपयोगी होते हैं।

यहां वर्णित सी एलिगेंस एक्सोफेर्स की भौतिक विशेषताएं हैं, उनका पता लगाने के लिए रणनीतियां, पहचान मानदंड, क्वांटिटेशन के लिए इष्टतम समय, और पशु विकास प्रोटोकॉल जो तनावों के लिए नियंत्रण करते हैं जो एक्सोफर उत्पादन स्तर को संशोधित कर सकते हैं। साथ में, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का विवरण प्रयोगशालाओं में बहिर्मंडलों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मानक स्थापित करने की सेवा करनी चाहिए । यह दस्तावेज प्रयोगशालाओं के लिए क्षेत्र में एक संसाधन के रूप में काम करना चाहता है, जिसके द्वारा एक्सोफर का उत्पादन किया जाता है और जिसके द्वारा पड़ोसी और दूर की कोशिकाओं द्वारा एक्सोफर्स पर प्रतिक्रिया व्यक्त की जाती है ।

Introduction

समुच्चय और बेकार माइटोकॉन्ड्रिया की न्यूरोटॉक्सिक चुनौतियों को लंबे समय से सेल-आंतरिक माना जाता रहा है, लेकिन हाल ही में यह स्पष्ट हो गया है कि एक न्यूरॉन में निकलने वाले मानव रोग प्रोटीन पड़ोसी कोशिकाओं में भी फैल सकते हैं, विकृति1को बढ़ावा दे सकते हैं। इसी तरह, स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रिया को उनके मूल उत्पादन की कोशिका से ट्रांससेलुलर क्षरण 2 या चुनौती प्राप्त पड़ोसी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियलआबादी के बचाव के लिए भेजा जा सकता है3। विभिन्न आकारों के वेसिकल्स को आम तौर पर सेलुलर सामग्रियों को पड़ोसी कोशिकाओं या तरल वातावरण में स्थानांतरित करने के लिएदेखागया है । कुछ निकाले गए वेसिकल्स औसत न्यूरोनल सोमा (औसत स्पर्श न्यूरॉन सोमा ~ 6 माइक्रोन) के आकार का दृष्टिकोण रखते हैं और बड़े समुच्चय और ऑर्गेनेल्स को समायोजित कर सकते हैं।

बड़े वेसिकल एक्सट्रूज़न का एक उल्लेखनीय उदाहरण जो प्रोटीन समुच्चय ले जा सकता है और ऑर्गेनेल्स सी एलिगेंस टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स में होता है जो एक उच्च कॉपी संख्या रिपोर्टर को व्यक्त करता है जो एक हानिकारक एकत्रीकरण-प्रवण, क्षरण प्रतिरोधी रीचरी5का निर्माण करता है। स्पर्श न्यूरॉन्स से एक्सोफर्स कहा जाता है, से निष्कासन ~ 4 माइक्रोन औसत व्यास हैं, चुनिंदा में एमएचरी या अन्य समुच्चय शामिल हैं, और सीधे पड़ोसी हाइपोडर्मिस में वितरित किए जाते हैं, जो आम तौर पर स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स को घेरे रहते हैं। हाइपोडर्मिस लाइसोसोम-आधारित गिरावट का प्रयास करता है, लेकिन कुछ गैर-पचने वाली सामग्री जैसे कि म्हेरी समुच्चय को हाइपोडर्मिस द्वारा जानवर के तरल पदार्थ से भरे छद्म कोकोलोम में फिर से निकाला जा सकता है, जिसमें से रीचेरी को रिमोट मेहतर कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है जिसे दीर्घकालिक भंडारण(चित्रा 1, चित्रा 2) 5के लिए कोलोमोसाइट्स कहाजाताहै।

बड़े एक्सोफर वेसिकल्स स्पर्श रिसेप्टर प्लाज्मा झिल्ली से घिरे कोशिका को छोड़ देते हैं और इसमें एकत्रित मानव रोग प्रोटीन, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम्स हो सकते हैं। एक्सोफ्रेड उत्पादन की प्रक्रिया में संभावित विषाक्त प्रजातियों की छंटाई शामिल प्रतीत होती है (उदाहरण के लिए एक एकत्रीकरण-प्रवण व्यक्त mCherry घुलनशील, GFP जैसे आक्रामक प्रोटीन से अलग किया जाता है जो ज्यादातर न्यूरोनल सोमा में रहता है)। इस तरह, धमकी देने वाली संस्थाओं के निर्देशित निष्कासन को न्यूरॉन 5 द्वारा पूरा कियाजाताहै। एक प्रोटेओस्टेसिस चैलेंज, जैसे ऑटोफैगी नॉकडाउन से प्रेरित तनाव, MG132-मध्यस्थता प्रोटेसोम अवरोध, या मानव रोग प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति जैसे हंटिंगटन रोग से जुड़े विस्तारित पॉलीग्लुटामाइन Q128 या अल्जाइमर रोग-फंसाया टुकड़ा एक1-42,न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं जो एक्सोथर्स5का उत्पादन करते हैं।

के रूप में बहिर्मंडल केवल हाल ही में प्रलेखित किया गया है, क्या उनके जीव विज्ञान गुण विवरण के बारे में जाना जाता है । एक्सोफर्स की खोज की गई थी, और सी एलिगेंस टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स में सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। छह सी एलिगेंस मेकेनोसेंसरी टच न्यूरॉन्स हैं जिनमें शरीर के चारों ओर सेल बॉडी वितरित होती है(चित्रा 3 ए)और माइक्रोट्यूबुल कोशिकाएं कहा जाता है क्योंकि उनके अल्ट्रास्ट्रक्चर में विशिष्ट 15 प्रोटोफिलामेंट माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं। स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स पूर्वकाल एवीएम (पूर्वकाल वेंट्रल माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन), एएलएमआर, और एएलएमएल (पूर्वकाल पार्श्व माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन्स दाएं और बाएं), अधिक केंद्रीय पीवीएम (पीछे वेंट्रल माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन), और पीछे पीएलएमआर और पीएलएम (पीछे पार्श्व माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन्स दाएं और बाएं) हैं। दिलचस्प बात यह है कि छह टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स एक ही आक्रामक ट्रांसजीन(चित्रा 3C)व्यक्त करने के बावजूद, विभिन्न दरों पर एक्सोफर्स का उत्पादन करते हैं। छह मेकेनोसेंसरी टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स में से, एएलएमआर न्यूरॉन अन्य स्पर्श न्यूरॉन्स की तुलना में अधिक बार एक्सोफेरजेनेसिस से गुजरता है। स्पर्श न्यूरॉन्स से बहिर्पोफर संख्या का मात्रातुन इस प्रकार आमतौर पर एएलएमआर पर ध्यान केंद्रित करके स्थापित किया जाता है।

एक्सोफेरजेनेसिस एक गतिशील प्रक्रिया है जो आमतौर पर न्यूरोनल साइटोप्लाज्म(चित्रा 1ए-बी)की सूजन से शुरू होती है। सेलुलर सामग्री, ऑर्गेनेल्स, या प्रोटीन समुच्चय को न्यूरोनल सोमा के एक तरफ एकत्र किया जाता है, जो आमतौर पर एएलएमआर न्यूरॉन के पीछे के अंत (पेश न्यूराइट से दूर) की ओर होता है, जो प्री-एक्सोफेर डोमेन (पीईडी)(चित्रा 1B)बनाता है। शुरुआती फैलाव के रूप में PED बाहर परियोजना शुरू होता है, एक पहचानने योग्य फैला हुआ कली बनाने के रूप में मनाया जाता है । देर से कली को परिभाषित किया जाता है जब पूर्व-बहिर्पोफर डोमेन का व्यापक व्यास सोमा-एक्सोफर गर्दन(चित्रा 1C)के कसना के व्यास से लगभग 1/3 बड़ा होता है। एक्सोफर्स को सोमा से लगभग किसी भी दिशा में बाहर निकाला जा सकता है, लेकिन अधिकांश बहिर्मंडल कोशिका शरीर से पीछे से बाहर निकलते हैं और लगभग उसी फोकल प्लेन में उभरते सोमा के रूप में रहते हैं।

एक्सोफर प्रारंभिक सोमा से दूर जा सकता है क्योंकि कली की गर्दन एक पतली फिलामेंट में संकरी हो गई है। एक्सोफर इस फिलामेंट(चित्रा 1डी, तीर)के माध्यम से सोमा से जुड़े रह सकते हैं और बाद में अलग हो सकते हैं। कैल्शियम, समुच्चय और माइटोकॉन्ड्रिया जैसी सेलुलर सामग्री को इस फिलामेंट के माध्यम से संलग्न एक्सोफर 5 में स्थानांतरित किया जा सकता है, हालांकि एक्सट्रूडेड सामग्री का थोक बड़े पैमाने पर नवोदित घटना द्वारा एक्सोफर डिब्बे में डाल दियाजाताहै। एक्सोफर्स को परिपक्व माना जाता है जब कोई दृश्यमान कनेक्टिंग ट्यूब या पतला फिलामेंट नहीं होता है और एक्सोफर पूरी तरह से भेजने वालेसोमा (चित्रा 1E)से अलग हो जाता है।

सी एलिगेंस टच न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स तुरंत हाइपोडर्मिस का सामना करते हैं, ऊतक जो स्पर्श न्यूरॉन को घेरे हुए हैं। सबसे अधिक, एक्सोफर वेसिकल पूंछ की ओर पीछे हाइपोडर्मिस के भीतर यात्रा करने के लिए प्रकट होता है, और असमा से काफी दूर हो सकता है इससे पहले कि एक्सोफर सामग्री गिरावट के लिए लक्षित दिखाई देती है (उदाहरण के लिए, दूरी सोमा(चित्रा 1F)से ~ 100 माइक्रोन दूर हो सकती है।) । फ्लोरोसेंट एक्सोफेर वेसिकल हाइपोडर्मिस के भीतर कई छोटे वेसिकल्स में टूट जाता है, जिसे "तारों से जड़ा हुआ रात"(चित्रा 1G और चित्रा 2)के रूप में संदर्भित किया जाता है। "तारों से जड़ा हुआ रात" चरण में, मूल एकांत बहिर्मंडल की तुलना में फ्लोरेसेंस के कई छोटे बिंदुओं में हाइपोडर्मल सिंक्यियम में स्पंदित फ्लोरोसेंट सामग्री को देखा जा सकता है। तारों से जड़ा रात कम आवर्धन के तहत पंचाट देख सकते है और उच्च आवर्धन के साथ, punctate और/ तारों से जड़ा रात का फ्लोरोसेंट संकेत आमतौर पर एक्सोफर और न्यूरोली व्यक्त फ्लोरेसेंस(चित्रा 2बी-सी)की तुलना में मंद होता है। कई पंचम वेसिकल्स में रीचेरी के फैलाव को हाइपोडर्मल सेल के एंडोसोमल/लाइसोसोमल नेटवर्क के साथ फागोसोम परिपक्वता और संलयन शामिल करने के लिए सोचा जाता है । कुछ बहिर्मुखी सामग्रियों की संभावना हाइपोडरमल lysosomal नेटवर्क में अपमानित कर रहे हैं, लेकिन अवशिष्ट प्रजातियों है कि गिरावट के लिए प्रतिरोधी है (जैसे mCherry समुच्चय) छद्म कोलोम, एक तरल पदार्थ के डिब्बे है कि सेलुलर मलबे को शामिल कर सकते है में hypodermis से बाहर फेंक दिया जाता है । फ्लोरोसेंट सामग्री को बाद में कोलोमोसाइट्स(चित्रा 2 सी)नामक दूरस्थ मेहतर कोशिकाओं द्वारा ली जाती है, जो ध्यान केंद्रित कर सकती है, स्टोर कर सकती है, और फिर से रीचेरी के क्षरण का प्रयास कर सकती है।

कुल निष्कासन और हस्तांतरण की घटना फिला में संरक्षित दिखाई देती है, सी एलिगेंस5,6, 7और डी मेलनोगेस्टर,8,,,7 9 के साथ-साथ कई स्तनधारी मॉडलों में आनुवंशिक मॉडलों में रिपोर्ट की गई है। स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एक्सोफर जैसे एक्सट्रूज़न की सूचना दी गई है, एक अवलोकन जिसमें यह सुझाव दिया गया है किसंरक्षिततंत्र समग्र और ऑर्गेनेल निष्कासन को कम कर सकता है । एक्सोफ्रेड उत्पादन इस प्रकार सेलुलर मलबे प्रबंधन का एक संरक्षित तंत्र हो सकता है जो एक मौलिक, लेकिन पूर्व में गैर मान्यता प्राप्त, न्यूरोनल प्रोटेओस्टेसिस और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण की शाखा है, जो असंतुलित होने पर, सक्रिय रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में योगदान दे सकता है। मलबे भेदभाव और छंटाई में शामिल अणुओं की पहचान, एक अलग उपकोशिकीय स्थान के लिए परिवहन, निष्कासन, गठन/सोमा और देर से बहिर्पोफर को जोड़ने ट्यूबलर कनेक्शन की कैंची, और एक पड़ोसी सेल द्वारा दूरदराज के क्षरण के लिए बड़े बाहर वेसिकल की मांयता भविष्य के काम के लिए रहते हैं । शारीरिक संदर्भ में भाग लेने वाले अणुओं की पहचान करने के लिए इन मॉडलों द्वारा पेश किए गए निष्पक्ष आनुवंशिक दृष्टिकोणों और शक्तिशाली सेल जैविक उपकरणों का उपयोग करते हुए, समग्र और ऑर्गेनेल संग्रहण और हस्तांतरण के तंत्र को परिभाषित करने के लिए नेमाटोड और फ्लाई मॉडल में अध्ययन गंभीर रूप से महत्वपूर्ण होंगे।

एक्सोफर जीव विज्ञान में ऑपरेटिव तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण पहले कदमों में वीवो एक्सोफर क्वांटिफिकेशन में प्रजनन योग्य के लिए प्रोटोकॉल को परिभाषित करना शामिल है। सी एलिगेंस मॉडल ऐसे प्रयासों के लिए एक विशेष लाभ प्रदान करता है क्योंकि शरीर पारदर्शी है और एक्सोफर्स को आसानी से देखा जा सकता है जब उनमें फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन या ऑर्गेनेल्स होते हैं। एक्सोफर्स को सी एलिगेंस डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स पीडीई और सीईपी, एएसई और एएसईआर संवेदी न्यूरॉन्स, और डाई-फिलिंग एम्फिड न्यूरॉन्स5द्वारा उत्पन्न होने की सूचना दी गई है । क्योंकि टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स सबसे अच्छी विशेषता है, यहां ध्यान एक्सोफर विश्लेषण के लिए टच न्यूरॉन्स के उपयोग पर है। हालांकि बुनियादी दृष्टिकोण किसी भी सेल से बहिर्पोफर उत्पादन को मापने के लिए लागू किया जा सकता है। सी एलिगेंस टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स का पता लगाने और क्वांटिटेट करने के लिए प्रोटोकॉल जो ट्रांसजेनिक रूप से रीचेरी प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, कार्गो पर जोर देने के साथ रेखांकित किए जाते हैं जिन्हें स्कोरिंग में निगरानी और अस्थायी बाधाओं पर जोर दिया जा सकता है। यह लेख वीवो एक्सोफर पहचान की ओर दृष्टिकोण को परिभाषित करता है, और पर्यावरण और आनुवंशिक स्थितियों का मात्रा, जो बहिर्मंडल उत्पादन को संशोधित करता है। प्रोटोकॉल बेसलाइन एक्सोफर उत्पादन के निर्धारण के लिए और जीनोटाइप में तुलना के लिए लगातार गैर-तनाव की स्थिति पर महत्वपूर्ण ध्यान देने पर जोर देते हैं।

Protocol

1. एक्सोफर डिटेक्शन के लिए उपयोगी उपभेद

  1. एक तनाव का चयन करें जो सी एलिगेंस के न्यूरॉन्स के भीतर फ्लोरोसेंट कार्गो को आसानी से एक्सोफर्स की कल्पना करने के लिए व्यक्त करता है।
    नोट: तालिका 1 उन उपभेदों को सूचीबद्ध करता है जिनका उपयोग टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स 5 ,11,,12में उत्पादित एक्सोफर्स की कल्पना करने के लिए किया गया है।5 सिद्धांत रूप में, किसी भी कोशिका या न्यूरोनल प्रकार को फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए सेल या ऊतक विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग करके एक्सोफर उत्पादन के लिए परीक्षण किया जा सकता है जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को एकत्रित करता है या अन्यथा निष्कासन के लिए चुना जाता है।
  2. वैकल्पिक रूप से, एम्फिड हेड न्यूरॉन्स में एक्सोफर्स की कल्पना करने के लिए डाई-फिलिंग परख का उपयोग करें, जो पर्यावरण के लिए खुले हैं और5,,13को बैकफिलिंग करने के लिए उत्तरदायी हैं।

2. ग्रोथ मीडिया

  1. मानक तरीकों के अनुसार संस्कृति उपभेदों के लिए मानक सूत्रकृमि विकास मीडिया (एनजीएम) तैयार करें14,,15
    नोट: भोजन की कमी, या फ्लोरो-डिऑक्सीयूरिडीन (FuDR), आमतौर पर संतान उत्पादन को अवरुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया, और नाटकीय रूप से बहिर्मुखी उत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं । जनसंख्या को लगातार खिलाया जाता है (बैक्टीरियल भोजन थकावट की भी छोटी अवधि से बचें) और जानवरों को निरंतर तापमान पर बनाए रखें।

3. पशुपालन लगातार बहिर्पोफर उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण

  1. लगातार मीडिया पर और लगातार जीवाणु खाद्य स्रोतों के साथ जानवरों को बढ़ाएं। जानवरों को जीवाणु भोजन से बाहर नहीं चलाना चाहिए, यहां तक कि समय की छोटी अवधि के लिए के बाद से खाद्य सीमा नाटकीय रूप से बहिर्मंडल उत्पादन के स्तर को बदल सकते हैं ।
  2. एक अध्ययन के दौरान मीडिया व्यंजनों और तैयारी एक समान रखें।
    नोट: बदलते मीडिया बहिर्पोफर उत्पादन के बेसल स्तर को प्रभावित कर सकते हैं । आगर बैच बेसलाइन एक्सोफर स्तर को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए जब आपूर्ति बहुत बदल जाती है, तो तारीख का नोट करें। स्वस्थ बैक्टीरियल भोजन सुनिश्चित करने और सूखे एगर को रोकने के लिए दो सप्ताह के बाद स्टॉक प्लेटें फेंक दें, जो एक्सोफर स्तर को प्रभावित करने वाले एगर ऑस्मोलैरिटी में परिवर्तन का कारण बनता है।
  3. बेसल स्थितियों के लिए, जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर रखें। चर तापमान पर पशुओं को पालना (यहां तक कि तापमान में अस्थायी परिवर्तन) अधिकतम बहिर्पोफर उत्पादन के समय में भिन्नता पैदा कर सकता है।
    नोट: तापमान परिवर्तनशीलता संस्कृति की स्थिति तक ही सीमित नहीं है । प्रयोगों के दौरान या प्रयोगशाला पीठ पर तापमान में भिन्नता प्रभावशाली हो सकती है। उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप कमरे के भीतर तापमान संस्कृति इनक्यूबेटर या प्रयोगशाला बेंच से नाटकीय रूप से भिन्न नहीं होना चाहिए।
  4. औषधीय विरोधी प्रजनन हस्तक्षेप का उपयोग न करें क्योंकि निषेचित अंडे एक्सोफर्स के प्रारंभिक वयस्क उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं।
    नोट: फ्लोरो-डिऑक्सीयूरिडीन (फ्यूडीआर)16 या सी2217के उपयोग से बचा जाना चाहिए। जीवन-काल या वृद्ध पशु प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, आयु-समकालिक आबादी को शारीरिक रूप से वयस्कों को उनकी छोटी संतान से हटाने के बजाय आम औषधीय विरोधी प्रजनन हस्तक्षेपों का उपयोग करने के बजाय बैक्टीरिया के साथ फैलने वाली ताजा प्लेटों पर उठाकर बनाए रखा जाना चाहिए ।
  5. दूषित संस्कृतियों का उपयोग न करें; जनसंख्या या प्लेट के जैविक समझौते की स्थिति में प्रयोगों को फिर से तैयार करें। बैक्टीरियल या फंगल संदूषण जानवरों में तनाव और मेटाबोलिक परिवर्तन को प्रेरित कर सकता है और प्रायोगिक आबादी से अनुपस्थित होना चाहिए।
    1. प्रजनन योग्य परिणामों को अधिकतम करने के लिए, संभावित पर्यावरण-प्रेरित एपीजेनेटिक परिवर्तनों से बचने के लिए प्रयोग से पहले 20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम दो स्वस्थ, अच्छी तरह से खिलाया, संदूषण मुक्त पीढ़ियों के लिए संस्कृतियों को बनाए रखें।

4. ब्लीचिंग, सुक्रोज प्लवनशीलता, या एल 4 लार्वा पिकिंग द्वारा एक्सोफ्रेस स्कोरिंग के लिए आयु तुल्यकालन

  1. प्रयोगात्मक आबादी को एक ही जैविक उम्र रखें, क्योंकि एक्सोफर डिटेक्शन पैटर्न वयस्क उम्र के साथ भिन्न होते हैं और मिश्रित आयु आबादी के जानवरों की तुलना परिणामों को भ्रमित कर सकती है। हमेशा एल 4 चरण में "सफेद वर्धमान" योनी आकृति विज्ञान की जांच करके प्रयोगात्मक पशु आबादी का सफल सिंक्रोनाइजेशन सुनिश्चित करें।
    नोट: आम तौर पर, सी एलिगेंस मेकेनोसेंसरी एएलएमआर न्यूरॉन्स के लिए पीक एक्सोफर उत्पादन वयस्क दिन 2-3(चित्रा 3 डी)पर होताहै, जैसा कि एल 4 चरण के बाद के दिनों से मापा जाता है। वयस्क दिन 1 एल 4 लार्वा चरण के 24 घंटे बाद है जिसे "सफेद वर्धमान" योनी आकृति विज्ञान(चित्रा 5E)द्वारा प्रतिष्ठित किया जाता है।
  2. ग्रेविड वयस्कों को ब्लीच करके सिंक्रोनाइज्ड अंडे की आबादी तैयार करें।
    1. एनजीएम प्लेट पर उगने वाले जानवरों को धोकर अंडों से भरे ग्रेविड वयस्कों को इकट्ठा करें। धोने के लिए, M9 बफर के 1 एमएल के साथ प्लेट को बाढ़ दें, निलंबित जानवरों के साथ तरल इकट्ठा करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। एक मिनी अपकेंद्रित्र के साथ गुरुत्वाकर्षण बसने या कोमल अपकेंद्रित्र द्वारा गोली जानवरों और सुपरनेट को दूर करें।
    2. एच 2 ओ में 1 मिलीएल में 5एम नाओएच के 150 माइक्रोन और 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) के 150 माइक्रोन जोड़ें और लगभग5मिनट के लिए उलटा करके मिलाएं।
      नोट: ताजा ब्लीचिंग समाधान यह सुनिश्चित करता है कि अंडे की फसल के लिए पशु छल्ली को बाधित किया जा सकता है। क्यूटिकल को बाधित करने में प्रगति की निगरानी एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत की जा सकती है; वयस्कों को इस बिंदु पर अंडे तोड़ना और जारी करना चाहिए कि ब्लीचिंग बंद कर दी जानी चाहिए।
    3. धीरे-धीरे 20 एस के लिए एक मिनीसेंट्रफ्यूज ट्यूब के साथ अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को हटा दें। M9 बफर और अपकेंद्रित्र के 1 mL फिर से जोड़ें, गोली के शीर्ष पर लगभग 100 μL छोड़ दें।
    4. ब्लीच समाधान के निशान को हटाने के लिए दो बार चरण 4.2.3 दोहराएं।
    5. शेष मात्रा में अंडे को फिर से खर्च करें और एक ताजा वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट में स्थानांतरित करें। वयस्कों को lysed किया जाएगा, लेकिन कई व्यवहार्य अंडे तैयारी में होने चाहिए।
  3. समय पर अंडे-वट द्वारा सिंक्रोनाइज्ड आबादी तैयार करें।
    1. मानक हस्तांतरण प्रोटोकॉल14का उपयोग कर एक वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट के लिए 20 ग्रेविड वयस्कों उठाओ ।
    2. जानवरों को स्वतंत्र रूप से क्रॉल करने और 1.5 घंटे के लिए अंडे डालने की अनुमति दें (कम चिंता के आकार वाले उत्परिवर्ती उपभेदों को अधिक वयस्क जानवरों की शुरूआत की आवश्यकता हो सकती है)।
    3. सभी वयस्क जानवरों को प्लेट से हटा दें, सिंक्रोनाइज्ड अंडे की आबादी को पीछे छोड़ दें। कुछ घंटे बाद प्लेटों की जांच करने के लिए सत्यापित करें कि कोई व्यवहार्य वयस्कों वयस्क हटाने के दौरान याद किया गया है ।
  4. अंडे के सुक्रोज प्लवनशीलता चयन द्वारा सिंक्रोनाइज्ड अंडे की आबादी तैयार करें।
    1. पांच एनजीएम प्लेटों से जानवरों और अंडे ले लीजिए जिस पर ग्रेविड जानवर 0.1% डिटर्जेंट (जैसे ट्वीन 20 या ट्राइटन एक्स-100) के साथ M9 समाधान के साथ प्लेटों में बाढ़ करके कम से कम 24 घंटे के लिए अंडे डाल रहे हैं और 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा कर रहे हैं। कमरे के तापमान पर कोमल अपकेंद्रित्र (30 एस के लिए 2,000 x ग्राम) द्वारा गोली वयस्कों।
    2. तीन बार ताजा M9 के 15 एमएल में सुपरनैंट निकालें और जानवरों को धोएं, प्रत्येक धोने के बाद सुपरनैंट को त्याग दें, जानवरों और अंडों में गोली को समृद्ध रखने के लिए सुनिश्चित रहें।
    3. सुपरनेटेंट के 2 एमएल बरकरार रखें और गोली को फिर से रीसस्ट करें। वॉल्यूम सुक्रोज द्वारा 60% वजन का 2 एमएल जोड़ें।
    4. 5 मिनट के लिए 2000 x g पर सेंट्रलाइज। समाधान अब अंडे में अत्यधिक समृद्ध एक ऊपरी चरण प्रदर्शित करेगा।
    5. ऊपरी चरण के लगभग 2.5 एमएल को एक नए 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और एम 9 के 10 एमएल जोड़ें।
    6. 1 मिनट के लिए उलटा द्वारा मिश्रण है, और फिर 1 मिनट के लिए 2000 x ग्राम अपकेंद्रित्र।
    7. सुपरनेट निकालें और M9 में अंडे से समृद्ध गोली धोएं। अंडे-गोली के 10-15 माइक्रोन को एक ताजा OP50-वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट में वितरित किया जा सकता है।
      नोट: यह विधि बड़ी संख्या में अंडे तैयार करती है; एकत्र जानवरों को OP50 ई. कोलाई भोजन से बाहर चलाने के लिए अनुमति न दें।
  5. विकास के L4 चरण में जानवरों को उठा कर सिंक्रोनाइज्ड आबादी तैयार करें।
    1. ऊपर वर्णित के रूप में वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों पर जानवरों को उगाएं।
      नोट: सी एलिगेंस चार असतत चरणों में विकसित होते हैं। 20 डिग्री सेल्सियस पर, एक नए रखे अंडे को हैच करने में लगभग 9 घंटे लगते हैं(चित्रा 5A)। पोस्ट हैच, एक जानवर लार्वा चरण 1 (एल 1) से लार्वा चरण 4 (एल 4) के माध्यम से गुजरता है, प्रत्येक मोल्ट (चित्रा 5ए-एफ)के बीच8-12घंटे तक चलने वाले प्रत्येक चरण के साथ। इसलिए, अंडे के साथ आग लगाकर तैयार एक प्लेट में अंडे पेश किए जाने के लगभग 40 घंटे बाद लेने के लिए कई एल4 जानवर होने चाहिए।
    2. विकासशील योनी(चित्रा 5E)के सफेद आधा चाँद वर्धमान आकार का पता लगाने के द्वारा L4-मंचन जानवरों की पहचान करें ।
      नोट: L4 चरण में पशु आकार में और शरीर रंजकता में एक समान हैं । मंचन जानवरों की परीक्षा के लिए एक ताजा विकास प्लेट के लिए सफेद वर्धमान के साथ जानवरों उठाओ। अगले दिन (~ 24 घंटे बाद) वयस्क दिन 1 के रूप में गिना जाना चाहिए।
    3. वयस्क दिन 2 पर दैनिक जानवरों की आबादी स्कोर।
      नोट: Exophers आम तौर पर वयस्कता के दिन 2 पर रन बनाए जाते हैं, जो बेसल स्थितियों के तहत पीक एक्सोफर उत्पादन है । हालांकि, क्योंकि एक्सोफेजेनेसिस पीक और समय का अध्ययन किया जा रहा है कि पर्यावरण या आनुवंशिक परिवर्तन द्वारा स्थानांतरित किया जा सकता है, यह सबसे व्यापक तस्वीर(चित्रा 3 डी)उत्पन्न करने के लिए चार दिनों में दैनिक वयस्क जानवरों की आबादी स्कोर करने की सलाह दी जाती है ।

5. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक्सोफर्स का पता लगाना

  1. फ्लोरेसेस माइक्रोस्कोपी के लिए आउटफिट किए गए उच्च आवर्धन छद्म-स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक्सोफर्स का निरीक्षण करें।
  2. एनजीएम प्लेटों पर जानवरों को 10-100 m levamisole/tetramisole समाधान के 100-200 μl को एनजीएम आगर प्लेट की सतह पर पिपिंग करके स्थिर करें । 2-4 मिनट के बाद, जानवर लकवाग्रस्त हो जाते हैं और सीधे आगर प्लेट पर देखा जा सकता है।
    नोट: स्थिरीकरण उपचार बिल्कुल आवश्यक नहीं हैं, जैसे कि एक प्रशिक्षित आंख के साथ, न्यूरोनल पहचान और एक्सोफर उपस्थिति नेत्रहीन द्वारा प्लेट पर माइक्रोस्कोप के नीचे रेंगने वाले जानवरों के बाद बनाए जा सकते हैं जब यह निर्धारित करते समय कि एक्सोफर का उत्पादन किया गया है या नहीं।
  3. एक्सोफर्स का विच्छेदन माइक्रोस्कोप का पता लगाने को पूरा करने के लिए 100x के कुल आवर्धन का उपयोग करके फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स का निरीक्षण करें।
    नोट: विच्छेदन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्कोरिंग एक्सोफेर घटनाओं को सीधे आगर प्लेटों पर सापेक्ष आसानी से बड़ी संख्या में जानवरों के अवलोकन के लिए अनुमति देता है जिस पर उन्हें पाला जाता है।
  4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक्सोफर अध्ययन के लिए लाइव इमेजिंग और बढ़ते रिपोर्टर उपभेदों
    1. लाइव-इमेज इंट्रासेलुलर गतिशीलता और एक्सोफेरजेनेसिस की विशेषताओं के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: लाइव इमेजिंग एक्सोफर उत्पादन के सूक्ष्म विवरणों को देखने के लिए एक लाभप्रद दृष्टिकोण है क्योंकि एक्सोफर उत्पादन एक गतिशील प्रक्रिया है।
    2. 10-100 mm पर लेविमिसोल या टेट्रामिसोल का उपयोग या हाइड्रोजेल पॉलीस्टीरिन माइक्रोमोतियों (15 माइक्रोन, 30 माइक्रोन या 40 माइक्रोन के व्यास के साथ)18पर लेविमिसोल या टेट्रामिसोल का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग के लिए पशु आंदोलन को प्रतिबंधित करें।
  5. यौगिक और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड तैयारी
    1. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक स्थिर एजेंट में 20-50 जानवरों माउंट। 13 मिमी व्यास उठाए गए-छल्ले के साथ चित्रित पुन: प्रयोज्य रिंग साइटोलॉजी स्लाइड बढ़ते के लिए उपयोगी होते हैं।
    2. चित्रित सर्कल के भीतर या आगर पैड पर 10-100 एमएल लेविमिसोल या टेट्रामिसोल जैसे लकवा के 5-20 माइक्रोन में जीवित जानवरों को चुनें।
    3. पक्षाघात के लिए 4 मिनट रुको, और फिर एक कवरस्लिप के साथ स्लाइड को कवर (सिफारिश नंबर 11/2 (०.१६-०.१९ मिमी) या नंबर 2 (०.१७-०.२५ मिमी) ।
  6. जानवरों की बढ़ती छोटी संख्या
    1. घुड़सवार जानवरों को कुचलने मत करो; प्रति स्लाइड केवल कुछ (20 से कम) जानवरों को देखते समय, कवरस्लिप के असमान दबाव के कारण कुछ जानवरों को कुचलने का खतरा होता है। बढ़ते के लिए कम प्रतिशत एगरल्ड पैड का उपयोग करके इस जोखिम को कम किया जा सकता है।
    2. 2-4% एगर उठे पैड स्लाइड करें, और फिर पैड में लकवा ग्रस्त समाधान के 2-15 माइक्रोन जोड़ें। ध्यान रखें levamisole और टेट्रामिसोल पैड में फैलाना, उनकी प्रभावी एकाग्रता कम।
    3. जानवरों को लकवा के समाधान या एगर पैड पर आराम करने वाले माइक्रोमोतियों की 2-15 माइक्रोन ड्रॉप में उठाकर माउंट करें। कवरलिप को ऊपर रखें और जांच करें कि जानवर18बरकरार हैं।
  7. आगर पैड तैयारी
    1. 2% आगर पैड तैयार करने के लिए, गर्मी 2% M9 समाधान और माइक्रोवेव में agarose जब तक agarose एक सजातीय और पिघला हुआ राज्य में है ।
    2. पर्याप्त गुणवत्ता के एक आगर पैड को प्राप्त करने के लिए, वैकल्पिक मिश्रण और कम शक्ति पर 20 सेकंड से भी कम समय के लिए microwaving । एक हीटिंग ब्लॉक पर उबलते एगर रखकर और बुलबुले को सतह पर बढ़ने की अनुमति देकर पैड के भीतर हवा के बुलबुले को शामिल करने से बचें।
    3. बढ़ी हुई बुलबुले के नीचे पिघला हुआ समाधान के भीतर गहरे से आगर आकर्षित करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
    4. एक सपाट सतह पर एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के दोनों ओर दो टेप स्लाइड और जगह तैयार करें। टेप स्लाइड बनाने के लिए प्रत्येक स्लाइड पर प्रयोगशाला टेप के दो 5 सेमी स्ट्रिप्स जगह(चित्रा 6A)
    5. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, टेप स्लाइड(चित्रा 6B)के बीच साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड सैंडविच पर आगर की एक बूंद रखें।
    6. ध्यान से और जल्दी से, टेप स्लाइड(चित्रा 6सीसी)भर में रखकर एक चौथी साफ स्लाइड के साथ पिघला हुआ एगर की बूंद को कवर करें ।
      नोट: स्लाइड धीरे से 0.4 मिमी मोटी (टेप की मोटाई)(चित्रा 6D)के बारे में एक चपटा सर्कल में पिघला हुआ एगर प्रेस करना चाहिए। अगर जल्दी ठंडा होना चाहिए।
    7. इसे फिसलने से टॉप स्लाइड निकालें(चित्रा 6E) एगर पैड जल्दी सूख जाते हैं और मिनटों के भीतर सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है। एक बार टॉप स्लाइड निकल जाने के बाद बढ़ते जानवरों के लिए तुरंत जेल पैड का इस्तेमाल करें। हवा के बुलबुले के साथ पैड का उपयोग करने से बचें।
    8. दो ग्लास स्लाइड के बीच 30 मिनट तक आगर पैड स्टोर करें। सूखे आगर जानवरों को एक साथ झुरमुट और desiccate करने के लिए कारण बनता है । लकवाग्रस्त समाधान या माइक्रोमोतियों के 2-15 माइक्रोन के भीतर जानवरों को माउंट करें और कवरस्लिप के साथ कवर करें; पक्षाघात और बढ़ते(चित्रा 6)के 20 मिनट के भीतर स्लाइड स्क्रीन ।
      नोट: क्योंकि तनाव की स्थिति एक्सोफेर दरों को बदल सकती है, ऐसे लकवा से बचें जो एक्सोफर्स के लिए स्क्रीनिंग करते समय ऑक्सीडेटिव तनाव (पूर्व: सोडियम एजाइड) को प्रेरित कर सकते हैं।
  8. कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक्सोफर्स का पता लगाना
    1. 63x और 100x पर 1.4 संख्यात्मक अपर्चर उद्देश्यों के साथ ऑर्गेनेल्स और अन्य सामग्री जैसे सेल जैविक सुविधाओं का निरीक्षण करें।
    2. बहुआयामी अधिग्रहण का उपयोग करते हुए चरण-नियंत्रण और छवि अधिग्रहण में सक्षम सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप और इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर इमेजिंग और डेटा संग्रह के लिए भी उपयुक्त होना चाहिए क्योंकि इन चरणों में मानक इमेजिंग दृष्टिकोण शामिल हैं।

6. स्पर्श न्यूरॉन्स की पहचान करना और घुड़सवार जानवरों के साथ एक्सोफर्स के लिए स्कोरिंग करना

  1. माउंट लकवाग्रस्त वयस्क जानवर(चित्रा 6)।
  2. वांछित जेड-प्लेन की पहचान करें। जानवर के उपयुक्त जेड-प्लेन की पहचान करने के लिए कम आवर्धन उज्ज्वल क्षेत्र (10-40x) का उपयोग करें, जानवर की स्थिति, सिर-पूंछ अभिविन्यास, और योनी के स्थान पर ध्यान दें - जो पार्श्व न्यूरोनल और एक्सोफेर पहचान(चित्रा 3A और चित्रा 5E)के लिए स्थल हैं।
  3. चुने हुए रिपोर्टर के फ्लोरेसेंस सिग्नल पर फोकस करें । एक ही जेड-प्लेन में रहना, चुने हुए साइटोसोलिक रिपोर्टर के लिए 10-40x पर वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस देखने के लिए स्विच करें।
    नोट: इस उदाहरण में फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति एमईसी-4 मेकेनोसेंसरी टच न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित होती है। उच्च प्रतिलिपि सरणी, और विभिन्न फ्लोरोफोरस में अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता होती है और इसलिए वेरिएबल फ्लोरोसेंट तीव्रता होती है। जरूरत पड़ने पर एडजस्ट करें।
  4. फोकल प्लेन में जानवर और फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति की गहराई का निरीक्षण करने के लिए जेड एक्सिस के भीतर स्क्रॉल करें। ऐसा करते समय, सिर-पूंछ अभिविन्यास की पुष्टि करें; हेड/फरीनक्स में फ्लोरोसेंट नर्व रिंग होगी और इस मामले में पूंछ में 1-2 दृश्यमान पीएलएम सोमस(चित्रा 3 ए)होंगे ।
  5. टच न्यूरॉन्स की पहचान करें
    1. पहचानें कि जानवर बाईं ओर घुड़सवार है या दाईं ओर(चित्र 3 ए)।
      नोट: जानवर की 3-आयामीता को ध्यान में रखते हुए, सबसे अच्छा इमेजिंग संकल्प प्रकाशिकी के निकटतम पक्ष पर पूरा किया जाता है।
    2. देख कर सोमा (एएलएम, एएलएमआर, एवीएम) की पहचान करें - तंत्रिका अंगूठी और पार्श्व न्यूरोनल प्रक्रियाओं की पहचान करने के लिए सिर पर शुरू करें।
    3. 10-40x आवर्धन पर, संलग्न प्रक्रिया की पहचान करने के लिए जेड-एक्सिस के माध्यम से धीरे-धीरे स्क्रॉल करें।
    4. एक बार प्रक्रिया की पहचान हो जाने के बाद, योनी की ओर पीछे की दिशा में इसका बाद में पालन करें, जहां सोमा स्पष्ट होगा, प्रक्रिया के अंत में एक गोल सेल शरीर द्वारा चिह्नित। एक बार सबसे अधिक फोकस न्यूरोनल सोमा पाया जाता है, इसे इस प्रकार अन्य न्यूरोनल लैंडमार्क का उपयोग करके पहचाना जा सकता है:
    5. पशु अभिविन्यास को असाइन करने में मदद करने के लिए एवीएम, पास के वेंट्रल न्यूरॉन का उपयोग करें। यदि एवीएम न्यूरॉन एएलएम के समान विमान में है तो पशु अपनी ओर आराम कर रहा है और उस विमान के बाहर न्यूरॉन एएलएमआर है । यदि एवीएम न्यूरॉन प्रश्न में एएलएम के रूप में एक ही विमान में नहीं है, तो फोकल प्लेन के निकटतम स्पर्श न्यूरॉन एएलएमएल है।
    6. पीवीएम न्यूरॉन की पहचान करें, पूंछ के पास स्थित एक और वेंट्रल टच न्यूरॉन, यह इंगित करने के लिए कि पूर्वकाल स्पर्श न्यूरॉन एक ही विमान में है या नहीं। यदि हां, तो स्पर्श न्यूरॉन मनाया ALML है।
    7. अन्य सोमा निकायों की स्थिति की भावना प्राप्त करें, ब्याज के क्षेत्र के पास (सोमा के दोनों ओर स्थित फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स), और सभी जेड-विमानों में, भले ही स्पष्ट ध्यान में सेट गहरे न्यूरॉन प्राप्त करना संभव न हो।
      नोट: सभी स्पर्श न्यूरॉन सोमा की पहचान महत्वपूर्ण है क्योंकि आउट-ऑफ-फोकस सोमा को एक्सोफर्स के लिए गलत किया जा सकता है।

7. एक्सोफर्स के लिए पहचान और स्कोरिंग

  1. एक बार एक स्पर्श न्यूरॉन पाया जाता है, यह बड़े फलाव (एक्सोफर डोमेन) के लिए निरीक्षण करने के लिए काफी बड़े एक कली बहिर्मंडल माना जाता है, (कम से कम 1/5तक पहुंचने के प्रारंभिक सोमा के आकार)(चित्रा 1C)
    नोट: औसत बहिर्मुखी व्यास में 2-8 μm के आसपास उपाय है, जबकि एक के औसत सोमा (ZB4065 bzIs166[पीmec-4::mCherry])पशु उपाय 6-10 दिन में μm 2 वयस्कों(चित्रा 7B)
  2. यदि कोई कली या एक्सोफर डोमेन नहीं देखा जाता है, तो सोमा से निकलने वाले एक संलग्न पतले फिलामेंट के लिए न्यूरोनल सोमा का निरीक्षण करें। संलग्न एक्सोफर्स प्रारंभिक सोमा के करीब और इसी तरह के जेड-प्लेन में स्थित होते हैं।
    नोट: Exophers हमेशा सोमा से जुड़ा नहीं रहता है। एक संलग्न फिलामेंट का पता लगाना एक निश्चित संकेत है कि वस्तु एक बहिर्मंडल है।
  3. एक असंबद्ध बहिर्पोफर की पहचान करने के लिए, एक बहिर्पोध की सामग्री की तलाश करें। एक्सोफर निष्कासित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को केंद्रित कर सकते हैं और इसलिए अक्सर सोमा की तुलना में उज्जवल होते हैं।
    नोट: एक्सोफर्स की सामग्री विषम और चर हैं। लाइसोसोम्स और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे सेलुलर ऑर्गेनेल्स को एक्सोफर्स(चित्रा 4सी-ई)के भीतर भी निकाला जा सकता है।
  4. विमान जिसमें उद्भव सोमा पाया गया था की तुलना में विभिन्न फोकल विमानों में असंबद्ध exophers के लिए देखो । यद्यपि एक्सोफर्स को किसी भी दिशा में एएलएम सोमा से फैलते हुए देखा गया है, यह विशिष्ट है कि बहिर्मंडल न्यूरोनल प्रक्रिया से पीछे की दिशा में सोमा से दूर निकल जाते हैं।
  5. बड़ी, गोलाकार वस्तुओं की जांच करें जो न्यूरोनल सोमस के रूप में तैनात और पहचाने नहीं जाते हैं। बहिर्मंडल अनियमित रूप से आकार का हो सकता है लेकिन आम तौर पर गोलाकार संरचनाएं हैं। एक्सोफर्स समय के साथ अपमानित हो जाते हैं, इसलिए पुराने एक्सोफर्स में अधिक अनियमित आकार होता है।
    नोट: परिपक्व या पुराने बहिर्मंडल को एक्सोफेर्स की उज्जवल फ्लोरेसेंस तीव्रता और उनके गोलाकार आकार के माध्यम से फैलाया गया "तारों वाली रात" चरण से प्रतिष्ठित किया जाता है।
  6. पहले एक्सोफेरजेनेसिस के सबूत के रूप में "तारों से जड़ा रात" फेनोटाइप की जांच करें। एक्सोफर्स एक "तारोंवाली रात" चरण में प्रगति करता है क्योंकि एक्सोफर छोटे वेसिकल्स में टूट जाता है और आसपास के हाइपोडरमिस एक्सोफर सामग्री(चित्रा 1G,2B, 3B और 7A)को नीचा दिखाने का प्रयास करते हैं।
    नोट: तारों से जड़ा रात चरण खंडित और बिखरे हुए (कभी-कभी नेटवर्क) फ्लोरोसेंट संस्थाओं द्वारा चिह्नित किया गया है जिन्होंने संरचनात्मक अखंडता खो दी है और स्पर्श न्यूरॉन्स और एक्सोफेर संरचनाओं की तुलना में एक मंद फ्लोरेसेंस प्रदर्शित करता है।
  7. "कई बहिर्पोफर घटनाओं" के उदाहरणों के लिए देखें। एक्सोफर आमतौर पर एक विलक्षण घटना (1 सोमा से निकलने वाले 1 बहिर्बोध) के रूप में उत्पादित होते हैं, लेकिन कुछ परिस्थितियों में एक से अधिक बहिर्पोफर एक सोमा(चित्रा 7 डी)से जारी किया जा सकता है।
    नोट: परिपक्व बहिर्मंडल कई वेसिकल्स में नीचा कर सकते हैं क्योंकि उन्हें हाइपोडर्मिस में अपमानित किया जाता है। यह भेद करना कि क्या प्रत्येक एक्सोफेर एक स्वतंत्र एक्सोफेरजेनेसिस घटना द्वारा उत्पन्न किया गया था या क्या एक अतिरिक्त वेसिकल बनाने के लिए एक मूल एक्सोफर स्प्लिट केवल समय-चूक अवलोकन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
  8. ध्यान रखें कि सभी रूपात्मक असामान्यताएं बहिर्मंडल में परिपक्व न होएं.
    1. एक एक्सोफर के रूप में एक डिफरेंट सोमा स्कोर न करें। एक विस्तारित या नुकीले सोमा को अवसर पर देखा जा सकता है (विशेष रूप से उम्र के साथ या तनाव में), लेकिन स्पष्ट संकीर्तन स्थल के बिना एक विस्तार एक बहिर्मंडल के रूप में नहीं बनाया जाता है।
    2. छोटी हल कलियों को अस्वीकार करें जो एक्सोफर इवेंट क्वांटिफिकेशन में सोमा के आकार कोप्राप्त नहीं करते हैं।
    3. न्यूराइट आउटग्रोथ को एक्सोफर्स के रूप में न गिनें। परिपक्व न्यूराइट्स उम्र के साथ नाटकीय रूप से विस्तार कर सकते हैं (आमतौर पर न्यूरोनल प्रक्रिया की विपरीत दिशा में) और फ्लोरोसेंट प्रोटीन ऐसी संरचनाओं के डिस्टल अंत में स्थानांतरित हो सकता है19।
      नोट: ये न्यूट्रिशन आउटग्रोथ एक्सोफर नहीं हैं क्योंकि उनके पास दिनों और हफ्तों में एक अलग विकासात्मक पैटर्न है, कलियों का निर्माण नहीं करते हैं, और अलग नहीं करते हैं(चित्रा 7E)।
  9. फ्लोरोसेंट संस्थाओं की पहचान करें जो एक्सोफर नहीं हैं।
    नोट: एक्सट्रूडेड फ्लोरोसेंट इकाई बनाम ऑटोफ्लोरेसेंस की सही पहचान सुनिश्चित करने के लिए पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का एक विचार प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
    1. ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति बनाम ऑटोफ्लोरेसेंस। ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस की गलती न करें। सच एक्सोफर सिग्नल आंत या आंत में नहीं होगा (डीआईसी पुष्टि इन ऊतकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) और एक्सोफर सिग्नल पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस की तुलना में काफी उज्जवल होगा।
      नोट: ऑटोफ्लोरेसेंस आंत कणिका आंतों फ्लोरोसेंट पिगमेंटेशन के कारण होता है और उम्र के साथ जमा होता है। यह विषम है, खासकर विभिन्न तरंगदैर्ध्य के साथ देखा जाता है।
    2. भ्रूण से संकेत। एक्सोफेरजेनेसिस के लिए भ्रूण संकेत गलती न करें। फ्लोरेसेंस से ब्राइटफील्ड रोशनी में स्विच करके और गर्भाशय में अंडे के साथ सिग्नल के संघों की जांच करके भ्रूण संकेत के संदेह की पुष्टि करें।
    3. विमान से बाहर या पास के सोमा शव। अवलोकन की शुरुआत में सभी आस-पास के सोमा निकायों की पहचान करके एक एक्सोफर के लिए विमान सोमा से बाहर निकलने से बचें।
      नोट: यदि एएलएमआर से एक्सोफर के लिए स्कोरिंग करते हैं, तो एवीएम और एएलएमआर सोमस के स्थान की पहचान करें और खाते हैं। सोमा के शरीर की पहचान के बारे में अधिक जानकारी चित्र 3एमें वर्णित है ।

8. स्कोरिंग और आंकड़े

  1. बाइनरी के रूप में स्कोर एक्सोफर्स (हां, एक एक्सोफर/नहीं है, एक्सोफर नहीं है)।
  2. किसी दिए गए न्यूरॉन के लिए एक्सोफर डिटेक्शन को "एक्सोफर-इवेंट" के रूप में विचार करें। एक बहिर्मंडल घटना सोमा या कई बहिर्मंडल के पास एक ही बहिर्मंडल का अवलोकन कर सकती है।
    नोट: अलग-अलग एक्सोफेरजेनेसिस घटनाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए समय-चूक अवलोकन का उपयोग करें।
  3. एक विशेष पहचान कोशिका के अनुसार एक्सोफर घटनाओं की गणना करें क्योंकि विभिन्न कोशिकाएं एक ही दर पर एक्सोफर का उत्पादन नहीं करती हैं (उदाहरण के लिए देखें चित्र 3 सी)। एएलएमआर न्यूरॉन्स यहां वर्णित उपभेदों में सबसे बेसलाइन एक्सोफर का उत्पादन करते हैं और इस प्रकार अक्सर यह स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स से एक्सोफेर क्वांटिफिकेशन के लिए चुना गया सेल होता है।
  4. आंकड़ों के लिए, सामान्य तौर पर, व्यवधान के विश्लेषण के लिए आवश्यक टिप्पणियों की इसी संख्या के साथ प्रति परीक्षण कम से 30 जानवरों के कम से 3 जैविक परीक्षणों का संचालन करते हैं ।
    1. नियंत्रण की तुलना में एक या दो म्यूटेंट/उपचार शामिल कई परीक्षणों के लिए, कोचरान-Mantel-Haenszel परीक्षण पी मूल्यों का निर्धारण करने के लिए उपयुक्त है ।
    2. नियंत्रण की तुलना में उपचार के दो से अधिक म्यूटेंट शामिल परीक्षणों के लिए, किसी भी संख्या में स्पष्ट भविष्यवक्ताओं के लिए महत्व का मूल्यांकन करने के लिए बाइनरी लॉजिस्टिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करना भी उचित है।

Representative Results

कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग एक्सोफर्स को मापने के लिए किया जा सकता है। टच न्यूरॉन एक्सोफर्स को प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग के माध्यम से वीवो में आसानी से कल्पना की जाती है जिसे एक्सट्रूज़न के लिए चुना जा सकता है, ऑर्गेनेल्स की लेबलिंग द्वारा जिसे बाहर निकाला जा सकता है, या सेल झिल्ली को टैग करके। तालिका 1 स्पर्श न्यूरॉन व्यक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की पहचान करता है जिनका उपयोग एक्सोफर्स की निगरानी के लिए किया गया है, जिसमें प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4में शामिल हैं। एक्सोफर्स में बाहर जाने वाली कार्गो में मानव हंटिंगटिन के एन-टर्मिनल डोमेन का एक संलयन विस्तारित पॉलीग्लोटामाइन (Q128)(चित्रा 4B),लाइसोसोम्स जो जीएफपी-टैग किए गए हैं, लाइसोसोम्स से जुड़े झिल्ली प्रोटीन (एलएमपी-1)(चित्रा 4C)और मैट्रिक्स-स्थानीय जीएफपी(चित्रा 4D)के साथ टैग किया गया है। साइटोप्लाज्मिक जीएफपी को दृढ़ता से निष्कासित नहीं कियाजाताहै और इसे सोमा 5 में अधिमानतः बनाए रखा जाता है, हालांकि जीएफपी एक्सोफर्स(चित्रा 4 ए)की कमजोर कल्पना कर सकता है। जब जीएफपी को निष्कासित किए गए प्रोटीन से जोड़ा जाता है, तो इस टैग का उपयोग एक्सोफर्स की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण बात यह है कि विभिन्न प्रोटीनों को टैग करके, विशिष्ट कार्गो और ऑर्गेनेल्स के निष्कासन पर सवालों की एक बड़ी श्रृंखला, साथ ही एक्सोफर्स बनाने वाले प्रोटीन और झिल्ली पर, संबोधित किया जा सकता है।

एक छद्म-स्टीरियोमाइक्रोस्कोप सेटअप आगर प्लेटों पर जानवरों में एक्सोफर्स को देखने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। यह सेटअप यौगिक और स्टीरियोस्कोपिक तकनीक का एक संकर है जिसमें प्रत्येक आवर्धन, छद्म-स्टीरियो प्रौद्योगिकी (स्टीरियोस्कोपिक आधार पर असतत उद्देश्य) पर उच्च संख्यात्मक एपर्चर प्रकाशिकी और स्थापित उद्देश्यों के लिए मध्यवर्ती आवर्धन पर देखने के लिए एक ज़ूम ऑपरेटिंग स्विच शामिल है। इस तरह के रूप में एक माइक्रोस्कोप 10x आईपीस और उच्च थ्रूप स्कोरिंग के लिए न्यूरोनल आकृति विज्ञान और बहिर्मंडल उत्पादन (स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल 2x उद्देश्य/

जबकि मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की आवर्धन क्षमताओं में आम तौर पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले स्पर्श न्यूरॉन्स के नेटवर्क को देखने के लिए उच्च पर्याप्त संकल्प होता है, मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप सोमा के ट्यूबलर कनेक्शन जैसे बहिर्कोष के उपकोशिक विवरणों को देखने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। इस तरह की टिप्पणियों के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता होती है (उपकरण विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

एक्सोफर क्वांटिटेशन अध्ययनों को प्रयोगात्मक तनावों को खत्म करने के लिए सख्त नियंत्रण की आवश्यकता होती है। प्रजनन योग्य बहिर्मंडल उत्पादन के लिए लगातार विकास स्थितियों के चौकस रखरखाव की आवश्यकता होती है। अधिक विशेष रूप से, बहिर्पोफर उत्पादन तनाव-उत्तरदायी है जैसे कि पीढ़ियों में लगातार भोजन, निरंतर तापमान और संदूषण मुक्त विकास प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं। एमसीएचरी की उच्च न्यूरोनल अभिव्यक्ति के साथ बेसल विकास की स्थिति के तहत, एक्सोफर उत्पादन अपेक्षाकृत कम है (एएलएमआर का 5-25% एक्सोफर्स का उत्पादन करता है) लेकिन ओस्मोटिक और ऑक्सीडेटिव तनाव सहित कुछ तनाव, बहिर्मंडल दरों में वृद्धि कर सकते हैं। जबकि mCherry अभिव्यक्ति तनाव के रूप में के बारे में सोचा जा सकता है, बहिर्पोष के स्तर के तनाव संवेदनशीलता का एक परिणाम यह है कि, अगर ठीक से नियंत्रित, प्रयोगात्मक तनाव परिचय और अधिक आसानी से प्रेरित करने और बहिर्मंडलेपी का निरीक्षण करने के लिए एक रणनीति हो सकती है ।

समय और प्रत्याशित एक्सोफर उत्पादन का स्तर। लार्वा विकास के दौरान एक्सोफर्स लगभग अनुपस्थित हैं। युवा वयस्क जीवन में पीक एक्सोफर उत्पादन की अवधि वयस्क दिनों 1-4 के दौरान अत्यधिक प्रतिबंधित प्रतीत होती है, जो आमतौर पर वयस्क दिन 2 या 3 पर स्पष्ट होती है। क्योंकि चोटी आगे या वापस एक छोटे से बदलाव कर सकते हैं, एक बहिर्पोफर उत्पादन प्रोफ़ाइल का सबसे पूरा मूल्यांकन वयस्क दिनों 1-4 पर दैनिक कई परीक्षणों स्कोर करने के लिए है । सामान्य तौर पर, एक एएलएमआर एक प्रमुख बहिर्मंडल का उत्पादन करता है, जिसमें वेसिकल कम से कम 24 घंटे तक बना रहता है। एक्सोफर का उत्पादन काफी जल्दी (अपने सबसे तेज मिनटों के क्रम पर) किया जा सकताहै। सबसे अधिक, प्रारंभिक वयस्क जीवन में न्यूरॉन के अनुसार केवल एक प्रमुख बहिर्बोधक का उत्पादन किया जाता है, लेकिन कई एक्सोफर का उत्पादन संभव है।

बेसल स्थितियों के तहत रीचरी व्यक्त करने वाले एएलएमआर द्वारा सामान्य बहिर्मंडल उत्पादन में वयस्क दिन 2-3(चित्रा3 डी) की इष्टतम समय सीमा के भीतर जांच किए गए एएलएमआर के 5-25% से लेकर है। प्रोटेओस्टेसिस संकट5,साथ ही अन्य तनावों के संपर्क में एक्सोफर स्तर को मिला सकते हैं। तनाव या आनुवंशिक क्षोभ एक्सोफर एक्सोफेर एक्सट्रूशन का उत्पादन करने वाले एएलएमआर न्यूरॉन्स के 90% तक उच्च दरों का पता लगाने के लिए एक्सोफर उत्पादन में वृद्धि कर सकते हैं।

एक्सोफेरजेनेसिस में विशिष्ट जीन की भूमिकाओं के परीक्षण के लिए फीडिंग-आधारित आरएनएआई। नेमाटोड सी एलिगेंस आमतौर पर जानवरों को खिलाने से आरएनएआई के अधीन होता है ई. कोलाई तनाव HT115 जो ब्याज20के जीन को लक्षित करते हुए एक डबल फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को व्यक्त करता है। HT115 बैक्टीरिया का इस्तेमाल किया जा सकता है जब आरएनएआई5खिलाने में बहिर्मंडल के लिए स्कोरिंग । जबकि अधिकांश ऊतकों में टेप इस तकनीक का उपयोग कर आरएनएआई द्वारा लक्षित किया जा सकता है, न्यूरॉन्स अधिक रिफ्रैक्टरी हैं। आरएनएआई के प्रति संवेदनशीलता को उन जानवरों का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जा सकता है जो न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर के तहत ट्रांसजेनिक डीएसआरएनए ट्रांसपोर्टर सिड-1 को व्यक्त करते हैं। इस तरह न्यूरोनल टिश्यू को आरएनएआई21के प्रति संवेदनशील किया जा सकता है .

ब्याज के जीन के ऊतक-विशिष्ट नॉकआउट को उस घटक में कमी वाले उत्परिवर्ती के भीतर अंतर्जात आरएनएआई चयापचय के घटक को व्यक्त करके पूरा किया जा सकता है। उदाहरण के लिए: Argonaute प्रोटीन RDE-1 विशेष रूप से rde-1 उत्परिवर्ती जानवरों के न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जा सकता है केवल न्यूरॉन्स में ब्याज की एक जीन के नॉकआउट प्राप्त करने के लिए जब जानवरों के एक RNAi हस्तक्षेप है कि जीन को लक्षित करने के संपर्क में हैं ।

मानक सूत्रकृमि आरएनएआई प्रोटोकॉल20,,22का उपयोग करना, एल 4 चरण में माता-पिता के जोखिम को आरएनएआई में और उनकी संतान को उपभोगित HT115 बैक्टीरिया विकसित करने की अनुमति देता है जब तक कि वयस्कता मजबूत आनुवंशिक दस्तक उत्पन्न नहीं करती है लेकिन आरएनएआई द्वारा प्रेरित संभावित विकासात्मक देरी पर ध्यान दे सकती है क्योंकि प्रयोगात्मक जानवर एक खाली वेक्टर नियंत्रण से अलग हो सकते हैं। नकारात्मक नियंत्रण तुलना के लिए हमेशा खाली वेक्टर नियंत्रण को शामिल करना महत्वपूर्ण है। RNAi खिलाने में एक्सोफर्स के लिए स्कोरिंग करते समय HT115 बैक्टीरिया का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, ध्यान दें कि आरएनएआई एक्सपोजर5की छोटी अवधि के दौरान भी कुछ जीन एक्सोफेरजेनेसिस दरों को बदलने में प्रभावी होते हैं। यदि कुछ जीन को लक्षित करने से विकासात्मक विफलता होती है, तो जानवरों को आजीवन नॉकआउट में उजागर करने से बचें, जानवरों को एल4 से वयस्क D2 या D3 तक जोखिम के लिए RNAi प्लेटों पर L4 चरण में उठाया जा सकता है।

तनाव का नाम जीनोटाइप विवरण एक्सोफेर प्रतिशत संदर्भ
एसके4005 zdIs5 [पीmec-4GFP] स्पर्श न्यूरॉन्स में जीएफपी की साइटोसोलिक अभिव्यक्ति। 1-8% एएलएम चित्रा 4A, मेलेंटिजेविच 2017
ZB4065 bzIs166 [पीmec-4::mCherry] टच न्यूरॉन्स में रीचेरी (bzIs166) का अतिव्यवसाईन, साइटोसोलिक सिग्नल और रीचेरी समुच्चय दोनों पैदा करता है। bzIs166 एक बहिर्मंडल प्रेरक है। रीचेरी एग्रीगेट्स एक्सोफेरजेनेसिस के भविष्यवक्ता हैं और अधिमानतः एक्सोफेर्स में बाहर निकाले जाते हैं। 3-20% एएलएम (सामान्य स्थिति) । 20-80% एएलएम (उपवास की स्थिति)। चित्रा 4B, मेलेंटिजेविच 2017
ZB4067 bzIs167 [पीmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1 [Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp लिन-15 +]; वाईएफपी साइटोसोलिकली लेबल एमईसी-7 टच न्यूरॉन्स। सह-व्यक्त Q128:: CFP विस्तार को एकत्रित करता है और उत्तेजित करता है। सीएफपी अधिमानतः चुप्पी साध लेता है । ~ 25% चित्रा 4C, मेलेतिजेविक 2017
ZB4509 bzIs166 [पीmec-4mCherry]; bzIs168 [पीmec-7LMP-1::GFP] bzIs168 LMP-1:: GFP लेबल प्लाज्मा झिल्ली और lysosomal झिल्ली। bzIs168 का उपयोग न्यूरोनल झिल्ली, एक्सोफर्स (जैसे वे झिल्ली बंधे होते हैं), और लिसोसोमल-झिल्ली संरचनाओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। 3-20% एएलएम चित्रा 4D, मेलेंटिजेविक 2017
ZB4528 bzIs166 [पीmec-4mCherry]; zhsEx17 [पीmec-4mitoLS::ROGFP] एलील zhsEx17 एक माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीय रिपोर्टर है जो स्थानीय ऑक्सीडेटिव वातावरण के अनुसार 405एनएम (ऑक्सीडाइज्ड) से 476एनएम (कम) तक अपनी चोटी की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य को बदलता है। यह स्पर्श न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और स्पर्श न्यूरॉन्स में और माइटो-एक्सोफर्स में माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करने के लिए अपने आप इस्तेमाल किया जा सकता है। 3-20% एएलएम प्रोटेओ-एक्सोफर। % एएलएम मिटो-एक्सोफेर क्वांटिटेशन प्रगति में। चित्रा 4E, मेलेंटिजेविक 2017, तोप 2008, घोष 2013

तालिका 1. स्पर्श न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए उपयोग किए गए उपभेदों, स्पर्श न्यूरॉन-एक्सोफर्स, और एक्सोफर सामग्री।

Figure 1
चित्रा 1: एक्सोफेरजेनेसिस के चरण। एक्सोफर बनाने और बाहर निकालने की प्रक्रिया को 'एक्सोफर-उत्पत्ति' कहा जाता है। एक्सोफर गठन की गतिशील प्रक्रिया में कई मिनट से लेकर कई घंटे तक का समय लग सकता है। चित्रित एक उच्च एक्सोफेजर उत्पादन तनाव, ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry] में गतिशील एक्सोफेरजेनेसिस प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट चरणों में सोमा और एक्सोफेर आकृति विज्ञान के उदाहरण हैं। सभी छवियों के दिन के हैं 2 वयस्क एएलएम न्यूरॉन्स एक 100x उद्देश्य के साथ लिया. (A)सामान्य सोमा। वयस्क मेकेनोसेंसरी टच न्यूरॉन एएलएम ट्रांसजेनिक रूप से पीएमईसी-4मचेरी व्यक्त करता है। चित्रित सोमा आकृति विज्ञान इस तनाव में युवा वयस्क न्यूरॉन्स की खासियत है, साइटोप्लाज्म में mCherry सांद्रता के साथ। (ख)अर्ली कली फेज । एक्सोफेरजेनेसिस के पहले अवलोकन योग्य कदम में सोमा झिल्ली के किनारे पर चयनित साइटोप्लाज्मिक सामग्री का ध्रुवीकरण शामिल है। यह कदम अक्सर सोमा के विस्तार या सूजन के साथ होता है। स्पर्श न्यूरॉन्स के मामले में, पूर्व-एक्सोफर डोमेन (पीईटी) आसपास के हाइपोडरमिस (यहां दिखाई नहीं देता) में फैली हुई है। शुरुआती कली डोमेन में रीचेरी सामग्री की अधिक एकाग्रता पर ध्यान दें। (ग)लेट कली फेज । आगे सेलुलर ध्रुवीकरण और पूर्व-बहिर्मंडल डोमेन के विस्तार पर, सोमा और एक्सोफर (तीर) के बीच एक कसना स्पष्ट हो जाता है। यह घटना देर कली चरण में संक्रमण का संकेत देती है। हालांकि देर कली चरण में सेल एक स्पष्ट संकीर्तन स्थल और अलग सोमा और एक्सोफर डोमेन प्रदर्शित करता है, यह अभी तक सोमा से पूरी तरह से बंद नहीं है; नवोदित बहिर्पोफर एक मोटी डंठल (तीर) से जुड़ा हो सकता है। नवोदित डोमेन एक प्रारंभिक बहिर्बोध माना जाता है जब प्रश्न में एक्सोफर डोमेन का व्यास निर्माण स्थल/डंठल के व्यास से लगभग 1/3 बड़ा होता है । (घ)अर्ली-एक्सोफर फेज । शुरुआती एक्सोफर्स को प्रस्थान करने वाले सोमा से डंठल से जोड़ा जा सकता है- इस कनेक्शन का व्यास पतला हो सकता है क्योंकि एक्सोफर सोमा से दूर जाता है। साइटोप्लाज्मिक सामग्री को सोमा से इस ट्यूब के माध्यम से एक्सोफर में स्थानांतरित किया जा सकता है, हालांकि अधिकांश सामग्री नवोदित की प्रक्रिया के दौरान भरी हुई होती है। एक्सोफर्स सोमा से अलग हो सकते हैं जैसा कि(ई)में दर्शाया गया है, अलग-अलग एक्सोफर्स को परिपक्व एक्सोफर्स(एफ) माना जाता है। परिपक्व बहिर्पोष आसपास के हाइपोडरमल ऊतक के माध्यम से पारगमन कर सकते हैं, प्रस्थान सोमा से दूर जा रहे हैं । (जी)हाइपोडरमिस सामग्री के बिखरे हुए पंचक उपस्थिति में मचेरी-लेबल वाले एक्सोफर का टूटना, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि यह हाइपोडरमल एंडोलेसोसोसोमल नेटवर्क में प्रवेश करता है। फैलाया हुआ समयनिष्ठ संकेत को "तारों की रात" चरण कहा जाता है। कुछ एक्सोफर सामग्री का क्षरण हाइपोडरमल लाइसोसोम्स द्वारा पूरा किया जाता है, लेकिन कुछ सामग्री पूरी तरह से अपमानित नहीं होती है और अक्सर हाइपोडरमिस द्वारा छद्म कोलोम में फिर से बाहर निकाला जाता है। एक्सोफेरजेनेसिस रीचरी ट्रांजिट को चित्र 2में अधिक विस्तार से वर्णित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सोफर्स में टच न्यूरॉन्स से बाहर निकाले गए रीरी आसपास के हाइपोडरमल लिसोसोमल नेटवर्क को संलग्न करते हैं, लेकिन बाद में छद्म कोकोलोम में बाहर निकाला जा सकता है जहां कोलोमोसाइट्स म्हेरी को स्टोर/नीचा कर सकते हैं। (A)कार्टून सारांश कैसे mCherry exophers में बाहर निकाला न्यूरॉन्स द्वारा निष्कासन के बाद शरीर पारगमन । एक्सोफेरजेनेसिस के दौरान चयनित सेलुलर सामग्री जैसे कि रीचेरी न्यूरोनल और हाइपोडर्मल प्लाज्मा झिल्ली से घिरे एक स्वतंत्र वेसिकल में भेजने वाले न्यूरोनल सोमा से स्थानीयकृत और कली हो जाती है। चूंकि स्पर्श न्यूरॉन्स हाइपोडर्मल ऊतक में एम्बेडेड होते हैं, क्योंकि एक्सोफर डोमेन बाहर की ओर बढ़ता है यह हाइपोडर्मिस में आगे बढ़ता है। बहिर्मंडल हाइपोडर्मिस को पारगमन कर सकता है, और घंटों से दिनों के बाद, एक्सोफर सामग्री हाइपोडर्मिस के एंडोइसोसोमल नेटवर्क के भीतर टुकड़ा कर सकती है। एमसीएचरी हाइपोडर्मिस में बिखरे हुए समयनिष्कर्म के रूप में दिखाई दे सकता है, जिसे "तारों से जड़ा गया रात" नामक एक मंच है। कुछ दिनों के बाद, कुछ रीचेरी हाइपोडरमिस से आसपास के छद्म कोकोलोम में गुजर सकते हैं, जहां कोलोमोसाइट्स नामक मेहतर कोशिकाएं एक्सेस प्राप्त कर सकती हैं, और रीचेरी ले सकती हैं जिन्हें संग्रहीत किया जा सकता है। (ख)तारों से जड़ा रात mCherry vesicles की उपस्थिति का उदाहरण । एक एएलएम सोमा की छवि बड़े एक्सोफ्रेस टुकड़े और तारों से जड़ा रात vesicles के साथ mCherry के साथ टैग किया । तनाव ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry] है । (ग)दूर कोलोमोसाइट्स में रीचेरी एकाग्रता का उदाहरण। एक वयस्क पशु दिन का साइडव्यू तनाव ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry] coelomocytes (तीर) में केंद्रित mCherry दिखा । कुछ तारों से जड़ा नाइट वेसिकल्स भी स्पष्ट हैं। सामान्य रूप से कोलोमोसाइट एकाग्रता जीवन के लगभग वयस्क दिन 5 के बाद स्पष्ट हो जाती है। (बीबॉटम) (बी)के कार्टून प्रजनन, स्पर्श न्यूरॉन्स और लाल रंग में उल्लिखित प्रक्रियाओं के साथ, के रूप में प्रतिभाशाली बहिर्पोफर टुकड़े कर रहे हैं; विभिन्न जेड-गहराई के बिखरे हुए छोटे वेसिकल्स हल्के गुलाबी रंग में दिखाए जाते हैं। (सीनीचे) (सी)की छवि का कार्टून संस्करण, लाल रंग में न्यूरोनल प्रक्रिया दिखाता है, गुलाबी और हरे रंग में कोलोमोसाइट्स में तारों से जड़ा हुआ रात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: मेकेनोसेंस्टरी टच न्यूरॉन्स एक सटीक लौकिक प्रोफ़ाइल के साथ विभिन्न स्तरों पर एक्सोफर्स का उत्पादन करते हैं। (क)(शीर्ष) पम्पिंग फैरिंक्स और जानवर के सिर पर न्यूरॉन-सघन तंत्रिका अंगूठी, मध्य शरीर पर योनी और पतला पूंछ सहित सी एलिगेंस के प्रमुख शारीरिक स्थलों के स्थानिक संबंध में मेकेनोसेंस्टरी टच न्यूरॉन्स का कार्टून चित्रण। (नीचे) फ्लोरोसेंटली ने जीएफपी को ऊपर और बाईं ओर से देखे जाने वाले स्पर्श न्यूरॉन्स को लेबल किया (वर्मएटलास से अनुकूलित छवियां)। लाल बॉक्स उस क्षेत्र को दर्शाता है जहां एएलएम एक्सोफर्स आमतौर पर स्थित होते हैं। (ख)मध्य निकाय क्षेत्र का उच्च आवर्धन दृश्य जिस पर एएलएम-व्युत्पन्न एक्सोफर्सेशन [पीएमईसी-4मचेरी] को व्यक्त करने वाले तनाव में उत्पादित किया जाता है । एवीएम और एएलएमआर न्यूरॉन को चित्रित किया गया है, और दिखाया गया है कि एमचेरी तारों से जड़ा हुआ रात के साथ एक एएलएमआर एक्सोफर है। एएलएमआर न्यूरॉन्स सबसे आसानी से एक्सोफर्स का उत्पादन करते हैं। (ग)एएलएमआर मेकेनोसेंसरी टच न्यूरॉन्स बेसल परिस्थितियों में हर्मेफ्रोडाइट्स में अन्य टच न्यूरॉन्स की तुलना में अधिक आसानी से एक्सोफर्स का उत्पादन करते हैं । Mechanosensory स्पर्श न्यूरॉन एक्सोफर उत्पादन वयस्क दिन 2 पर, के रूप में व्यक्तिगत स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स के लिए रन बनाए संकेत दिया है । तनाव: ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry], एन एंड जीटी;150, त्रुटि सलाखों SEM हैं ।(D)ALMR स्पर्श न्यूरॉन्स किशोर L4 चरण या उंनत आयु में जानवरों के साथ तुलना में वयस्कता के 2 और 3 दिनों के दौरान अधिक बहिर्वाह का उत्पादन । तनाव: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, त्रुटि सलाखों SEM हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कुछ फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के उदाहरण जो एक्सोफर सामग्री को टैग करते हैं। एक्सोफर्स का निरीक्षण करने का एक सीधा तरीका ट्रांसजेनिक जानवरों का निर्माण करना है जो न्यूरोनल प्रमोटरों से फ्लोरोफोरस व्यक्त करते हैं। फ्लोरोफोरस एक्सोफ्रेयर और ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए अनुमति देता है जो एकत्रीकरण और/या प्रोटेओस्ट्रेस को प्रेरित करता है जो एक्सोफेरजेनेसिस को बढ़ाता है । एम्फिड न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स को भी देशी परिस्थितियों में देखा जा सकता है, दृश्य के लिए डाई भरने का उपयोग करके। दिखाए गए आम उपभेदों के उदाहरण हैं जिनका उपयोग एक्सोफर्स, (ई) एक्सोफर, (एस) सोमा का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। (A)सोमा और तनाव SK4005 zdIs5[पीmec-4GFP], 100x उद्देश्य फोटोग्राफी के लिए इस्तेमाल के एक वयस्क के एक एएलएम से, पैमाने पर बार 3μm । इस तनाव में, घुलनशील जीएफपी शामिल एक्सोफर्स को मापा जाता है, लेकिन एक्सोफ्रेस उत्पादन कभी-कभी होता है। अन्य अध्ययनों में एक्सोफर्स में अधिमानतः बाहर निकाले जा सकते प्रोटीन के लिए जीएफपी को फ्यूज करना इस बात की पुष्टि करता है कि जीएफपी संलयन परिपक्व बहिर्मंडल में पाया जा सकताहै। (ख)एएलएम सोमा और तनाव ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry] के एक वयस्क के बहिर्मुखी, जो mCherry व्यक्त करता है और स्पर्श न्यूरॉन बहिर्मंडल उत्पादन लाती है । 100x उद्देश्य फोटोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया, स्केल बार 5 μm। (C)एएलएम सोमा और तनाव ZB4067 bzIs167[पीmec-4mitogfp पीmec-4mCherry4] के एक वयस्क के बहिर्मुखी; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp लिन-15+]; Htt57Q128 की छवि के लिए उपयोग किया जाने जाने वाले चयनात्मक नीले चैनल::CFP। एक्सोफर में htt57Q128 शामिल हैं:: CFP समुच्चय (तीर), जो सोमा की तुलना में बहिर्मंडल में अधिक केंद्रित दिखाई देते हैं। 40x उद्देश्य फोटोग्राफी, स्केल बार 5μm के लिए इस्तेमाल किया। (D-E) एक्सोफर्स में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ ऑर्गेनेल्स और ऑर्गेनेल-स्पेसिफिक टैगिंग हो सकती है, जो ऑर्गेनेल एक्सट्रूसेशन की निगरानी में सक्षम बनाता है। (घ)Lysosomal झिल्ली टैग LMP-1:: GFP सोमा और बहिर्मंडल झिल्ली और टैग प्लाज्मा झिल्ली कमजोर रूपरेखा (प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण lysosomal लक्ष्यीकरण के रास्ते पर एक तस्करी कदम है) और लेबल lysosomal organelles दृढ़ता से । दिखाया गया है कि एक वयस्क एएलएम सोमा सह-एक्सप्रेसिंग पीएमईसी-4एमएचरी और पीएमईसी-7एलएमपी-1:: जीएफपी है जो झिल्ली और लाइसोसोम्स को स्थानीयकृत करता है। सोमा में एक्सोफर के टुकड़े (तीर) होने की संभावना वाले अन्य छोटे एक्सोफर के साथ एक संलग्न एक्सोफर है। जीएफपी सकारात्मक संरचनाएं सोमा में शामिल हैं और बड़े एक्सोफेर में मौजूदहैं, तनाव: ZB4509 bzIs166 [पीmec-4mCherry];bzIs168[Pmec-7LMP-1:GFP]। 100x उद्देश्य फोटोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया, स्केल बार 5 μm। ई)सोमा और एक्सोफर्स में माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करने के लिए एक माइटोकॉन्ड्रियल जीएफपी मार्कर का इस्तेमाल किया जा सकता है। दिखाया गया है कि एक वयस्क एएलएम सोमा है जो पीएमईसी-4मचेरी और मिटो:: रोगएफपी को व्यक्त करता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स का स्थानीयकरण करता है। मिटो:: ROGFP अकेले व्यक्त, mCherry के बिना, भी आसानी से न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और exophers कि माइटोकॉन्ड्रिया शामिल है के लिए स्कोर । तनाव: ZB4528 bzIs166[पीmec-4mCherry]; zhsEx17 [पीmec-4mitoLS::ROGFP]। फोटोग्राफी के लिए उपयोग किया जाने वाले 100x उद्देश्य; स्केल बार 5μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सी एलिगेंस और एल 4 पहचान का विकास चक्र। (क)20 डिग्री सेल्सियस पर एक अंडा लगभग 9 घंटे लगते है एक बार मां द्वारा रखी हैच । (ख)एक नया रची जानवर लार्वा चरण 1 (L1) में है और 12 घंटे के बाद एक L2 लार्वा में मोल्ट । (ग)पशु एल2 में रहते हैं और(डी)एल 3 लार्वा चरणों के बारे में 8 घंटे के लिए प्रत्येक । (ङ)किशोर जानवरों को चौथा लार्वा चरण (एल4) माना जाता है और उन्हें एक विशिष्ट विकासशील योनी द्वारा चिह्नित किया जाता है जो मध्य शरीर के पास एक सफेद वर्धमान के रूप में दिखाई देता है। इस की उपस्थिति जबकि वर्धमान आसान पहचान और L4 मंचन जानवरों के उठा सक्षम बनाता है सिंक्रोनाइज्ड संस्कृतियों है कि बाद में बहिर्पोफर के लिए स्कोरिंग की सुविधा स्थापित करने के लिए । जानवर ग्रेविड वयस्कों में अपने अंतिम मोल्ट से पहले लगभग 10 घंटे तक एल 4 चरण में रहते हैं, एफ)अंडे विकसित करके पहचाना जाता है, दिखाई देने वाला शुक्राणु, और अंडे बिछाने की शुरुआत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: माइक्रोस्कोप स्लाइड आगर पैड की तैयारी। (क)शीर्ष पर लंबाई के साथ रखी प्रयोगशाला टेप की एक पट्टी के साथ दो स्लाइड तैयार करें । चित्र के रूप में बीच में एक गैर टेप माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें । ) स्लाइड के शीर्ष पर पिघला हुआ agarose की एक बूंद रखें । (ग)ड्रॉप के शीर्ष पर धीरे से एक साफ स्लाइड रखें, एग्रास को एक हवा निकाल सर्कल पैड में दबाएं। (घ)टेप स्लाइड्स को हटा दें, जो एक भी पैड बनाने के लिए आवश्यक आगर के एक भी सपाट को पूरा करने के लिए कार्य करते हैं । (ई)एक बार एगरेग्याड पैड सूख जाने के बाद टॉप स्लाइड निकालें । (च)पिपेट एगर पैड के शीर्ष पर एक लकवाग्रस्त समाधान (लेविमिसोल या टेट्रामिसोल) । (जी)उचित रूप से झोला-लकवा में जानवरों का मंचन करें । (ज)धीरे से एक कवरलिप के साथ जानवरों को कवर और सुनिश्चित करें कि जानवरों को जीवित हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एक्सोफर और एक्सोफर पहचान मानदंडों के पात्र। (ए)सामान्य मानदंड जो एक बहिर्पोढ़ की पहचान करते हैं। (ख)भेजने वाले सोमा और निकाले गए एक्सोफर के बीच व्यास तुलना, माइक्रोन में मापा जाता है । वयस्क एएलएम सोमास, एन = 35, तनाव: ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry]-६.५३ माइक्रोन औसत आकार सोमा और ३.८३ माइक्रोन औसत आकार exopher । (ग)एक्सोफेर डोमेन और नवोदित बहिर्मंडल के बीच अंतर करने के लिए मानदंडों को परिभाषित करना । (घ)सबसे अधिक, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स एक बड़ा बहिर्मंडल बनाते हैं, जो बाद में विभाजन या टुकड़े के रूप में हाइपोडर्मिस अपनी सामग्री को नीचा दिखाने का प्रयास करता है । फिर भी, एक स्पर्श न्यूरॉन के बगल में कई एक्सोफर्स देखे जा सकते हैं जो एक न्यूरॉन से या वैकल्पिक रूप से कई एक्सोफर घटनाओं से प्राप्त हो सकते हैं, एक्सोफर्स भी खुद को कली या टुकड़ा कर सकते हैं। कई एक्सोफर जैसी संस्थाओं की उत्पत्ति केवल समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। शीर्ष एक दूर बहिर्पोफर के साथ एक ALMR स्पर्श न्यूरॉन सोमा दर्शाया गया है। नीचे एक एएलएमआर स्पर्श न्यूरॉन सोमा को कई एक्सोफर-जैसे एक्सट्रूज़न के साथ दर्शाया गया है। (ई)वयस्क एएलएम टच न्यूरॉन सोमस में आम रूपात्मक विशेषताएं जो एक्सोफेर घटनाओं के लिए गलत हो सकती हैं। शीर्ष बाएं - एक डिटेन्ड एएलएम सोमा, जिसमें कोई स्पष्ट एक्सोफेर डोमेन या संकीर्तन साइट नहीं है। शीर्ष मध्य - न्यूरॉन्स में छोटे एक्सेलिलिएलर प्रोट्रूस हो सकते हैं जो एक्सोफर के अनुरूप हो सकते हैं, लेकिन एक्सोफेर माने जाने वाले आकार की आवश्यकता मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं। शीर्ष अधिकार - उम्र के साथ, स्पर्श न्यूरॉन्स अपने मामूली न्यूराइट के साथ वृद्धि विकसित कर सकते हैं। अक्सर रीचेरी सामग्री को न्यूराइट आउटग्रोथ की नोक पर एकत्र किया जा सकता है। यदि एकत्र mCherry एक्सोफर-टू-सोमा आकार आवश्यकताओं को पूरा नहीं करता है तो यह एक्सोफर के रूप में नहीं किया जाता है। नीचे वयस्क एएलएम न्यूरॉन्स को दर्शाया गया है जो एक्सोफर डोमेन या एक्सोफर के लिए मानदंडों को परिभाषित करते हैं। बोटॉम लेफ्ट - एएलएम सोमा में एक प्रमुख एक्सोफर डोमेन है जिसमें चुनिंदा री साइटोसोल और रीचेरी टैग किए गए एग्रीगेट्स शामिल हैं। एक्सोफर डोमेन संकीर्तन साइट तीर द्वारा चिह्नित है और आकार मानदंडों को पूरा करती है (कम से कम1/5 सोमा के आकार)। एक्सोफर डोमेन का सबसे बड़ा व्यास कसना साइट के व्यास से लगभग 1/3 बड़ा है, एक बहिर्मंडल घटना के लिए मानदंडों को पूरा करना। नीचे मध्य - एएलएम सोमा जिसमें एक प्रमुख नवोदित एक्सोफर है जो आकार मानदंडों को पूरा करता है। यहां स्पष्ट संकीर्तन स्थल है। नीचे सही - एएलएम सोमा जिसमें एक संलग्न म्हेरी-भरा एक्सोफर है जो एक्सोफर आकार आवश्यकताओं को पूरा करता है। एक्सोफर एक पतली कनेक्टिंग फिलामेंट से जुड़ा होता है। सभी छवियां तनाव ZB4065 bzIs166[पीmec-4mCherry] से हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

बड़े एक्सोफर्स के रूप में कुल और ऑर्गेनेल उन्मूलन के वीवो आणविक तंत्र में का लक्षण वर्णन इसकी प्रारंभिक अवस्था में है। निष्कासन के लिए कार्गो के पदनाम के रूप में प्रश्न, सेल के भीतर इन कार्गो का ध्रुवीकृत संग्रह, एक्सोफर्स उत्पन्न करने के निर्णय का विनियमन, एक्सट्रूज़न मध्यस्थता करने वाली मशीनरी, और पड़ोसी सेल में डिग्रेडिव मशीनरी के साथ एक्सोफर्स की बातचीत सभी को संबोधित किया जाना बाकी है। इसके अलावा, ट्यूबलर कनेक्शन के वीवो विज़ुअलाइज़ेशन में जो जैविक सामग्रियों को पारित कर सकते हैं जिसमें कैल्शियम, समुच्चय और माइटोकॉन्ड्रिया शामिल हैं, अपने आप में दिलचस्प और कम अध्ययन किए गए जीव विज्ञान हैं। क्यों कुछ कोशिकाओं को और अधिक दूसरों की तुलना में उत्पादन बहिर्पोफर के लिए प्रवण है के सवाल भी अनसुलझे हैं, लेकिन आनुवंशिक रूप से इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित दृष्टिकोण के साथ विच्छेदित किया जा शुरू कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित एक्सोफर उत्पादन के प्रजनन योग्य स्कोरिंग को प्राप्त करने के दृष्टिकोण हैं, पास के सेल सोमास से एक्सोफर्स को अलग करने पर ध्यान देने के साथ, एक्सोफर उत्पादन के शिखर पर कब्जा करने के लिए विश्लेषण का समय, और अनपेक्षित तनावों को खत्म करने के लिए विकास की स्थिति का सख्त नियंत्रण जो एक्सोफेर स्तरों को संशोधित कर सकता है। बड़े शुरुआती एक्सोफर के दोनों अंतर, या आसपास के हाइपोडर्मिस में "तारों से रात' फैलाव को एक्सोफर उत्पादन के सबूत के रूप में विस्तृत किया जा सकता है। यह कहा जा रहा है, बेसल स्थितियों के तहत mCherry व्यक्त न्यूरॉन्स सबसे अधिक बार एक विशिष्ट प्रकार के न्यूरॉन्स के 5-25% के साथ जुड़े रहे है एक बहिर्पोफर उत्पादन । तनाव की स्थिति का नियंत्रित परिचय एक्सोफर उत्पादन को बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है, जो एक्सट्रूस का उत्पादन करने वाले 90% न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए है, विशेष रूप से संशोधक के लिए आनुवंशिक या औषधीय स्क्रीन के लिए उपयोगी है।

मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में, बड़े समुच्चय रोगी न्यूरॉन्स से पड़ोसी कोशिकाओं में स्थानांतरित कर सकते हैं ताकि विकृति फैल को बढ़ावा दिया जा सके। एक्सोफर तंत्र फिला में कुल निष्कासन के लिए उपयोग किए जाने वाले संरक्षित तंत्र के माध्यम से मालूम हो सकता है। वीवो अणुओं में परिभाषित करना जो या तो इस प्रक्रिया की दक्षता को बढ़ाते हैं (जिसे अधिक प्रभावी प्रोटेओस्टेसिस नियंत्रण माना जाता है) या ब्लॉक इसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का मुकाबला करने के लिए उपन्यास रणनीतियों के डिजाइन को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसे, यहां वर्णित प्रोटोकॉल शास्त्रीय आनुवंशिक म्यूटेनेसिस स्क्रीन, जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो व्यवस्थित रूप से एन्जेवर और दमन की पहचान करने के लिए जीन को नीचे गिराते हैं, या दवा हस्तक्षेप अध्ययन के लिए जो इस प्रक्रिया के उम्मीदवार औषधीय संशोधकों की पहचान करते हैं। दृष्टिकोण सीधा है, हालांकि कुछ हद तक श्रमसाध्य है। एक्सोफर्स इतने बड़े हैं कि उन्हें एक उच्च आवर्धन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है। फिर भी, सी एलिगेंस न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत छोटे होते हैं और उनके ऑर्गेनेल्स को देखते हैं या उनकी झिल्ली को उच्च शक्ति कॉन्फोकल छवियों की आवश्यकता होती है और यह एक धीमी प्रक्रिया है। उच्च थ्रूपुट के विकल्पों में बहु-वेल प्लेट प्रारूप में उच्च सामग्री इमेजिंग दृष्टिकोण शामिल हो सकते हैं।

स्कोरिंग को एक्सोफर करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के आवेदन को उस प्रक्रिया के एक ठोस आनुवंशिक विच्छेदन को रेखांकित करना चाहिए जिसके द्वारा न्यूरॉन्स सेलुलर मलबे को व्यवस्थित और खत्म कर सकते हैं।

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

हम निम्नलिखित NIH अनुदान स्वीकार करते हैं: R01AG047101 और R37AG56510. ड्रिस्कोल और ग्रांट लैब्स के सदस्यों ने कठोर प्रयोगों और मजबूत संचार के साथ वर्णित प्रोटोकॉल के विकास और ठीक ट्यूनिंग में बड़े पैमाने पर योगदान दिया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95B Scientific CMOS camera Photometrics Prime
1,000 μL low retention tips Sarstedt
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
absolute ethanol Vwr 20821.33
Agar Sigma Aldrich A1296
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
FBS10 Standard microscope Meyer Instruments KSC 410-1-100-1 FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
LDI – Laser Diode Illuminator 89 North
levamisole Sigma Aldrich 16595-80-5
M4 multipette Eppendorf 4982000012
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
pipeteboy 2 VWR 612-0927
Polystyrene microbeads Sigma Aldrich MFCD00131491
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
Reusable ringed cytology slides ThermoFisher Scientific 22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] contract Driscoll lab GFP expressed in touch neurons
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
Triton-X Thermofisher scientific 28313
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] contract Driscoll lab mCherry expressed in touch neurons
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] contract Driscoll lab Q128 expressed in touch neurons
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] contract Driscoll lab mitoROGFP expressed in touch neurons
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] contract Driscoll lab autophagy marker expressed in touch neurons
ZEISS Axio Vert.A1 Zeiss

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 163 एक्सोफर्स सी एलिगेंस एजिंग बायोलॉजी प्रोटेओस्टेसिस एग्रीगेट्स एग्रीगेट्स एग्रीगेट्स एग्रीगेट्स एग्रीगेट्स न्यूरोडिजेनरेशन माइटोकॉन्ड्रिया लाइसोसोम्स ऑर्गेनेल ट्रांसफर
<em>सी एलिगेंस</em> में बड़े एक्सोफर वेसिकल्स <em>में वीवो</em> न्यूरोनल एग्रीगेट और ऑर्गेनेल एक्सट्रूस में स्कोरिंग के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण
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Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. More

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. J. Vis. Exp. (163), e61368, doi:10.3791/61368 (2020).

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