Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

النهج الكمية لتسجيل في الجسم العصبي الكلي الجسمية وبثق Organelle في Vesicles كبيرة exopher في C. elegans

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61368
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول مقاربات الكشف عن كميات البثقات الكبيرة التجميعية و/أو العضية (~4 ميكرومتر) التي تنتجها خلايا C. elegans في شكل طاردات غشاءية. نحن نصف السلالات، وظروف النمو، ومعايير التسجيل، والتوقيت، والاعتبارات المجهرية اللازمة لتسهيل تشريح هذه الآلية طرد الحطام.

Abstract

سمية البروتينات المُختَلَفة واختلالُ الاختلالُ المتَجَزِني هي عواملٌ محوريةٌ تُعزِّزُ انخفاض الخلايا العصبية الوظيفية المرتبطة بالعمر والأمراض العصبية التنكسية عبر الأنواع. على الرغم من أن هذه التحديات والأعصاب منذ فترة طويلة تعتبر جوهرية الخلية، وهناك أدلة كبيرة تدعم الآن أن البروتينات المرض البشري المُعَدَّد في الخلايا العصبية التي تنشأ في خلية واحدة يمكن أن تظهر في الخلايا المجاورة، وهي ظاهرة مقترحة لتعزيز انتشار الأمراض في الأمراض العصبية البشرية.

C. الخلايا العصبية الكبار elegans التي تعبر عن البروتينات المجمعة يمكن أن قذف كبيرة (~ 4 ميكرومتر) غشاء تحيط الحويصلات التي يمكن أن تشمل البروتين المجمعة, الميتوكوندريا, وlysosomes. وتسمى هذه الحويصلات الكبيرة "exophers" وتتميز عن إكسوسومات (التي هي حوالي 100x أصغر ولها تكوين حيوي مختلف). وقد يحدث التخلص من الحطام الخلوي في الطاردات من خلال آلية محفوظة تشكل فرعاً أساسياً، ولكن غير معترف به سابقاً، من بروتيوستاسيس الخلايا العصبية ومراقبة جودة الميتوكوندريا، ذات الصلة بالعمليات التي تنتشر بها المجاميع في الأمراض العصبية البشرية.

في حين أن exophers قد درست في الغالب في الحيوانات التي تعبر عن mCherry عالي النسخ المعدلة وراثيا داخل الخلايا العصبية التي تعمل باللمس ، فإن هذه البروتوكولات مفيدة بنفس القدر في دراسة تكوين الخلايا العصبية الخارجية باستخدام العضيات الموسومة بالفلورسنت أو البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في فئات مختلفة من الخلايا العصبية.

ويرد وصفها هنا هي السمات المادية للطاردات من نوع C. elegans، واستراتيجيات الكشف عنها، ومعايير تحديد الهوية، والتوقيت الأمثل للكمية، وبروتوكولات نمو الحيوانات التي تتحكم في الضغوط التي يمكن أن تعدل مستويات الإنتاج الطارد. وينبغي أن تعمل تفاصيل البروتوكولات المبينة هنا معاً على وضع معيار للتحليل الكمي للخرّيات عبر المختبرات. تسعى هذه الوثيقة إلى أن تكون بمثابة مورد في هذا المجال للمختبرات التي تسعى إلى وضع آليات جزيئية يتم من خلالها إنتاج الطاردات والتي يتم من خلالها رد فعل الطاردات من قبل الخلايا المجاورة والبعيدة.

Introduction

التحديات السمة العصبية من المجاميع والميتوكوندريا المختلة منذ فترة طويلة تعتبر الخلية الجوهرية، ولكن في الآونة الأخيرة أصبح من الواضح أن البروتينات المرض البشري misfolded التي تنشأ في خلية عصبية واحدة يمكن أن تنتشر أيضا إلى الخلايا المجاورة، وتعزيز علم الأمراض1. وبالمثل، يمكن إرسال الميتوكوندريا الثدييات من الخلية من إنتاجها الأصلي للتحلل عبر الخلايا2 أو لإنقاذ السكان الميتوكوندريا في الخلايا المجاورة تحد3. وقد لوحظ عموما حويصلات من مختلف الأحجام لنقل المواد الخلوية إلى الخلايا المجاورة أو إلى محيط السوائل4. بعض الحصويات مقذوف نهج حجم سوما الخلايا العصبية متوسط (متوسط لمس الخلايا العصبية سوما ~ 6 ميكرومتر) ويمكن أن تستوعب المجاميع الكبيرة والعضيات.

مثال صارخ على بثق vesicle كبيرة التي يمكن أن تحمل مجاميع البروتين والعضيات يحدث في الخلايا العصبية مستقبلات اللمس C. elegans التي تعبر عن عدد كبير من مراسل بناء ترميز تجميع الضارة المعرضة، مقاومة للتحلل mCherry5. البثق من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس، ودعا exophers، هي ~ 4 μm متوسط القطر، وتشمل انتقائيا mCherry أو المجاميع الأخرى، ويتم تسليمها مباشرة في hypodermis المجاورة، والتي تحيط عادة الخلايا العصبية مستقبلات اللمس. يحاول hypodermis التحلل القائم على الليسسومات ، ولكن بعض المحتويات غير القابلة للهضم مثل مجاميع mCherry يمكن إعادة قذفها من قبل hypodermis في pseudocoelom مملوءة بالسوائل من الحيوان ، والتي يمكن أن تؤخذ من قبل mCherry الخلايا الزبالة النائية تسمى coelomocytes لتخزين المدى الطويل(الشكل 1، الشكل 2)5.

الحويصلات البثق كبيرة ترك الخلية محاطة غشاء البلازما مستقبلات اللمس ويمكن أن تحتوي على بروتينات الأمراض البشرية المجمعة, الميتوكوندريا, وlysosomes. ويبدو أن عملية إنتاج الطاردة تنطوي على فرز الأنواع السامة المحتملة (على سبيل المثال يتم فصل mCherry المعرضة للتجميع عن البروتينات القابلة للذوبان وغير الفظة مثل GFP التي لا تزال في الغالب في سوما الخلايا العصبية). وبهذه الطريقة، يتم إنجاز الطرد الموجه للكيانات المهددة من قبل الخلايا العصبية5. تحد بروتيوستاسيس, مثل الإجهاد الناجم عن الضربة القاضية autophagy, MG132 بوساطة تثبيط البروتياما, أو التعبير عن المعدلات وراثيا من بروتينات الأمراض البشرية مثل مرض هنتنغتون الموسعة polyglutamine Q128 أو مرض الزهايمر المتورطة جزء Aβ1-42, يمكن أن تزيد من أعداد الخلايا العصبية التي تنتج بروفات5.

كما exophers لم يتم توثيقها إلا مؤخرا ، ما هو معروف عن وصفها جدارة البيولوجيا. تم اكتشاف exophers في, وهي الأكثر درس جيدا في, C. elegans الخلايا العصبية مستقبلات اللمس. هناك ستة الخلايا العصبية اللمس الميكانيكية c. elegans التي لديها خلايا الخلايا وزعت في جميع أنحاء الجسم(الشكل 3A)وتسمى خلايا microtubule لأن ملامحها الفائقة مميزة 15 microtubules protofilament. الخلايا العصبية مستقبلات اللمس هي AVM الأمامي (الخلايا العصبية الصغرى الأمامية), ALMR, وALML (الخلايا العصبية الجزئية الأمامية الأمامية اليمنى واليسارية), وPVM أكثر مركزية (الخلايا العصبية الصغرى البطينية الخلفية), وPLMR الخلفي وPLML (الخلايا العصبية الجزئية الخلفية الخلفية يمينا ويسارا) في الذيل. ومن المثير للاهتمام, الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الستة إنتاج exophers بمعدلات مختلفة, على الرغم من التعبير عن transgene الهجومية نفسها(الشكل 3C). من الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الستة mechanosensory, الخلايا العصبية ALMR يخضع إكسوبروجينسيس في كثير من الأحيان من الخلايا العصبية الأخرى التي تعمل باللمس. وهكذا عادة ما يتم تأسيس كمية من أعداد exopher من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس من خلال التركيز على ALMR.

Exophergenesis هي عملية ديناميكية تبدأ عادة بتورم السيتوبلازم العصبي(الشكل 1A-B). يتم جمع محتويات الخلوية، العضيات، أو مجاميع البروتين إلى جانب واحد من سوما الخلايا العصبية، والأكثر شيوعا نحو النهاية الخلفية للخلايا العصبية ALMR (بعيدا عن نيوريت إسقاط)، وتشكيل المجال ما قبل exopher (PED) (الشكل 1B). ويلاحظ بروز في وقت مبكر كما يبدأ PED إلى المشروع إلى الخارج، وتشكيل برعم بارزة يمكن التعرف عليها. يتم تعريف البرعم المتأخر عندما يكون أوسع قطر من المجال ما قبل الطاردة هو تقريبا 1/3 أكبر من قطر انقباض عنق سوما- اضح (الشكل 1C). يمكن إخراج الطاردات في أي اتجاه تقريبًا من سوما ، ولكن معظم الطاردات تخرج من جسم الخلية وتبقى في نفس الطائرة البؤرية تقريبًا مثل سوما الأصلية.

يمكن للطارد الابتعاد عن سوما الأصلي حيث يضيق عنق البرعم في خيوط رقيقة. يمكن أن تبقى exophers تعلق على سوما عن طريق هذا خيوط (الشكل 1D ، السهم) ويمكن أن تصبح في وقت لاحق منفصلة. يمكن نقل المحتويات الخلوية مثل الكالسيوم والمجاميع والميتوكوندريا عبر هذا الخيط إلى الطارد المرفق5، على الرغم من أن الجزء الأكبر من المواد مقذوف يتم وضعها في مقصورة البثق من قبل الحدث الناشئ الضخم. تعتبر exophers ناضجة عندما لا يكون هناك أنبوب ربط مرئية أو خيوط رقيقة ويتم فصل exopher تماما من سوما المرسل (الشكل 1E).

Exophers التي تنتجها الخلايا العصبية لمس C. elegans تواجه على الفور hypodermis, الأنسجة التي تحيط الخلايا العصبية التي تعمل باللمس. الأكثر شيوعا، vesicle exopher يبدو أن السفر داخل تحت الجلد في المستقبل نحو الذيل، ويمكن أن تكون بعيدة إلى حد ما من سوما قبل محتويات exopher تظهر مستهدفة للتدهور (على سبيل المثال، يمكن أن تكون المسافة ~ 100 ميكرومتر بعيدا عن سوما (الشكل 1F)). vesicle الفلورسنت exopher ينكسر في العديد من الحويصلات الصغيرة داخل hypodermis، مع الأخذ في مظهر يشار إليها باسم "ليلة مرصعة بالنجوم" (الشكل 1G والشكل 2). في مرحلة "ليلة مرصعة بالنجوم"، يمكن ملاحظة مادة فلورية دقيقة متناثرة عبر syncytium تحت الجلد في العديد من النقاط الصغيرة من الفلورانس بالمقارنة مع exopher الانفرادي الأصلي. ليلة مرصعة بالنجوم يمكن أن ننظر punctate تحت التكبير منخفضة ومع التكبير أعلى، يمكن أن ننظر punctate و / أو شبكية داخل hypodermis. إشارة الفلورسنت من ليلة مرصعة بالنجوم عادة ما يكون باهتا من exopher وفلوريسنسي أعرب عن العصبية(الشكل 2B-C). ويعتقد أن تشتت mCherry في العديد من الحويصلات punctate تنطوي على النضج والانصهار phagosome مع شبكة endosomal / lysosomal من الخلية تحت الجلد. ومن المرجح أن تتحلل بعض المواد طاردة في شبكة تحت الجلد، ولكن الأنواع المتبقية التي تقاوم التحلل (مثل مجاميع mCherry) تُرمى من تحت الجلد في الـ pseudocoelom، وهي مقصورة سائل يمكن أن تحتوي على حطام خلوي. يتم أخذ المواد الفلورية في وقت لاحق من قبل الخلايا الزبالة النائية ودعا coelomocytes(الشكل 2C)،والتي يمكن أن تركز، وتخزين، ومرة أخرى محاولة تدهور mCherry.

ظاهرة البثق الكلي ونقل يبدو الحفاظ عليها عبر phyla، بعد أن تم الإبلاغ عنها في النماذج الوراثية مثل C. elegans5,,6,,7 و D. melanogaster8,9 وكذلك في نماذج الثدييات المتعددة. وقد تم الإبلاغ عن قذفات تشبه الطاردة لخلايا الثدييات10، وهي ملاحظة تشير إلى أن الآليات المحفوظة قد تكون وراء الطرد الكلي والعضلي. وبالتالي، قد يكون إنتاج الطارد آلية محفوظة لإدارة الحطام الخلوية التي تشكل فرعًا أساسيًا، ولكن غير معترف به سابقًا، من بروتيوستاسيس الخلايا العصبية ومراقبة جودة الميتوكوندريا، والتي قد تساهم بنشاط، عند اختلال توازنها، في الإصابة بمرض تنكس عصبي. تحديد الجزيئات المشاركة في التمييز في الحطام والفرز ، والانتقال إلى لغة فرعية متميزة ، والبثق ، وتشكيل / scission من اتصال أنبوبي يربط سوما والبراز المتأخر ، والاعتراف الحويقد الكبير مقذوف للتحلل عن بعد من قبل خلية مجاورة لا تزال للعمل في المستقبل. وستكون الدراسات في نماذج الديدان الخيطية والذبابة ذات أهمية حاسمة في تحديد آليات جمع ونقل المجاميع والعضية، وذلك باستخدام النهج الجينية غير المتحيزة والأدوات البيولوجية القوية للخلايا التي توفرها هذه النماذج لتحديد الجزيئات المشاركة في السياق الفسيولوجي.

الخطوات الأولى الحاسمة في فك آليات المنطوقة في البيولوجيا exopher تنطوي على تحديد بروتوكولات لإعادة إنتاجها في الكم exopher الجسم الحي. نموذج C. elegans يقدم ميزة خاصة لمثل هذه الجهود منذ الجسم شفاف ويمكن ملاحظة exophers بسهولة عندما تحتوي على البروتينات الفلورية الموسومة أو العضيات. وقد أفيد Exophers أن يتم إنشاؤها من قبل الخلايا العصبية الدوبامين C. elegans PDE وCEP, ASE و ASER الخلايا العصبية الحسية, والخلايا العصبية الأميد صبغ ملء5. لأن exophers التي تنتجها الخلايا العصبية مستقبلات اللمس هي أفضل تتميز, التركيز هنا هو على استخدام الخلايا العصبية التي تعمل باللمس لتحليل exopher. ومع ذلك يمكن تطبيق النهج الأساسي لقياس الإنتاج الطارد من أي خلية. بروتوكولات للكشف عن وكمية exophers التي تنتجها الخلايا العصبية مستقبلات اللمس C. elegans التي تعبر بشكل وراثيا البروتين mCherry يتم تحديدها، مع التركيز على الشحنات التي يمكن رصدها والقيود الزمنية في التهديف. تعرّف هذه المقالة المقاربات تجاه في تحديد الطاردة الحية ، وكمية الظروف البيئية والجينية التي تعدل إنتاج exopher. وتؤكد البروتوكولات الاهتمام الحاسم بالظروف الثابتة غير الإجهادية لتحديد إنتاج الطاردات الأساسية للمقارنات عبر الأنماط الجينية.

Protocol

1. سلالات مفيدة للكشف exopher

  1. حدد سلالة التي تعبر عن البضائع الفلورسنت داخل الخلايا العصبية من C. elegans لتصور بسهولة exophers.
    ملاحظة: الجدول 1 قوائم السلالات التي تم استخدامها لتصور exophers المنتجة في الخلايا العصبية مستقبلات اللمس5,11,12. من حيث المبدأ، يمكن اختبار أي نوع خلية أو الخلايا العصبية لإنتاج exopher باستخدام مروج الخلية أو الأنسجة محددة لدفع التعبير عن بروتين الفلورسنت التي مجاميع أو يتم اختيار خلاف ذلك للبثق.
  2. بدلا من ذلك، استخدم مقايسة صبغ ملء لتصور exophers في الخلايا العصبية الرأس أمبيريد، والتي هي مفتوحة على البيئة وقابلة للملء5،13.

2. وسائل الإعلام النمو

  1. إعداد وسائط النمو الخيطية القياسية (NGM) سلالات الثقافة وفقا لأساليب القياسية14،15.
    ملاحظة: نقص الغذاء، أو الفلورو ديوكسيوريدين (FuDR)، وتستخدم عادة لمنع إنتاج ذرية، ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على إنتاج الطارد. الحفاظ على تغذية السكان بشكل مستمر (تجنب فترات قصيرة حتى من الإرهاق الغذائي البكتيري) والحفاظ على الحيوانات في درجة حرارة ثابتة.

3- تربية الحيوانات بالغة الأهمية بالنسبة للإنتاج المستمر للطاردات

  1. رفع الحيوانات على وسائل الإعلام متسقة ومع مصادر الغذاء البكتيرية متسقة. يجب على الحيوانات عدم نفاد الأغذية البكتيرية، حتى لفترات قصيرة من الزمن منذ الحد من الغذاء يمكن أن تغير بشكل كبير مستويات الإنتاج exopher.
  2. الحفاظ على وصفات وسائل الإعلام وإعداد موحدة طوال الدراسة.
    ملاحظة: تغيير الوسائط يمكن أن يؤثر على مستويات القاعدية من إنتاج exopher. يمكن أن تؤثر دفعات Agar على مستويات الطاردة الأساسية ، لذلك عندما تتغير الكثيرات الإمدادات ، قم بملاحظة التاريخ. رمي لوحات الأسهم بعد أسبوعين لضمان الغذاء البكتيري الصحي ومنع أجار المجففة، مما يسبب تغييرات في osmolarity أغار التي تؤثر على مستويات الطاردة.
  3. للظروف القاعدية، والحفاظ على الحيوانات في درجة حرارة ثابتة من 20 درجة مئوية. يمكن أن يسبب تربية الحيوانات في درجات حرارة متغيرة (حتى التغيرات المؤقتة في درجة الحرارة) اختلافات في توقيت إنتاج الطارد الأقصى.
    ملاحظة: لا يقتصر تغير درجة الحرارة على ظروف الثقافة. يمكن أن تكون التغيرات في درجات الحرارة أثناء التجارب أو على مقاعد البدلاء في المختبر مؤثرة. على سبيل المثال، يجب ألا تختلف درجات الحرارة داخل غرفة المجهر بشكل كبير عن حاضنة الثقافة أو مقعد المختبر.
  4. لا تستخدم التدخلات الدوائية المضادة للخصوبة لأن البويضات المخصبة تعتبر حاسمة لإنتاج البالغين المبكر من الطاردات.
    ملاحظة: يجب تجنب استخدام الفلورو-ديكوكسيوريدين (FuDR)16 أو C2217. عند إجراء تجارب على مدى العمر أو العمر، ينبغي الحفاظ على مجموعات سكانية متزامنة مع السن من خلال إزالة البالغين جسدياً من ذريتهم الأصغر عن طريق قطفهم على ألواح جديدة تنتشر بالبكتيريا بدلاً من استخدام تدخلات مضادة للخصوبة الدوائية الشائعة.
  5. لا تستخدم الثقافات الملوثة؛ إعادة تشغيل التجارب في حالة التسوية البيولوجية للسكان أو لوحة. يمكن أن يسبب التلوث البكتيري أو الفطري الضغوط والتغيرات الأيضية في الحيوانات ويجب أن يكون غائبًا عن التجمعات التجريبية.
    1. لتحقيق أقصى قدر من النتائج القابلة للتكرار، الحفاظ على الثقافات لأجيال صحية جيدة التغذية وخالية من التلوث على الأقل عند 20 درجة مئوية قبل التجريب لتجنب التغيرات اللاجينية المحتملة الناجمة عن البيئة.

4. تزامن العمر لتكفير التهديف عن طريق التبييض، التعويم السكروز، أو قطف اليرقات L4

  1. الحفاظ على مجموعات السكان التجريبية في نفس العمر البيولوجي ، حيث تختلف أنماط الكشف عن الطارد مع سن البالغين ويمكن مقارنة الحيوانات من مجموعات عمرية مختلطة أن تربك النتائج. ضمان دائما تزامن ناجحة من مجموعات الحيوانات التجريبية عن طريق التحقق من "الهلال الأبيض" الفرج مورفولوجيا في المرحلة L4.
    ملاحظة: عموما, ذروة إنتاج exopher لC. elegans mechanosensory ALMR الخلايا العصبية يحدث في يوم الكبار 2-3(الشكل 3D)، كما تقاس من أيام مرحلة ما بعد L4. يوم الكبار 1 هو 24 ساعة بعد مرحلة اليرقات L4 التي تتميز "الهلال الأبيض" الفرج مورفولوجيا (الشكل 5E).
  2. إعداد مجموعات البيض متزامنة عن طريق تبيض البالغين gravid.
    1. جمع البالغين gravid مليئة البيض عن طريق غسل الحيوانات تنمو على لوحة NGM. لغسل، الفيضانات لوحة مع 1 مل من M9 العازلة، pipet صعودا وهبوطا لجمع السائل مع الحيوانات المعلقة و pipet في أنبوب microcentuge 1.5 مل. بيليه الحيوانات عن طريق تسوية الجاذبية أو الطرد المركزي لطيف مع جهاز طرد مركزي صغير وإزالة supernatant.
    2. إضافة 150 ميكرولتر من 5M NAOH و 150 μL من 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض) في 1 مل في H2O ومزيج عن طريق عكس لمدة 5 دقائق تقريبا.
      ملاحظة: يضمن محلول التبييض الطازج أن بشرة الحيوان يمكن أن تتعطل لحصاد البيض. ويمكن رصد التقدم المحرز في تعطيل بشرة تحت مجهر تشريح؛ يجب على البالغين كسر وإطلاق البيض عند النقطة التي ينبغي وقف التبييض.
    3. برفق الطرد المركزي مع أنبوب minicentrifuge لمدة 20 S وإزالة supernatant. إضافة 1 مل من M9 العازلة والطرد المركزي مرة أخرى، وترك حوالي 100 ميكرولتر على رأس بيليه.
    4. كرر الخطوات 4.2.3 مرتين لإزالة آثار حل bleach.
    5. إعادة تثبيت البيض في الحجم المتبقي ونقلها إلى لوحة NGM الطازجة. سيتم lysed الكبار، ولكن العديد من البيض قابلة للحياة يجب أن يكون في إعداد.
  3. إعداد مجموعات متزامنة من قبل البيض موقوتة وضع.
    1. اختيار 20 البالغين gravid إلى لوحة NGM المصنفة باستخدام بروتوكولات النقل القياسية14.
    2. السماح للحيوانات بحرية الزحف ووضع البيض لمدة 1.5 ساعة (سلالات متحولة مع أحجام الحضنة منخفضة قد تتطلب إدخال المزيد من الحيوانات البالغة).
    3. إزالة جميع الحيوانات البالغة من لوحة عن طريق قطف، وترك مجموعة البيض متزامنة وراء. تحقق من اللوحات بعد ساعات قليلة للتحقق من عدم وجود بالغين قابلين للحياة قد فاتهم أثناء إزالة البالغين.
  4. إعداد مجموعات البيض المتزامنة عن طريق اختيار تعويم السكروز من البيض.
    1. جمع الحيوانات والبيض من خمسة لوحات NGM التي تم وضع الحيوانات gravid البيض لمدة 24 ساعة على الأقل عن طريق الفيضانات لوحات مع حل M9 مع 0.1٪ المنظفات (مثل توين 20 أو تريتون X-100) وجمع في أنبوب 15 مل. بيليه الكبار عن طريق الطرد المركزي لطيف في درجة حرارة الغرفة (2000 × ز لمدة 30 s).
    2. إزالة الحيوانات supernatant وغسل في 15 مل من M9 الطازجة ثلاث مرات، والتخلص من افرنح بعد كل غسل، ويجري التأكد من الحفاظ على بيليه المخصب في الحيوانات والبيض.
    3. الاحتفاظ 2 مل من عظمى و resuspend بيليه. إضافة 2 مل من 60% الوزن من قبل السكروز حجم.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 5 دقائق. الحل الآن عرض مرحلة العليا المخصب للغاية في البيض.
    5. نقل حوالي 2.5 مل من المرحلة العليا إلى أنبوب جديد 15 مل وإضافة 10 مل من M9.
    6. مزيج من قبل عكس لمدة 1 دقيقة، ثم الطرد المركزي 2000 س ز لمدة 1 دقيقة.
    7. إزالة سوبرنات وغسل بيليه البيض المخصب في M9. 10-15 μL من البيض بيليه يمكن توزيعها على جديد OP50 البذور لوحة NGM.
      ملاحظة: هذه الطريقة تعد عددا كبيرا من البيض; لا تسمح الحيوانات التي تم جمعها لنم من المواد الغذائية OP50 كولاي.
  5. إعداد مجموعات متزامنة من خلال قطف الحيوانات في مرحلة التنمية L4.
    1. تنمو الحيوانات على لوحات NGM البذور كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: C. elegans تطوير في أربع مراحل منفصلة. في 20 درجة مئوية، بيضة وضعت حديثا يستغرق حوالي 9 ساعات لتفقس (الشكل 5A). آخر فتحة، يمر من خلال المرحلة اليرقات 1 (L1) إلى المرحلة اليرقات 4 (L4)، مع كل مرحلة تستمر 8-12 ساعة بين كل molt(الشكل 5أ-ف). لذلك ، يجب أن يكون هناك طبق يتم إعداده عن طريق التلقيح مع البيض يحتوي على العديد من الحيوانات L4 لاختيار حوالي 40 ساعة بعد إدخال البيض.
    2. تحديد L4-نظمت الحيوانات عن طريق تحديد شكل هلال نصف القمر الأبيض من الفرج النامية(الشكل 5E).
      ملاحظة: الحيوانات في مرحلة L4 موحدة في الحجم وفي تصبغ الجسم. اختيار الحيوانات مع الهلال الأبيض إلى لوحة نمو جديدة لفحص الحيوانات على مراحل. في اليوم التالي (~ 24 ساعة في وقت لاحق) ينبغي أن تحسب كبالغ اليوم 1.
    3. تسجيل عدد من الحيوانات يوميا في يوم الكبار 2.
      ملاحظة: عادة ما يتم تسجيل exophers في اليوم 2 من مرحلة البلوغ ، وهو ذروة إنتاج الطارد في ظل الظروف القاعدية. ومع ذلك، لأن ذروة التهجينسيس وتوقيت قد تتحول من التغيرات البيئية أو الجينية التي يجري دراستها، ينصح بتسجيل عدد من الحيوانات البالغة يوميا على مدى أربعة أيام لتوليد الصورة الأكثر شمولا (الشكل 3D).

5. الكشف عن exophers باستخدام المجهر الفلورسنت

  1. مراقبة exophers باستخدام عالية التكبير الزائفة ستيريو تشريح المجهر الذي يتم تجهيزه للمجهر الفلوريسنس.
  2. 3- اشل حركة الحيوانات على لوحات NGM عن طريق الأنابيب 100-200 ميكرولتر من 10-100 mM levamisole/tetramisole حل على سطح لوحة NGM agar. بعد 2-4 دقائق ، تصبح الحيوانات مشلولة ويمكن ملاحظتها مباشرة على لوحة agar.
    ملاحظة: لا يلزم مطلقاً علاج الجمود، بحيث يمكن تسجيل هوية الخلايا العصبية ووجود الطاردة من خلال تتبع الحيوانات الزاحفة بصريًا تحت المجهر على اللوحة عند تحديد ما إذا كان قد تم إنتاج طارد أم لا.
  3. مراقبة الخلايا العصبية الفلورية باستخدام التكبير الكلي من 100x لإنجاز تشريح المجهر الكشف عن exophers.
    ملاحظة: يسمح تسجيل أحداث الطاردة باستخدام المجهر التشريحي بمراقبة أعداد كبيرة من الحيوانات بسهولة نسبية مباشرة على لوحات الأجار التي يتم تربيتها عليها.
  4. التصوير الحي وسلالات المراسلين المتصاعدة للدراسات exopher باستخدام المجهر confocal
    1. استخدام المجهر confocal إلى الحياة صورة ديناميات داخل الخلية وخصائص الطارد.
      ملاحظة: التصوير المباشر هو أسلوب مفيد لمراقبة تفاصيل خفية من إنتاج exopher لأن إنتاج exopher هو عملية ديناميكية.
    2. تقييد حركة الحيوان للتصوير الحي عالية الدقة باستخدام أساليب مريحة، بما في ذلك استخدام ليفاميسول أو تتراميسول في 10-100 mM أو تطبيق ميكروبات البوليسترين هيدروجيل (بأقطار 15 ميكرومتر، 30 ميكرومتر أو 40 ميكرومتر)18.
  5. إعداد الشرائح للمجهر المركب والمجهرية
    1. جبل 20-50 الحيوانات في عامل شل على شريحة المجهر. إن شرائح الخلايا الحلقية القابلة لإعادة الاستخدام المرسومة بـ 13 مم قطرها المرفوعة من الحلقات مفيدة في التركيب.
    2. اختيار الحيوانات الحية في 5-20 ميكرولتر من الشلل مثل 10-100 mM levamisole أو tetramisole داخل دائرة رسمت أو على وسادة أجار.
    3. انتظر 4 دقائق للشلل، ثم غطي الشريحة بغطاء (يوصي رقم 11/2 (0.16 - 0.19 مم) أو رقم 2 (0.17 - 0.25 مم).
  6. أعداد صغيرة متزايدة من الحيوانات
    1. لا تسحق الحيوانات المركبة؛ عند مراقبة عدد قليل فقط (أقل من 20) الحيوانات في الشريحة الواحدة، وهناك خطر من سحق بعض الحيوانات بسبب الضغط غير المتكافئ من الغطاء. ويمكن التقليل من هذا الخطر باستخدام لوحة agarose منخفضة النسبة المئوية للتركيب.
    2. جعل 2-4٪ أغاروز لوحة الشريحة، ثم إضافة 2-15 μL من حل الشلل إلى لوحة. نضع في اعتبارنا levamisole وتيتراميسولي منتشر في لوحة, خفض تركيزها الفعال.
    3. جبل عن طريق قطف الحيوانات في قطرة 2-15 ميكرولتر من محلول الشلل أو الميكروبات يستريح على وسادة أجار. ضع الغطاء على القمة وتحقق من أن الحيوانات سليمة18.
  7. إعداد وسادة Agar
    1. لإعداد 2٪ agar منصات، سخني 2٪ agarose في M9 الحل والميكروويف حتى agarose هو في حالة متجانسة المنصهر.
    2. لتحقيق لوحة أجار من نوعية كافية، والاختلاط البديل وmicrowaving في انخفاض الطاقة لأقل من 20 ثانية. تجنب إدراج فقاعات الهواء داخل لوحة عن طريق وضع أجار الغليان على كتلة التدفئة والسماح للفقاعات للصعود إلى السطح.
    3. استخدام ماصة باستور لرسم أجار من عمق داخل الحل المنصهر تحت فقاعات ارتفع.
    4. إعداد اثنين من الشرائح اُلَقَط ووضع على جانبي شريحة مجهر زجاجية نظيفة على سطح مستو. لجعل الشرائح اسجل مكان اثنين شرائط 5 سم من شريط المختبر على كل شريحة (الشكل 6A).
    5. باستخدام باستور بابت ، ضع قطرة واحدة من أجار على شريحة المجهر النظيف تقع بين الشرائح اُ مسجلة (الشكل 6B).
    6. بعناية وسرعة، تغطية قطرة من agar المنصهر مع شريحة نظيفة الرابعة عن طريق وضع في عبر الشرائح مسجلة (الشكل 6Cc).
      ملاحظة: يجب أن تضغط الشريحة بلطف على أجار المنصهر في دائرة مسطّحة حول 0.4 مم سميكة (سمك الشريط) (الشكل 6D). وينبغي أن أجار تبرد بسرعة.
    7. إزالة الشريحة العلوية عن طريق تحريك تشغيله (الشكل 6E). منصات Agar تجف بسرعة وأفضل استخدام في غضون دقائق. بمجرد إزالة الشريحة العلوية، استخدم لوحة الجل على الفور للحيوانات المتصاعدة. تجنب استخدام منصات مع فقاعات الهواء.
    8. تخزين منصات agar تصل إلى 30 دقيقة المغطى بين الشرائح الزجاجية اثنين. agar المجففة يسبب الحيوانات تكتل معا وتجفيفها. جبل الحيوانات ضمن 2-15 ميكرولتر من محلول الشلل أو الميكروبات وتغطية مع غطاء؛ شاشة الشريحة في غضون 20 دقيقة من الشلل وتصاعد (الشكل 6).
      ملاحظة: لأن ظروف الإجهاد يمكن أن تغير معدلات الطارد، وتجنب الالشلل التي يمكن أن تحفز الإجهاد التأكسي (على سبيل المثال: أزيد الصوديوم) عند فحص exophers.
  8. الكشف عن exophers باستخدام المجهر الغزل القرص confocal
    1. مراقبة الخصائص البيولوجية للخلايا مثل العضيات والمحتويات الأخرى ذات الأهداف الرقمية 1.4 في 63x و100x.
    2. استخدام البرمجيات قادرة على مرحلة السيطرة على الصور والاستفادة من اقتناء متعددة الأبعاد. وينبغي أن تكون المجاهر وبرامج معالجة الصور مناسبة أيضاً للتصوير وجمع البيانات لأن هذه الخطوات تنطوي على نهج تصوير قياسية.

6. تحديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس وتسجيل لاكفوررس مع الحيوانات التي شنت

  1. جبل مشلولة الحيوانات الكبار(الشكل 6).
  2. تحديد المستوى Z المطلوب. استخدام انخفاض التكبير مشرق الميدان (10-40x) لتحديد مناسبة Z-الطائرة من الحيوان، مع العلم تحديد المواقع من الحيوان، والتوجه الرأس الذيل، وموقع الفرج - التي هي معالم لتحديد الخلايا العصبية و exopher في وقت لاحق(الشكل 3A & الشكل 5E).
  3. ركز على إشارة الفلورانس للمراسل المختار. البقاء في نفس الطائرة Z، والتحول إلى عرض الفلورانس widefield في 10-40x لمراسل السيتوسوليك المختار.
    ملاحظة: في هذا المثال يتم دفع تعبير الفلورسنت بواسطة mechanosensory اتصال المروج خلية العصبية الخاصة. صفائف نسخة عالية، وفلوروفور مختلفة لديها تباين في التعبير وبالتالي كثافة فلورية متغيرة. ضبط إذا لزم الأمر.
  4. قم بالتمرير داخل محور Z لمراقبة عمق التعبير الحيواني والفلورسنت في المستوى البؤري. أثناء القيام بذلك، تأكيد اتجاه الرأس الذيل; الرأس / البلعوم سيكون لها حلقة العصب الفلورسنت وفي هذه الحالة، سوف يحتوي الذيل 1-2 مرئية PLM سوما (الشكل 3A).
  5. تحديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس
    1. تحديد ما إذا كان الحيوان مثبتاً على الجانب الأيسر أو الأيمن (الشكل 3A).
      ملاحظة: النظر في الأبعاد 3 من الحيوان، يتم إنجاز أفضل دقة التصوير على الجانب الأقرب إلى البصريات.
    2. تحديد سوما (ALM، ALMR، AVM) من خلال مراقبة - تبدأ في الرأس لتحديد حلقة العصب والعمليات العصبية الجانبي.
    3. عند التكبير 10-40x، قم بالتمرير ببطء خلال المحور Z لتحديد العملية المرفقة.
    4. بمجرد تحديد العملية ، اتبعها بشكلٍ جانبي في الاتجاه الخلفي نحو الفرج ، حيث ستكون السومة واضحة ، تتميز بجسم خلية مستديرة في نهاية العملية. مرة واحدة في معظم في التركيز يتم العثور على سوما العصبية, يمكن التعرف عليها باستخدام المعالم العصبية الأخرى على النحو التالي:
    5. استخدم AVM، وهي عصبون بطني قريب، للمساعدة في تعيين التوجه الحيواني. إذا كانت الخلايا العصبية AVM في نفس الطائرة كما ALM ثم الحيوان يستريح على جانبها والخلايا العصبية خارج تلك الطائرة هو ALMR . إذا لم تكن الخلايا العصبية AVM في نفس الطائرة كما ALM في السؤال، أقرب الخلايا العصبية التي تعمل باللمس إلى الطائرة المحورية هو ALML.
    6. تحديد الخلايا العصبية PVM, خلية عصبية أخرى تعمل باللمس في الجزء الخلفي تقع بالقرب من الذيل, للإشارة إلى ما إذا كانت الخلايا العصبية لمسة الأمامية في نفس الطائرة. إذا كان الأمر كذلك، فإن الخلايا العصبية التي تتم مراقبتها هي ALML.
    7. الحصول على شعور من موقف الهيئات سوما أخرى، بالقرب من منطقة الاهتمام (الخلايا العصبية الفلورية تقع على جانبي سوما)، وفي جميع الطائرات Z، حتى لو لم يكن من الممكن الحصول على أعمق الخلايا العصبية المنصوص عليها في تركيز واضح.
      ملاحظة: تحديد جميع الوسمات الخلايا العصبية التي تعمل باللمس مهم لأن سوما خارج التركيز يمكن أن يكون مخطئا لsophers.

7. تحديد وتسجيل لsophers

  1. مرة واحدة يتم العثور على خلية عصبية تعمل باللمس، وافحصه لبرزات كبيرة (مجالات اضحة) كبيرة بما يكفي لاعتبارها طارد برعم، (تصل على الأقل 1/5th حجم سوما الأصلي) (الشكل 1C).
    ملاحظة: متوسط exopher التدابير حول 2-8 ميكرومتر في القطر، في حين أن متوسط سوما (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) يقيس الحيوان 6-10 ميكرومتر في اليوم 2 البالغين(الشكل 7B).
  2. إذا لم يتم ملاحظة أي مجال برعم أو exopher ، فتفقد سوما العصبية لشعير رفيع مرفقة منبثقة من سوما. طاردات المرفقة تميل إلى أن تكون موجودة أقرب إلى سوما الأصلي وفي طائرة Z مماثلة.
    ملاحظة: لا تبقى دائماً إرفاق exophers إلى سوما. إن الكشف عن خيوط مرفقة هو مؤشر قاطع على أن الجسم هو طارد.
  3. لتحديد طارد غير مرتبط، ابحث عن محتويات طارد. يمكن أن تركز Exophers البروتينات الفلورية المطرودة وبالتالي فهي في كثير من الأحيان أكثر إشراقا من سوما.
    ملاحظة: محتويات exophers غير متجانسة ومتغيرة. ويمكن أيضا أن العضيات الخلوية مثل الليسوسومات والميتوكوندريا يمكن أن قذف داخل exophers (الشكل 4C-E).
  4. ابحث عن طاردات غير مُعدّة في طائرات محورية مختلفة عن الطائرة التي عُثر فيها على سوما الأصلية. على الرغم من أن exophers قد شوهدت لبرز من سوما ALM في أي اتجاه، فمن المعتاد أن يبرز من سوما، في اتجاه الخلفي من عملية الخلايا العصبية.
  5. تحقق من وجود كائنات كروية كبيرة غير متمركزة وتعرف على أنها سوما الخلايا العصبية. يمكن أن تكون الطاردات غير منتظمة الشكل ولكنها عادة ما تكون هياكل كروية. الطاردات تصبح متدهورة مع مرور الوقت، لذلك الطاردات الأكبر سنا تميل إلى أن يكون لها شكل أكثر غير انتظام.
    ملاحظة: يتم تمييز الطاردات الناضجة أو القديمة عن مرحلة "الليل المرصع بالنجوم" المشتتة عبر كثافة الفلورانس الأكثر إشراقًا للبراز وشكلها الكروي.
  6. التحقيق في "ليلة مرصعة بالنجوم" النمط الظاهري كدليل على exophergenesis في وقت سابق. Exophers التقدم إلى "ليلةمرصعة بالنجوم" المرحلة كما اكف عن كسر في الحويصلات أصغر و hypodermis المحيطة يحاول التحلل من محتويات exopher (الشكل 1G، 2B ، 3B & 7A).
    ملاحظة: تتميز المرحلة الليلية المرصعة بالنجوم بكيانات الفلورسنت المجزأة والمتناثرة (الشبكية في بعض الأحيان) التي فقدت السلامة الهيكلية وتعرض الفلورامديم بالمقارنة مع الخلايا العصبية اللمسية والهياكل الطاردة.
  7. ابحث عن مثيلات "أحداث متعددة exopher". وعادة ما تنتج exophers كما حدث المفرد (1 exopher المنبثقة من 1 سوما) ولكن في بعض الظروف أكثر من طارد واحد يمكن أن يطلق سراحه من سوما واحدة(الشكل 7D).
    ملاحظة: يمكن أن تتحلل الاكراميات الناضجة إلى الحويصلات المتعددة كما أنها متدهورة في تحت الجلد. التمييز بين ما إذا كان كل exopher ولدت من قبل حدث مستقل exophergenesis أو ما إذا كان واحد الأصلي exopher الانقسام لإنشاء الحاويات إضافية يمكن تحديدها فقط من قبل الملاحظة الفاصل الزمني.
  8. نضع في اعتبارنا أن ليس كل تشوهات المورفولوجية تنضج إلى exophers.
    1. لا يسجل سوما مفكك كما exopher. ويمكن ملاحظة سوما الموسعة أو مدببة في بعض الأحيان (وخاصة مع التقدم في السن أو تحت الضغط)، ولكن لا يتم تسجيل تمديد دون موقع انقباض واضح كما exopher.
    2. رفض البراعم الصغيرة التي لم يتم حلها التي لا تحقق 1/5th حجم سوما في الكم exopher الحدث.
    3. لا تحسب النوريات تتفوق على أنها exophers. يمكن أن تمتد النوريات الناضجة بشكل كبير مع التقدم في السن (عادة في الاتجاه المعاكس لعملية الخلايا العصبية) ويمكن أن يهاجر البروتين الفلورسنت إلى نهاية القاصي من هذه الهياكل19.
      ملاحظة: هذه النموثات النورية ليست exophers كما لديهم نمط التنموية متميزة على مدى الأيام والأسابيع، لا تشكل براعم، ولا فصل(الشكل 7E).
  9. تحديد الكيانات الفلورية التي لا تكون مُكَرَبة.
    ملاحظة: من المهم الحصول على فكرة عن الفلورسنسي الخلفية لضمان التحديد الصحيح للكيان الفلورسنت مقذوف مقابل autofluorescence.
    1. تعبير الفلورسنت المُنَجَزِع مُنَجِرَةً مقابل الفلوروست. لا تخطئ في الفلوروس التعبيرية المعدلة وراثيا. إشارة exopher الحقيقي لن يكون في الأمعاء أو الأمعاء (يمكن استخدام تأكيد DIC لتحديد هذه الأنسجة) وسوف تكون إشارة exopher أكثر إشراقا بكثير من autofluorescence الخلفية.
      ملاحظة: يحدث الفلورس التلقائي بسبب تصبغ الفلورسنت الأمعاء الحبيبية المعوية ويتراكم مع التقدم في السن. فمن هيطروجينيوس، لا سيما كما ينظر إليها مع أطوال موجية مختلفة.
    2. إشارة من الأجنة. لا تخطئ إشارة الجنين لتكفير النسل. تأكيد الشكوك في إشارة الجنين عن طريق التحول من الفلوريسنس إلى الإضاءة البراقة والتحقق من وجود ارتباطات للإشارة مع البيض في الرحم.
    3. من الطائرة أو جثث سوما القريبة. تجنب الخطأ من سوما الطائرة لطارد من خلال تحديد جميع الهيئات سوما القريبة، حتى somas خارج التركيز في بداية المراقبة.
      ملاحظة: إذا كان تسجيل ل exophers من ALMR، تحديد وحساب موقع AVM و ALMR سوما. ويرد وصف مزيد من التفاصيل حول تحديد الجسم سوما في الشكل 3A.

8- تسجيل النقاط والإحصاءات

  1. تسجيل exophers كما ثنائي (نعم، هناك exopher / لا، لا يوجد exopher).
  2. النظر في الكشف عن exopher باعتبارها "exopher الحدث" لخلينية معينة. يمكن أن يشكل حدث الطارد ملاحظة لطارد واحد بالقرب من سوما أو العديد من الطاردات.
    ملاحظة: لتحديد عدد أحداث التهجينسيس الفردية استخدام الملاحظة الفاصل الزمني.
  3. عد الأحداث exopher لكل خلية معينة محددة لأن خلايا مختلفة لا تنتج exophers في نفس المعدل (انظر على سبيل المثال الشكل 3C). الخلايا العصبية ALMR إنتاج معظم exophers خط الأساس في السلالات المذكورة هنا ، وبالتالي في كثير من الأحيان هذه هي الخلية المختارة لتكميم الكم من الخلايا العصبية مستقبلات اللمس.
  4. للإحصاءات، بشكل عام، إجراء ما لا يقل عن 3 تجارب بيولوجية، من ما لا يقل عن 30 الحيوانات التي سجلت في كل تجربة مع العدد المقابل من الملاحظات اللازمة لتحليل الأعطال.
    1. بالنسبة للعديد من التجارب التي تنطوي على واحد أو اثنين من المسوخ / العلاجات مقارنة مع السيطرة، اختبار كوكران-مانتل-هاينزيل مناسب لتحديد قيم p.
    2. بالنسبة للتجارب التي تنطوي على أكثر من اثنين من المسوخ من العلاجات مقارنة مع السيطرة، فمن المناسب أيضا استخدام تحليل تراجع لوجستي ثنائي لتقييم أهمية أي عدد من التنبؤات القاطعة.

Representative Results

يمكن استخدام العديد من المراسلين الفلورسنت لقياس الطاردات. يتم تصور الخلايا العصبية المسية بسهولة في الجسم الحي عن طريق وضع علامات الفلورسنت للبروتينات التي يمكن اختيارها للبثق، عن طريق وضع العلامات من العضيات التي يمكن مقذوفها، أو عن طريق وضع علامات أغشية الخلايا. يحدد الجدول 1 الخلايا العصبية التي تم التعبير عنها باللمس والتي تم استخدامها لرصد exophers ، مع أمثلة تمثيلية مدرجة في الشكل 4. الشحنات التي من المعروف أن قذف في exophers تشمل اندماج المجال N-المحطة الطرفية من الصيد البشري لتوسيع بوليغلوتامين (Q128) (الشكل 4B)، الليسوسومات التي هي GFP الموسومة مع بروتين الغشاء المرتبط الليسوسوم (LMP-1) (الشكل 4C)، والميتوكوندريا الموسومة مع GFP المترجمة بالمصفوفة (الشكل 4D). لا يتم طرد Cytoplasmic GFP بقوة ويتم الاحتفاظ بها بشكل تفضيلي في سوما5، على الرغم من أن GFP يمكن أن تصور ضعيف exophers(الشكل 4A). عندما يتم دمج GFP إلى البروتينات التي يتم طردها، يمكن استخدام هذه العلامة لتصور exophers. وثمة نقطة هامة هي أنه من خلال وضع علامات على البروتينات المختلفة، يمكن معالجة مجموعة كبيرة من الأسئلة المتعلقة بطرد شحنات وعضيات محددة، وكذلك بشأن البروتينات والأغشية التي تشكل طاردات.

إعداد ميثوميكروبسكوب زائف هو أداة فعالة لعرض exophers في الحيوانات على لوحات أجار. هذا الإعداد هو مزيج من التكنولوجيا المركبة والمجسومة التي تشمل البصريات الفتحة الرقمية عالية على كل التكبير ، والتكنولوجيا الزائفة ستيريو (أهداف منفصلة على قاعدة مجسمة) ، ومفتاح التشغيل التكبير للعرض في التكبير المتوسطة إلى الأهداف المثبتة. وينبغي أن تكون مجهزة مجهر مثل هذا مع 10x العينات وأهداف قوية بما يكفي لمراقبة مورفولوجيا الخلايا العصبية وإنتاج exopher لتسجيل عالية الإنتاجية (2x الهدف المستخدم لمسح / قطف، 10x الهدف المستخدم لتحديد وتسجيل).

في حين أن قدرات التكبير من المناظير ستيريو القياسية عادة ما يكون عالية بما فيه الكفاية لدقة لرؤية شبكة من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس التعبير عن البروتينات الفلورية، المجاهر تشريح القياسية ليست كافية لمراقبة التفاصيل دون الخلوية من exophers مثل اتصالات أنبوبي من سوما إلى exopher. وتستلزم هذه الملاحظات إجراء مجهري (انظر جدول المواد للاطلاع على تفاصيل المعدات).

تتطلب دراسات الكميات ا exopher ضوابط صارمة للقضاء على الضغوط التجريبية. إن المحافظة على ظروف النمو الثابتة منتبهة مطلوبة لإنتاج الطارد القابل للتكرار. وبشكل أكثر تحديداً، فإن الإنتاج الطارد للطاردات يستجيب للإجهاد بحيث أن التغذية الثابتة، ودرجة الحرارة الثابتة، والنمو الخالي من التلوث عبر الأجيال هي عوامل حاسمة لقابلية التكاثر. تحت ظروف النمو القاعدي مع تعبير الخلايا العصبية العالية من mCherry، إنتاج exopher منخفض نسبيا (5-25٪ من ALMRs إنتاج exophers) ولكن بعض الضغوط، بما في ذلك الاكسدة والأكسدة، يمكن أن تزيد من معدلات exopher. في حين يمكن اعتبار التعبير mCherry من الإجهاد، نتيجة طبيعية من الإجهاد حساسية مستويات الطارد هو أنه، إذا تم التحكم بشكل صحيح، يمكن أن يكون مقدمة الإجهاد التجريبية استراتيجية للحث بسهولة أكبر ومراقبة إكسوبروجينسيس.

التوقيت ومستويات الإنتاج الطارد المتوقعة. الطاردات تكون غائبة تقريباً أثناء تطور اليرقات. ويبدو أن فترة ذروة إنتاج الطارد في حياة الشباب البالغين تقتصر إلى حد كبير على أيام البالغين 1-4، والأكثر وضوحا في يوم الكبار 2 أو 3. لأن الذروة يمكن أن تتحول إلى الأمام أو إلى الوراء قليلا، والتقييم الأكثر اكتمالا لملف تعريف إنتاج exopher هو تسجيل تجارب متعددة يوميا على مدى أيام الكبار 1-4. بشكل عام، ينتج ALMR واحدة كبيرة exopher، مع الحاوسة تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل. يمكن إنتاج exopher بسرعة إلى حد ما (على ترتيب دقائق في أسرع حالاتها). الأكثر شيوعا، يتم إنتاج واحد فقط طارد الرئيسية في الخلايا العصبية في وقت مبكر من حياة الكبار، ولكن إنتاج exophers متعددة من الممكن.

في إنتاج exopher العام بواسطة ALMRs التعبير عن mCherry تحت الظروف القاعدية يتراوح بين 5-25٪ من ALMRs فحصها ضمن الإطار الزمني الأمثل ليوم الكبار 2-3(الشكل 3D). يمكن proteostasis الأزمات5، فضلا عن التعرض لضغوط أخرى تعدل مستوى exopher. الإجهاد أو الضائقة الوراثية يمكن أن تزيد من إنتاج exopher إلى معدلات الكشف عن ارتفاع يصل إلى 90٪ من الخلايا العصبية ALMR إنتاج قذفات ناضحة.

التغذية المستندة إلى RNAi لاختبار أدوار جينات محددة في إكسوبجنينسيس. وs nematode C. elegans يتعرض عادة لRNAi هدمها عن طريق تغذية الحيوانات تحولت E. سلالة القولونية HT115 التي تعبر عن رنا مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DSRNA) استهداف جين من الفائدة20. HT115 البكتيريا يمكن استخدامها عند تسجيل ل exophers في تغذية RNAi5. في حين أن النصوص في معظم الأنسجة يمكن أن تستهدفها RNAi باستخدام هذه التقنية، والخلايا العصبية هي أكثر انكسار. يمكن معايرة الحساسية لRNAi باستخدام الحيوانات التي تعبر عن الناقل dsRNA المعدلة وراثيا SID-1 تحت المروج الخلايا العصبية محددة. وبهذه الطريقة يمكن أن تكون تحسس الأنسجة العصبية لRNAi21.

يمكن إنجاز ضربة قاضية خاصة بالأنسجة لجين ذات أهمية من خلال التعبير عن مكون من استقلاب RNAi الداخلي داخل متحولة تعاني من نقص في هذا المكون. على سبيل المثال: يمكن التعبير عن بروتين Argonaute RDE-1 على وجه التحديد في الخلايا العصبية للحيوانات المتحولة rde-1 لتحقيق ضربة قاضية لجينة ذات أهمية فقط في الخلايا العصبية عندما تتعرض الحيوانات لتدخل RNAi يستهدف ذلك الجين.

باستخدام نظام nematode القياسية RNAi بروتوكولات20,22, التعرض للوالدين في مرحلة L4 إلى RNAi والسماح لذريتهم لتطوير تستهلك تحول HT115 البكتيريا حتى مرحلة البلوغ يولد قوية جينية بالضربة القاضية ولكن تكون منتبهة إلى التأخيرات التنموية المحتملة الناجمة عن RNAi كما قد تنمو الحيوانات التجريبية بشكل مختلف عن مكافحة ناقلات فارغة. من المهم أن تشمل دائما مكافحة ناقلات فارغة للمقارنة التحكم السلبي. HT115 البكتيريا يمكن استخدامها عند تسجيل لاكفوفر في تغذية RNAi. ومع ذلك، لاحظ أن بعض الجينات فعالة في تغيير معدلات النشوء حتى خلال فترات أقصر من التعرض RNAi5. إذا كان استهداف جينات معينة يؤدي إلى فشل النمو، وتجنب تعريض الحيوانات لضربة قاضية مدى الحياة، يمكن ببساطة أن يتم انتقاؤها الحيوانات في مرحلة L4 على لوحات RNAi للتعرض من L4 إلى D2 أو D3 الكبار.

اسم سلالة الجيني وصف النسبة المئوية للطارد مرجع
SK4005 zdIs5 [فم م-4GFP] التعبير السيتوسوليك من GFP في الخلايا العصبية اللمس. 1-8% ALM الشكل 4A, Melentijevic 2017
ZB4065 bzIs166[فميث-4:: mCherry] فرط التعبير عن mCherry (bzIs166) في الخلايا العصبية اللمس، وتنتج كل من إشارة cytosolic والمجاميع mCherry. bzIs166 هو مستحث exopher. المجاميع mCherry هي تنبؤات من الطاردة ويتم مقذوف بشكل تفضيلي في exophers. 3-20٪ ALM (الظروف العادية). 20-80% ALM (ظروف الصيام). الشكل 4B, Melentijevic 2017
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1 [فmec-7YFP Pميتش-3htt57Q128:: cfp لين-15+]; YFP cytosolically التسميات الخلايا العصبية لمسة mec-7. شارك في التعبير عن Q128::CFP المجاميع ويحفز exophers. CFP يسكت بشكل تفضيلي. ~25% الشكل 4C, ميلتييفيتش 2017
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168 [Pmec-7LMP-1::GFP] bzIs168 LMP-1::GFP التسميات أغشية البلازما والأغشية الليسوسونية. bzIs168 يمكن استخدامها لتحديد الأغشية العصبية، exophers (كما هي غشاء ملزمة)، وهياكل غشاء الليسوسوم. 3-20% ALM الشكل 4D, Melentijevic 2017
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [فم-4mitoLS::ROGFP] Allele zhsEx17 هو مراسل موضعية الميتوكوندريا أن يغير الطول الموجي ذروة الإثارة من 405nm (المؤدّد) إلى 476nm (مخفض) وفقا للبيئة المؤدّد المحلي. يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس ويمكن استخدامها من تلقاء نفسها لتحديد الميتوكوندريا في الخلايا العصبية على اتصال وفي mito-exophers. 3-20٪ ALM proteo-exopher. النسبة المئوية للكمية Mito-exopher ALM قيد التنفيذ. الشكل 4E, Melentijevic 2017, مدفع 2008, Ghose 2013

الجدول 1- الانبعاثات 1000 سلالات التي تم استخدامها للتصور من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس, لمس الخلايا العصبية exophers, ومحتويات exopher.

Figure 1
الشكل 1: مراحل النشوء. وتسمى عملية صنع وإخراج خارج "exopher-التكوين". يمكن أن تستغرق العملية الديناميكية لتشكيل الطارد عدة دقائق إلى عدة ساعات. يصور أمثلة من سوما وmorphology exopher في خطوات محددة خلال عملية الطاردة الديناميكية في سلالة عالية exopher المنتجة، ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. جميع الصور هي من اليوم 2 الخلايا العصبية ALM الكبار التي اتخذت مع هدف 100x. (أ) سوما عادي. الكبار mechanosensory اتصال الخلايا العصبية ALM بشكل معدل وراثيا التعبير عن Pmec-4mCherry. مورفولوجيا سوما يصور هو نموذجي من الخلايا العصبية الكبار الشباب في هذه السلالة، مع تركيزات mCherry في السيتوبلازم. (ب) مرحلة برعم المبكر. الخطوة الأولى الملاحظة من الخلع ينطوي على استقطاب من المواد السيتوبلازمية المختارة إلى حافة غشاء سوما. وغالبا ما تكون مصحوبة هذه الخطوة من قبل التوسع أو تورم سوما. في حالة الخلايا العصبية التي تعمل باللمس ، يمتد المجال ما قبل exopher (PED) إلى hypodermis المحيطة (غير مرئية هنا). لاحظ التركيز الأكبر للمواد mCherry في مجال برعم في وقت مبكر. (C) مرحلة البراعم المتأخرة. على مزيد من الاستقطاب الخلوي والتوسع في المجال ما قبل exopher، وينقبض بين سوما وطارد (السهم) يصبح واضحا. يشير هذا الحدث إلى الانتقال إلى مرحلة البراعم المتأخرة. على الرغم من أن في مرحلة البراعم في وقت متأخر من الخلية معارض موقع انقباض واضح والمجالات سوما منفصلة وطارد، فإنه لم يقرص بعد قبالة تماما من سوما. قد تكون تعلق exopher في مهدها من قبل ساق سميكة (السهم). ويعتبر المجال في مهدها exopher في وقت مبكر عندما يكون قطر المجال exopher في السؤال تقريبا 1 / 3 أكبر من قطر موقع البناء / ساق. (د)مرحلة الطارد المبكر. يمكن تركيب الطاردات المبكرة من ساق من سوما المغادرين - يمكن أن يكون قطر هذا الاتصال رقيقًا مع انتقال الطارد بعيدًا عن سوما. يمكن نقل المواد السيتوبلازمية من سوما إلى الطارد عبر هذا الأنبوب ، على الرغم من أن معظم المواد يتم تحميلها أثناء عملية الخروج في مهدها. يمكن أن تنفصل الاكفاء عن سوما كما هو مبين في (E) ، تعتبر الاكفاءات المنفصلة exophers ناضجة (F). يمكن للطارد الناضج العبور من خلال الأنسجة تحت الجلد المحيطة ، والابتعاد عن سوما المغادرين. (G) انهيار إكسوبر المسمى mCherry إلى الحويصلات الصغيرة داخل نتائج hypodermis في مظهر مفصلي متناثرة من المواد mCherry، على الأرجح لأنها تدخل شبكة الغدد الغدد تحت الجلد. وتسمى الإشارة المتفرقة "ليلة مرصعة بالنجوم" المرحلة. ومن المرجح أن يتم تحقيق تدهور بعض المحتويات الطاردة عن طريق الليسوسومات تحت الجلد ، ولكن بعض المواد لا تتحلل بشكل كامل وغالبا ما يتم إعادة قذفها من قبل hypodermis في pseudocoelom. ويرد وصف العبور ما بعد exophergenesis mCherry بمزيد من التفصيل في الشكل 2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: mCherry مقذوف من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في exophers يشارك الشبكة lysosomal تحت الجلد المحيطة ولكن يمكن مقذوف في وقت لاحق في pseudocoelom حيث يمكن تخزين coelomocytes / المهينة mCherry. (A) ملخص الكرتون لكيفية مقذوف mCherry في الطاردات تعبر الجسم بعد الطرد من قبل الخلايا العصبية. خلال exophergenesis محتويات خلوية مختارة مثل mCherry تصبح مترجمة وبرعم قبالة من سوما الخلايا العصبية المرسلة في الحويساء المستقلة التي تحيط بها أغشية البلازما العصبية وتحت الجلد. منذ الخلايا العصبية التي تعمل باللمس جزءا لا يتجزأ من الأنسجة تحت الجلد، كما براعم المجال exopher إلى الخارج فإنه يتحرك أبعد من ذلك في hypodermis. يمكن للطارد عبور تحت الجلد ، وبعد ساعات إلى أيام ، يمكن أن تتفتت محتويات الطارد داخل الشبكة endolysosomal من تحت الجلد. يمكن أن تظهر mCherry كما puncta متناثرة في جميع أنحاء hypodermis، مرحلة تسمى "ليلة مرصعة بالنجوم". بعد بضعة أيام، يمكن لبعض mCherry تمر من تحت الجلد في pseudocoelom المحيطة بها، حيث الخلايا الزبال يسمى coelomocytes يمكن الحصول على الوصول إلى، وتأخذ، mCherry التي يمكن تخزينها. (B) مثال على ظهور الـ mcherry night المرصع بالنجوم. صورة لـ ALM سوما الموسومة بـ mCherry مع شظايا كبيرة من الطاردات وحرفيات ليلية مرصعة بالنجوم. سلالة هو ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. (C) مثال على تركيز mCherry في coelomocytes البعيدة. Sideview من يوم بالغ 10 من سلالة ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] تظهر mCherry تتركز في coelomocytes (السهام). بعض الهضانات الليلية المرصعة بالنجوم واضحة أيضاً في تركيز coelomocyte عموما يصبح واضحا بعد حوالي يوم الكبار 5 من الحياة. (B أسفل) الكرتون الاستنساخ من (B), مع الخلايا العصبية اللمس والعمليات المبينة باللون الأحمر, كما هي ألمع شظايا exopher; تظهر في فُيصلات صغيرة متناثرة من مختلف أعماق Z في وردي أخف. (C أسفل) إصدار الكرتون من صورة (C) ، تظهر عملية الخلايا العصبية في الأحمر ، ليلة مرصعة بالنجوم في الوردي وcoelomocytes باللون الأخضر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الخلايا العصبية لمسة Mechanosensory إنتاج exophers على مستويات مختلفة مع لمحة زمنية دقيقة. (A) (أعلى) تصوير الكرتون من الخلايا العصبية لمسة mechanosensory في العلاقة المكانية إلى المعالم التشريحية الرئيسية من C. elegans بما في ذلك البلعوم ضخ والعصب الكثيفة العصبون في رأس الحيوان، والفرج في منتصف الجسم، والذيل مدبب. (أسفل) تسمية Fluorescently الخلايا العصبية التي تعمل باللمس التعبير عن GFP كما ينظر إليها من الجانب العلوي والأيسر (الصور المقتبسة من WormAtlas). الصندوق الأحمر يصور المنطقة التي توجد فيها عادة طاردات ALM. (B) عرض التكبير العالي لمنطقة الجسم الوسطى التي يتم فيها إنتاج طاردات مشتقة من ALM في سلالة تعبر عن [Pmec-4mCherry]. AVM و ALMR يتم تصوير الخلايا العصبية, ويظهر هو exopher ALMR جنبا إلى جنب مع ليلة مرصعة بالنجوم mCherry. الخلايا العصبية ALMR إنتاج معظم بسهولة exophers. (C) ALMR mechanosensory الخلايا العصبية التي تعمل باللمس أكثر سهولة إنتاج exophers مقارنة مع الخلايا العصبية الأخرى التي تعمل باللمس في hermaphrodites تحت الظروف القاعدية. Mechanosensory اتصال الخلايا العصبية exopher الإنتاج في يوم الكبار 2, كما سجل لالخلايا العصبية مستقبلات اللمس الفردية هو المشار إليه. سلالة: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N> 150, أشرطة الخطأ هي SEM. (D) ALMR الخلايا العصبية التي تعمل باللمس تنتج المزيد من الخرائب خلال أيام 2 و 3 من مرحلة البلوغ مقارنة مع مرحلة L4 المراهقين أو مع الحيوانات في سن متقدمة. سلالة: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] ، N> 150 ، أشرطة الخطأ هي SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة لبعض المراسلين الفلورسنت الذين يُشيرون إلى محتويات مُفْضِرة. وهناك طريقة مباشرة لمراقبة exophers هو عن طريق خلق الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن الفلوروفوريس من المروجين الخلايا العصبية. الفلوروفورات تسمح للتصور من التعبير exopher والمحولة وراثيا يدفع التجميع و / أو proteostress أن يزيد من exophergenesis. يمكن أيضا أن exophers التي تنتجها الخلايا العصبية amphid لاحظ في ظل الظروف الأصلية، وذلك باستخدام صبغة ملء للتصور. تظهر أمثلة على سلالات شائعة يمكن استخدامها لمراقبة الطاردات، (E) exopher، (S) سوما. (أ)سوما وطارد من ALM من شخص بالغ من سلالة SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]، 100x الهدف المستخدم للتصوير الفوتوغرافي، شريط مقياس 3μm. في هذه السلالة، يتم قياس الطاردات التي تشمل GFP القابلة للذوبان، ولكن يحدث إنتاج الطارد بشكل غير متكرر. إن دمج GFP في البروتينات التي يمكن قذفها بشكل تفضيلي في طاردات في دراسات أخرى تؤكد أنه يمكن اكتشاف الانصهارات GFP في الطاردات الناضجة. (B) ALM سوما وطاردة من الكبار من سلالة ZB4065 bzIs166[فmec-4mCherry], الذي يعبر عن mCherry ويحفز على اتصال الخلايا العصبية exopher الإنتاج. 100x الهدف المستخدمة في التصوير الفوتوغرافي، مقياس شريط 5 μm. (C) ALM سوما وطاردة من سلالة ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pم م م-3htt57Q128:: cfp lin-15+]; انتقائية قناة زرقاء تستخدم لصورة htt57Q128 ::CFP. يحتوي exopher htt57Q128 ::CFP المجاميع (الأسهم)، التي تظهر أكثر تركيزا في exopher مما كانت عليه في سوما. 40x الهدف المستخدم للتصوير الفوتوغرافي، شريط مقياس 5μm. (D-E) يمكن أن تحتوي exophers على العضيات ووضع علامات خاصة بالعضية مع البروتينات الفلورية مما يتيح مراقبة بثق العضية. (D) Lysosomal غشاء العلامة LMP -1 :: GFP يحدد سوما وغشاء exopher والعلامات أغشية البلازما ضعيفة (توطين غشاء البلازما هو خطوة الاتجار في الطريق إلى استهداف الليسوسومي) وتسميات lysosomal organelles بقوة. يظهر هو الكبار ALM سوما شارك في التعبير عن Pmec-4mCherry وPmec-7LMP-1::GFP التي تُحَمّل إلى الأغشية والليسوسومات. يحتوي سوما على طاردة مرفقة مع قذفات أصغر أخرى من المرجح أن تكون شظايا اضحة (سهام). يتم تضمين الهياكل الإيجابية GFP في سوما وهي موجودة في الطارد الكبير، سلالة: ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]؛ bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]. 100x الهدف المستخدمة في التصوير الفوتوغرافي، مقياس شريط 5 μm. E) يمكن استخدام علامة GFP الميتوكوندريا لتحديد الميتوكوندريا في سوما وطاردات. يظهر هو سوما ALM الكبار التعبير عن Pmec-4mCherry وmito::ROGFP، الذي يُترجم إلى مصفوفة الميتوكوندريا. mito::ROGFP أعرب وحده، دون mCherry، ويمكن أيضا بسهولة أن تستخدم لتحديد الخلايا العصبية والنتيجة لاكبراز التي تشمل الميتوكوندريا. سلالة: ZB4528 bzIs166[فميث-4مشري]; zhsEx17 [فم-4mitoLS::ROGFP]. 100x الهدف المستخدم للتصوير الفوتوغرافي؛ شريط مقياس 5μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: دورة تطويرية لتحديد هوية سي إليغانس وL4. (أ) في 20 درجة مئوية البيضة يستغرق حوالي 9 ساعات لتفقيس وضعت مرة واحدة من قبل الأم. (ب) مفقس حديثا في المرحلة اليرقة 1 (L1) و يرقات في يرقة L2 بعد 12 ساعة. (C) تبقى الحيوانات في L2 و (D) L3 مراحل اليرقات لمدة 8 ساعات لكل من. (E) تعتبر الحيوانات المراهقة المرحلة الرابعة من اليرقات (L4) وتتميز بالفرج النامي الواضح الذي يظهر كهلال أبيض بالقرب من منتصف الجسم. وجود هذا في حين أن الهلال تمكن من التعرف على الحيوانات وانتقاءها من L4 على مراحل لإنشاء ثقافات متزامنة تسهل في وقت لاحق تسجيل الاكفاء. تبقى الحيوانات في مرحلة L4 لحوالي 10 ساعات قبل molt النهائي في البالغين جرافيد، F) التي تم تحديدها من خلال تطوير البيض، الحيوانات المنوية مرئية، والشروع في وضع البيض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: إعداد المجهر شريحة agar وسادة. (أ) إعداد اثنين من الشرائح مع شريط واحد من شريط المختبر وضعت بالطول عبر الجزء العلوي. ضع شريحة مجهر غير مسجلة في ما بين الصورة. ب) ضع قطرة من agarose المنصهرة على أعلى الشريحة. (C) ضع شريحة نظيفة بلطف على أعلى القطرة ، والضغط على agarose في وسادة دائرة مفرغة. (D) إزالة الشرائح اُلُوَقَط، والتي تعمل على إنجاز تسطيح حتى لأجار الذي هو مطلوب لإنشاء لوح زوجي. (E) إزالة الشريحة العليا مرة واحدة وقد جفت لوحة agarose. (F) الماصات حل الشلل (levamisole أو tetramisole) على رأس لوحة أجار. (G) اختيار الحيوانات نظمت بشكل مناسب في الشلل. (H) بلطف تغطية الحيوانات مع غطاء وضمان الحيوانات على قيد الحياة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: شخصيات من exophers ومعايير تحديد exopher. (أ) المعايير العامة التي تحدد الطارد. (B) مقارنات القطر بين سوما المرسل وبثق البثق، تقاس بالميكوم. الكبار ALM سوماز، N = 35، سلالة: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] - 6.53 μm متوسط حجم سوما و 3.83 ميكرومتر متوسط حجم exopher. (ج)تحديد معايير للتمييز بين نطاق الطارد وطاردة الناشئة. (D) الأكثر شيوعا, الخلايا العصبية الفردية جعل واحد exopher كبيرة, الذي انقسمات في وقت لاحق أو شظايا كما يحاول hypodermis إلى تدهور محتوياته. ومع ذلك ، يمكن ملاحظة exophers متعددة بجانب خلية عصبية لمسة واحدة قد تستمد من أحداث متعددة من الخلايا العصبية أو بدلا من ذلك ، يمكن أن براعم exophers أيضا أو تجزئة نفسها. ولا يمكن تحديد أصل الكيانات المتعددة الشبيهة بالطاردات إلا باستخدام المجهر الفاصل الزمني. أعلى يصور صوما الخلايا العصبية اللمس ALMR مع exopher واحد بعيد. القاع يصور سوما الخلايا العصبية اللمس ALMR مع البثقات متعددة مثل exopher. (E) الميزات المورفولوجية الشائعة في الكبار ALM اتصال الخلايا العصبية somas التي قد تكون مخطئة للأحداث exopher. أعلى اليسار - سوما ALM مفككة، مع عدم وجود مجال واضح أو موقع انقباض. أعلى المتوسطة - يمكن أن يكون الخلايا العصبية نتوءات صغيرة خارج الخلية التي قد تكون مماثلة لبراز، ولكن لا تفي بمعايير متطلبات الحجم التي تعتبر exopher. أعلى اليمين – مع التقدم في السن, يمكن أن الخلايا العصبية التي تعمل باللمس تطوير outgrowths على طول neurite طفيفة. في كثير من الأحيان يمكن جمع المواد mCherry في غيض من خارج neurite. لا يتم تسجيل هذا كطارد إذا mCherry التي تم جمعها لا تفي بمتطلبات حجم الطارد إلى سوما. القاع يصور الخلايا العصبية ALM الكبار التي لديها معايير تعريف لمجال exopher أو exopher. بولتوم اليسار - ALM سوما التي لديها مجال exopher بارزة التي تشمل بشكل انتقائي mCherry cytosol والمجاميع مي شيري الموسومة. يتم وضع علامة على موقع انقباض المجال بالأسهم ويستوفى معايير الحجم (على الأقل 1/5th حجم سوما). أكبر قطر من المجال exopher هو تقريبا 1/3 أكبر من قطر موقع الانقباض، وتلبية المعايير لحدث exopher. أسفل الأوسط - ALM سوما التي لديها exopher بارزة في مهدها التي تلبي معايير الحجم. هناك موقع انقباض واضح. أسفل اليمين - ALM سوما التي لديها exopher المرفقة mCherry مليئة التي تلبي متطلبات حجم exopher. يتم إرفاق exopher من خيوط ربط رقيقة. جميع الصور من سلالة ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

إن توصيف الآليات الجزيئية في الجسم الحي للتخلص الكلي والعضلي في شكل طاردات كبيرة لا يزال في مراحله الأولى. ولا تزال هناك أسئلة بشأن تعيين الشحنات للطرد، وجمع هذه الشحنات المستقطبة داخل الخلية، وتنظيم قرار توليد طاردات، والآلات التي تتوسط عمليات البثق، وتفاعل الطاردات مع الآلات المهينة في خلية مجاورة، كلها مسائل لا تزال قيد المعالجة. وعلاوة على ذلك، فإن التصور في الجسم الحي من الاتصالات أنبوبي التي يمكن تمرير المواد البيولوجية التي تشمل الكالسيوم، والمجاميع، والميتوكوندريا هو البيولوجيا مثيرة للاهتمام وناظرة في حقها. كما أن الأسئلة المتعلقة بالأسباب التي تؤدي إلى أن تكون بعض الخلايا أكثر عرضة للإنتاج من غيرها من غير المحلول، ولكن يمكن أن تبدأ في تشريحها وراثياً باستخدام النهج المبينة في هذا البروتوكول.

ويرد في هذا البروتوكول وصف تفصيلي هو النهج المتبعة لتحقيق نقاط قابلة للتكرار لإنتاج الطاردات، مع الاهتمام بتمييز الطاردات من الصوما القريبة من الخلايا، وتوقيت التحليلات لالتقاط ذروة إنتاج الطارد، والرقابة الصارمة على ظروف النمو للقضاء على الضغوط غير المقصودة التي يمكن أن تعدل مستويات الطارد. يمكن أن يتم كمي كل من التمييز من طارد كبير في وقت مبكر، أو "ليلة مرصعة بالنجوم" تشتت في hypodermis المحيطة كدليل على إنتاج الطارد. ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية التي تعبر عن mCherry في ظل ظروف القاعدية غالباً ما ترتبط بـ 5-25% من الخلايا العصبية من نوع معين تنتج طاردًا. يمكن تطبيق إدخال تسيطر عليها من ظروف الإجهاد لزيادة إنتاج exopher للكشف عن ما يصل إلى 90٪ من الخلايا العصبية المنتجة البثقات، مفيدة بشكل خاص للشاشات الوراثية أو الدوائية للمعدّلات.

في الأمراض العصبية البشرية ، يمكن أن تنتقل المجاميع الكبيرة من الخلايا العصبية المريضة إلى الخلايا المجاورة لتعزيز انتشار علم الأمراض. وقد تُطبَّق آلية الطاردة عن طريق آلية محفوظة تستخدم في البثق الكلي عبر الـphyla. تحديد جزيئات في vivo التي إما تعزيز كفاءة هذه العملية (تعتبر أكثر فعالية مكافحة البروتيوستاسيس) أو كتلة قد تكون تسخيرها للتأثير على تصميم استراتيجيات جديدة لمكافحة الأمراض العصبية المتعددة. على هذا النحو، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لشاشات الطفرات الوراثية الكلاسيكية، وشاشات RNAi على نطاق الجينوم التي تدق الجينات بشكل منهجي لتحديد التعزيزات والقامع، أو لدراسات التدخل الدوائي التي تحدد المعدلات الدوائية المرشحة لهذه العملية. وهذا النهج واضح، وإن كان شاقا إلى حد ما. exophers كبيرة جداً بحيث يمكن أن ينظر إليها مع المجهر تشريح عالية التكبير. ومع ذلك ، فإن الخلايا العصبية C. elegans صغيرة نسبيًا والنظر إلى أعضائها أو أغشيتها يتطلب صورًا التقاء عالية السلطة وهي عملية بطيئة. خيارات لخرج أعلى يمكن أن تنطوي على أساليب التصوير المحتوى عالية في شكل لوحة متعددة جيدا.

وينبغي أن يكون تطبيق نهج موحد للتخلص من النفايات من المخلفات أساسا لتشريح وراثي متضافر للعملية التي يمكن للخلايا العصبية من خلالها تنظيم الحطام الخلوي والقضاء عليه.

Disclosures

اي

Acknowledgments

نحن نعترف بمنح المعاهد القومية للصحة التالية: R01AG047101 و R37AG56510. وقد ساهم أعضاء مختبرات دريسكول وغرانت على نطاق واسع في تطوير وصقل البروتوكولات الموصوفة، مع إجراء تجارب صارمة واتصالات قوية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95B Scientific CMOS camera Photometrics Prime
1,000 μL low retention tips Sarstedt
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
absolute ethanol Vwr 20821.33
Agar Sigma Aldrich A1296
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
FBS10 Standard microscope Meyer Instruments KSC 410-1-100-1 FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
LDI – Laser Diode Illuminator 89 North
levamisole Sigma Aldrich 16595-80-5
M4 multipette Eppendorf 4982000012
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
pipeteboy 2 VWR 612-0927
Polystyrene microbeads Sigma Aldrich MFCD00131491
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
Reusable ringed cytology slides ThermoFisher Scientific 22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] contract Driscoll lab GFP expressed in touch neurons
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
Triton-X Thermofisher scientific 28313
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] contract Driscoll lab mCherry expressed in touch neurons
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] contract Driscoll lab Q128 expressed in touch neurons
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] contract Driscoll lab mitoROGFP expressed in touch neurons
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] contract Driscoll lab autophagy marker expressed in touch neurons
ZEISS Axio Vert.A1 Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).
  2. Davis, C. H., et al. Transcellular degradation of axonal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).
  3. Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).
  4. Stahl, P. D., Raposo, G. Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis. Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).
  5. Melentijevic, I., et al. C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367 (2017).
  6. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).
  7. Tyson, T., et al. Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  9. Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nature Communications. 6, 6768 (2015).
  10. Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism. bioRxiv. 10 (1), (2019).
  11. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
  12. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).
  13. Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  15. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  16. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  17. Weicksel, S. E., et al. A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).
  18. Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).
  19. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  20. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).
  21. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  22. Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 163، Exophers، C. elegans، علم الأحياء الشيخوخة، بروتيوستاسيس، انتشار الكلي، انتقال الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية، التنكس العصبي، الميتوكوندريا، ليسوسومات، نقل العضية
النهج الكمية لتسجيل <em>في الجسم العصبي الكلي الجسمية</em> وبثق Organelle في Vesicles كبيرة exopher في <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. … More

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. J. Vis. Exp. (163), e61368, doi:10.3791/61368 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter