Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantitative metoder til scoring in vivo Neuronal Aggregat og Organelle Extrusion i Store Exopher Vesikler i C. elegans

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61368
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver metoder til påvisning og kvantisering af store aggregerede og/eller organelle ekstruderinger (~4 μm), der produceres af C. elegans celler i form af membranbundne exfoner. Vi beskriver stammer, vækstbetingelser, scoringskriterier, timing og mikroskopi overvejelser, der er nødvendige for at lette dissektion af denne debris udvisning mekanisme.

Abstract

Toksicitet af misfolded proteiner og mitokondriel dysfunktion er afgørende faktorer, der fremmer aldersrelaterede funktionelle neuronal tilbagegang og neurodegenerative sygdomme på tværs af arter. Selv om disse neurotoksiske udfordringer længe har været anset for at være celle-iboende, betydelige beviser understøtter nu, at fejlfoldede humane sygdomsproteiner med oprindelse i en neuron kan forekomme i tilstødende celler, et fænomen foreslået at fremme patologi spredes i menneskelige neurodegenerative sygdomme.

C. elegans voksne neuroner, der udtrykker aggregering proteiner kan ekstrudere store (~ 4 μm) membran-omgivet vesikler, der kan omfatte den aggregerede protein, mitokondrier, og lysosomer. Disse store vesikler kaldes "exophers" og adskiller sig fra exosomer (som er omkring 100x mindre og har forskellige biogenese). Smide ud cellulære vragrester i exophers kan forekomme ved en bevaret mekanisme, der udgør en grundlæggende, men tidligere ukendt, gren af neuronal proteostase og mitokondriel kvalitetskontrol, der er relevante for processer, som aggregater spredes i menneskelige neurodegenerative sygdomme.

Mens exophers er for det meste undersøgt i dyr, der udtrykker høj kopi transgene mCherry inden touch neuroner, disse protokoller er lige så nyttige i studiet af exophergenesis ved hjælp af fluorescerende mærkede organeller eller andre proteiner af interesse i forskellige klasser af neuroner.

Beskrevet her er de fysiske træk ved C. elegans exophers, strategier for deres påvisning, identifikationskriterier, optimal timing for kvantificering, og dyr vækst protokoller, der styrer for understreger, der kan modulere exopher produktionsniveauer. Sammen bør detaljer om protokoller, der er skitseret her, tjene til at fastsætte en standard for kvantitativ analyse af exophers på tværs af laboratorier. Dette dokument har til formål at tjene som en ressource på området for laboratorier, der søger at udarbejde molekylære mekanismer, som exophers produceres, og som exophers reageres på af tilstødende og fjerne celler.

Introduction

De neurotoksiske udfordringer af aggregater og dysfunktionelle mitokondrier har længe været anset for at være celle-iboende, men for nylig er det blevet klart, at misfolded human sygdom proteiner med oprindelse i en neuron kan også sprede sig til tilstødende celler, fremme patologi1. Ligeledes kan pattedyr mitokondrier sendes ud af cellen af deres oprindelige produktion til transcellulærnedbrydning 2 eller til redning af mitokondrielle populationer i udfordrede tilstødendeceller 3. Vesicles i forskellige størrelser er generelt blevet observeret for at overføre cellulære materialer til tilstødende celler eller til flydende omgivelser4. Nogle ekstruderede vesikler tilgang størrelsen af den gennemsnitlige neuronal soma (gennemsnitlig touch neuron soma ~ 6 μm) og kan rumme store aggregater og organeller.

Et slående eksempel på stor vesicle ekstrudering, der kan bære protein aggregater og organeller forekommer i C. elegans touch receptor neuroner, der udtrykker en høj kopi nummer reporter konstruere kodning en skadelig sammenlægning-tilbøjelige, nedbrydning-resistente mCherry5. Ekstruderinger fra touch neuroner, kaldet exophers, er ~ 4 μm gennemsnitlig diameter, selektivt omfatter mCherry eller andre aggregater, og leveres direkte ind i den nærliggende hypodermis, som normalt omgiver touch receptor neuroner. Hypodermis forsøg lysosom-baseret nedbrydning, men nogle ikke-fordøjelige indhold såsom mCherry aggregater kan re-ekstruderes af hypodermis i væskefyldte pseudocoelom af dyret, hvorfra mCherry kan tages op af fjerntliggende skyllevæske celler kaldet coelomocytes til langtidsopbevaring (Figur 1, Figur 2)5.

De store ekstruderede exopher vesicles forlade cellen omgivet af touch receptor plasma membran og kan indeholde aggregerede humane sygdom proteiner, mitokondrier, og lysosomer. Processen med exopher produktion synes at indebære sortering af potentielt giftige arter (for eksempel en sammenlægning-tilbøjelige udtrykt mCherry er adskilt fra opløselige, inoffensive proteiner som GFP, der forbliver for det meste i neuronal soma). På denne måde, rettet udvisning af de truende enheder opnås ved neuron5. En proteostase udfordring, såsom stress induceret af autofagi knockdown, MG132-medieret afledningshæmmer, eller transgene udtryk for humane sygdomme proteiner såsom Huntingtons Sygdom-associerede ekspanderet polyglutamin Q128 eller Alzheimers sygdom-impliceret fragment Aβ1-42, kan øge antallet af neuroner, der producerer exophers5.

Som exophers er først for nylig blevet dokumenteret, hvad der er kendt af deres biologi fortjener beskrivelse. Exophers blev opdaget i, og er de mest godt undersøgt i, C. elegans touch receptor neuroner. Der er seks C. elegans mechanosensory touch neuroner, der har celle organer fordelt rundt i kroppen (Figur 3A) og kaldes mikrotubule celler, fordi deres ultrastruktur har karakteristiske 15 protofilament mikrotubuli. Touch receptor neuroner er den forreste AVM (forreste ventrale microtubule neuron), ALMR, og ALML (forreste laterale mikrotubule neuroner højre og venstre), jo mere centrale PVM (posterior ventral microtubule neuron), og den bageste PLMR og PLML (posterior lateral microtubule neuroner højre og venstre) i halen. Interessant, de seks touch receptor neuroner producere exophers på forskellige satser, på trods af at udtrykke den samme offensive transgene (Figur 3C). Af de seks mechanosensory touch receptor neuroner, ALMR neuron gennemgår exophergenesis oftere end de andre touch neuroner. Kvantisering af exopher numre fra touch neuroner er således normalt etableret ved at fokusere på ALMR.

Exophergenesis er en dynamisk proces, der typisk begynder med hævelse af neuronal cytoplasma (Figur 1A-B). Cellulære indhold, organeller, eller protein aggregater er indsamlet til den ene side af neuronal soma, oftest mod den bageste ende af ALMR neuron (væk fra den fremskkrivende neurite), danner en præ-exopher domæne (PED) (Figur 1B). Den tidlige fremspring er observeret som PED begynder at projektet udad, danner en genkendelig fremspringende opløbet opløbet. Den sene knop defineres, når den bredeste diameter af præ-exopher domæne er ca 1/3 større end diameteren af konstriktionen af soma-exopher hals (Figur 1C). Exophers kan skubbes ud i næsten alle retninger fra soma, men de fleste exophers exit posteriort fra cellen kroppen og forblive i omtrent samme brændpunkt plan som den oprindelige soma.

Exopher kan bevæge sig væk fra den oprindelige soma som halsen af opløbet indsnævres til en tynd glødetråd. Exophers kan forblive fastgjort til soma via denne glødetråd (Figur 1D, pil) og kan senere blive løsrevet. Cellulære indhold såsom calcium, aggregater, og mitokondrier kan overføres via denne glødetråd i den vedhæftede exopher5, selv om hovedparten af ekstruderet materiale er sat i exopher rummet ved den massive spirende begivenhed. Exophers betragtes som modne, når der ikke er synligt forbindelsesrør eller tynd glødetråd, og exopher er helt adskilt fra sende soma (Figur 1E).

Exophers produceret af C. elegans touch neuroner straks støder på hypodermis, det væv, der omgiver touch neuron. Mest almindeligt, exopher vesicle synes at rejse inden for hypodermis posteriort mod halen, og kan være temmelig fjernt fra soma før exopher indhold synes målrettet til nedbrydning (for eksempel kan afstanden være ~ 100 μm væk fra soma (Figur 1F)). Den fluorescerende exopher vesicle bryder op i mange mindre vesicles i hypodermis, idet der på en udseende benævnt "stjerneklar nat" (Figur 1G og Figur 2). I "stjerneklar nat" fase, punktformig fluorescerende materiale kan observeres spredt over hypodermal syncytium i mange mindre punkter af fluorescens i forhold til den oprindelige ensomme exopher. Stjerneklar nat kan se punktformig under lav forstørrelse og med højere forstørrelse, kan se punktlig og / eller netværksforbundet inden for hypodermis. Den fluorescerende signal af stjerneklar nat er typisk lysdæmper end exopher og neuronally udtrykt fluorescens (Figur 2B-C). Spredningen af mCherry i mange punktformige vesikler menes at involvere fagagosom modning og fusion med den ensomale / lysosomal netværk af hypodermal celle. Nogle exopher materialer er sandsynligvis nedbrudt i hypodermal lysosomal netværk, men resterende arter, der er resistente over for nedbrydning (såsom mCherry aggregater) er smidt ud af hypodermis i pseudocoelom, en væske rum, der kan indeholde cellulære vragrester. Fluorescerende materiale er senere taget i af fjerntliggende skyllevæske celler kaldet coelomocytter (Figur 2C), som kan koncentrere, gemme, og igen forsøge nedbrydning af mCherry.

Fænomenet aggregat ekstrudering og overførsel synes bevaret på tværs af phyla, der er blevet rapporteret i genetiske modeller som C. elegans5,,6,7 og D. melanogaster8,9 samt i flere pattedyr modeller. Exopher-lignende ekstruderinger er blevet rapporteret for pattedyrceller 10, en observation tyder på, at bevarede mekanismer kan ligge til grund for aggregeret og organelle udvisning. Exopher produktion kan således være en bevaret mekanisme cellulære vragrester forvaltning, der udgør en grundlæggende, men tidligere ukendt, gren af neuronal proteostase og mitokondriel kvalitetskontrol, som, når ubalanceret, kan aktivt bidrage til neurodegenerative sygdom. Identifikation af de molekyler, der er involveret i snavs diskrimination og sortering, transport til en særskilt subcellulær lokalitet, ekstrudering, dannelse / scission af rørformede forbindelse forbinder soma og sen exopher, og anerkendelse af den store ekstruderet vesicle for fjernforringelse af en tilstødende celle forbliver til fremtidigt arbejde. Undersøgelser i nematode- og fluemodeller vil være af afgørende betydning for at definere mekanismer for indsamling og overførsel af organiske tog, ved hjælp af upartiske genetiske tilgange og kraftfulde cellebiologiske værktøjer, der tilbydes af disse modeller til at identificere deltagende molekyler i fysiologisk sammenhæng.

Kritiske første skridt i dechifrering mekanismer operative i exopher biologi indebærer at definere protokoller for reproducerbare in vivo exopher kvantificering. C. elegans-modellen giver en særlig fordel for en sådan indsats, da kroppen er gennemsigtig, og exophers let kan observeres, når de indeholder fluorescerende mærkede proteiner eller organeller. Exophers er blevet rapporteret til at blive genereret af C. elegans dopaminerge neuroner PDE og CEP, ASE og ASER sensoriske neuroner, og farvestof-påfyldning amphid neuroner5. Fordi exophers produceret af touch receptor neuroner er bedst karakteriseret, fokus her er på brugen af touch neuroner til exopher analyse. Men den grundlæggende tilgang kan anvendes til at måle exopher produktion fra enhver celle. Protokoller til påvisning og kvantisere exophers produceret af C. elegans touch receptor neuroner, der transgenically udtrykke mCherry protein er skitseret, med vægt på laster, der kan overvåges og tidsmæssige begrænsninger i scoring. Denne artikel definerer tilgange til in vivo exopher identifikation, og mængden af miljømæssige og genetiske tilstande, der modulerer exopher produktion. Protokollerne lægger vægt på kritisk opmærksomhed på konstante ikke-stress betingelser for bestemmelse af baseline exopher produktion og for sammenligninger på tværs af genotyper.

Protocol

1. Stammer nyttige for exopher afsløring

  1. Vælg en stamme, der udtrykker fluorescerende laster i neuroner af C. elegans til let at visualisere exophers.
    BEMÆRK: Tabel 1 viser stammer, der er blevet brugt til at visualisere exophers produceret i touch receptor neuroner5,,11,,12. I princippet kan enhver celle- eller neuronal type testes for produktion af exopher ved hjælp af en celle- eller vævsspecifik promotor til at drive udtryk for et fluorescerende protein, der aggregerer eller på anden måde er udvalgt til ekstrudering.
  2. Alternativt kan du bruge en farvestof-påfyldning analyse til at visualisere exophers i ammid hovedet neuroner, som er åbne for miljøet og modtagelige for opfyldning5,13.

2. Vækstmedier

  1. Forbered standard nematodevækstmedier (NGM) på dyrkningsstammer efter standardmetode14,15.
    BEMÆRK: Mangel på fødevarer, eller fluor-deoxyuridin (FuDR), der anvendes almindeligvis til at blokere afkom produktion, og kan dramatisk påvirke exopher produktion. Hold befolkningen kontinuerligt fodret (undgå selv korte perioder med bakteriel mad udmattelse) og vedligeholde dyr ved en konstant temperatur.

3. Husdyrhold kritisk for konsekvent exopher produktion

  1. Hæv dyr på konsekvente medier og med konsekvent bakterielle fødevarer kilder. Dyr må ikke løbe tør for bakteriemad, selv i korte perioder, da fødevarebegrænsningen dramatisk kan ændre exopher produktionsniveauet.
  2. Hold medieopskrifter og forberedelse ensartet gennem en undersøgelse.
    BEMÆRK: Ændring af medier kan påvirke basale niveauer af exopher produktion. Agar-batches kan påvirke baseline exopher niveauer, så når levering partier ændre, gøre et notat af datoen. Smid lagerplader ud efter to uger for at sikre sund bakteriemad og for at forhindre tørret agar, som forårsager ændringer i agar osmolarity, der påvirker exopher niveauer.
  3. Ved basale forhold opbevares dyrene ved en konstant temperatur på 20 °C. Opdræt af dyr ved variable temperaturer (selv midlertidige temperaturændringer) kan forårsage variationer i timingen af maksimal exopher produktion.
    BEMÆRK: Temperaturvariation er ikke begrænset til kulturforhold. Temperaturvariationer under forsøg eller på laboratoriebænken kan være virkningsfulde. For eksempel bør temperaturer i et mikroskop rum ikke afvige dramatisk fra kultur inkubator eller lab bænk.
  4. Brug ikke farmakologiske anti-fertilitet interventioner, fordi befrugtede æg er afgørende for tidlig voksen produktion af exophers.
    BEMÆRK: Brug af Fluoro-deoxyuridin (FuDR)16 eller C2217skal undgås. Når der udføres livsvarigt eller gamle dyreforsøg, bør alderssynkronerede populationer opretholdes ved fysisk at fjerne voksne fra deres mindre afkom ved at plukke dem på friske plader spredt med bakterier i stedet for at bruge almindelige farmakologiske anti-fertilitet interventioner.
  5. Brug ikke forurenede kulturer; genoptage eksperimenter i tilfælde af biologisk kompromis af populationen eller pladen. Bakteriel eller svampeforurening kan fremkalde belastninger og metaboliske ændringer hos dyr og skal være fraværende fra forsøgspopulationer.
    1. For at maksimere reproducerbare resultater skal kulturer opretholdes i mindst to sunde, velfodrede, forureningsfrie generationer ved 20 °C før forsøg for at undgå potentielle miljøinducerede epigenetiske ændringer.

4. Alder synkronisering for exopher scoring ved blegning, saccharose flotation, eller L4 larver picking

  1. Hold forsøgspopulationer den samme biologiske alder, da exopher detektionsmønstre varierer med voksenalder og sammenligning af dyr i blandet alder populationer kan forvirre resultater. Sørg altid for vellykket synkronisering af forsøgsdyrpopulationer ved at kontrollere for den "hvide halvmåne" vulvamorfologi på L4-triniet.
    BEMÆRK: Generelt, peak exopher produktion for C. elegans mechanosensory ALMR neuroner forekommer på voksen dag 2-3 (Figur 3D), målt fra dage efter L4 fase. Voksen dag 1 er 24 timer efter L4 larve fase, der er kendetegnet ved "hvid halvmåne" vulva morfologi (Figur 5E).
  2. Forbered synkroniserede æg populationer ved blegning gravid voksne.
    1. Saml gravide voksne fyldt med æg ved at vaske dyr vokser på en NGM plade. For at vaske, oversvømme pladen med 1 ml M9 buffer, pipet op og ned for at indsamle væske med suspenderede dyr og pipet i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Pellet dyr ved gravitationel afregning eller blid centrifugering med en mini centrifuge og fjerne supernatant.
    2. Der tilsættes 150 μL 5M NaOH og 150 μL 6% natriumhypochlorit (blegemiddel) i 1 ml i H2O og blandes ved inversion i ca. 5 minutter.
      BEMÆRK: Frisk blegning løsning sikrer, at dyret neglebånd kan forstyrres for æg-høst. Fremskridt i forstyrre neglebånd kan overvåges under en dissekere mikroskop; voksne bør knække og frigive æg på det punkt, hvor blegning bør stoppes.
    3. Centrifuge med et minicentrifugerør til 20 s og fjern supernatanten. Der tilsættes 1 ml M9-buffer og centrifuge igen, så der efterlades ca. 100 μL oven på pellets.
    4. Gentag trin 4.2.3 to gange for at fjerne spor af blegemiddelopløsning.
    5. Opspræn dine æg i det resterende volumen og overføres til en frisksået NGM plade. Voksne vil blive lyset, men mange levedygtige æg bør være i præparatet.
  3. Forbered synkroniserede populationer ved tidsbaseret æg-lay.
    1. Vælg 20 gravide voksne til en seedet NGM plade ved hjælp af standard overførselsprotokoller14.
    2. Lad dyrene kravle frit og lægge æg i 1,5 timer (mutantstammer med lave yngelstørrelser kan kræve indførelse af flere voksne dyr).
    3. Fjern alle voksne dyr fra pladen ved at plukke, forlader synkroniseret æg population bag. Kontroller pladerne et par timer senere for at kontrollere, at ingen levedygtige voksne er blevet savnet under fjernelse af voksne.
  4. Forbered synkroniserede æg populationer ved saccharose flotation udvælgelse af æg.
    1. Der indsamles dyr og æg fra fem NGM-plader, hvorpå personer har lagt æg i mindst 24 timer ved hjælp af oversvømmelsesplader med M9-opløsning med 0,1 % vaskemiddel (f.eks. Pellet voksne ved blid centrifugering ved stuetemperatur (2.000 x g for 30 s).
    2. Fjern supernatant og vask dyrene i 15 ml frisk M9 tre gange, kassere supernatant efter hver vask, og sørg for at holde pellet beriget med dyr og æg.
    3. Bevar 2 ml supernatant og resuspend pellet. Der tilsættes 2 ml 60 % vægt efter volumen saccharose.
    4. Centrifuge ved 2000 x g i 5 min. Opløsningen vil nu vise en øvre fase stærkt beriget i æg.
    5. Overfør ca. 2,5 ml af den øverste fase til et nyt 15 ml rør og tilsæt 10 ml M9.
    6. Bland ved inversion i 1 min, og derefter centrifuge 2000 x g i 1 min.
    7. Fjern supernatanten og vask den ægberigede pellet i M9. 10-15 μL af æggepille kan fordeles til en frisk OP50-seedet NGM plade.
      BEMÆRK: Denne metode forbereder et stort antal æg; lad ikke indsamlede dyr løbe tør for OP50 E. coli-fødevarer.
  5. Forbered synkroniserede populationer ved at plukke dyr på L4 udviklingsstadiet.
    1. Dyrk dyr på seedede NGM-plader som beskrevet ovenfor.
      BEMÆRK: C. elegans udvikler sig i fire diskrete faser. Ved 20 °C tager det ca. 9 timer at klække et nylagt æg (Figur 5A). Postlugen, et dyr passerer gennem larve fase 1 (L1) til larve fase 4 (L4), med hver fase varer 8-12 timer mellem hver molt (Figur 5A-F). Derfor bør en plade, der fremstilles ved podning med æg, have mange L4-dyr at plukke ca. 40 timer efter, at æggene er indført.
    2. Identificer L4-iscenesatte dyr ved at lokalisere den hvide halvmånemåneform af den udviklende vulva (Figur 5E).
      BEMÆRK: Dyr på L4-scenen er ensartede i størrelse og i kropspigmentering. Pick dyr med den hvide halvmåne til en frisk vækst plade til undersøgelse af iscenesatte dyr. Den følgende dag (~ 24 timer senere) skal tælles som voksen dag 1.
    3. Score en population af dyr dagligt på voksen dag 2.
      BEMÆRK: Exophers er typisk scoret på dag 2 i voksenalderen, som er toppen exopher produktion under basale forhold. Men da exophergenesis peak og timing kan ændres af miljømæssige eller genetiske ændringer, der undersøges, anbefales det at score en population af voksne dyr dagligt over fire dage for at generere det mest omfattende billede (Figur 3D).

5. Påvisning af exophers ved hjælp af et fluorescerende mikroskop

  1. Overhold exophers ved hjælp af en høj forstørrelse pseudo-stereo dissekere mikroskop, der er udstyret til fluorescens mikroskopi.
  2. Immobilisere dyr på NGM plader ved pipettering 100-200 μL af 10-100 mM levamisole / tetramisole opløsning på NGM agar plade overflade. Efter 2-4 minutter bliver dyrene lammet og kan observeres direkte på agarpladen.
    BEMÆRK: Immobilisering behandlinger er ikke absolut påkrævet, således at med et uddannet øje, neuronal identifikation og exopher tilstedeværelse kan scores ved visuelt efter kravlende dyr under mikroskopet på pladen, når det afgøres, om en exopher er blevet produceret.
  3. Overhold fluorescerende neuroner ved hjælp af en total forstørrelse på 100x for at opnå dissekerende mikroskopdetektion af exophers.
    BEMÆRK: Scoring exopher begivenheder ved hjælp af dissektion mikroskopi giver mulighed for observation af et stort antal dyr med relativ lethed direkte på agar plader, hvor de er opdrættet.
  4. Levende billeddannelse og montering reporter stammer til exopher undersøgelser ved hjælp af konfokal mikroskopi
    1. Brug et konfokal mikroskop til live-billede intracellulære dynamik og karakteristika exophergenesis.
      BEMÆRK: Live imaging er en fordelagtig tilgang til at observere subtile detaljer i exopher produktion, fordi exopher produktion er en dynamisk proces.
    2. Begræns dyrenes bevægelse for høj opløsning levende billeddannelse ved hjælp af praktiske metoder, herunder udnyttelse af levamisole eller tetramisole ved 10-100 mM eller anvendelse af hydrogel polystyren mikroperler (med diametre på 15 μm, 30 μm eller 40 μm)18.
  5. Forberedelse af glideskreds til sammensat og konfokal mikroskopi
    1. Monter 20-50 dyr i et immobiliserende middel på et mikroskop dias. Genanvendelige ringmærkede cytologi dias malet med 13 mm diameter hævede ringe er nyttige til montering.
    2. Pick levende dyr i 5-20 μL af en paralytisk såsom 10-100 mM levamisole eller tetramisole i den malede cirkel eller på agar pad.
    3. Vent 4 minutter på lammelse, og dæk derefter rutsjebanen med en dæksel (anbefal nr. 11/2 (0,16 – 0,19 mm) eller nr. 2 (0,17 - 0,25 mm).
  6. Montering af et lille antal dyr
    1. Knus ikke monterede dyr; når der kun observeres nogle få (mindre end 20) dyr pr. rutsjebane, er der risiko for at knuse nogle af dyrene på grund af ulige tryk på dæksledet. Denne risiko kan minimeres ved hjælp af en lav procentdel agarose pad til montering.
    2. Lav en 2-4% agarose pad slide, og derefter tilføje 2-15 μL paralytisk opløsning til puden. Husk levamisole og tetramisole diffuse ind i puden, faldende deres effektive koncentration.
    3. Monter ved at plukke dyr i en 2-15 μL dråbe paralytisk opløsning eller mikroperler, der hviler på agarpuden. Læg dækslæbet ovenpå, og kontroller, at dyrene erintakte 18.
  7. Agar pad forberedelse
    1. For at forberede 2% agar puder, varme 2% agarose i M9 opløsning og mikrobølgeovn, indtil agarose er i en homogen og smeltet tilstand.
    2. For at opnå en agar pad af tilstrækkelig kvalitet, alternativ blanding og microwaving ved lav effekt i mindre end 20 sekunder. Undgå at inkludere luftbobler i puden ved at placere kogende agar på en varmeblok og lade boblerne stige op til overfladen.
    3. Brug en Pasteur pipette til at trække agar dybt inde i den smeltede opløsning under de opstandne bobler.
    4. Forbered to tapede dias og sted på hver side af et rent glasmikroskop dias på en flad overflade. For at gøre tapede lysner placere to 5 cm strimler af laboratorietape på hvert dias (Figur 6A).
    5. Ved hjælp af en Pasteur pipet, placere en enkelt dråbe agar på den rene mikroskop dias klemt inde mellem tapede dias(Figur 6B).
    6. Forsigtigt og hurtigt dække dråbe smeltet agar med en fjerde ren dias ved at placere i på tværs af tapede dias(Figur 6Cc).
      BEMÆRK: Diaset skal forsigtigt presse den smeltede agar ind i en flad cirkel, der er ca. 0,4 mm tyk (båndets tykkelse) (Figur 6D). Agaren skal hurtigt afkøles.
    7. Fjern den øverste slide ved at skubbe den af (Figur 6E) . Agar puder tørre hurtigt og er bedst anvendes inden for få minutter. Når den øverste slide er fjernet, skal du straks bruge gelpuden til montering af dyr. Undgå at bruge puder med luftbobler.
    8. Opbevar agar puder op til 30 minutter indkapslet mellem de to glas dias. Tørret agar får dyr til at klumpe sammen og udtørre. Dyr monteres inden for 2-15 μL af paralytisk opløsning eller mikroperler og dække med dæksel skærmen inden for 20 minutter efter lammelse og montering(Figur 6).
      BEMÆRK: Fordi stress betingelser kan ændre exopher satser, undgå paralytika, der kan fremkalde oxidativstress (ex: natrium azide) når screening for exophers.
  8. Påvisning af exophers ved hjælp af et konfokalt mikroskop med roterende disk
    1. Overhold celle biologiske træk såsom organeller og andet indhold med 1,4 numeriske blænde mål på 63x og 100x.
    2. Brug software i stand til fase-kontrol og billede erhvervelse udnytte den flerdimensionale erhvervelse. Mikroskoper og billedbehandlingssoftware bør også være egnet til billedbehandling og dataindsamling, da disse trin omfatter standardbilleddannelsesmetoder.

6. Identifikation af berøringsneuroner og scoring for exophers med monterede dyr

  1. Monter lammet voksent dyr (Figur 6).
  2. Identificer det ønskede Z-fly. Brug lav forstørrelse lyse felt (10-40x) til at identificere den egnede Z-plan af dyret, idet der tages hensyn til placeringen af dyret, hoved-hale orientering, og placering af vulva - som er vartegn for senere neuronal og exopher identifikation (Figur 3A & Figur 5E).
  3. Fokuser på fluorescenssignalet fra den valgte journalist. Opholder sig i samme Z-fly, skifte til widefield fluorescens visning på 10-40x for den valgte cykliske reporter.
    BEMÆRK: I dette eksempel lysstofrør er drevet af mec-4 mechanosensory touch neuron-specifikke promotor. Høje kopieringsarrays og forskellige fluorophores har variation i udtryk og derfor variabel lysstofrør. Juster om nødvendigt.
  4. Rul inden for Z-aksen for at observere dyrets dybde og fluorescerende udtryk i brændplanet. Mens du gør det, bekræfte hoved-hale orientering; hovedet/svælge vil have fluorescerende nervering, og i dette tilfælde vil halen indeholde 1-2 synlige PLM somas (Figur 3A).
  5. Identificer berøringsneuroner
    1. Identificer, om dyret er monteret i venstre eller højre side (Figur 3A).
      BEMÆRK: I betragtning af dyrets 3-dimensionalitet opnås den bedste billedopløsning på den side, der er tættest på optikken.
    2. Identificer soma (ALM, ALMR, AVM) ved at observere - start i hovedet for at identificere nerveringen og laterale neuronale processer.
    3. Ved 10-40x forstørrelse, langsomt rulle gennem Z-aksen for at identificere den vedhæftede proces.
    4. Når processen er identificeret, følg den side om side i den bageste retning mod vulva, hvor soma vil være synlige, præget af en rund celle krop i slutningen af processen. Når den mest in-focus neuronal soma er fundet, Det kan identificeres ved hjælp af andre neuronal vartegn som følger:
    5. Brug AVM, en nærliggende ventral neuron, til at hjælpe med at tildele dyr orientering. Hvis AVM neuron er i samme plan som ALM så dyret hviler på sin side og neuron uden for dette plan er ALMR . Hvis AVM neuron ikke er i samme plan som ALM pågældende, den nærmeste touch neuron til brændpunktet flyet er ALML.
    6. Identificer PVM neuron, en anden ventral touch neuron placeret nær halen, at angive, om den forreste touch neuron er i samme plan. Hvis ja, touch neuron observeret er ALML.
    7. Få en fornemmelse af placeringen af andre soma organer, nær det område af interesse (fluorescerende neuroner placeret på begge sider af soma), og i alle Z-fly, selv om det ikke er muligt at få den dybeste neuron sat i klar fokus.
      BEMÆRK: Identifikationen af alle touch neuron somas er vigtig, fordi out-of-fokus soma kan forveksles med exophers.

7. Identifikation og scoring for exophers

  1. Når en touch neuron er fundet, inspicere det for store fremspring (exopher domæner) stor nok til at blive betragtet som en knop exopher, (nå mindst 1/5th størrelsen af den oprindelige soma) (Figur 1C).
    BEMÆRK: Den gennemsnitlige exopher måler omkring 2-8 μm i diameter, mens den gennemsnitlige soma af en (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) dyr måler 6-10 μm i dag 2 voksne (Figur 7B).
  2. Hvis ingen knop eller exopher domæne er observeret, inspicere neuronal soma for en vedhæftet tynd glødetråd stammer fra soma. Vedhæftede exophers tendens til at være placeret tættere på oprindelse soma og i en lignende Z-plan.
    BEMÆRK: Exophers ikke altid forblive knyttet til soma. Påvisning af en vedhæftet glødetråd er en endelig indikation af, at objektet er en exopher.
  3. For at identificere en løsgænger skal du kigge efter indholdet af en exopher. Exophers kan koncentrere bortviste fluorescerende proteiner og er derfor ofte lysere end soma.
    BEMÆRK: Indholdet af exophers er heterogene og variable. Cellulære organeller såsom lysosomer og mitokondrier kan også ekstruderes i exophers (Figur 4C-E).
  4. Kig efter løsgængere i forskellige fokalefly end det fly, hvor den oprindelige soma blev fundet. Selv exophers er blevet set at stikke ud fra ALM soma i alle retninger, det er typisk, at exophers stikker væk fra soma, i en posterior retning fra neuronal proces.
  5. Kontroller for store, sfæriske objekter, der ikke er placeret og identificeret som neuronal somas. Exophers kan være uregelmæssigt formet, men er typisk sfæriske strukturer. Exophers bliver nedbrudt over tid, så ældre exophers tendens til at have en mere uregelmæssig form.
    BEMÆRK: Modne eller ældre exophers adskiller sig fra den spredte "stjerneklar nat" fase via lysere fluorescens intensitet af exophers og deres sfæriske form.
  6. Undersøg "stjerneklar nat" fænotype som bevis for tidligere exophergenesis. Exophers fremskridt i en "stjerneklarnat" fase som exopher bryder op i mindre vesicles og de omkringliggende hypodermis forsøg på at forringe exopher indhold (Figur 1G, 2B, 3B & 7A).
    BEMÆRK: Den stjerneklare natscene er præget af fragmenterede og spredte (undertiden netværksforbundne) fluorescerende enheder, der har mistet strukturel integritet og viser en svag fluorescens i forhold til touch neuroner og exopher strukturer.
  7. Se efter forekomster af "flere exopher begivenheder". Exophers er normalt produceres som en enestående forekomst (1 exopher stammer fra 1 soma), men under nogle omstændigheder mere end én exopher kan frigives fra en enkelt soma (Figur 7D).
    BEMÆRK: Modne exophers kan nedbrydes til flere vesikler, da de er nedbrudt i hypodermis. Skelne, om hver exopher blev genereret af en uafhængig exophergenesis begivenhed, eller om en original exopher split for at skabe en ekstra vesicle kan kun bestemmes af time-lapse observation.
  8. Husk, at ikke alle morfologiske abnormiteter modnes til exophers.
    1. Må ikke score en udspilet soma som en exopher. En udvidet eller spids soma kan observeres på lejlighed (især med alder eller under stress), men en forlængelse uden en klar konstriktion site er ikke scoret som en exopher.
    2. Afvis små løste knopper, der ikke når 1/5th størrelsen af soma i exopher begivenhed kvantificering.
    3. Du må ikke tælle neurite outgrowths som exophers. Modne neuritter kan strække sig dramatisk med alderen (normalt i den modsatte retning af den neuronale proces) og fluorescerende protein kan migrere ind i den distale ende af sådannestrukturer 19.
      BEMÆRK: Disse neurite udvækster er ikke exophers, da de har en særskilt udviklingsmæssige mønster over dage og uger, ikke danner knopper, og ikke løsrive (Figur 7E).
  9. Identificer fluorescerende enheder, der ikke er exophers.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at få en idé om baggrundslysstofsynsstof for at sikre korrekt identifikation af den ekstruderede fluorescerende enhed vs. autofluorescens.
    1. Transgenlysstoftryk vs. autofluorescens. Tag ikke fejl af autofluorescens for transgene udtryk. Den sande exopher signal vil ikke være i tarmen eller tarmen (DIC bekræftelse kan bruges til at identificere disse væv) og exopher signal vil være betydeligt lysere end baggrunden autofluorescens.
      BEMÆRK: Autofluorescens er forårsaget af tarmgranulat intestinal fluorescerende pigmentering og ophobes med alderen. Det er heterogent, især set med forskellige bølgelængder.
    2. Signal fra embryoner. Må ikke fejl embryo signal for exophergenesis. Bekræft mistanke om embryosignal ved at skifte fra fluorescens til brightfield belysning og kontrol for sammenslutninger af signal med æg i livmoderen.
    3. Ud af flyet eller nærliggende soma organer. Undgå at tage fejl af en ud af flyet soma for en exopher ved at identificere alle nærliggende soma organer, selv out-of-fokus somas i starten af observationen.
      BEMÆRK: Hvis scoring for exophers fra ALMR, identificere og redegøre for placeringen af AVM og ALMR somas. Yderligere oplysninger om identifikation af soma-karrosseri er beskrevet i figur 3A.

8. Scoring og statistik

  1. Score exophers som binære (ja, der er en exopher / nej, er der ikke en exopher).
  2. Overvej exopher afsløring som en "exopher-begivenhed" for en given neuron. En exopher begivenhed kan udgøre observation af en enkelt exopher nær en soma eller flere exophers.
    BEMÆRK: Hvis du vil kvantificere antallet af individuelle exophergenesis-hændelser, skal du bruge time-lapse-observation.
  3. Tal exopher hændelser pr en bestemt identificeret celle, fordi forskellige celler ikke producerer exophers med samme hastighed (se for eksempel Figur 3C). ALMR neuroner producere de mest baseline exophers i de stammer, der er beskrevet heri, og dermed ofte er dette cellen udvalgt til exopher kvantificering fra touch receptor neuroner.
  4. For statistikker gennemfører der generelt mindst tre biologiske forsøg med mindst 30 dyr, der er scoret pr. forsøg, med det tilsvarende antal observationer, der kræves til analyse af afbrydelsen.
    1. For flere forsøg med en eller to mutanter/behandlinger sammenlignet med kontrol er Cochran-Mantel-Haenszel-testen egnet til at bestemme p-værdierne.
    2. For forsøg med mere end to mutanter af behandlinger sammenlignet med kontrol er det også hensigtsmæssigt at anvende en binær logistisk regressionsanalyse til at vurdere betydningen for et vilkårligt antal kategoriske prædiktorer.

Representative Results

Flere fluorescerende journalister kan bruges til at måle exophers. Touch neuron exophers er let visualiseret in vivo via fluorescerende mærkning af proteiner, der kan vælges til ekstrudering, ved mærkning af organeller, der kan ekstruderes, eller ved mærkning cellemembraner. Tabel 1 identificerer berøringsneuroner udtrykt fluorescerende journalister, der er blevet brugt til at overvåge exophers, med repræsentative eksempler i figur 4. Laster, der er kendt for at være ekstruderet i exophers omfatter en fusion af N-terminal domæne af human huntingtin til ekspanderet polyglutamin (Q128) (Figur 4B), lysosomer, der er GFP-mærket med lysosomal associeret membran protein (LMP-1) (Figur 4C), og mitokondrier mærket med matrix-lokaliseret GFP (Figur 4D). Cytoplasmic GFP er ikke stærkt bortvist og er fortrinsvis bevares i soma5, selv om GFP kan svagt visualisere exophers (Figur 4A). Når GFP er smeltet til proteiner, der er udvist, kan dette tag bruges til at visualisere exophers. Et vigtigt punkt er, at ved mærkning forskellige proteiner, en lang række spørgsmål om udvisning af specifikke laster og organeller, samt på proteiner og membraner, der udgør exophers, kan løses.

En pseudo-stereomikroskop setup er et effektivt værktøj til visning af exophers i dyr på agar plader. Denne opsætning er en hybrid af sammensatte og stereoskopisk teknologi, der omfatter høj numerisk blænde optik på hver forstørrelse, pseudo-stereo teknologi (diskrete mål over en stereoskopisk base), og en zoom betjeningskontakt til visning på forstørrelser mellemliggende til installerede mål. Et mikroskop som dette bør være udstyret med 10x okularer og mål stærke nok til at observere neuronal morfologi og exopher produktion for høj-throughput scoring (2x mål, der anvendes til scanning / plukning, 10x mål, der anvendes til at identificere og score).

Mens forstørrelse kapaciteter standard stereomikroskoper typisk har høj nok opløsning til at se netværket af touch neuroner udtrykke fluorescerende proteiner, standard dissekere mikroskoper er ikke tilstrækkeligt til at observere subcellulære detaljer af exophers som rørformede forbindelser af soma til exopher. Sådanne observationer kræver konfokal mikroskopi (se materialetabellen for at få oplysninger om udstyr).

Exopher kvantisering undersøgelser kræver strenge kontroller for at fjerne eksperimentelle belastninger. Den opmærksomme vedligeholdelse af ensartede vækstbetingelser er nødvendig for reproducerbar eksopherproduktion. Mere specifikt, exopher produktion er stress-lydhør sådan, at konsekvent fodring, konstant temperatur, og forurening-fri vækst på tværs af generationer er afgørende for reproducerbarhed. Under basale vækstbetingelser med høj neuronal ekspression af mCherry, exopher produktion er relativt lav (5-25% af ALMRs producere exophers), men nogle understreger, herunder osmotisk og oxidativ stress, kan øge exopher satser. Mens mCherry udtryk kan opfattes som stress, en naturlig følge af stress-følsomhed exopher niveauer er, at hvis korrekt kontrolleret, eksperimentel stress introduktion kan være en strategi for lettere at fremkalde og observere exophergenesis.

Timing og forventede exopher produktionsniveauer. Exophers er næsten fraværende under larve udvikling. Perioden med peak exopher produktion i unge voksne liv synes at være stærkt begrænset til i løbet af voksne dage 1-4, mest almindeligt at være tydelig på voksen dag 2 eller 3. Fordi toppen kan flytte frem eller tilbage lidt, den mest komplette evaluering af en exopher produktion profil er at score flere forsøg dagligt over voksne dage 1-4. Generelt producerer en ALMR en større exopher, med vesicle vedvarende i mindst 24 timer. Exopher kan produceres forholdsvis hurtigt (i rækkefølgen af minutter på sin hurtigste). Mest almindeligt, kun én større exopher produceres pr neuron i begyndelsen af voksenlivet, men produktion af flere exophers er mulig.

Generelt exopher produktion af ALMRs udtrykke mCherry under basale forhold spænder fra 5-25% af ALMRs undersøgt inden for den optimale tidsramme for voksne dag 2-3 (Figur 3D). Proteostase kriser5, samt eksponering for andre belastninger kan modulere exopher niveau. Stress eller genetiske perturbations kan øge exopher produktion til påvisning satser så højt som 90% af ALMR neuroner producerer eksopher ekstruderinger.

Fodring-baserede RNAi til test roller specifikke gener i exophergenesis. Den nematode C. elegans er almindeligt udsat for RNAi banke ned ved fodring dyr forvandlet E. coli stamme HT115 at udtrykke en dobbelt strandede RNA (dsRNA) rettet mod et gen af interesse20. HT115 bakterier kan bruges, når scoring for exophers i fodring RNAi5. Mens udskrifter i de fleste væv kan målrettes af RNAi ved hjælp af denne teknik, neuroner er mere ildfaste. Følsomhed over for RNAi kan kalibreres ved hjælp af dyr, der udtrykker den transgene dsRNA transporter SID-1 under en neuron-specifik promotor. På denne måde neuronal væv kan sensibiliseres til RNAi21.

Vævsspecifik knockdown af et gen af interesse kan opnås ved at udtrykke en komponent af endogene RNAi metabolisme inden for en mutant, der er mangelfuld i denne komponent. For eksempel: Argonautproteinet RDE-1 kan udtrykkes specifikt i rde-1-mutantdyrs neuroner for at opnå knockdown af et gen af interesse kun i neuroner, når dyr udsættes for en RNAi intervention rettet mod dette gen.

Ved hjælp af standard nematode RNAi protokoller20,22, eksponering af forældrene på L4 fase til RNAi og giver deres afkom til at udvikle forbrugende omdannet HT115 bakterier indtil voksenalderen genererer den stærke genetiske knock-down, men være opmærksomme på potentielle udviklingsmæssige forsinkelser induceret af RNAi som forsøgsdyr kan vokse anderledes end en tom vektor kontrol. Det er vigtigt altid at medtage den tomme vektorkontrol for negativ kontrolsammenligning. HT115 bakterier kan bruges, når scoring for exophers i fodring RNAi. Bemærk dog, at nogle gener er effektive til at ændre exophergenesis satser selv i kortere perioder af RNAi eksponering5. Hvis målretning af visse gener fører til udviklingssvigt, undgå at udsætte dyr for livslang knockdown, kan dyr simpelthen plukkes på L4 fase på RNAi plader for eksponering fra L4 til voksen D2 eller D3.

Strain navn Genotype Beskrivelse Exopher-procent Reference
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] Cyklisk udtryk for GFP i berøringsneuroner. 1-8% ALM Figur 4A, Melentijevic 2017
ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry] Overekspression af mCherry (bzIs166) i touch neuroner, producerer både cyklisk signal og mCherry aggregater. bzIs166 er en exopher inducer. mCherry aggregater er prædiktorer af exophergenesis og er fortrinsvis ekstruderet i exophers. 3-20% ALM (normale forhold). 20-80% ALM (fastende forhold). Figur 4B, Melentijevic 2017
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; YFP cytosolically etiketter mec-7 touch neuroner. Co-udtrykt Q128::CFP aggregater og inducerer exophers. Faktielt tavshed. ~25% Figur 4C, Meletijevic 2017
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] bzIs168 LMP-1::GFP etiketter plasmamembraner og lysosomale membraner. bzIs168 kan bruges til at identificere neuronale membraner, exophers (som de er membran bundet), og lysosomal-membran strukturer. 3-20% ALM Figur 4D, Melentijevic 2017
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] Allele zhsEx17 er en mitokondrielt lokaliseret reporter, der ændrer sin peak excitation bølgelængde fra 405nm (oxideret) til 476nm (reduceret) i henhold til den lokale oxidative miljø. Det er udtrykt i touch neuroner og kan bruges på egen hånd til at identificere mitokondrier i touch neuroner og i mito-exophers. 3-20% ALM proteo-exopher. % ALM mito-exopher-kvantisering er i gang. Figur 4E, Melentijevic 2017, Cannon 2008, Ghose 2013

Tabel 1. Stammer, der har været brugt til visualisering af touch neuroner, touch neuron-exophers, og exopher indhold.

Figure 1
Figur 1: Stadier af Exophergenesis. Processen med at gøre og skubbe en exopher kaldes 'exopher-genesis'. Den dynamiske proces med exopher dannelse kan tage flere minutter til flere timer. Afbildet er eksempler på soma og exopher morfologi på bestemte trin under den dynamiske exophergenesis proces i en høj-exopher producerer stamme, ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Alle billeder er af dag 2 voksne ALM neuroner taget med en 100x mål. (A) Normal soma. Voksen mechanosensory touch neuron ALM transgenically udtrykker Pmec-4mCherry. Den afbildede somamorfologi er typisk for unge voksne neuroner i denne stamme, med mCherry koncentrationer i cytoplasmaet. (B) Tidlig opløbet fase. Det første observerbare trin af exophergenesis indebærer polarisering af udvalgte cytoplasmatisk materiale til kanten af soma membranen. Dette trin er ofte ledsaget af en udvidelse eller hævelse af soma. I tilfælde af touch neuroner, pre-exopher domæne (PED) strækker sig ind i den omgivende hypodermis (ikke synlig her). Bemærk den større koncentration af mCherry materiale i den tidlige opløbet domæne. (C) Sen opløbet fase. Efter yderligere cellulære polarisering og en udvidelse af pre-exopher domæne, en konstriktion mellem soma og exopher (pil) bliver tydeligt. Denne hændelse signalerer overgangen til den sene opløbet fase. Selv i den sene opløbet fase cellen udviser en klar konstriktion site og separate soma og exopher domæner, er det endnu ikke klemt helt fra soma; den spirende exopher kan fastgøres af en tyk stilk (pil). Den spirende domæne betragtes som en tidlig exopher når diameteren af exopher domæne pågældende er omkring 1 / 3 større end diameteren af byggepladsen / stilk. DD) Tidlig exopher fase. Tidlige exophers kan fastgøres ved en stilk fra den afgående soma-diameteren af denne forbindelse kan tynde som exopher bevæger sig væk fra soma. Cytoplasmatisk materiale kan overføres fra soma til exopher via dette rør, selv om de fleste materiale er indlæst under processen med spirende ud. Exophers kan løsrive sig fra soma som afbildet i (E), adskilte exophers betragtes modne exophers (F). Den modne exopher kan transit gennem det omgivende hypodermale væv, bevæger sig væk fra den afgående soma. g )Opdelingaf den mCherry-mærkede exopher i mindre vesikler i hypodermis resulterer i et spredt punktformigt udseende af mCherry-materialet, sandsynligvis da det kommer ind i hypodermal endolysosomal-nettet. Det spredte punktformigt signal kaldes "stjerneklar nat" fase. Nedbrydning af nogle exopher indhold er sandsynligvis opnås ved hypodermal lysosomer, men noget materiale er ikke fuldt nedbrudt og er ofte re-ekstruderet af hypodermis i pseudocoelom. Transitten efter exophergenesis mCherry er nærmere beskrevet i figur 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: mCherry ekstruderet fra berøring neuroner i exophers engagerer det omgivende hypodermal lysosomal netværk, men kan senere ekstruderes ind i pseudocoelom hvor coelomocytter kan gemme / nedbryde mCherry. (A) Cartoon resumé af, hvordan mCherry ekstruderet i exophers transiter kroppen efter udvisning af neuroner. Under exophergenesis udvalgte cellulære indhold såsom mCherry bliver lokaliseret og knop ud fra den sendende neuronale soma i en uafhængig vesicle omgivet af neuronal og hypodermalplasma membraner. Da touch neuroner er indlejret i hypodermal væv, som exopher domæne knopper udad det bevæger sig videre ind i hypodermis. Exopher kan passere hypodermis, og efter timer til dage, exopher indhold kan fragmentere i endolysosomal netværk af hypodermis. Den mCherry kan fremstå som spredt punktformig hele hypodermis, en scene kaldet "stjerneklar nat". Efter et par dage, kan nogle af de mCherry passere ud af hypodermis i de omkringliggende pseudocoelom, hvor skyllevæske celler kaldet coelomocytter kan få adgang til, og tage op, mCherry, der kan opbevares. (B) Eksempel på udseendet af den stjerneklare nat mCherry vesicles. Billede af en ALM soma mærket med mCherry med store exopher fragmenter og stjerneklar nat vesicles. Stamme er ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. (C) Eksempel på mCherry koncentration i fjerne coelomocytter. Sideview af en voksen dyredag 10 af stamme ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] viser mCherry koncentreret i coelomocytter (pile). Nogle stjerneklare nat vesicles er også indlysende. Generelt coelomocyte koncentration bliver tydeligt efter omkring voksen dag 5 af livet. (B nederst) Cartoon reproduktion af (B), med touch neuroner og processer skitseret i rødt, som er lyseste exopher fragmenter; spredte små vesikler af forskellige Z-dybder er vist i lysere pink. (C bund) Cartoon version af billedet af (C), der viser neuronal proces i rød, stjerneklar nat i pink og coelomocytes i grøn. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Mechanosensory touch neuroner producere exophers på forskellige niveauer med en præcis tidsmæssig profil. (A)(Top) Cartoon skildring af mechanosensory touch neuroner i rumlige forhold til centrale anatomiske vartegn af C. elegans herunder pumpe svælg og neuron-tætte nerve ring i spidsen af dyret, vulva på midten kroppen, og den koniske hale. (Nederst) Fluorescently mærket touch neuroner udtrykke GFP som set fra toppen og venstre side (billeder tilpasset fra WormAtlas). Den røde boks viser det område, hvor ALM exophers er typisk placeret. (B)Høj forstørrelsesvisning af det midterkropområde, hvor ALM-afledte exophers fremstilles i en stamme, der udtrykker [Pmec-4mCherry]. AVM og ALMR neuron er afbildet, og vist er en ALMR exopher sammen med mCherry stjerneklar nat. ALMR neuroner lettest producere exophers. (C) ALMR mechanosensory touch neuroner lettere producere exophers sammenlignet med andre touch neuroner i hermafroditter under basale forhold. Mechanosensory touch neuron exopher produktion på voksen dag 2, som scorede for individuelle touch receptor neuroner er indiceret. Stamme: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, fejlbarer er SEM.(D)ALMR touch neuroner producerer flere exophers i løbet af dag 2 og 3 i voksenalderen sammenlignet med den unge L4 fase eller med dyr i fremskreden alder. Stamme: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, fejl barer er SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på nogle fluorescerende journalister, der tag exopher indhold. En enkel måde at observere exophers er ved at skabe transgene dyr, der udtrykker fluorophores fra neuronale promotorer. Fluorophores giver mulighed for visualisering af exopher og transgene udtryk inducerer sammenlægning og / eller proteostress, der øger exophergenesis. Exophers produceret af amphid neuroner kan også observeres under indfødte betingelser, ved hjælp af farvestof påfyldning til visualisering. Vist er eksempler på almindelige stammer, der kan bruges til at observere exophers, (E) exopher, (S) soma. (A) Soma og exopher fra en ALM af en voksen af stamme SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP],100x mål, der anvendes til fotografering, skala bar 3μm. I denne stamme måles exophers, der omfatter opløselig gfp, men eksopherproduktion forekommer sjældent. Fusing GFP til proteiner, der kan være fortrinsvis ekstruderet i exophers i andre undersøgelser bekræfter, at GFP fusioner kan påvises i modne exophers. (B) ALM soma og exopher af en voksen af stamme ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], som udtrykker mCherry og inducerer touch neuron exopher produktion. 100x mål, der anvendes til fotografering, skala bar 5 μm. C) ALM soma og exopher af en voksen af stamme ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; selektiv blå kanal, der anvendes til billede af htt57Q128::CFP. Exopher indeholder htt57Q128::CFP aggregater (pile), der synes mere koncentreret i exopher end i soma. 40x mål, der anvendes til fotografering, skala bar 5μm. (D-E) Exophers kan indeholde organeller og organelle-specifikke tagging med fluorescerende proteiner gør det muligt overvågning af organelle ekstrudering. (D) Lysosomal membran tag LMP-1::GFP skitserer soma og exopher membran og tags plasma membraner svagt (plasma membran lokalisering er en handel skridt på vej til lysosomal målretning) og etiketter lysosomal organeller stærkt. Vist er en voksen ALM soma co-udtrykke Pmec-4mCherry og Pmec-7LMP-1::GFP at lokaliserer til membraner og lysosomer. Soma har en vedhæftet exopher med andre mindre ekstruderinger sandsynligvis være exopher fragmenter (pile). GFP positive strukturer er inkluderet i soma og er til stede i den store exopher, stamme: ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]. 100x mål, der anvendes til fotografering, skala bar 5 μm. E)En mitokondriel GFP markør kan bruges til at identificere mitokondrier i soma og exophers. Vist er en voksen ALM soma udtrykker Pmec-4mCherry og mito::ROGFP, som lokaliserer til mitokondrielle matrix. mito::ROGFP udtrykt alene, uden mCherry, kan også let bruges til at identificere neuroner og score for exophers, der omfatter mitokondrier. Stamme: ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]. 100x mål, der anvendes til fotografering; skala bar 5μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Udviklingscyklus for C. elegans og L4-identifikation. AA) Ved 20 °C tager det ca. 9 timer at klække et æg, når det er lagt af moderen. BB) Et nyudklækket dyr er i larvetrin 1 (L1) og molts ind i en L2 larver efter 12 timer. c) Dyrene forbliver i L2- og(D)L3 larvestadiet i ca. 8 timer hver. (E)Unge dyr betragtes som den fjerde larve fase (L4) og er præget af en iøjnefaldende udvikle vulva, der fremstår som en hvid halvmåne nær midten kroppen. Tilstedeværelsen af dette, mens halvmåne gør det nemt at identificere og plukke L4 iscenesatte dyr for at etablere synkroniserede kulturer, der senere letter scoring for exophers. Dyr forbliver i L4-scenen i ca. 10 timer, før deres sidste molt til gravide voksne, F ), identificeretved at udvikle æg, synlig spermatheca og initiering af æglægning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Fremstilling af mikroskop slide agar pad. (A) Forbered to dias med en enkelt strimmel laboratorietape placeret på langs over toppen. Placer et mikroskoprutsjebane, der ikke er optaget, mellem som afbilledet. B) An kan du placere en dråbe smeltet agarose oven på rutsjebanen. (C) Anstæn skal du placere et rent rutsjebane forsigtigt oven på dråben og trykke agarosen ind i en deflateret cirkelpude. (D)Fjern tapede dias, som handler for at opnå en endnu udfladning af agar, der er nødvendig for at skabe en jævn pad. (E) Fjern det øverste dias, når agarosepuden er tørret. (F) Pipette en paralytisk opløsning (levamisole eller tetramisole) på toppen af agar pad. (G) Pick passende iscenesat dyr i paralytisk. HH) Tildæk forsigtigt dyrene med en dækslet og sørg for, at dyrene er i live. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Tegn på exophers og exopher identifikationskriterier. (A)Generelle kriterier, der identificerer en exopher. BB) Diametier sammenligninger mellem den udsendende soma og den ekstruderede eksophør, målt i μm. Voksen ALM somas, N = 35, stamme: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] - 6,53 μm gennemsnitlig størrelse af soma og 3,83 μm gennemsnitlig størrelse exopher. CC) Definition af kriterier for differentiering mellem et exopher-domæne og en spirende exopher. (D) Mest almindeligt, individuelle neuroner gøre en stor exopher, som senere splitter eller fragmenter som hypodermis forsøg på at forringe dens indhold. Stadig, flere exophers kan observeres ved siden af en touch neuron, der kan stamme fra enten flere exopher begivenheder fra en neuron eller alternativt, exophers kan også knop eller fragmentere sig selv. Oprindelsen af flere exopher-lignende enheder kan kun bestemmes ved hjælp af tidsforfald mikroskopi. Top skildrer en ALMR touch neuron soma med en enkelt fjern exopher. Bunden viser en ALMR touch neuron soma med flere exopher-lignende ekstruderinger. (E)Fælles morfologiske træk i voksne ALM touch neuron somas, der kan forveksles med exopher begivenheder. Øverst til venstre - En udspilet ALM soma, uden nogen klar exopher domæne eller konstriktion site. Top midterste - Neuroner kan have små ekstracellulære fremspring, der kan være analoge med exophers, men opfylder ikke størrelse krav kriterier, der skal betragtes som en exopher. Øverst til højre – Med alderen, touch neuroner kan udvikle udvækster langs deres mindre neurite. Ofte mCherry materiale kan indsamles på spidsen af neurite udvækst. Dette er ikke scoret som en exopher, hvis den indsamlede mCherry ikke opfylder exopher-til-soma størrelse krav. Bunden viser voksne ALM neuroner, der har definere kriterier for en exopher domæne eller en exopher. Botom venstre - ALM soma, der har en fremtrædende exopher domæne, der selektivt omfatter mCherry cytosol og mCherry mærkede aggregater. Exopher domæne konstriktion site er markeret med pile og opfylder størrelseskriterierne (mindst 1/5th størrelsen af soma). Den største diameter af exopher domæne er næsten 1 / 3 større end diameteren af konstriktion site, opfylder kriterierne for en exopher begivenhed. Nederste midterste - ALM soma, der har en fremtrædende spirende exopher, der opfylder størrelseskriterierne. Der er en klar konstriktion site. Nederst til højre - ALM soma, der har en vedhæftet mCherry-fyldt exopher, der opfylder exopher størrelse krav. Exopher er fastgjort af en tynd forbinder glødetråd. Alle billeder er fra stamme ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Karakteriseringen af in vivo molekylære mekanismer af aggregat og organelle elimination i form af store exophers er i sin vorden. Spørgsmål med hensyn til udpegning af laster til udvisning, den polariserede samling af disse laster i cellen, regulering af beslutningen om at generere exophers, de maskiner, der formidler ekstruderinger, og samspillet mellem eksophers med de nedbrydende maskiner i en nærliggende celle alle mangler at blive behandlet. Desuden in vivo visualisering af rørformede forbindelser, der kan passere biologiske materialer, der omfatter calcium, aggregater, og mitokondrier er interessant og understudy biologi i sig selv. Spørgsmål om, hvorfor visse celler er mere tilbøjelige til at exopher produktion end andre også er uløste, men kan begynde at være genetisk dissekeret med de tilgange, der er skitseret i denne protokol.

Beskrevet i detaljer i denne protokol er tilgange til at opnå reproducerbar scoring af exopher produktion, med vægt på at skelne exophers fra nærliggende celle somas, timing af analyser til at fange toppen af exopher produktion, og streng kontrol af vækstbetingelser for at fjerne utilsigtede belastninger, der kan modulere exopher niveauer. Både sondringen mellem den store tidlige exopher, eller "stjerneklar nat' dispersion i de omkringliggende hypodermis kan kvanteres som bevis for exopher produktion. Når det er sagt, neuroner udtrykker mCherry under basale forhold er oftest forbundet med 5-25% af neuroner af en bestemt type producerer en exopher. Kontrolleret indførelse af stressbetingelser kan anvendes til at øge exopher produktion til påvisning så højt som 90% af neuroner producerer ekstruderinger, især nyttige for genetiske eller farmakologiske skærme for modifikatorer.

I human neurodegenerative sygdom, store aggregater kan overføre fra syge neuroner til tilstødende celler til at fremme patologi spredning. Exopher mekanisme kan svede via en bevaret mekanisme, der anvendes til samlet ekstrudering på tværs af phyla. Definition af in vivo molekyler, der enten øge effektiviteten af denne proces (betragtes som mere effektiv proteostase kontrol) eller blokere det kan udnyttes til at påvirke udformningen af nye strategier til bekæmpelse af flere neurodegenerative sygdomme. Som sådan, den protokol, der er beskrevet her kunne bruges til klassiske genetiske mutagenesis skærme, genom-dækkende RNAi skærme, der systematisk vælte gener til at identificere smagsforstærkere og suppressorer, eller for narkotika intervention undersøgelser, der identificerer kandidat farmakologiske modifikatorer af denne proces. Tilgangen er ligetil, men noget besværlig. Exophers er så store, at de kan ses med en høj forstørrelse dissekere mikroskop. Stadig, C. elegans neuroner er relativt små og ser på deres organeller eller deres membraner kræver højere effekt konfokale billeder og er en langsom proces. Muligheder for højere overførselshastighed kan indebære billeddannelse i højt indhold i flertjæt pladeformat.

Anvendelsen af en standardiseret tilgang til exopher scoring bør ligge til grund for en samordnet genetisk dissektion af den proces, hvorigennem neuroner kan organisere og fjerne cellulære vragrester.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Vi anerkender følgende NIH tilskud: R01AG047101 og R37AG56510. Medlemmer af Driscoll og Grant labs har bidraget i udstrakt grad til udvikling og finjustering af beskrevne protokoller, med strenge eksperimenter og stærk kommunikation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95B Scientific CMOS camera Photometrics Prime
1,000 μL low retention tips Sarstedt
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
absolute ethanol Vwr 20821.33
Agar Sigma Aldrich A1296
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
FBS10 Standard microscope Meyer Instruments KSC 410-1-100-1 FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
LDI – Laser Diode Illuminator 89 North
levamisole Sigma Aldrich 16595-80-5
M4 multipette Eppendorf 4982000012
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
pipeteboy 2 VWR 612-0927
Polystyrene microbeads Sigma Aldrich MFCD00131491
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
Reusable ringed cytology slides ThermoFisher Scientific 22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] contract Driscoll lab GFP expressed in touch neurons
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
Triton-X Thermofisher scientific 28313
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] contract Driscoll lab mCherry expressed in touch neurons
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] contract Driscoll lab Q128 expressed in touch neurons
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] contract Driscoll lab mitoROGFP expressed in touch neurons
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] contract Driscoll lab autophagy marker expressed in touch neurons
ZEISS Axio Vert.A1 Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).
  2. Davis, C. H., et al. Transcellular degradation of axonal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).
  3. Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).
  4. Stahl, P. D., Raposo, G. Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis. Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).
  5. Melentijevic, I., et al. C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367 (2017).
  6. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).
  7. Tyson, T., et al. Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  9. Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nature Communications. 6, 6768 (2015).
  10. Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism. bioRxiv. 10 (1), (2019).
  11. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
  12. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).
  13. Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  15. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  16. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  17. Weicksel, S. E., et al. A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).
  18. Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).
  19. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  20. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).
  21. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  22. Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).

Tags

Neurovidenskab Exophers C. elegans aldring biologi proteostase samlet spredning neuron-til-neuron transmission neurodegeneration mitokondrier lysosomer organelle overførsel
Kvantitative metoder til scoring <em>in vivo</em> Neuronal Aggregat og Organelle Extrusion i Store Exopher Vesikler i <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. More

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. J. Vis. Exp. (163), e61368, doi:10.3791/61368 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter