Summary
Denne protokollen beskriver tilnærminger for deteksjon og kvantisering av store aggregater og/eller organelleprofiler (~4 μm) produsert av C. elegans celler i form av membranbundne eksfoster. Vi beskriver stammer, vekstforhold, scoringskriterier, timing og mikroskopihensyn som trengs for å lette disseksjon av denne utvisningsmekanismen for rusk.
Abstract
Toksisitet av feilfoldet proteiner og mitokondriedysfunksjon er avgjørende faktorer som fremmer aldersrelatert funksjonell nevronal nedgang og nevrodegenerativ sykdom på tvers av arter. Selv om disse nevrotoksiske utfordringene lenge har vært ansett å være celle-iboende, støtter betydelige bevis nå at feilfoldede humane sykdomsproteiner med opprinnelse i ett nevron kan vises i nærliggende celler, et fenomen foreslått å fremme patologi spredt i menneskelig nevrodegenerativ sykdom.
C. elegans voksne nevroner som uttrykker aggregering proteiner kan ekstrudere store (~ 4 μm) membran-omgitt vesikler som kan inkludere aggregerte protein, mitokondrier, og lysosomer. Disse store vesikler kalles "exophers" og er forskjellig fra eksosomer (som er ca 100x mindre og har forskjellig biogenese). Kaste ut cellulære rusk i eksofer kan oppstå ved en bevart mekanisme som utgjør en grunnleggende, men tidligere ukjent, gren av nevronal proteostase og mitokondrie kvalitetskontroll, relevant for prosesser der aggregater spredt i menneskelige nevrodegenerative sykdommer.
Mens exophers har blitt for det meste studert hos dyr som uttrykker høy kopi transgen mCherry innen berøring nevroner, disse protokollene er like nyttig i studiet av exophergenesis ved hjelp fluorescerende merket organeller eller andre proteiner av interesse i ulike klasser av nevroner.
Beskrevet her er de fysiske funksjonene i C. elegans exophers, strategier for deres deteksjon, identifikasjonskriterier, optimal timing for kvantifisering, og dyr vekst protokoller som kontrollerer for påkjenninger som kan modulere exopher produksjonsnivåer. Sammen bør detaljer om protokoller skissert her tjene til å etablere en standard for kvantitativ analyse av eksfosere på tvers av laboratorier. Dette dokumentet søker å tjene som en ressurs i feltet for laboratorier som søker å utarbeide molekylære mekanismer der eksfosere produseres og som eksfosere reageres på av nærliggende og fjerne celler.
Introduction
De nevrotoksiske utfordringene til aggregater og dysfunksjonelle mitokondrier har lenge vært ansett å være celleinboende, men mer nylig har det blitt klart at feilfoldede humane sykdomsproteiner med opprinnelse i ett nevron også kan spre seg til nærliggende celler, og fremme patologi1. På samme måte kan pattedyr mitokondrier sendes ut av cellen i sin opprinnelige produksjon for transcellulær nedbrytning2 eller for redning av mitokondriepopulasjoner i utfordrede naboceller3. Vesikler av ulike størrelser har generelt blitt observert for å overføre cellulære materialer til nærliggende celler eller til flytende omgivelser4. Noen ekstruderte vesikler nærmer seg størrelsen på den gjennomsnittlige nevronale soma (gjennomsnittlig berøring neuron soma ~ 6 μm) og kan romme store aggregater og organeller.
Et slående eksempel på stor vesikkelekstrudering som kan bære proteinaggregater og organeller forekommer i C. elegans berøringsreseptornevroner som uttrykker en høy kopi nummer reporter konstruere koding en skadelig aggregering-utsatt, nedbrytningsresistent mCherry5. Profiler fra berøringsnevronene, kalt eksfoster, er ~ 4 μm gjennomsnittlig diameter, selektivt inkluderer mCherry eller andre aggregater, og leveres direkte inn i de nærliggende hypodermis, som normalt omgir berøringsreseptornevronene. Hypodermis forsøker lysosombasert nedbrytning, men noe ikke-fordøyelig innhold som mCherry aggregater kan ekstruderes av hypodermis inn i den væskefylte pseudocoelom av dyret, hvorfra mCherry kan tas opp av eksterne scavenger celler kalt koelomocytter for langsiktig lagring (Figur 1, Figur 2)5.
De store ekstruderte eksofag vesikler forlater cellen omgitt av berøringsreseptorplasmamembran og kan inneholde aggregerte humane sykdomsproteiner, mitokondrier og lysosomer. Prosessen med exopher produksjon synes å innebære sortering av potensielt giftige arter (for eksempel en aggregering-utsatt uttrykt mCherry er segregert fra løselige, uoffensive proteiner som GFP som forblir hovedsakelig i nevronal soma). På denne måten oppnås rettet utvisning av de truende enhetene av nevronen5. En proteostase utfordring, som stress indusert av autofagi knockdown, MG132-mediert proteasom hemming, eller transgenuttrykk av humane sykdomsproteiner som Huntington sykdom-assosiert utvidet polyglutamin Q128 eller Alzheimers sykdom-implisert fragment Aβ1-42, kan øke antall nevroner som produserer exophers5.
Som exophers har bare nylig blitt dokumentert, det som er kjent om deres biologi fortjener beskrivelse. Exophers ble oppdaget i, og er de mest godt studert i, C. elegans berøre reseptor nevroner. Det er seks C. elegans mechanosensory touch nevroner som har cellelegemer fordelt rundt kroppen (Figur 3A) og kalles mikrotubuli celler fordi deres ultrastruktur har karakteristiske 15 protofilament mikrotubuli. Berøringsreseptornevronene er de fremre AVM (fremre ventral mikrotubulinevron), ALMR og ALML (fremre laterale mikrotubulenevroner høyre og venstre), de mer sentrale PVM (bakre ventral mikrotubule neuron), og bakre PLMR og PLML (bakre laterale mikrotubule nevroner høyre og venstre) i halen. Interessant, de seks touch reseptor nevroner produsere exophers til forskjellige priser, til tross for å uttrykke samme støtende transgene (Figur 3C). Av de seks mechanosensoriske berøringsreseptornevronene gjennomgår ALMR-nevronen eksofergenese oftere enn de andre berøringsnevronene. Kvantitet av exopher tall fra berøring nevroner er dermed vanligvis etablert ved å fokusere på ALMR.
Exophergenesis er en dynamisk prosess som vanligvis begynner med hevelse i nevronal cytoplasma (Figur 1A-B). Cellulært innhold, organeller eller proteinaggregater samles til den ene siden av den nevronale soma, oftest mot den bakre enden av ALMR-nevronen (vekk fra den projiserende neuritt), danner et pre-exopher domene (PED) (Figur 1B). Den tidlige fremspringet observeres når PED begynner å projisere utover, og danner en gjenkjennelig utstående knopp. Den sene knoppen defineres når den bredeste diameteren til pre-exopher-domenet er ca. 1/3 større enn diameteren på innsnevringen av soma-exopher-halsen (figur 1C). Exophers kan kastes ut i nesten hvilken som helst retning fra soma, men de fleste exophers utgang bakre fra cellekroppen og forblir i omtrent samme fokalplan som den opprinnelige soma.
Eksopher kan bevege seg bort fra den opprinnelige soma som halsen på knoppen smalner inn i en tynn filament. Exophers kan forbli festet til soma via denne filament (Figur 1D, pil) og kan senere bli løsrevet. Cellulært innhold som kalsium, aggregater og mitokondrier kan overføres via denne filamentet til den vedlagte eksopher5, selv om hoveddelen av ekstrudert materiale settes inn i eksofagrommet av den massive spirende hendelsen. Exophers anses modne når det ikke er synlig tilkoblingsrør eller tynn filament og eksopher er helt atskilt fra sending soma (figur 1E).
Exophers produsert av C. elegans berøre nevroner umiddelbart møte hypodermis, vevet som omgir touch neuron. Oftest ser eksopher vesicle ut til å reise innenfor hypodermis bakre bakre mot halen, og kan være ganske fjernt fra soma før exopher innholdet vises målrettet for nedbrytning (for eksempel kan avstanden være ~ 100 μm bort fra soma (Figur 1F)). Den fluorescerende exopher vesicle bryter opp i mange mindre vesikler i hypodermis, tar på seg et utseende referert til som "stjerneklar natt" (Figur 1G og figur 2). I "stjerneklar natt" scenen, punktat fluorescerende materiale kan observeres spredt over hypodermal syncytium i mange mindre punkter av fluorescens i forhold til den opprinnelige ensomme exopher. Starry natt kan se punktat under lav forstørrelse og med høyere forstørrelse, kan se punktat og / eller nettverk i hypodermis. Det fluorescerende signalet fra stjernenatten er vanligvis dimmer enn eksopher og neuronally uttrykt fluorescens (Figur 2B-C). Spredningen av mCherry i mange punktat vesikler antas å innebære phagosome modning og fusjon med endosomal / lysosomalt nettverk av hypodermal celle. Noen eksofagmaterialer er sannsynligvis degradert i hypodermal lysosomalt nettverk, men gjenværende arter som er motstandsdyktige mot nedbrytning (for eksempel mCherry aggregater) kastes ut av hypodermis inn i pseudocoelom, et flytende rom som kan inneholde cellulært rusk. Det fluorescerende materialet blir senere tatt inn av eksterne scavenger celler kalt koelomocytter (Figur 2C), som kan konsentrere seg, lagre, og igjen forsøke nedbrytning av mCherry.
Fenomenet aggregert ekstrudering og overføring vises bevart over phyla, etter å ha blitt rapportert i genetiske modeller som C. elegans5,,6,,7 og D. melanogaster8,9 samt i flere pattedyr modeller. Eksoferlignende profiler er rapportert for pattedyrceller10, en observasjon som tyder på at konserverte mekanismer kan være til grunn for aggregert og organelle utvisning. Exopher produksjon kan dermed være en konservert mekanisme for cellulær rusk ledelse som utgjør en grunnleggende, men tidligere ukjent, gren av nevronal proteostase og mitokondrie kvalitetskontroll, som, når ubalansert, kan aktivt bidra til nevrodegenerativ sykdom. Identifisering av molekylene som er involvert i rusk diskriminering og sortering, transport til en distinkt subcellulær lokalitet, ekstrudering, dannelse / scission av den rørformede forbindelsen som forbinder soma og sen eksopher, og anerkjennelse av den store ekstruderte vesikkelen for ekstern nedbrytning av en nærliggende celle forblir for fremtidig arbeid. Studier på nematode- og flymodeller vil være kritisk viktige for å definere mekanismer for aggregert og organellsamling og overføring, ved hjelp av objektive genetiske tilnærminger og kraftige cellebiologiske verktøy som tilbys av disse modellene for å identifisere deltakende molekyler i fysiologisk sammenheng.
Kritiske første skritt i dechiffrere mekanismer operative i exopher biologi innebærer definere protokoller for reproduserbar in vivo exopher kvantifisering. C. elegans modellen gir en spesiell fordel for slike anstrengelser siden kroppen er gjennomsiktig og exophers kan lett observeres når de inneholder fluorescerende merkede proteiner eller organeller. Exophers har blitt rapportert å være generert av C. elegans dopaminerge nevroner PDE og CEP, ASE og ASER sensoriske nevroner, og fargestoff-fylling amphid nevroner5. Fordi eksfoser produsert av berøringsreseptornevroner er best preget, er fokuset her på bruk av berøringsnevroner for exopher-analyse. Men den grunnleggende tilnærmingen kan brukes til å måle exopher produksjon fra en hvilken som helst celle. Protokoller for å oppdage og kvantate exophers produsert av C. elegans berøring reseptor nevroner som transgent uttrykke mCherry protein er skissert, med vekt på last som kan overvåkes og timelige begrensninger i scoring. Denne artikkelen definerer tilnærminger mot in vivo exopher identifikasjon, og kvantifisering av miljømessige og genetiske forhold som modulerer exopher produksjon. Protokoller legger vekt på kritisk oppmerksomhet til konstante ikke-stressforhold for fastsettelse av baseline exopher produksjon og for sammenligninger på tvers av genotyper.
Protocol
1. Stammer som er nyttige for exopher deteksjon
- Velg en stamme som uttrykker fluorescerende laster i nevronene i C. elegans for å lett visualisere eksfosere.
MERK: Tabell 1 viser stammer som har blitt brukt til å visualisere eksfosere produsert i berøringsreseptornevroner5,,11,,12. I prinsippet kan enhver celle eller nevronal type testes for exopher produksjon ved hjelp av en celle eller vev spesifikk promotor for å drive uttrykk for et fluorescerende protein som aggregerer eller på annen måte er valgt for ekstrudering. - Alternativt kan du bruke en fargefyllingsanalyse for å visualisere eksfofer i de amplusede hodenevronene, som er åpne for miljøet og mottagelig for etterfyllingav 5,13.
2. Vekstmedier
- Forbered standard nematode vekstmedier (NGM) til kulturstammer i henhold tilstandardmetoder 14,,15.
MERK: Mangel på mat, eller fluor-deoxyuridine (FuDR), brukes ofte til å blokkere avkomproduksjon, og kan dramatisk påvirke exopher produksjon. Hold befolkningen kontinuerlig matet (unngå selv korte perioder med bakteriell mat utmattelse) og opprettholde dyr ved en konstant temperatur.
3. Husdyrhold kritisk for konsistent exopher produksjon
- Hev dyr på konsistente medier og med konsistente bakterielle matkilder. Dyr må ikke gå tom for bakteriell mat, selv i korte perioder siden matbegrensning kan dramatisk endre exopher produksjonsnivåer.
- Hold medieoppskrifter og forberedelsesuniform gjennom en studie.
MERK: Endring av media kan påvirke basalnivåer av exopher produksjon. Agar-partier kan påvirke eksopher-nivåene ved baseline, så når forsyningspartiene endres, noterer du datoen. Kast ut lagerplater etter to uker for å sikre sunn bakteriell mat og for å forhindre tørket agar, noe som forårsaker endringer i agar osmolarity som påvirker exopher nivåer. - For basale forhold, hold dyr ved en konstant temperatur på 20 °C. Oppdrett av dyr ved varierende temperaturer (selv midlertidige temperaturendringer) kan forårsake variasjoner i tidspunktet for maksimal exopher produksjon.
MERK: Temperaturvariabilitet er ikke begrenset til kulturforhold. Temperaturvariasjoner under eksperimenter eller på laboratoriebenken kan være virkningsfulle. For eksempel bør temperaturene i et mikroskoprom ikke avvike dramatisk fra kulturinkubatoren eller laboratoriebenken. - Ikke bruk farmakologiske anti-fruktbarhet intervensjoner fordi befruktede egg er avgjørende for tidlig voksen produksjon av exophers.
MERK: Bruk av Fluoro-deoksyuridin (FuDR)16 eller C2217,må unngås. Når du utfører levetid eller gamle dyreforsøk, bør alderss synkroniserte populasjoner opprettholdes ved fysisk å fjerne voksne fra deres mindre avkom ved å plukke dem på ferske plater spredt med bakterier i stedet for å bruke vanlige farmakologiske anti-fruktbarhet intervensjoner. - Ikke bruk forurensede kulturer; reinitiere eksperimenter i tilfelle biologisk kompromiss av befolkningen eller platen. Bakteriell eller soppforurensning kan indusere stress og metabolske endringer hos dyr og må være fraværende fra eksperimentelle populasjoner.
- For å maksimere reproduserbare resultater, vedlikehold kulturer i minst to sunne, godt matet, forurensningsfrie generasjoner ved 20 °C før eksperimentering for å unngå potensielle miljøinduserte epigenetiske endringer.
4. Alderssynkronisering for exopher scoring ved bleking, sukrose flotasjon, eller L4 larver plukke
- Hold eksperimentelle populasjoner samme biologiske alder, da exopher deteksjonsmønstre varierer med voksen alder og sammenligning av dyr i blandet alder populasjoner kan forvirre resultater. Sørg alltid for vellykket synkronisering av eksperimentelle dyrepopulasjoner ved å se etter den "hvite halvmåne" vulva morfologien på L4-scenen.
MERK: Vanligvis forekommer topp exopher produksjon for C. elegans mechanosensory ALMR nevroner på voksen dag 2-3 (Figur 3D),målt fra dager etter L4 stadium. Voksen dag 1 er 24 timer etter L4 larval scenen som er preget av "hvit halvmåne" vulva morfologi (Figur 5E). - Forbered synkroniserte eggpopulasjoner ved bleking gravid voksne.
- Samle gravid voksne fylt med egg ved å vaske dyr som vokser på en NGM plate. For å vaske, oversvømme platen med 1 ml M9 buffer, pipet opp og ned for å samle væske med suspenderte dyr og pipet inn i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Pellet dyr ved gravitasjonsoppgjør eller mild sentrifugering med en mini sentrifuge og fjerne supernatanten.
- Tilsett 150 μL 5M NaOH og 150 μL av 6 % natriumhypokloritt (blekemiddel) i 1 ml i H2O og bland ved inversjon i ca. 5 minutter.
MERK: Fersk blekeløsning sikrer at dyreseksaget kan forstyrres for egghøsting. Fremgang i å forstyrre skjellaget kan overvåkes under et dissekerende mikroskop; voksne bør bryte og frigjøre egg på det punktet at blekingen skal stoppes. - Sensproger forsiktig med et minicentrifugerør i 20 s og fjern supernatanten. Tilsett 1 ml M9 buffer og sentrifuge igjen, slik at ca 100 μL på toppen av pellet.
- Gjenta trinn 4.2.3 to ganger for å fjerne spor av blekemiddelløsning.
- Resuspend eggene i gjenværende volum og overføre til en frisk seeded NGM plate. Voksne vil bli lyset, men mange levedyktige egg bør være i preparatet.
- Forbered synkroniserte populasjoner etter tidsbesvøm egg-lay.
- Velg 20 gravid voksne til en seeded NGM plate ved hjelp av standard overføringsprotokoller14.
- La dyr fritt krype og legge egg i 1,5 timer (muterte stammer med lave brødstørrelser kan kreve innføring av flere voksne dyr).
- Fjern alle voksne dyr fra platen ved å plukke, og la den synkroniserte eggpopulasjonen bak seg. Sjekk platene noen timer senere for å kontrollere at ingen levedyktige voksne har blitt savnet under fjerning av voksne.
- Forbered synkroniserte eggpopulasjoner ved sukroseflotasjonsvalg av egg.
- Samle dyr og egg fra fem NGM plater som gravid dyr har lagt egg i minst 24 timer ved flom plater med M9 løsning med 0,1% vaskemiddel (som Tween 20 eller Triton X-100) og samle inn i en 15 ml rør. Pellet voksne ved mild sentrifugering ved romtemperatur (2000 x g for 30 s).
- Fjern supernatant og vask dyr i 15 ml fersk M9 tre ganger, kast supernatanten etter hver vask, sørg for å holde pellet beriket hos dyr og egg.
- Behold 2 ml overnaturant og resuspend pellet. Tilsett 2 ml 60% vekt etter volumsukrose.
- Sentrifuge ved 2000 x g i 5 min. Løsningen vil nå vise en øvre fase som er svært beriket i egg.
- Overfør ca. 2,5 ml av den øvre fasen til et nytt 15 ml rør og tilsett 10 ml M9.
- Bland ved inversjon i 1 min, og sentrifuge 2000 x g i 1 min.
- Fjern det overnaturlige og vask den eggberikede pelleten i M9. 10-15 μL av eggpellet kan distribueres til en frisk OP50-seeded NGM plate.
MERK: Denne metoden forbereder et stort antall egg; ikke la innsamlede dyr gå tom for OP50 E. coli-mat.
- Forbered synkroniserte populasjoner ved å plukke dyr på L4 utviklingsstadiet.
- Dyrke dyr på seedede NGM plater som beskrevet ovenfor.
MERK: C. elegans utvikler seg i fire diskrete stadier. Ved 20 °C tar et nylagt egg ca. 9 timer å klekkes (figur 5A). Postluke passerer et dyr gjennom larval trinn 1 (L1) til larval trinn 4 (L4), med hvert trinn som varer 8-12 timer mellom hver smeltet (figur 5A-F). Derfor bør en tallerken tilberedt ved å inokulere med egg ha mange L4-dyr å plukke ca 40 timer etter at egg er introdusert. - Identifiser L4-iscenesatte dyr ved å finne den hvite halvmånemåneformen til den utviklende vulva (figur 5E).
MERK: Dyr på L4-scenen er ensartede i størrelse og i kroppspigmentering. Plukk dyr med den hvite halvmåne til en frisk vekstplate for undersøkelse av iscenesatte dyr. Dagen etter (~ 24 timer senere) regnes som voksen dag 1. - Score en populasjon av dyr daglig på voksen dag 2.
MERK: Exophers er vanligvis scoret på dag 2 av voksen alder, som er toppen exopher produksjon under basale forhold. Men fordi exophergenesis topp og timing kan forskyves av miljømessige eller genetiske endringer som studeres, anbefales det å score en populasjon av voksne dyr daglig over fire dager for å generere det mest omfattende bildet (Figur 3D).
- Dyrke dyr på seedede NGM plater som beskrevet ovenfor.
5. Påvisning av eksfosere ved hjelp av et fluorescerende mikroskop
- Vær oppmerksom på eksfoster ved hjelp av et pseudo-stereo-stereoskop som er utstyrt for fluorescensmikroskopi.
- Immobilisere dyr på NGM plater ved å pipettering 100-200 μL av 10-100 mM levamisole / tetramisole løsning på NGM agar plate overflaten. Etter 2-4 minutter blir dyrene lammet og kan observeres direkte på agarplaten.
MERK: Immobiliseringsbehandlinger er ikke helt nødvendig, slik at med et trent øye kan nevronal identifikasjon og eksovis tilstedeværelse scores ved visuelt å følge krypende dyr under mikroskopet på platen når man avgjør om en eksofer er produsert eller ikke. - Observer fluorescerende nevroner ved hjelp av en total forstørrelse på 100x for å oppnå dissekering av mikroskopdeteksjon av eksfosere.
MERK: Scoring exopher hendelser ved hjelp av disseksjon mikroskopi gjør det mulig for observasjon av et stort antall dyr med relativ letthet direkte på agar plater som de er oppdratt. - Levende bilde- og monteringsreporterstammer for exopher-studier ved hjelp av konfokal mikroskopi
- Bruk et konfokalt mikroskop til live-image intracellulær dynamikk og egenskaper av eksofergenese.
MERK: Levende bildebehandling er en fordelaktig tilnærming for å observere subtile detaljer om exopher produksjon fordi exopher produksjon er en dynamisk prosess. - Begrens dyrebevegelse for høyoppløselig levende bildebehandling ved hjelp av praktiske metoder, inkludert utnyttelse av levamisol eller tetramisole ved 10-100 mM eller anvendelse av hydrogelpolystyren mikroperler (med diameter på 15 μm, 30 μm eller 40 μm)18.
- Bruk et konfokalt mikroskop til live-image intracellulær dynamikk og egenskaper av eksofergenese.
- Skyv forberedelse for sammensatt og konfokal mikroskopi
- Monter 20-50 dyr i et immobiliserende middel på et mikroskopsklie. Gjenbrukbare ringede cytologisklier malt med hevet ringer med hevet diameter på 13 mm er nyttige for montering.
- Plukk levende dyr i 5-20 μL av en paralytisk som 10-100 mM levamisole eller tetramisole i den malte sirkelen eller på agarputen.
- Vent i 4 minutter på lammelse, og dekk deretter lysbildet med en dekkslipp (anbefaler nr. 11/2 (0,16 – 0,19 mm) eller nr.
- Montering av et lite antall dyr
- Ikke knus monterte dyr; ved å observere bare noen få (mindre enn 20) dyr per lysbilde, er det fare for å knuse noen av dyrene på grunn av ulikt trykk på dekkslippen. Denne risikoen kan minimeres ved hjelp av en lav prosentandel agarose pad for montering.
- Lag en 2-4% agarose pad lysbilde, og deretter legge til 2-15 μL av paralytisk løsning til puten. Husk at levamisole og tetramisole sprer seg inn i puten, noe som reduserer deres effektive konsentrasjon.
- Monter ved å plukke dyr inn i en 2-15 μL dråpe paralytisk oppløsning eller mikroperler som hviler på agarputen. Plasser dekkslippen på toppen og kontroller at dyrene er intakte18.
- Agar pad forberedelse
- For å forberede 2% agar pads, varme 2% oppsto i M9 løsning og mikrobølgeovn til agarose er i en homogen og smeltet tilstand.
- For å oppnå en agarpute av tilstrekkelig kvalitet, alternativ blanding og mikrobølge ved lav effekt i mindre enn 20 sekunder. Unngå inkludering av luftbobler i puten ved å plassere kokende agar på en varmeblokk og la boblene stige til overflaten.
- Bruk en Pasteur pipette til å tegne agar fra dypt inne i smeltet oppløsning under de oppstandne boblene.
- Forbered to teipede lysbilder og plasser på hver side av et rent glassmikroskop lysbilde på en flat overflate. For å få de teipede objektglassene til å plassere to 5 cm strimler av laboratorietape på hvert lysbilde (figur 6A).
- Bruk en Pasteurpipetter til å plassere en enkelt dråpe agar på det rene mikroskopet som er klemt mellom de teipede objektglassene (figur 6B).
- Dekk forsiktig og raskt til dråpen av smeltet agar med en fjerde ren skyve ved å plassere inn over de teipede lysbildene (figur 6Cc).
MERK: Skyveren skal forsiktig trykke den smeltede agaren inn i en flat sirkel som er ca. 0,4 mm tykk (tykkelsen på båndet) (figur 6D). Agaren skal raskt avkjøles. - Fjern det øverste lysbildet ved å skyve det av (figur 6E). Agar pads tørker raskt og brukes best i løpet av minutter. Når det øverste lysbildet er fjernet, bruk gelputen umiddelbart for montering av dyr. Unngå å bruke pads med luftbobler.
- Oppbevar agarputer opptil 30 minutter innkapslet mellom de to glassskliene. Tørket agar får dyr til å klumpe seg sammen og tørke. Monter dyr innenfor 2-15 μL av paralytisk oppløsning eller mikroperler og dekk med dekkslip; skjermen skyves lysbildet innen 20 minutter etter lammelse og montering (figur 6).
MERK: Fordi stressforhold kan endre exopher priser, unngå paralytika som kan indusere oksidativt stress (f.eks: natriumazid) ved screening for exophers.
- Påvisning av eksfosere ved hjelp av et spinnende diskkonokalt mikroskop
- Vær oppmerksom på cellebiologiske egenskaper som organeller og annet innhold med 1,4 numeriske blenderåpningsmål ved 63x og 100x.
- Bruk programvare som er i stand til scenekontroll og bildeoppkjøp ved hjelp av flerdimensjonalt oppkjøp. Mikroskoper og bildebehandlingsprogramvare bør også være egnet for bildebehandling og datainnsamling, da disse trinnene involverer standard bildetilnærminger.
6. Identifisere berøringsnevroner og scoring for eksokroker med monterte dyr
- Monter lammet voksendyr (figur 6).
- Identifiser ønsket Z-plan. Bruk lavt forstørrelseslysfelt (10-40x) for å identifisere dyrets egnede Z-plan, legg merke til plasseringen av dyret, hodehaleorienteringen og plasseringen av vulva - som er landemerker for senere nevronal og exopher identifikasjon (figur 3A og figur 5E).
- Fokuser på fluorescenssignalet til den valgte reporteren. Bor i samme Z-plan, bytt til widefield fluorescens visning på 10-40x for den valgte cytosoliske reporter.
MERK: I dette eksemplet er fluorescerende uttrykk drevet av mec-4 mechanosensorisk berøring neuron-spesifikk promotor. Høy kopi arrays, og ulike fluoroforer har variasjon i uttrykk og derfor variabel fluorescerende intensitet. Juster om nødvendig. - Rull i Z-aksen for å observere dybden av dyret og fluorescerende uttrykk i fokalplanet. Mens du gjør det, bekrefter du hode-hale orientering; hodet/svelget vil ha fluorescerende nervering, og i dette tilfellet vil halen inneholde 1-2 synlige PLM somas (figur 3A).
- Identifiser berøringsnevroner
- Identifiser om dyret er montert på venstre eller høyre side (figur 3A).
MERK: Med tanke på dyrets 3-dimensjonalitet oppnås den beste bildeoppløsningen på siden nærmest optikken. - Identifiser soma (ALM, ALMR, AVM) ved å observere - start på hodet for å identifisere nerveringen og laterale nevronale prosesser.
- Ved 10-40x forstørrelse, sakte bla gjennom Z-aksen for å identifisere den vedlagte prosessen.
- Når prosessen er identifisert, følg den lateralt i bakre retning mot vulva, hvor soma vil være tydelig, preget av en rund cellekropp på slutten av prosessen. Når den mest in-focus neuronal soma er funnet, det kan identifiseres ved hjelp av andre nevronale landemerker som følger:
- Bruk AVM, en nærliggende ventral neuron, for å hjelpe tildele dyr orientering. Hvis AVM-nevronen er i samme plan som ALM, hviler dyret på siden og nevronen utenfor det flyet er ALMR . Hvis AVM-nevronen ikke er i samme plan som det aktuelle ALM, er det nærmeste berøringsnevnen til fokalplanet ALML.
- Identifiser PVM neuron, en annen ventral touch neuron ligger nær halen, for å indikere om den fremre berøring neuron er i samme plan. I så fall er berøringsneuron observert ALML.
- Få en følelse av posisjonen til andre somalegemer, nær interesseområdet (fluorescerende nevroner som ligger på hver side av soma), og i alle Z-fly, selv om det ikke er mulig å få den dypeste nevronen satt i klart fokus.
MERK: Identifiseringen av alle berøringsneuron somas er viktig fordi ute av fokus soma kan forveksles med exophers.
- Identifiser om dyret er montert på venstre eller høyre side (figur 3A).
7. Identifisere og score for exophers
- Når en touch neuron er funnet, inspisere den for store fremspring (exopher domener) stor nok til å bli betraktet som en knopp exopher, (nå minst 1/5th størrelsen på den opprinnelige soma) (Figur 1C).
MERK: Den gjennomsnittlige eksopher måler rundt 2-8 μm i diameter, mens den gjennomsnittlige soma av en (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) dyr måler 6-10 μm i dag 2 voksne (Figur 7B). - Hvis ingen knopp eller exopher domene observeres, inspiser den nevronale soma for en vedlagt tynn filament som kommer fra soma. Vedlagte eksfosere har en tendens til å være plassert nærmere den opprinnelige soma og i et lignende Z-plan.
MERK: Exophers forblir ikke alltid festet til soma. Påvisning av en vedlagt filament er en definitiv indikasjon på at objektet er en exopher. - For å identifisere en ufestet exopher, se etter innholdet i en exopher. Exophers kan konsentrere utvist fluorescerende proteiner og er derfor ofte lysere enn soma.
MERK: Innholdet i eksfoser er heterogene og variable. Cellulære organeller som lysosomer og mitokondrier kan også ekstruderes i eksofag (figur 4C-E). - Se etter ufestede eksfosere i forskjellige fokalfly enn flyet der den opprinnelige soma ble funnet. Selv om eksfosere har blitt sett å stikke ut fra ALM soma i alle retninger, er det typisk at eksfosere stikker ut fra soma, i bakre retning fra nevronalprosessen.
- Se etter store, sfæriske objekter som ikke er plassert og identifisert som nevronale somas. Exophers kan være uregelmessig formet, men er vanligvis sfæriske strukturer. Exophers blir degradert over tid, så eldre exophers har en tendens til å ha en mer uregelmessig form.
MERK: Modne eller eldre eksokroker skiller seg fra den spredte "stjerneklare natten" scenen via lysere fluorescensintensiteten til eksfosere og deres sfæriske form. - Undersøk "stjernenatten" fenotype som bevis på tidligere eksofergenese. Exophers fremgang i en "stjerneklarnatt" scenen som exopher bryter opp i mindre vesikler og de omkringliggende hypodermis forsøker å forringe exopher innholdet (Figur 1G, 2B, 3B & 7A).
MERK: Den stjerneklare nattscenen er preget av fragmenterte og spredte (noen ganger nettverks) fluorescerende enheter som har mistet strukturell integritet og viser en svak fluorescens i forhold til berøringsnevroner og exopher strukturer. - Se etter forekomster av "flere exopher hendelser". Exophers er vanligvis produsert som en entall forekomst (1 exopher som kommer fra 1 soma), men under noen omstendigheter mer enn én exopher kan frigjøres fra en enkelt soma (Figur 7D).
MERK: Modne eksoferer kan forringes til flere vesikler når de brytes ned i hypodermis. Å skille mellom om hver eksofer ble generert av en uavhengig eksofergenesehendelse eller om en original eksofag splittet for å skape en ekstra vesikkel bare kan bestemmes av tidsforløp observasjon. - Husk at ikke alle morfologiske abnormiteter modnes til exophers.
- Ikke score en distended soma som en exopher. En utvidet eller spiss soma kan observeres av og til (spesielt med alder eller under stress), men en forlengelse uten et klart innsnevringssted er ikke scoret som en exopher.
- Avvis små løste knopper som ikke oppnår 1/5th størrelsen på soma i exopher hendelse kvantifisering.
- Ikke tell neuritt utvekster som eksfosere. Modne neuritter kan strekke seg dramatisk med alderen (vanligvis i motsatt retning av nevronale prosessen) og fluorescerende protein kan migrere inn i den distale enden av slikestrukturer 19.
MERK: Disse neurittutvekstene er ikke exophers da de har et distinkt utviklingsmønster over dager og uker, danner ikke knopper og løsner ikke (figur 7E).
- Identifiser fluorescerende enheter som ikke er exophers.
MERK: Det er viktig å få en ide om bakgrunnsfluorescens for å sikre riktig identifisering av den ekstruderte fluorescerende enheten vs. autofluorescens.-
Transgen fluorescerende uttrykk vs autofluorescens. Ikke forveksle autofluorescence for transgene uttrykk. Den sanne exopher signal vil ikke være i tarmen eller tarmen (DIC bekreftelse kan brukes til å identifisere disse vev) og exopher signal vil være betydelig lysere enn bakgrunnen autofluorescence.
MERK: Autofluorescens er forårsaket av tarmgranulat intestinal fluorescerende pigmentering og akkumuleres med alderen. Det er heterogent, spesielt sett med forskjellige bølgelengder. - Signal fra embryoer. Ikke forveksle embryosignal for eksofergenese. Bekreft mistanker om embryosignal ved å bytte fra fluorescens til brightfield belysning og se etter assosiasjoner av signal med egg i livmoren.
-
Ut av flyet eller nærliggende soma kropper. Unngå å misforstå en ut av flyet soma for en exopher ved å identifisere alle nærliggende soma organer, selv ute av fokus somas i begynnelsen av observasjonen.
MERK: Hvis du scorer for eksfofere fra ALMR, identifiser og redegjør for plasseringen av AVM og ALMR somas. Flere detaljer om soma kroppen identifikasjon er beskrevet i figur 3A.
-
Transgen fluorescerende uttrykk vs autofluorescens. Ikke forveksle autofluorescence for transgene uttrykk. Den sanne exopher signal vil ikke være i tarmen eller tarmen (DIC bekreftelse kan brukes til å identifisere disse vev) og exopher signal vil være betydelig lysere enn bakgrunnen autofluorescence.
8. Scoring og statistikk
- Score exophers som binære (ja, det er en exopher / nei, det er ikke en exopher).
- Vurder exopher deteksjon som en "exopher-hendelse" for en gitt nevron. En exopher hendelse kan utgjøre observasjon av en enkelt exopher nær en soma eller flere exophers.
MERK: For å kvantifisere antall individuelle eksofergenesehendelser, bruk tidsforløpobservasjon. - Telle exopher hendelser per en bestemt identifisert celle fordi forskjellige celler ikke produserer exophers i samme hastighet (se for eksempel Figur 3C). ALMR nevroner produserer de mest baseline exophers i stammene beskrevet heri, og dermed ofte er dette cellen valgt for exopher kvantifisering fra berøringreseptornevroner.
- For statistikk, generelt, gjennomføre minst 3 biologiske studier, av minst 30 dyr scoret per studie med tilsvarende antall observasjoner som kreves for analyse av forstyrrelsen.
- For flere studier som involverer en eller to mutanter/behandlinger sammenlignet med kontroll, er Cochran-Mantel-Haenszel-testen hensiktsmessig for å bestemme p-verdier.
- For studier som involverer mer enn to mutanter av behandlinger sammenlignet med kontroll, er det også hensiktsmessig å bruke en binær logistisk regresjonsanalyse for å evaluere betydning for en rekke kategoriske prediktorer.
Representative Results
Flere fluorescerende journalister kan brukes til å måle eksfosere. Touch neuron exophers er lett visualisert in vivo via fluorescerende merking av proteiner som kan velges for ekstrudering, ved merking av organeller som kan ekstruderes, eller ved merking av cellemembraner. Tabell 1 identifiserer berøringsneuron uttryktfluorelege som har blitt brukt til å overvåke eksokroer, med representative eksempler inkludert i figur 4. Laster som er kjent for å bli ekstrudert i eksosomer inkluderer en fusjon av N-terminaldomenet av menneskelig huntingtin til utvidet polyglutamin (Q128) (Figur 4B),lysosomer som er GFP-merket med lysosomalt assosiert membranprotein (LMP-1) (figur 4C) og mitokondrier merket med matrise-lokalisert GFP (figur 4D). Cytoplasmatisk GFP er ikke sterkt utvist og er fortrinnsvis beholdt i soma5, selv om GFP kan svakt visualisere exophers (Figur 4A). Når GFP er smeltet sammen til proteiner som er utvist, kan denne koden brukes til å visualisere eksfosere. Et viktig poeng er at ved å merke forskjellige proteiner, kan et stort spekter av spørsmål om utvisning av spesifikke laster og organeller, samt på proteiner og membraner som utgjør eksfosere, tas opp.
Et pseudo-stereomikroskop oppsett er et effektivt verktøy for å se exophers hos dyr på agar plater. Dette oppsettet er en hybrid av sammensatt og stereoskopisk teknologi som inkluderer høy numerisk blenderåpning optikk på hver forstørrelse, pseudo-stereo teknologi (diskrete mål over en stereoskopisk base), og en zoom driftsbryter for visning på forstørrelser mellomliggende til installerte mål. Et mikroskop som dette bør være utstyrt med 10x okularer og mål kraftig nok for å observere nevronal morfologi og exopher produksjon for høy gjennomstrømning scoring (2x mål som brukes for skanning / plukking, 10x mål som brukes for å identifisere og score).
Mens forstørrelsesmuligheter av standard stereomikroskop vanligvis har høy nok oppløsning til å se nettverket av berøringsnevroner som uttrykker fluorescerende proteiner, er standard dissekeringsmikroskop ikke tilstrekkelig for å observere subcellulære detaljer om eksfofer som de rørformede forbindelsene til soma til exopher. Slike observasjoner nødvendiggjør konfokal mikroskopi (se Materialse tabellen for utstyrsdetaljer).
Exopher kvantitetsstudier krever strenge kontroller for å eliminere eksperimentelle påkjenninger. Det oppmerksomme vedlikeholdet av konsistente vekstforhold er nødvendig for reproduserbar exopher produksjon. Mer spesifikt er exopher produksjon stress-responsive slik at konsekvent fôring, konstant temperatur, og forurensning-fri vekst på tvers av generasjoner er avgjørende for reproduserbarhet. Under basale vekstforhold med høyt nevronalt uttrykk for mCherry, exopher produksjonen er relativt lav (5-25% av ALMRs produsere exophers), men noen påkjenninger, inkludert osmotisk og oksidativt stress, kan øke exopher priser. Mens mCherry uttrykk kan tenkes som stress, en corollary av stress-følsomhet av exopher nivåer er at, hvis riktig kontrollert, eksperimentell stress introduksjon kan være en strategi for lettere indusere og observere exophergenesis.
Timing og forventet exopher produksjonsnivåer. Exophers er nesten fraværende under larval utvikling. Perioden med topp exopher produksjon i unge voksne liv synes å være svært begrenset til i løpet av voksen dager 1-4, oftest å være tydelig på voksen dag 2 eller 3. Fordi toppen kan skifte fremover eller tilbake litt, er den mest komplette evalueringen av en exopher produksjonsprofil å score flere studier daglig over voksne dager 1-4. Generelt produserer en ALMR en stor eksopher, med vesikkelen vedvarer i minst 24 timer. Exopher kan produseres ganske raskt (i rekkefølgen av minutter på sitt raskeste). Vanligvis produseres bare en stor eksopher per nevron tidlig i voksenlivet, men produksjon av flere exophers er mulig.
Generelt exopher produksjon av ALMRs uttrykker mCherry under basale forhold varierer fra 5-25% av ALMRs undersøkt innenfor den optimale tidsrammen for voksen dag 2-3 (Figur 3D). Proteostasekriser 5, samt eksponering for andre påkjenninger kan modulere exopher nivå. Stress eller genetiske perturbasjoner kan øke exopher produksjon til deteksjon priser så høyt som 90% av ALMR nevroner som produserer exopher profiler.
Fôringsbaserte RNAi for testing av spesifikke gener i eksofergenese. Nematode C. elegans er ofte utsatt for RNAi slå ned ved å mate dyr forvandlet E. coli stamme HT115 som uttrykker en dobbel strandet RNA (dsRNA) rettet mot et gen av interesse20. HT115 bakterier kan brukes når du scorer for exophers i fôring RNAi5. Mens transkripsjoner i de fleste vev kan målrettes av RNAi ved hjelp av denne teknikken, nevroner er mer ildfast. Følsomhet for RNAi kan kalibreres ved hjelp av dyr som uttrykker den transgene dsRNA-transportøren SID-1 under en nevronspesifikk promotor. På denne måten kan nevronalt vev sensibiliseres til RNAi21.
Vevsspesifikk knockdown av et gen av interesse kan oppnås ved å uttrykke en komponent av endogene RNAi metabolisme i en mutant som er mangelfull i den komponenten. For eksempel: Argonaute protein RDE-1 kan uttrykkes spesielt i nevroner av rde-1 mutant dyr for å oppnå knockdown av et gen av interesse bare i nevroner når dyr er utsatt for en RNAi intervensjon rettet mot det genet.
Ved hjelp av standard nematode RNAiprotokoller 20,22, eksponering av foreldrene på L4 scenen til RNAi og tillater deres avkom til å utvikle forbruker forvandlet HT115 bakterier til voksen alder genererer den sterke genetiske knock-down, men være oppmerksomme på potensielle utviklingsforsinkelser indusert av RNAi som eksperimentelle dyr kan vokse annerledes enn en tom vektorkontroll. Det er viktig å alltid inkludere den tomme vektorkontrollen for negativ kontrollsammenligning. HT115 bakterier kan brukes når du scorer for exophers i fôring RNAi. Vær imidlertid oppmerksom på at noen gener er effektive for å endre exophergenesis priser selv i kortere perioder med RNAi eksponering5. Hvis målretting av visse gener fører til utviklingssvikt, unngå å utsette dyr for livslang knockdown, kan dyr bare plukkes på L4-scenen på RNAi plater for eksponering fra L4 til voksen D2 eller D3.
| Stammenavn | Genotype | Beskrivelse | Exopher prosent | Referanse |
| SK4005 | zdIs5[Pmec-4GFP] | Cytosolisk uttrykk for GFP i berøring nevroner. | 1-8% ALM | Figur 4A, Melentijevic 2017 |
| ZB4065 Leilighet | bzIs166[Pmec-4::mCherry] | Overuttrykk av mCherry (bzIs166) i berøring nevroner, produserer både cytosolisk signal og mCherry aggregater. bzIs166 er en exopher induktor. mCherry aggregater er prediktorer av eksofergenese og er fortrinnsvis ekstrudert i eksotører. | 3-20% ALM (normale forhold). 20-80% ALM (fasteforhold). | Figur 4B, Melentijevic 2017 |
| ZB4067 Leilighet | BzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; | YFP cytosolisk etiketter mec-7 touch nevroner. Co-uttrykt Q128::CFP aggregater og induserer exophers. CFP fortrinnsvis demper. | ~ 25% | Figur 4C, Meletijevic 2017 |
| ZB4509 Leilighet | bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | bzIs168 LMP-1::GFP merker plasmamembraner og lysosomalmembraner. bzIs168 kan brukes til å identifisere nevronale membraner, eksfosere (som de er membranbundet) og lysosomalmembranstrukturer. | 3-20% ALM | Figur 4D, Melentijevic 2017 |
| ZB 4528 Leilighet | bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | Allele zhsEx17 er en mitokondrialt lokalisert reporter som endrer sin topp eksitasjon bølgelengde fra 405nm (oksidert) til 476nm (redusert) i henhold til det lokale oksidative miljøet. Det uttrykkes i berøringsnevronene og kan brukes alene for å identifisere mitokondrier i berøringsnevroner og i mito-eksokroker. | 3-20% ALM proteo-exopher. % ALM mito-exopher kvantitet pågår. | Figur 4E, Melentijevic 2017, Cannon 2008, Ghose 2013 |
Tabell 1. Stammer som har blitt brukt til visualisering av berøringsnevroner, berører nevron-eksophers og exopher innhold.
Figur 1: Stadier av eksofergenese. Prosessen med å lage og kaste ut en exopher kalles "exopher-genesis". Den dynamiske prosessen med exopher formasjon kan ta flere minutter til flere timer. Avbildet er eksempler på soma og exopher morfologi på bestemte trinn under den dynamiske exophergenesis prosessen i en høy exopher produserende belastning, ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Alle bilder er av dag 2 voksne ALM nevroner tatt med en 100x mål. (A) Normal soma. Voksen mechanosensorisk touch neuron ALM transgenically uttrykker Pmec-4mCherry. Soma morfologi avbildet er typisk for unge voksne nevroner i denne stammen, med mCherry konsentrasjoner i cytoplasma. (B)Tidlig knoppfase. Det første observerbare trinnet av eksofergenese innebærer polarisering av valgt cytoplasmatisk materiale til kanten av somamembranen. Dette trinnet er ofte ledsaget av en utvidelse eller hevelse i soma. I tilfelle av berøringsnevroner strekker pre-exopher-domenet (PED) seg inn i de omkringliggende hypodermis (ikke synlig her). Legg merke til større konsentrasjon av mCherry materiale i tidlig knopp domene. (C) Sen knopp fase. Ved ytterligere cellulær polarisering og en utvidelse av pre-exopher-domenet, blir en innsnevring mellom soma og exopher (pil) tydelig. Denne hendelsen signaliserer overgangen til sen knoppfasen. Selv om cellen i sen knopp-fasen viser et klart innsnevringssted og skiller soma- og exopher-domener, er den ennå ikke klemt helt av fra soma; den spirende eksopher kan festes av en tykk stilk (pil). Det spirende domenet regnes som en tidlig exopher når diameteren på exopher domenet i spørsmålet er omtrent 1/3 større enn diameteren på byggeplassen / stilken. (D)Tidlig eksopher fase. Tidlige eksfosere kan festes av en stilk fra avgangssommea - diameteren på denne forbindelsen kan tynnes når eksopher beveger seg bort fra soma. Cytoplasmatisk materiale kan overføres fra soma til eksopher via dette røret, selv om det meste av materialet er lastet under prosessen med spirende ut. Exophers kan løsne fra soma som avbildet i (E), separert exophers anses modne exophers (F). Den modne eksopher kan passere gjennom det omkringliggende hypodermalvevet, beveger seg bort fra avgang soma. (G)Sammenbrudd av mCherry-merket exopher i mindre vesikler i hypodermis resulterer i en spredt punktat utseende av mCherry materiale, mest sannsynlig når det kommer inn i hypodermal endolysosomale nettverk. Det spredte punktatsignalet kalles "stjerneklar natt"-fasen. Nedbrytning av noe eksofaginnhold oppnås sannsynligvis av hypodermale lysosomer, men noe materiale er ikke fullstendig degradert og blir ofte ekstrudert av hypodermis inn i pseudocoelom. Post-exophergenesis mCherry transitt er beskrevet mer detaljert i figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: mCherry ekstrudert fra berøringsnevroner i eksoserveringer engasjerer det omkringliggende hypodermale lysosomale nettverket, men kan senere ekstruderes inn i pseudocoelom hvor koelomocytter kan lagre / forringe mCherry. (A) Cartoon sammendrag av hvordan mCherry ekstrudert i eksfosere passerer kroppen etter utvisning av nevroner. Under eksofergenese valgt cellulært innhold som mCherry bli lokalisert og knopp av fra å sende nevronal soma i en uavhengig vesikkel omgitt av nevronale og hypodermal plasma membraner. Siden berøringsnevronene er innebygd i hypodermalvevet, som exopher-domeneknoppene utover, beveger det seg videre inn i hypodermis. Eksopher kan passere hypodermis, og etter timer til dager, exopher innholdet kan fragmentere i endolysosomale nettverket av hypodermis. MCherry kan vises som spredt punktpunkt gjennom hypodermis, en scene som heter "stjerneklar natt". Etter noen dager kan noen av mCherry passere ut av hypodermis inn i den omkringliggende pseudocoelom, hvor scavenger celler kalt coelomocytes kan få tilgang til, og ta opp, mCherry som kan lagres. (B)Eksempel på utseendet på stjerneklare natt mCherry vesikler. Bilde av en ALM soma merket med mCherry med store exopher fragmenter og stjerneklare natt vesikler. Stamme er ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. (C)Eksempel på mCherry konsentrasjon i fjerne koelomocytter. Sidevisning av en voksen dyr dag 10 av belastning ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] viser mCherry konsentrert i koelomocytter (piler). Noen stjerneklare natt vesikler er også tydelige. Generelt blir koelomocyttkonsentrasjon tydelig etter omtrent voksen dag 5 av livet. (B nederst) Tegneserie reproduksjon av (B), med berøring nevroner og prosesser skissert i rødt, som er lyseste exopher fragmenter; spredte små vesikler av forskjellige Z-dybder er vist i lysere rosa. (C nederst) Tegneserieversjon av bilde av (C), som viser nevronal prosess i rødt, stjerneklar natt i rosa og coelomocytes i grønt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mechanosensoriske berøringsnevroner produserer eksfosere på forskjellige nivåer med en presis temporal profil. (A)(Øverst) Tegneserieskildring av mechanosensoriske berøringsnevroner i romlig forhold til viktige anatomiske landemerker i C. elegans, inkludert pumpesvelg og den nevrontett nerveringen på dyrets hode, vulva på midten av kroppen og den koniske halen. (Nederst) Fluorescerende merkede berøringsnevroner som uttrykker GFP sett fra topp og venstre side (bilder tilpasset fra WormAtlas). Den røde boksen viser området der ALM exophers er vanligvis plassert. (B)Høy forstørrelsesvisning av midtkroppsregionen der ALM-avledede eksfosere produseres i en stamme som uttrykker [Pmec-4mCherry]. AVM og ALMR neuron er avbildet, og vist er en ALMR exopher sammen med mCherry stjerneklar natt. ALMR nevroner produserer mest eksfosere. (C) ALMR mechanosensory touch nevroner lettere produsere exophers sammenlignet med andre touch nevroner i hermafroditter under basale forhold. Mechanosensory touch neuron exopher produksjon på voksen dag 2, som scoret for individuelle berøring reseptor nevroner er indikert. Stamme: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, feilbarer er SEM. (D) ALMR touch nevroner produserer flere exophers i løpet av dag 2 og 3 av voksen alder sammenlignet med ungdom L4 stadium eller med dyr i avansert alder. Stamme: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N> 150, feilfelt er SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på noen fluorescerende journalister som tagger exopher innhold. En enkel måte å observere eksfosere på er ved å skape transgene dyr som uttrykker fluoroforer fra nevronale promotorer. Fluoroforene tillater visualisering av eksoferen og transgene uttrykket induserer aggregering og / eller proteostress som øker eksofergenesen. Exophers produsert av amlusne nevroner kan også observeres under innfødte forhold, ved hjelp av fargestoff fylling for visualisering. Vist er eksempler på vanlige stammer som kan brukes til å observere exophers, (E) exopher, (S) soma. (A) Soma og exopher fra en ALM av en voksen av stamme SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP],100x mål som brukes til fotografering, skala bar 3μm. I denne stammen måles eksfoser som inkluderer løselig GFP, men exopher-produksjonen skjer sjelden. Fusing GFP til proteiner som fortrinnsvis ekstruderes i eksofag i andre studier bekrefter at GFP-fusjoner kan oppdages i modne eksfosere. (B)ALM soma og exopher av en voksen av stamme ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], som uttrykker mCherry og induserer touch neuron exopher produksjon. 100x mål som brukes til fotografering, skala bar 5 μm. (C) ALM soma og exopher av en voksen av stamme ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; selektiv blå kanal som brukes til bilde av htt57Q128::CFP. Eksopher inneholder htt57Q128::CFP aggregater (piler), som vises mer konsentrert i exopher enn i soma. 40x mål som brukes til fotografering, skala bar 5μm. -Det er ikke noe å si på. Exophers kan inneholde organeller og organelle-spesifikk merking med fluorescerende proteiner muliggjør overvåking av organelle ekstrudering. (D)Lysosomal membran tag LMP-1::GFP skisserer soma og exopher membran og koder plasma membraner svakt (plasma membran lokalisering er en menneskehandel skritt på vei til lysosomal målretting) og etiketter lysosomal organeller sterkt. Vist er en voksen ALM soma co-uttrykke Pmec-4mCherry og Pmec-7LMP-1::GFP som lokaliserer til membraner og lysosomer. Soma har en festet exopher med andre mindre profiler sannsynlig å være exopher fragmenter (piler). GFP positive strukturer er inkludert i soma og er til stede i den store exopher, belastning: ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]. 100x mål som brukes til fotografering, skala bar 5 μm. E) En mitokondrie GFP-markør kan brukes til å identifisere mitokondrier i soma og eksfoser. Vist er en voksen ALM soma uttrykker Pmec-4mCherry og mito::ROGFP, som lokaliserer til mitokondriematrisen. mitito::ROGFP uttrykt alene, uten mCherry, kan også lett brukes til å identifisere nevroner og score for exophers som inkluderer mitokondrier. Stamme: ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]. 100x mål som brukes til fotografering; vektstangen 5μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Utviklingssyklus av C. elegans og L4 identifikasjon. Ved20°C tar et egg ca. 9 timer å klekkes en gang lagt av moren. (B) Et nyklekket dyr er i larval stadium 1 (L1) og smelter inn i en L2 larve etter 12 timer. (C) Dyr forblir i L2 og (D) L3 larval stadier i ca 8 timer hver. (E) Unge dyr regnes som den fjerde larvalstadiet (L4) og er preget av en iøynefallende utviklende vulva som fremstår som en hvit halvmåne nær midten av kroppen. Tilstedeværelsen av dette mens halvmåne muliggjør enkel identifisering og plukking av L4 iscenesatte dyr for å etablere synkroniserte kulturer som senere letter scoring for exophers. Dyr forblir i L4-scenen i ca 10 timer før deres siste smelting til gravid voksne, F) identifisert ved å utvikle egg, synlig spermatheca, og initiering av egglegging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Tilberedning av mikroskop skyve agar pad. (A)Forbered to lysbilder med en enkelt stripe av laboratorietape plassert på langs over toppen. Plasser et ikke-teipet mikroskop lysbilde i mellom som avbildet. B) Plasser en dråpe smeltet oppsto på toppen av lysbildet. (C) Plasser et rent lysbilde forsiktig oppå dråpen, og trykk på agarose inn i en deflatert sirkelpute. (D) Fjern de teipede lysbildene, som virker for å oppnå en jevn utflating av agaren som er nødvendig for å lage en jevn pute. FjernEdet øverste lysbildet når agaroseputen har tørket. (F) Pipette en paralytisk løsning (levamisole eller tetramisole) på toppen av agarputen. (G)Velg passende iscenesatte dyr i paralytisk. Dekkforsiktigdyrene med en dekkslipp og sørg for at dyrene er i live. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Tegn av eksfoser og exopher identifikasjonskriterier. (A)Generelle kriterier som identifiserer en exopher. (B) Diameter sammenligninger mellom sending soma og ekstrudert eksopher, målt i μm. Voksen ALM somas, N = 35, belastning: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] - 6,53 μm gjennomsnittlig størrelse på soma og 3,83 μm gjennomsnittlig størrelse på exopher. (C) Definere kriterier for differensiering mellom et exopher domene og en spirende exopher. (D)Oftest gjør individuelle nevroner en stor eksopher, som senere deler seg eller fragmenter som hypodermis forsøker å forringe innholdet. Likevel, flere exophers kan observeres ved siden av en touch neuron som kan komme fra enten flere exopher hendelser fra en nevron eller alternativt, exophers kan også knopp eller fragmentere seg selv. Opprinnelsen til flere exopher-lignende enheter kan bare bestemmes ved hjelp av tidsforløp mikroskopi. Top viser en ALMR touch neuron soma med en enkelt fjern exopher. Bunnen viser en ALMR touch neuron soma med flere exopher-lignende profiler. (E) Vanlige morfologiske egenskaper hos voksne ALM touch neuron somas som kan forveksles med exopher hendelser. Øverst til venstre - En distended ALM soma, uten klart exopher domene eller innsnevring nettsted. Topp midten - Nevroner kan ha små ekstracellulære fremspring som kan være analoge med eksokroer, men oppfyller ikke størrelseskravkriterier for å bli betraktet som en exopher. Øverst til høyre – Med alderen kan berøringsnevroner utvikle utvekster langs deres mindre neuritt. Ofte kan mCherry materiale samles på spissen av neuritt utvekst. Dette er ikke scoret som en exopher hvis den innsamlede mCherry ikke oppfyller exopher-to-soma størrelseskrav. Bottom skildrer voksne ALM nevroner som har definerende kriterier for et exopher domene eller en exopher. Botom venstre - ALM soma som har en fremtredende exopher domene som selektivt inkluderer mCherry cytosol og mCherry merket aggregater. Exopher domene innsnevring området er preget av piler og oppfyller størrelseskriteriene (minst1/5 th størrelsen på soma). Den største diameteren av exopher domenet er nesten 1/3 større enn diameteren på innsnevring området, møte kriterier for en exopher hendelse. Bottom middle - ALM soma som har en fremtredende spirende exopher som oppfyller størrelseskriteriene. Det er et klart innsnevringssted. Nederst til høyre - ALM soma som har en vedlagt mCherry-fylt exopher som oppfyller exopher størrelse krav. Eksopher er festet av en tynn tilkobling filament. Alle bilder er fra belastning ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Karakteriseringen av in vivo molekylære mekanismer for aggregert og organelle eliminering i form av store eksfosere er i sin barndom. Spørsmål om betegnelsen av last for utvisning, polarisert samling av disse lastene i cellen, reguleringen av beslutningen om å generere eksfoster, maskineriet som formidler profiler, og samspillet mellom eksfosere med det nedbrytbare maskineriet i en nærliggende celle gjenstår å bli adressert. Videre er in vivo visualisering av rørformede forbindelser som kan passere biologiske materialer som inkluderer kalsium, aggregater og mitokondrier interessant og understudert biologi i seg selv. Spørsmål om hvorfor visse celler er mer utsatt for exopher produksjon enn andre også er uløst, men kan begynne å bli genetisk dissekert med tilnærmingene skissert i denne protokollen.
Beskrevet i detalj i denne protokollen er tilnærmingene til å oppnå reproduserbar scoring av exopher produksjon, med fokus på å skille exophers fra nærliggende celle somas, tidspunktet for analyser for å fange toppen av exopher produksjon, og streng kontroll over vekstforhold for å eliminere utilsiktede påkjenninger som kan modulere exopher nivåer. Både skillet mellom den store tidlige eksopher, eller "stjerneklar natt" spredning i de omkringliggende hypodermis kan kvantes som bevis på exopher produksjon. Når det er sagt, nevroner som uttrykker mCherry under basale forhold er oftest forbundet med 5-25% av nevroner av en bestemt type som produserer en exopher. Kontrollert innføring av stressforhold kan brukes for å øke exopher produksjonen til deteksjon så høyt som 90% av nevroner som produserer profiler, spesielt nyttig for genetiske eller farmakologiske skjermer for modifikatorer.
Ved human nevrodegenerativ sykdom kan store aggregater overføres fra syke nevroner til nærliggende celler for å fremme patologispredning. Eksopher mekanismen kan skje via en konservert mekanisme som brukes for aggregert ekstrudering over phyla. Definere in vivo molekyler som enten forbedre effektiviteten av denne prosessen (anses mer effektiv proteostase kontroll) eller blokkere det kan utnyttes til å påvirke utformingen av nye strategier for bekjempelse av flere nevrodegenerative sykdommer. Som sådan kan protokollen som er beskrevet her, brukes til klassiske genetiske mutageneseskjermer, genom-brede RNAi-skjermer som systematisk slår ned gener for å identifisere enhancers og suppressors, eller for narkotikaintervensjonsstudier som identifiserer kandidatfarmakologiske modifikatorer av denne prosessen. Tilnærmingen er grei, men noe arbeidskrevende. Exophers er så store at de kan sees med et høyforstørrelsesspisse mikroskop. Likevel er C. elegans nevroner relativt små og ser på deres organeller eller deres membraner krever høyere kraft konfokale bilder og er en langsom prosess. Alternativer for høyere gjennomstrømming kan innebære høyinnholdsavbildningsmetoder i multi-well plate-format.
Anvendelsen av en standardisert tilnærming til exopher scoring bør til grunne en samordnet genetisk disseksjon av prosessen der nevroner kan organisere og eliminere cellulær rusk.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi erkjenner følgende NIH-tilskudd: R01AG047101 og R37AG56510. Medlemmer av Driscoll- og Grant-laboratoriene har bidratt mye til utvikling og finjustering av protokoller som er beskrevet, med strenge eksperimenter og sterk kommunikasjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95B Scientific CMOS camera | Photometrics Prime | ||
| 1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
| 10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
| 10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| 13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| 25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
| 300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| 9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
| absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
| C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
| calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
| cholesterol | Acros | 110190250 | |
| dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
| E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
| FBS10 Standard microscope | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom |
| glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
| Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
| LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
| LDI – Laser Diode Illuminator | 89 North | ||
| levamisole | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
| M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
| magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
| Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| Polystyrene microbeads | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
| RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
| Reusable ringed cytology slides | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
| SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | contract Driscoll lab | GFP expressed in touch neurons | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
| Triton-X | Thermofisher scientific | 28313 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit | CrestOptics | ||
| ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | contract Driscoll lab | mCherry expressed in touch neurons | |
| ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | contract Driscoll lab | Q128 expressed in touch neurons | |
| ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | contract Driscoll lab | mitoROGFP expressed in touch neurons | |
| ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | contract Driscoll lab | autophagy marker expressed in touch neurons | |
| ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |
References
- Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).
- Davis, C. H., et al. Transcellular degradation of axonal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).
- Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).
- Stahl, P. D., Raposo, G. Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis. Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).
- Melentijevic, I., et al. C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367 (2017).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).
- Tyson, T., et al. Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).
- Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nature Communications. 6, 6768 (2015).
- Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism. bioRxiv. 10 (1), (2019).
- Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
- Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).
- Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Weicksel, S. E., et al. A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).
- Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).
- Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
- Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).
