Summary
糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。
Abstract
ヒト腎臓組織の遺伝子発現解析は、恒常性および疾患病態生理を理解する重要なツールである。この技術の解像度と深さを高め、組織内の細胞のレベルにそれを拡張することが必要です。単一核および単一細胞RNAシーケンシングの使用は広く普及しているが、組織解離から得られた細胞の発現シグネチャは空間的文脈を維持しない。特定の蛍光マーカーに基づくレーザーマイクロディション(LMD)は、既知の局在化を伴う特定の構造および対象細胞群の単離を可能にし、それによって腎臓組織における空間的に固定されたトランスクリプトーミックシグネチャの取得を可能にする。迅速な蛍光ベースの染色に導かれたLMD方法論を最適化し、ヒト腎臓内の5つの異なるコンパートメントを分離し、その後のRNAシーケンシングを貴重なヒト腎臓組織標本から行います。また、収集した検体の妥当性の評価を可能にする品質管理パラメータも提示します。この原稿で概説されているワークフローは、高い信頼を持ってサブセグメントの転写シグネチャを分離するこのアプローチの実現可能性を示しています。ここで提示される方法論的アプローチは、関連する抗体マーカーの置換を伴う他の組織タイプにも適用され得る。
Introduction
組織標本の研究における技術の進歩は、様々な臓器における健康と病気の状態の理解を改善しました。このような進歩は、病理学が限られた領域または特定の細胞タイプで始まることができるが、臓器全体に重要な意味を持つことを強調している。したがって、現在の個別化医療の時代において、細胞レベルと地域レベルの両方で生物学を理解することが重要であり、世界的に1.これは、病理学的ストレスを開始および/または応答する様々な特殊な細胞および構造で構成される腎臓において特に当てはまる。様々なタイプのヒト腎臓病の病因はまだよく分かっていない。ヒト腎臓における特定の管状のセグメント、構造、または間質の領域における遺伝子発現の変化を研究する方法論を生み出すと、疾患の病因を知らせることができる領域固有の変化を発見する能力が高まる。
ヒト腎臓生検検は限られた貴重な資源です。したがって、腎臓組織のトランスクリプトミクスを問い合わせた技術は、組織を減態するために最適化されるべきである。細胞および地域レベルでのトランスクリプトミクスを研究するために利用可能な方法は、単一細胞RNAシーケンシング(scRNaseq)、単一核RNaseq(snRNaseq)、その場空間ハイブリダイゼーション、およびレーザーマイクロダイスセクション(LMD)を含む。後者は、下流RNAシーケンシングおよび分析2、3、4、5のために、組織切片内の対象となる領域または構造を正確に分離するために適しています。LMDは、解剖中に蛍光ベースのイメージングを使用して検証されたマーカーに基づいて、特定の細胞タイプまたは構造の同定に頼るために採用することができる。
レーザー顕微鏡解剖支援地域転写術のユニークな特徴には、1)細胞および構造の空間的文脈の保全が含まれ、細胞が組織学的ではなく発現によって同定される単一細胞技術を補完する。抗体マーカーは発現シグネチャを定義するため、2)この技術は他のイメージング技術に情報を提供し、知らされる。3)マーカーが疾患で変化した場合でも構造を識別する能力;4)約20,000遺伝子における低発現転写物の検出。5)顕著な組織経済。この技術は、十分なRNA取得に必要なコアの厚さが100μm未満の腎臓生検に対してスケーラブルであり、大規模なリポジトリまたは学術センター6で一般的に利用可能なアーカイブされた凍結組織の使用を可能にする。
その後の研究では、ヒト腎臓組織で使用するための新しい急速蛍光染色プロトコルで最適化された、地域およびバルクトランスクリプトミクス技術を詳細に記述します。このアプローチは、凝集した管間質の表現とは対照的に、インタースティジウムおよびネフロンサブセグメントに対して別々の発現データを提供するため、従来の LMD 探索を改善します。厳格かつ再現性を確保するために実施される品質保証と管理対策が含まれています。このプロトコルは、細胞および関心のある領域の可視化を可能にし、これらの孤立した領域からのRNAの満足のいく獲得をもたらし、下流RNAシーケンシングを可能にする。
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Protocol
この研究は、インディアナ大学の機関審査委員会(IRB)によって使用が承認されました。
注:最適な切断温度(OCT)化合物に保存され、-80°Cで保存されている腎臓腎切開組織(XおよびY次元の両方で最大2 cm)でこのプロトコルを使用してください。 RNA汚染を制限する方法ですべての作業を実行し、きれいな使い捨て手袋とフェイスマスクを使用してください。すべての表面の清潔さを確認します。このプロトコルが最適化された装置は、パルスUVレーザーを搭載したレーザーマイクロ解剖システムです。
1. クライオセクション
- 1.2 μm LMD PPS膜(ポリ(p-フェニレンスルフィド)は、凍結切断の直前にUV光(組織培養層流れフード)に30分間スライドします。最適な組織付着のために、スライドを室温で保管してください。
- クライオスタットを-20°Cに冷却します。 作業面を清掃し、新しい切断ブレードを取り付けます。
- 小さなスライドボックス(RNase表面除染液で洗浄)をクライオスタットチャンバーの中に置き、切りたてのティッシュでスライドを保存します。
- 組織ホルダーにOCTで標本を付着し、チャンバー温度に達するために数分間平衡化し、OCTブロックとホルダーの間の接着を強化します。熱抽出器を使用してプロセスを支援します。
- 試料を12μmの厚さに切り、スライドアダプタを使用して専用のLMDスライドに貼り付けます。各スライドは、スライドごとに1つの腎切除セクションを保持するか、スライドごとに最大2つの腎臓生検セクションを保持します。スライドを -80 °C に乾燥剤カートリッジを使用して保管し、密閉したビニール袋の中に保管して、余分な水分がスライドボックス内に蓄積するのを防ぎます。
- 各スライドに、標本ID、日付、スライド番号をラベル付けします。
- 凍結切断の最初の日から10日以内に標本とスライドを使用してください。
2. レーザーマイクロディシス
- 染色の直前に、以下を加えることによってRNaseフリーPBSで10%BSAの抗体ミックス(Ab-Mix)を調製する:FITC-ファロイジンの4 μL、 DAPIの1.5 μL、アレクサフルオール546に直接結合したタム・ホースフォールタンパク質(THP)抗体の2μL、RNase阻害剤の3.3μL、PBS中の10%BSAの89.2 μL(100 μLの体積に達する)。
注:代替抗体はTHP抗体の代わりに使用されてもよい。例えば、2μLのメガリン/LRP2抗体は、アレクサフルオール568に直接結合して、近位細管を標識するために使用することができる。Ab-Mixには、LRP2またはTHP抗体が含まれています(それぞれ、近位細管または太い上昇肢のいずれかを視覚化します)。他の抗体は、ユーザのニーズに応じて検証され得る。 - スライドを氷冷(-20°C)で100%アセトンで1分間洗い、湿度室に移動します。
- RNaseフリーPBSでスライドの上部を30sリピートで洗います。
- RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。
- 5分間、Ab-Mixを塗布します。
- RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。
- スライドを5分間空気乾燥し、レーザーマイクロ解剖切断プラットフォームに積み込みます。
- PCR作業に適した回収チューブ(オートクレーブ0.5 mLマイクロ遠心分離チューブ)を取り付け、RNA分離キットから50 μLの抽出バッファーを含みます。
- LMD を続行します。各 LMD セッションは、2 時間以内に完了します。
- 顕微鏡カメラを使用して、実行されたプロトコルのアーカイブ目的、トレーニング、品質評価の解剖を検証するために、LMD前後の免疫蛍光画像を収集します。0.5 ~ 1 ng の RNA を得るためには、最低 500,000 μm2 領域が必要です。これは、多くの場合、関心のあるすべてのサブセグメントに十分な量の材料を得るために、最大8 x12 μm厚いセクションを使用する必要があります。
- 染色、形態、位置によって関心領域を特定し、40を超えるレーザーパワーを使用してそれらを切除します。
注: 解剖基準は次のとおりです。近位細管はFITC-ファロイジンおよびLRP2標識によって定義される。太い昇順の四肢はTHPラベリングによって定義されます。収集ダクトは核形態(DAPI)および他の染色の欠如によって定義される。糸球体はFITC-ファロイジンおよび形態によって定義される。インタースティジウムは、染色された管状の間の面積として定義される。
- 2つの12μm断面をLMDスライドに貼り付け、その断面全体を抽出バッファに解剖することで、バルク断面式シグネチャを得ます。
- LMDプロセスが完了したら、収集マイクロ遠心チューブを閉じ、それを激しくフリックして、コンテンツがキャップからチューブの底に移動したことを確認します
- 30 sの3,000 x g でチューブを遠心分離します。
- 42°Cの水浴で30分間チューブをインキュベートします。
- 2分間3,000 x g でチューブを遠心分離します。
- 上清を新しい0.5 mLチューブに移し、-80°Cで保管してください。
3. RNAの単離
注: この RNA 絶縁プロトコルでは、市販の RNA 分離キットからプロトコルを適合させました。製造元のプロトコルは、プロジェクトに設定された品質管理要件を満たすように変更されています。
- 各RNA精製カラム(PC)に250μLのコンディショルドバッファー(CB)を加え、室温で5分間インキュベートします。
- 遠心分離機 16,000 x gで 1 分間すべての PC .
- 50 μLの70%エタノール(キットに付属)を組織サンプルでチューブに加えます。上下にピペットを入れ、サンプルをよく混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。遠心分離機を使用しないでください。
- 100 x g で 2 分間調整された PC と遠心分離機に混合物を移し、16,000 x g で 30 s の遠心分離を迅速に行います (流れを除去するため)。特定のサブセグメントに対して組織サンプルを持つチューブが 1 つ以上ある場合は、この手順を繰り返します。
- 100 μL のウォッシュバッファ 1 (WB1) を PC に追加し、遠心分離機を 8,000 x gで 1 分間追加します。
- 各サンプルごとに40 μLのDNaseを用意します(RDDバッファの35 μLに5μLのDNaseを追加します)。その後、PCの膜に直接40μLの混合物を加え、室温で15分間インキュベートします。
- PCの膜にWB1の40 μLを加え、8,000 x gで15 sの遠心分離機を加 えます。
- PCの膜に100 μLのウォッシュバッファ2(WB2)を加え、遠心分離機を8,000 x gで1分間加 えます。
- PCの膜にWB2の100 μLを加えて、16,000 x gで2分間遠心分離し、16,000 x gで1分間の遠心分離の直後に加 えます。
- PCを新しい0.5 mLチューブに移します。
- 膜に溶出バッファー(EB)の12 μLを加え、室温で7分間インキュベートします。したがって、全ての分化された解剖組織サンプルの最終容積は、サブセグメント当たり12μLである。
- 遠心分離 1000 x g で 1 分間、16,000 x gで 2 分間のサンプルを.
- バイオアナライザ分析用に2μLを新しいチューブに移します(凍結融解イベントを防止するため)。
- すべてのチューブを-80 °Cに保管して、さらなる処理の準備が整います。
4. RNAシーケンシング
- 商業用バイオアナライザーと少量のRNA測定専用チップを使用して、シーケンシング用の各サンプルを評価します。
- ライブラリの準備とシーケンスの前に次の品質管理(QC)パラメータが必要です:バルクの場合は4 ngより大きく、各サブセグメントの1 ng以上のRNAの量。200ヌクレオチド(DV200)より長い転写物のパーセントは、LMD標本(最適>75%)に対して25%を超える必要があります。
- 少量の分解されたRNAを対象とした商用cDNAライブラリ調製キットでライブラリの準備を行います。サプリメントに記載されている市販キットの場合、25% の最小 DV200 と断片化を必要としないオプション 2 を使用することをお勧めします。シーケンス テクノロジによっては、30% 7 など、より高い最小 DV200 しきい値が必要になる場合があります。
- cDNAアダプターとインデックスを追加します。
- 磁気ビーズ技術を使用して、RNAseqライブラリを浄化します。
- RNAseqライブラリ増幅工程の前に市販のrRNA除去キットを使用してリボソームcDNAを枯渇させます。
- 2 ng/μL cDNAライブラリ濃度で磁気ビーズ技術を使用して、最終的なRNAseqライブラリを精製します。
- バルク用に 3,000 万読み取り/サンプル、サブセグメントセクションの場合は 1 億読み取り/サンプルを使用して、商業シーケンシング システムで 75 bp ペアエンドの RNA シーケンシングを実行します。
- バッチ効果の制御を可能にするために、シーケンシングの実行ごとにリファレンスRNA(25 μg)を使用してください。リファレンスRNAの初期濃度は1μg/μLで、シーケンシングで使用される最終濃度は25 ng/μLです。
- FastQC アプリケーションを利用してデータ解析を実行し、シーケンシング、遺伝子間およびミトコンドリア読み取りの品質を評価し、遺伝子に起因する読み取りを決定します。
- アライメントには統合ゲノミクスビューア(IGV)を使用し、トランスクリプト発現測定にはedgeR/rbamtoolsを使用します。
- 100,000 読み取りより少ないサンプルを削除します。位数は、ユーザー定義のしきい値で低く発現した遺伝子を除外した後、データセット内の生の読み取りを正規化します。
- 式を、他のすべてのサブセグメントおよび log2 変換の平均に対する対象サブセグメントの比率として定量化します。同じ遺伝子の相対発現は、サブセグメントとサンプル間で比較され得る。しかし、遺伝子とRNA種間の分解の可能性により、2つの異なる遺伝子間の相対的な発現を比較することは理想的ではありません。
- 各ネフロンサブセグメントに固有のメーカーのセットの遺伝子発現を比較するために濃縮分析を行い、参照RNAサンプルはバッチ間で比較されます。R 値が 0.9 を超える平均式の標準偏差の 1 以内のバッチ効果は許容可能と見なされます。バッチ効果スコアを高くする場合は、追加の正規化が必要です。受け入れられたバッチ効果から逸脱した実行には、フラグを設定できます。Q30 は、シーケンス実行ごとに 90%以上にする必要があります。
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Representative Results
サンプル
9つの基準腎切除術(インディアナ大学で得られた3つの標本と腎臓精密医療プロジェクトを通じて得られた6つの標本)からのデータを提示し、腎臓腎球体のセグメントおよび間質領域を分離する急速な蛍光染色法を利用する。このプロセスで利用されたセクションは、死亡した腎臓ドナーまたは影響を受けない腫瘍腎摘出から得られた。これらのサンプルは、連続したセクションから採取したH&E染色で可視化された疾患の病理学的証拠を有していなかった(図1A)。
レーザーマイクロディスセクション品質管理
腎臓の管状サブセグメントの同定は、独自の管状マーカーの抗体染色、ならびに形態および構造的ランドマークによって達成される。 図1B-C は、代表的な腎摘出術からの管状サブセグメントの染色およびマイクロ解剖を示す。これは、DAPI(核)、FITC-ファロイジン(F-アクチン)、および必要に応じて追加の抗体を用いて染色することによって達成される。使用される蛍光染色により、高い信頼度で腎サブセグメントを可視化することが可能になったが、画像構造の空間的位置決めと同様に形態学的特徴によってさらに導かれる(図2)。例えば、糸球体は、非常に特徴的な形態を有するファロイジンおよびDAPI染色によって明らかにされる。同様に、収集ダクトは核形態と他の汚れの欠如を使用して視覚化されます。メガリン/LRP2抗体(アレクサフルオール568に直接結合)は、近位細管を同定するためにここで使用されます。太い上昇肢は、タム・ホースフォールタンパク質(THP)抗体(アレクサ・フルオール546に直接結合)を用いて可視化される。対照的に、インタースティジウムは細管の外膜に沿って切除され、間質細胞および免疫細胞ならびに小さな毛細血管を含む。
サブセグメントあたり0.5〜1 ngの十分なRNAを得るために、我々は500,000 μm2の最小面積を解剖することを目指す。これは、一般的に、すべてのサブセグメントに十分な材料を得るために5〜8個の12μm厚いセクション(スライドあたり1セクション)を必要とします。任意のスライドの解剖は1スライドあたり〜4セグメントを切断することを可能にするRNAの質を維持するために2時間未満で完了する。同じサブセグメントから取得した組織は、下流のシーケンスのために複数のスライドからプールされます。LMD前後の蛍光画像を取得し、付属カメラを使用して対象のサブセグメントの収集を検証します。 図3 は、解剖面積と最小RNA入力の成功率を示しています。この代表的なデータセットでは、最小エリア入力を満たす成功率は >90% でした。ソース組織がCDまたはインタースティジウムの少量を有する場合、8枚のスライドを利用した後、これらのセグメントの解剖面積が500,000 μm2 以下になる可能性があります。追加のスライドは、ユーザーのニーズに応じてカットすることができます。しかし、 図3に示すように、面積が500,000 μm2に近い場合、検出された望ましい遺伝子数は高い成功率(100%)を有する読み取りカウントの成功率は98.6%です(1検体はQC指標を下回りました)。したがって、追加の組織を利用することなく、十分な遺伝子および読み取り数を達成するのに十分な組織があった。
シーケンシング入力品質管理
選択された商業図書館の準備およびシーケンシングプラットホームは、高分解されたRNAの量が少なくても、転写物発現の再現可能な測定を可能にする。最小RNA入力は500pgであり、最小DV200(読み取りの割合は200ヌクレオチドより長い)は25%を超えています。最小の RIN はありません。1サンプルあたり1億読み取りでシーケンシングを行い、低く発現したトランスクリプトを検出するために、利用可能な読み取りを飽和させようとしています。合計読み取りは、ユーザーのニーズに応じて調整できます。
2つの12μmバルク断層断面から十分なRNAを得ることは簡単であるため、バルクシーケンシング用に4ngの最小最小mRNA量を求めています。プロトコルで説明されているように、各サブセグメントは、合計RNAで0.5〜1 ngを必要とします。最適なRNA濃度は、単離後に50 pg/μL以上です。RNA量がこれより少ない場合、遺伝子検出および読み取り数の減少が観察される可能性があります。サンプルの大部分は、検出された遺伝子数が20,000個、100万個の読み取り値が得られます。すべての標本に対して25%を超えるDV200がメーカーに必要です(>75%が最適と考えられています)。RINは測定されますが、レーザーマイクロ解剖のプロセスはRINを減少させ、RNAシーケンシングプラットフォームは断片化されたRNA用に最適化されています。RNAの量および質は、シーケンシングの前にバイオアナライザによって評価されます。急速な染色は、組織が室温および水性条件にさらされる時間を減少させ、それによって可能な範囲でRNAの分解を最小限に抑える。シーケンス入力用の DV200 品質管理メトリックも 図 3にあります。
シーケンス出力品質管理
ダウンストリーム データ処理では、異なるバッチ内のサンプル間の比較を可能にするために、分位法の正規化を使用します。最小遺伝子検出数は10,000、最小読み取り回数は100万個で、分位正規化にサンプルを含めるしきい値として採用されます。低い遺伝子検出または読み取り数を有するサンプルは、分位正規化とその後の比較分析から除外されます。98 個の分割されたサブセグメント サンプルのうち、これらのしきい値を満たさなかったのは 1 つだけです (図 3)。Q30 (99.9% の信頼度でマッピングされた読み取りの割合) は、各シーケンス実験で 93% を超えています (図 4)。
我々は、ヒト参照RNA(25ng)を各シーケンシング実行で配列し、そのような補正が望まれる場合または必要な場合にバッチ効果の補正を可能にする。測定されたバッチ効果は、R値が 0.9 を返す平均式の標準偏差の 1 以内にする必要があります。バッチ効果が高い場合は、そのシーケンス実行に対して追加の正規化が必要です。ここで、バッチ効果は 図4に示した4つのシーケンシング実験において3%を下回っている。したがって、バッチ効果は、典型的には、全てのシーケンシング実行に対する分位正規化で対処され、参照RNAに対して無関係である。参照RNAに基づく補正はまだ実施されていませんが、この情報は利用可能であり、特定の分析の目的に応じて使用できます。
厳格さと再現性
細胞の種類と構造を特定する際に、厳格なデモンストレーションを行うことが重要です。レーザーマイクロディセクショション後、他の区画と比較して、糸球体、PT、TAL、CD、およびインタースティジウムにおける既知のマーカーの濃縮について試験する(表1)。濃縮分析は、事前に決定された期待マーカーの遺伝子発現を比較するために使用されます。遺伝子発現は、他のサブセグメントの平均と比較して、対象となるサブセグメントの発現の対数2 比として伝えられる。この発現メトリックは、個人間変動を低減し、標本間の細胞と区画の種類の比較を容易にするため、ヒトサンプルに選択されました。ただし、生の読み取りと分位法の正規化された読み取りは、代替分析でも比較できます。 フィギュルe5 は、ヒトタンパク質アトラスに示されるこれら5種類の既知のマーカーの免疫ヒストリカル染色の例を示す。
したがって、収集される正しいサブセグメントに自信を与える直交データソースを提示する:1)セグメント/コンパートメントの抗体染色および形態を含むイメージング、および2)既知のマーカーを示す発現出力が対応するサブセグメントで表現される。
各サブセグメントで発現する遺伝子の局所転写分析により、新規かつ低評価のマーカー同定が可能となる。 図6 は、対応するニーフロンサブセグメントの特異的な免疫学的染色を生じたLMD領域転写法を介して同定された各サブセグメントに対する1つのマーカーの例を示す。
再現性を実証し、オペレータの変動の影響を理解するために、腫瘍腎摘出サンプルに関する実験を行った。この標本は、RNAシーケンシング結果の信頼性を高めるために糸球体、PT、TALを再解剖し、現在有用な技術的複製として機能する。数ヶ月離れて、このサンプルは、凍結切断、抗体染色、LMD解剖、RNA抽出、ライブラリの準備、および糸球体、PTおよびTALコンパートメントのRNAシーケンシング(図7)の第2の例を受けた。2 つのバージョン (v1 と v2) が比較されました。糸球体、PT、TALの各コンパートメントは、参照RNAの最小バッチ効果と同様に、r2 値>0.95と高い相関を示しました。
図1:腎組織の代表的な画像。
(A) ヒト参照腎臓組織のH&E染色。(B) ヒト参照腎臓組織の免疫蛍光画像は、LMD前に染色された太い上昇肢セグメントを有し、(C)単一の太い上昇肢構造の解剖直後に行う。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:参照腎サブセグメントの代表的な画像は、特定の免疫蛍光染色法を用いて20倍で可視化する。
(A)糸球体、(B)近位管、(C)太い上昇肢、(D)収集ダクト、(E)間見立て。(*=p < 0.05, **= p < 0.01, ***= p < 0.001 By ANOVA)。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:セグメンタル転写学における品質管理指標
(A) 試験試料の90%より大きい方が、解剖領域入力閾値500,000 μm2を満たした。(B) 1個を除くすべてのサンプルは、少なくとも500 pgの所望のRNA入力を満たし、(C)パイロットサンプルの100%がメーカーの最小DV200閾値25%を満たし、(D)サンプルの100%が検出された最小閾値10,000個の遺伝子を満たしました。(E) 1つを除くすべてのサンプルが、最小読み取り回数100万に達した。予想通り、低解剖領域はRNA濃度の低下、遺伝子数の低下、読み取り数の減少と相関します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: シーケンシング品質管理
(A)参照RNA(非分位正規化)を用いたシーケンシング実行は、全てのランの平均発現と比較される。最小バッチ効果との強い相関があります (すべての R >0.969)。(B) すべての実行で読み取りの 93% を超える割合が高い信頼度 (Q30 または 99.9%)Q30 の値は、レーンごとに複数のレーンを持つ単位で提供されることに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:選択した既知のマーカーを同定するための免疫ヒストケミカル染色の例。
イメージは (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2 に対して描かれています。免疫細胞化学画像は、ヒトタンパク質アトラスから得られます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:関連サブセグメントにおける非伝統的マーカー遺伝子の発現を例示する免疫ヒストケミカル染色の例。
対応する免疫体系化学を伴う転写物には、(A)糸球体におけるSHANK3、近位細管中の(B)ACSM2B、厚い上昇肢のRAP1GAP、および(D)集集管中の(D)L1CAMが含まれる。免疫細胞化学画像は、ヒトタンパク質アトラスから得られます。(*= p < 0.0001 By ANOVA)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:同じサンプルの別々のシーケンスとの2つの異なる解剖間の相関関係。
(A)糸球体、(B)近位尿細管、および(C)ヘンレの厚い上昇ループにおける異なる解剖間で高い相関が認められた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| マーカー | セグメント | 折り畳み変更 | p値 |
| NPHS1 | 糸 球体 | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | プロキシマルチューブレ | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | 太い昇順の四肢 | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | ダクトの収集 | 4.09 | 0.000133 |
| コル6A2 | インタースティジウム | 7.19 | 1.47E-06 |
表1:残りのサブセグメントと比較して、3つの腎切片標本の各サブセグメントの平均値を示す。
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Discussion
LMDベースのトランスクリプトミクスは、組織内の特定の領域に遺伝子発現を固定する有用な技術である。腎臓におけるこの技術とその潜在的な応用の基礎は、前に説明された8.しかしながら、最適化、近代化、蛍光法解解の合理化は、特に下流RNAシーケンシングのための高精度解離を目的とすることは、あまりユビキタスではない。この方法論は組織内に空間的に接地されているため、特に疾患状態において、組織構造における新規または過小評価されたマーカーを明らかにする可能性がある。実際、細胞の多くの一般的なマーカーは疾患によって変化する可能性があるため、空間的文脈のない同一性裁定のために細胞RNA発現マーカーのみに依存することは、疾患状態では困難である可能性がある。したがって、空間的に固定されたLMDアプローチは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングのような他の多くの転写技術を補完し、その遺伝子発現プロファイル9によって主に細胞を定義する地上真理プラットフォームを提供する可能性がある。さらに、LMDが提供する遺伝子発現の深さ(サンプルあたり最大20,000個の遺伝子)は、複数のソースからのデータをクロスリンクし、一定の深さなしでは明らかではない遺伝子発現の変化を説明するもう一つの利点と重要な場所を提供します。組織経済の検討は、凍結ブロックからの合計100μm未満の厚さがLMDデータセット全体に十分である可能性があるという、この技術のもう一つの肯定的な特徴です。これは残ったティッシュが他の分析目的のために使用されることを可能にする。
LMD には制限があります。レーザーマイクロディスセクション転写データ取得の予想限界の1つは、スループットの低下という性質です。将来の自動化は、スケーラビリティ10,11を改善する上で重要である可能性がある。LMDトランスクリプトミクスの2つの追加の制限には、専門知識への依存性と組織品質がデータ結果に及ぼす影響が含まれます。関心のあるセグメント外の細胞および物質の不注意な収集は、単一の細胞ではなく、細胞の濃縮されたコンパートメントが収集されるため、既知の制限である。LMDは、組織構造の理解にユーザーの熟練度に依存しているため、特定の領域の専門知識が必要です。したがって、個人は、抗体染色の有無にかかわらず、腎臓内の関連領域を同定するように訓練されなければならない。最後に、組織の品質の効果は、下流のデータ品質に影響を与える可能性があります。LMDプロトコルは組織劣化につながるので、出発物質の品質が重要です。しかし、このプロトコルは、中程度の品質のいくつかのサンプルをアーカイブした生検で最適化されました。含まれるデータは、選択されたトランスクリプトームプラットフォームが堅牢であることを示しています。
注目すべきは、RNAシーケンシングの使用する分離キットと下流の方法論は、RNA分解の予想される程度に合わせて特別に調整されなければならない。ここで説明した染色プロトコルは、そのような効果を最小限に抑えることに最も好ましい効果を有するため採用された。このプロトコルでは、他のトランスクリプトーム技術間の将来の比較を容易にするために、組織はOCTに埋め込まれた。しかしながら、ホルマリン固定組織は代替のものであるかもしれない。
この原稿に示されたデータは、最適化、品質管理の指標、技術成果を含む地域のトランスクリプトミクスの利点を明らかにします。厳密な前分析および分析的品質管理基準の確立、および厳格さと再現性の確かな証拠の確立は、あらゆる方法論に不可欠です。地域のトランスクリプトミクスの将来の応用は、生物学的応用、技術進歩、および分析の進歩に広く分類することができる。将来の生物学的応用は、傷つけていない、負傷した、および尿細管の再生からの組織の尋問だけでなく、炎症に近い管状を対象とするかもしれない。これらのコンパートメントは、従来の形態学的マーカーと「経路」特異的マーカーの抗体染色の両方によって同じ生検で同定することができる。この技術で使用するために検証された2つの抗体マーカー、メガリンおよびウロモジュリンは、それぞれ近位細管および太い上昇肢において高く発現される。しかし、これらのマーカーは、重度の疾患を有する組織において減少し得る。このような状況では、経路特異的マーカーまたは発現レベルを変化しない新規マーカーの抗体の追加検証は、この問題を克服する可能性があります。
LMDは、他の器官の転写的な尋問に使用する適切な方法である可能性が高い。迅速な染色に働く抗体の選択と最適化が不可欠です。通常の染色プロトコルで働く抗体は、高い親和性抗体を必要とする可能性が高い迅速な染色プロトコルでは必ずしも機能しない場合があります。一次結合抗体は必要なステップを最小限に抑え、利点を提供するかもしれません。しかし、フルオロフォアに対する抗体の結合は結合を変える可能性があり、試験実験はプロトコルにこれらの試薬を組み込む前に行う必要がある。
結論として、蛍光ベースのレーザーマイクロ解剖のパイプラインを記述して、ヒト腎臓の特定の領域および構造を分離し、トランスクリプトミック解析を可能にする。このアプローチは重要な利点を提供し、組織ベースの分子尋問を提供するために他の組織に拡張することができる。地域のトランスクリプトミクスは、発現を理解するための組織病理学的アンカーを提供し、生物学の解釈と健康と病気の署名を支援することによって、他のトランスクリプト技術を補完します。この技術は、腎臓のトランスクリプトームアトラスを構築するためのビジョンの範囲内で自然に適合します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
一般的な: 著者らは、腎臓精密医療プロジェクト(www.kpmp.org)の研究者の優雅な支援とアドバイスに感謝したいと考えています。
資金調達: この作業のサポートは、NIH/NIDDK K08DK107864(M.T.E.)によって提供されました。NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M E., P.C.D.);R01DK099345 (T.A.S.)。この原稿で報告された研究は、国立糖尿病・消化器病研究所と腎臓病研究所(NIDDK)腎臓精密医療プロジェクト(KPMP)(kpMP)(www.kpmp.org)によって、賞番号U2CDK114886の下で支援されました。
データと材料の可用性: データは遺伝子発現オムニバス(GEO #保留中)にアーカイブされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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