Summary
Vi beskriver en protokoll for lasermikrodisseksjon av undersegmenter av den menneskelige nyren, inkludert glomerulus, proksimal tubule, tykk stigende lem, samlekanal og interstitium. RNA blir deretter isolert fra de oppnådde rommene, og RNA-sekvensering utføres for å bestemme endringer i transkripsjonssignaturen i hvert undersegment.
Abstract
Genuttrykksanalyse av menneskelig nyrevev er et viktig verktøy for å forstå homeostase og sykdomsveiofysiologi. Øke oppløsningen og dybden av denne teknologien og utvide den til nivået av celler i vevet er nødvendig. Selv om bruken av enkelt kjernefysisk og enkeltcellede RNA-sekvensering har blitt utbredt, opprettholder uttrykket signaturer av celler hentet fra vevdissosiasjon ikke romlig kontekst. Laser mikrodisseksjon (LMD) basert på spesifikke fluorescerende markører ville tillate isolering av spesifikke strukturer og cellegrupper av interesse med kjent lokalisering, og dermed muliggjør oppkjøpet av romlig forankret transkripsjonsiske signaturer i nyrevev. Vi har optimalisert en LMD-metodikk, styrt av en rask fluorescensbasert flekk, for å isolere fem forskjellige rom i den menneskelige nyren og utføre påfølgende RNA-sekvensering fra verdifulle menneskelige nyrevevsprøver. Vi presenterer også kvalitetskontrollparametere for å muliggjøre vurdering av tilstrekkeligheten av de innsamlede prøvene. Arbeidsflyten som er skissert i dette manuskriptet, viser muligheten for denne tilnærmingen til å isolere subsegmentale transkripsjonsmessige signaturer med høy tillit. Den metodiske tilnærmingen som presenteres her, kan også brukes på andre vevstyper med substitusjon av relevante antistoffmarkører.
Introduction
Teknologiske fremskritt i å studere vevsprøver har forbedret forståelsen av helsetilstanden og sykdommen i ulike organer. Slike fremskritt har understreket at patologi kan starte i begrensede regioner eller i bestemte celletyper, men har viktige implikasjoner på hele orgelet. Derfor, i dagens æra av personlig medisin, er det viktig å forstå biologien på både celle- og regionalnivå og ikke bare globalt1. Dette gjelder spesielt i nyrene, som består av ulike spesialiserte celler og strukturer som differensialt initierer og / eller reagerer på patologisk stress. Patogenesen av ulike typer menneskelig nyresykdom er fortsatt ikke godt forstått. Generere en metodikk for å studere endringer i genuttrykk i spesifikke rørformede segmenter, strukturer eller områder av interstitium i den menneskelige nyre vil forbedre evnen til å avdekke regionen spesifikke endringer som kan informere om patogenesen av sykdommen.
Humane nyrebiopsiprøver er en begrenset og dyrebar ressurs. Derfor bør teknologier som forhører transkripsjonsmikromikk i nyrevev optimaliseres for å isere vev. De tilgjengelige metodene for å studere transkripsjonsmikromer på celle- og regionalnivå inkluderer encellede RNA-sekvensering (scRNaseq), enkelt kjernefysisk RNaseq (snRNaseq), in situ romlig hybridisering og lasermikrodisseksjon (LMD). Sistnevnte er godt egnet for presis isolering av regioner eller strukturer av interesse innenfor vevsseksjoner, for nedstrøms RNA sekvenseringog analyse 2,3,4,5. LMD kan vedtas for å stole på identifisering av bestemte celletyper eller strukturer basert på validerte markører ved hjelp av fluorescensbasert avbildning under disseksjon.
De unike egenskapene til lasermikrodisseksjon assistert regionale transkripsjonsmikromikk inkluderer: 1) bevaring av romlig kontekst av celler og strukturer, som utfyller enkeltcelleteknologier der celler identifiseres ved uttrykk i stedet for histologisk; 2) teknologien informerer og er informert av andre bildeteknologier fordi en antistoffmarkør definerer uttrykkssignaturer; 3) evnen til å identifisere strukturer selv når markører endres i sykdom; 4) påvisning av lavt uttrykte transkripsjoner i ca 20.000 gener; og 5) bemerkelsesverdig vev økonomi. Teknologien er skalerbar til en nyrebiopsi med mindre enn 100 μm tykkelse av en kjerne som er nødvendig for tilstrekkelig RNA-oppkjøp og muliggjør bruk av arkivert frosset vev, som vanligvis er tilgjengelige i store repositorier ellerakademiske sentre 6.
I det påfølgende arbeidet beskriver vi den regionale og bulk transkripsjonsteknologien i detalj, optimalisert med en ny rask fluorescensfargingsprotokoll for bruk med menneskelig nyrevev. Denne tilnærmingen forbedres på klassiske LMD-utforskninger fordi den gir separate uttrykksdata for interstitium- og nephron-delsegmentene i motsetning til aggregert tubulointerstitialuttrykk. Inkludert er kvalitetssikring og kontrolltiltak iverksatt for å sikre rigor og reproduserbarhet. Protokollen muliggjør visualisering av celler og regioner av interesse, noe som resulterer i tilfredsstillende oppkjøp av RNA fra disse isolerte områdene for å tillate nedstrøms RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent for bruk av Institutional Review Board (IRB) ved Indiana University.
MERK: Bruk denne protokollen med nyrenevrbektomivev (opptil 2 cm i både X- og Y-dimensjonene) som er bevart i optimal skjæretemperatur (OCT) og lagret ved -80 °C. Utfør alt arbeid på en måte som begrenser RNA-kontaminering, bruk rene engangshansker og en ansiktsmaske. Sørg for rensligheten til alle overflater. Utstyret som denne protokollen ble optimalisert for er et lasermikrodisseksjonssystem med pulserende UV-laser.
1. Kryoseksjon
- Utsett 1,2 μm LMD PPS-membran (poly(p-fenylensulfid) glir til UV-lys (i en vevskultur laminær strømningshette) i 30 minutter, umiddelbart før kryoseksjon. Oppbevar lysbildene ved romtemperatur for optimal vevsetterlevelse.
- Avkjøl kryostaten til -20 °C. Rengjør arbeidsflatene og monter et nytt skjæreblad.
- Plasser en liten skyveboks (rengjøres med RNase overflatedekontamineringsløsning) inne i kryostatkammeret for å lagre lysbilder med nykuttet vev.
- Fest prøven i OCT til en vevsholder og la den likevekte i noen minutter for å nå kammertemperaturen og styrke vedheftet mellom OCT-blokken og holderen. Hjelp prosessen ved hjelp av en varmeavtrekker.
- Klipp prøven til en tykkelse på 12 μm og fest den til det spesialiserte LMD-lysbildet ved hjelp av lysbildeadapteren. Hvert lysbilde holder en nephrectomy seksjon per lysbilde eller opptil to nyre biopsi seksjoner per lysbilde. Oppbevar lysbildene ved -80 °C med en tørkemiddelpatron og inne i en tett lukket plastpose for å hindre at overflødig fuktighet samler seg inne i glideboksen.
- Merk hvert lysbilde med en prøve-ID, dato og lysbildenummer.
- Bruk lysbildene med prøver innen 10 dager fra den første datoen for kryoseksjon.
2. Laser mikrodisseksjon
- Umiddelbart før fargingen, klargjør antistoffblandingen (Ab-Mix) i 10 % BSA i RNase-fri PBS ved å legge til følgende: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antistoff direkte konjugert til Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitor og 89,2 μL på 10% BSA i PBS (for å nå et volum på 100 μL).
MERK: Alternative antistoffer kan brukes i stedet for THP-antistoffet. For eksempel kan 2 μL megalin/LRP2-antistoff, direkte konjugert til Alexa Fluor 568, brukes til å merke den proksimale tubulien. Ab-Mix inneholder enten LRP2 eller THP antistoff (for å visualisere enten proksimale tubuli eller tykke stigende lemmer, henholdsvis). Andre antistoffer kan valideres i henhold til brukerens behov. - Vask lysbildet i iskaldt (-20 °C) 100% aceton i 1 min og flytt den til fuktighetskammeret.
- Vask toppen av lysbildet med RNase-fri PBS i 30 s. Gjenta.
- Vask toppen av lysbildet med 10% BSA i RNase-fri PBS for 30 s. Gjenta.
- Påfør Ab-Mix i 5 min.
- Vask toppen av lysbildet med 10% BSA i RNase-fri PBS for 30 s. Gjenta.
- Lufttørking av lysbildet i 5 minutter og legg den på lasermikrodisseksjonskutteplattformen.
- Monter oppsamlingsrørene (autoklavert 0,5 ml mikrocentrifugerør) som passer for PCR-arbeid, som inneholder 50 μL ekstraksjonsbuffer fra RNA-isolasjonssettet.
- Fortsett med LMD. Fullfør hver LMD-økt i løpet av de fleste 2 timer.
- Samle pre- og post-LMD immunofluorescence bilder, ved hjelp av mikroskopet kameraet for å validere disseksjon for inter-operatør variabilitet samt arkivformål, opplæring og kvalitetsvurdering av den utførte protokollen. For å få 0,5 – 1 ng av RNA, er det nødvendig med minst 500 000 μm2-området. Dette krever ofte bruk av opptil 8 x12 μm tykke seksjoner for å oppnå tilstrekkelig mengde materiale for alle delsegmenter av interesse.
- Identifisere områder av interesse ved farging, morfologi og plassering og avgiftsdirektoratet dem ved hjelp av laserkraft større enn 40.
MERK: Her er disseksjonskriteriene. Den proksimale tubulien er definert av FITC-Phalloidin og LRP2-merking. Den tykke stigende lemmen er definert av THP-merking. Innsamlingskanalen er definert av kjernefysisk morfologi (DAPI) og fravær av andre flekker. Glomerulus er definert av FITC-Phalloidin og morfologi. Interstitium er definert som området mellom beisede tubuli.
- Få en massesignal uttrykkssignatur ved å feste to 12 μm-seksjoner til et LMD-lysbilde og dissekere hele delene til ekstraksjonsbuffer.
- Når LMD-prosessen er fullført, lukker du innsamlingsrørene og knipser det kraftig for å sikre at innholdet flyttes fra hetten til bunnen av røret
- Sentrifuger rørene ved 3000 x g i 30 s.
- Inkuber rørene i 42 °C vannbad i 30 min.
- Sentrifuger rørene på 3000 x g i 2 min.
- Overfør det overnaturlige til et nytt 0,5 ml rør og oppbevar det i -80 °C.
3. RNA isolasjon
MERK: For denne RNA-isolasjonsprotokollen har vi tilpasset en protokoll fra et kommersielt RNA-isolasjonssett. Produsentens protokoll er endret for å oppfylle kvalitetskontrollkravene som er angitt for prosjektet.
- Tilsett 250 μL betinget buffer (CB) i hver RNA-rensekolonne (PC) og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuge alle PCer for 1 min ved 16.000 x g.
- Tilsett 50 μL 70 % etanol (gitt i settet) i rørene med vevsprøver. Bland prøvene godt ved å pipetter opp og ned. Ikke vortex. Ikke sentrifuge.
- Overfør blandingen til bes condition-PCer og sentrifuge i 2 min ved 100 x g (for å binde RNA), følg raskt med sentrifugering i 30 s ved 16 000 x g (for å fjerne strømningen). Gjenta dette trinnet hvis mer enn 1 rør med vevsprøver er tilgjengelige for et gitt undersegment.
- Legg til 100 μL vaskebuffer 1 (WB1) i PCene og sentrifugen i 1 minutt ved 8000 x g.
- Forbered 40 μL DNase per hver prøve (Tilsett 5 μL DNase til 35 μL RDD-buffer). Tilsett deretter 40 μL av blandingen direkte på membranen på PCen og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Tilsett 40 μL WB1 på membranen på PC, og sentrifuge for 15 s ved 8000 x g.
- Tilsett 100 μL vaskebuffer 2 (WB2) på membranen på PC,og sentrifuge i 1 min ved 8000 x g.
- Tilsett 100 μL WB2 på membranen av PC, sentrifuge i 2 min ved 16.000 x g, umiddelbart følg av sentrifugering i 1 min ved 16.000 x g.
- Overfør PC-en til et nytt 0,5 ml rør.
- Tilsett 12 μL Elution Buffer (EB) på membranen og inkuber i 7 min ved romtemperatur. Dermed er det endelige volumet av alle samlede dissekerte vevsprøver 12 μL per undersegment.
- Sentrifuge prøvene i 1 min ved 1000 x g og deretter i 2 min ved 16.000 x g.
- Overfør 2 μL til et friskt rør for Bioanalyzer-analyse (for å forhindre fryse-tine hendelser).
- Oppbevar alle rørene i -80 °C til de er klare til videre behandling.
4. RNA sekvensering
- Vurder hver prøve, beregnet for sekvensering, for kvalitet ved hjelp av en kommersiell Bioanalyzer og en chip dedikert til å måle små mengder RNA.
- Følgende kvalitetskontrollparametere (QC) før bibliotekforberedelse og sekvensering er nødvendig: Antall RNA større enn 4 ng for bulk og større enn 0,5 - 1 ng for hvert delsegment; Prosentandelen av transkripsjoner som er lengre enn 200 nukleotider (DV200) er nødvendig for å være større enn 25 % for LMD-prøver (optimal > 75 %).
- Utfør bibliotekforberedelser med et kommersielt preparatsett for cDNA-bibliotek beregnet på små mengder degradert RNA. For det kommersielle settet som er oppført i tillegget, foreslår vi at du bruker alternativ 2, som krever et minimum DV200 på 25% og ingen fragmentering. Noen sekvenseringsteknologier kan kreve høyere minimum DV200 terskler, for eksempel 30%7.
- Legg til cDNA-adaptere og indekser.
- Rens RNAseq-bibliotekene ved hjelp av magnetisk perleteknologi.
- Tøm ribosomal cDNA ved hjelp av et kommersielt rRNA-fjerningssett før RNAseq bibliotekforsterkningstrinn.
- Rens det endelige RNAseq-biblioteket ved hjelp av magnetisk perleteknologi ved en 2 ng / μL cDNA bibliotekkonsentrasjon.
- Utfør RNA-sekvensering av 75 bp paret ende på et kommersielt sekvenseringssystem med 30 millioner lesing / prøve for bulk og 100 millioner lesing / prøve for undersegmentale seksjoner.
- Bruk en referanseRNA (25 μg) med hver sekvenseringskjøring for å tillate kontroll av batcheffekt. Den første konsentrasjonen av vår referanseRNA er 1 μg/ μL, mens den endelige konsentrasjonen som benyttes i sekvensering er 25 ng / μL. Kjør referanseRNA som en separat prøve under bibliotekforberedelse og kjør med alle LMD-prøver hver gang.
- Utfør dataanalyse ved hjelp av FastQC-applikasjonen for å vurdere kvaliteten på sekvensering, intergene og mitokondrielesninger og for å bestemme leser tilskrevet et gen.
- Bruk Integrative Genomics Viewer (IGV) for justering og edgeR/rbamtools for transkripsjonsuttrykksmål.
- Fjern prøver med mindre enn 100 000 leser. Quantile normaliserer rå leser i datasettet etter filtrering ut lavt uttrykte gener på en brukerdefinert terskel.
- Kvantifisere uttrykket som et forhold mellom undersegmentet av interesse til gjennomsnittet av alle andre undersegmenter og log2-transformering. Relativ uttrykk for samme gen kan sammenlignes på tvers av undersegmenter og prøver; Det er imidlertid ikke ideelt å sammenligne relativ uttrykk mellom to forskjellige gener på grunn av potensielle forskjeller i nedbrytning på tvers av gener og RNA-arter.
- Utfør en berikelsesanalyse for å sammenligne genuttrykk for et sett beslutningstakere som er spesifikke for hvert nefhron-delsegment, mens Reference RNA-prøver sammenlignes på tvers av grupper. En satsvis effekt innenfor 1 standardavvik for gjennomsnittsuttrykk med R-verdi > 0,9 anses som akseptabelt. Ytterligere normalisering er nødvendig for en høyere batch effekt score. Alle kjøringer som avviker fra den godkjente satsvise effekten, kan flagges. Q30 bør være større enn > 90% for hver sekvenseringskjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøver
Vi presenterer data fra ni referanse nephrectomies (3 prøver innhentet ved Indiana University og 6 prøver innhentet gjennom Nyre Precision Medicine Project), ved hjelp av rask fluorescens farging protokollen for å isolere nyre nephron segmenter og interstitielle områder. Seksjonene som benyttes i denne prosessen ble hentet fra avdøde nyredonorer eller upåvirket tumornephhrectomies. Disse prøvene hadde ikke patologiske tegn på sykdom som visualisert i H&E-flekken tatt fra sammenhengende seksjoner (figur 1A).
Laser mikrodisseksjon kvalitetskontroll
Identifisering av rørformede undersegmenter i nyrene oppnås gjennom antistofffarging av unike rørformede markører, samt morfologi og strukturelle landemerker. Figur 1B-C illustrerer farging og mikrodisseksjon av rørformede undersegmenter fra en representativ nefkultomi. Dette oppnås ved farging med DAPI (kjerner), FITC-Phalloidin (F-actin) og et ekstra antistoff etter behov. Fluorescensfargingen som ble brukt gjorde det mulig å visualisere nyreundersegmenter med høy grad av tillit, ytterligere styrt av morfologiske egenskaper samt romlig posisjonering av de avbildede strukturene (figur 2). For eksempel avsløres glomeruli av falloidin og DAPI-farging med svært særegen morfologi. På samme måte visualiseres innsamlingskanaler ved hjelp av kjernefysisk morfologi og fraværet av andre flekker. Megalin/LRP2-antistoffet (direkte konjugert til Alexa Fluor 568) brukes her til å identifisere proksimale tubuli. Den tykke stigende lemmen visualiseres ved hjelp av et Tamm-Horsfall-protein (THP) antistoff (direkte konjugert til Alexa Fluor 546). I motsetning blir interstitium skåret langs den ytre membranen i tubuli og inkluderer stromale og immunceller samt små kapillærer.
For å oppnå tilstrekkelig RNA på 0,5 – 1 ng per undersegment, søker vi å dissekere et minimumsområde på 500 000 μm2. Dette krever vanligvis fem til åtte 12 μm tykke seksjoner (1 seksjon per lysbilde) for å oppnå tilstrekkelig materiale for alle undersegmenter. Disseksjon av et hvert lysbilde er fullført på mindre enn 2 timer for å bevare RNA-kvalitet som gjør det mulig å kutte ~ 4 segmenter per lysbilde. Ervervet vev fra samme undersegment er samlet fra flere lysbilder for nedstrøms sekvensering. Et pre- og post-LMD immunofluorescence bilde er oppnådd for å validere samlingen av undersegmenter av interesse ved hjelp av et vedlagt kamera. Figur 3 avgrenser suksessratene for disseksjonsområdet og minimum RNA-inngang. Suksessraten for å møte minimumsområdeinndataene var > 90% i dette representative datasettet. Hvis kildevevet har en liten mengde CD eller interstitium, er det en mulighet for at disseksjonsområdet vil være under 500.000 μm2 for disse segmentene etter bruk av 8 lysbilder. Flere lysbilder kan kuttes avhengig av brukerens behov. Men, som vist i figur 3, hvis området er nær 500.000 μm2, har de ønskede genene som oppdages telle en høy suksessrate (100%) og den totale suksessraten for lesetelling er 98,6 % (1 prøve falt under QC-målingen). Dermed var det nok vev til å oppnå tilstrekkelig gen og lese teller uten å utnytte ekstra vev.
Sekvensering av kvalitetskontroll for inngang
Den valgte kommersielle bibliotekforberedelses- og sekvenseringsplattformen muliggjør reproduserbare målinger av transkripsjonsuttrykk, selv med lave mengder svært degradert RNA. Minimum RNA-inngang er 500 pg og minimum DV200 (andel av leser lengre enn 200 nukleotider i lengde) er over 25%. Det er ingen minimum RIN. Sekvensering med 100 millioner leser per prøve, søker vi å mette de tilgjengelige lesingene for å oppdage lavt uttrykte transkripsjoner. De totale leser kan justeres i henhold til brukerens behov.
Det er enkelt å få tilstrekkelig RNA fra to 12 μm bulk tverrsnittsseksjoner, så vi søker å oppnå et høyere minimum totalt mRNA-antall på 4 ng for bulksekvensering. Som avgrenset i protokollen, krever hvert undersegment 0,5-1 ng totalt RNA. Den optimale RNA-konsentrasjonen er over 50 pg/μL etter isolasjon. RNA-beløp lavere enn dette kan føre til redusert gendeteksjon og lesetall observert. Flertallet av prøvene gir > 20.000 gener oppdaget og > 1 million leser. En DV200 større enn 25% for alle prøver er nødvendig av produsenten (> 75% anses optimal). Selv om RIN måles, reduserer prosessen med lasermikrodisseksjon RIN og RNA-sekvenseringsplattformene er optimalisert for fragmentert RNA. RNA-kvantitet og kvalitet vurderes av en bioanalyzer før sekvensering. Den raske flekken reduserer tiden vevet utsettes for romtemperatur og vandige forhold, og minimerer dermed i den grad det er mulig, nedbrytning av RNA. DV200-kvalitetskontrollberegningen for sekvensering av inndata finnes også i figur 3.
Sekvensering av utgangskvalitetskontroll
Nedstrøms databehandling bruker quantile normalisering for å tillate sammenligning mellom prøver i forskjellige partier. Et minimum gendeteksjon på 10.000 og et minimum leseantall på 1 million er ansatt som terskler for å inkludere prøver i quantile normalisering. Prøver med lavere gendeteksjon eller lesetall er utelukket fra quantile normalisering og påfølgende komparative analyser. Bare 1 av 98 dissekerte undersegmentale prøver klarte ikke å oppfylle disse terskler (figur 3). Q30 (andel av lesinger kartlagt med en 99,9% tillit) har vært større enn 93% for hvert sekvensering eksperiment (figur 4).
Vi sekvenserer en menneskelig referanse RNA (25 ng) med hver sekvenseringskjøring for å tillate korreksjon for batch effekt hvis en slik korreksjon er ønsket eller nødvendig. Den målte partieffekten skal være innenfor 1 standardavvik for gjennomsnittsuttrykk med en R-verdi > 0,9. Hvis batcheffekten er høyere, kreves ytterligere normalisering for den sekvenseringskjøringen. Her har batcheffekten vært under 3% i de fire sekvenseringseksperimentene avbildet i figur 4. Dermed er batch effekt vanligvis adressert med quantile normalisering for alle sekvensering kjører, agnostisk til referansen RNA. Ingen korreksjon basert på referansen RNA er implementert ennå, men denne informasjonen er tilgjengelig og kan brukes avhengig av målene for en bestemt analyse.
Rigor og reproduserbarhet
Det er viktig å demonstrere strenghet i å identifisere celletyper og strukturer. Etter lasermikrodisseksjon tester vi for berikelse av kjente markører i glomeruli, PT, TAL, CD og interstitium sammenlignet med de andre rommene (tabell 1). En berikelsesanalyse brukes til å sammenligne genuttrykk for forhåndsbestemte forventede markører. Genuttrykk formidles somlogg 2-forhold for uttrykket for delsegmentet av interesse sammenlignet med gjennomsnittet for de andre undersegmentene. Denne uttrykksberegningen ble valgt for menneskelige prøver, da det reduserer inter-individuell variasjon, noe som letter sammenligninger mellom celle- og romtyper på tvers av prøver. De rå lesingene og quantile normaliserte leserne kan imidlertid også sammenlignes i alternative analyser. Figure 5 illustrerer eksempler på immunohistokjemisk farging av disse 5 utvalgte kjente markører, som presentert i Human Protein Atlas.
Dermed presenterer vi ortogonale datakilder som gir tillit til riktig undersegment som samles inn: 1) avbildningen som inkluderer antistoffflekken og morfologien til segmentet / rommet, og 2) uttrykksutgangen som viser kjente markører uttrykkes i det tilsvarende undersegmentet.
Den regionale transkripsjonsanalysen av gener uttrykt i hvert undersegment gir mulighet for ny og undervurdert markøridentifikasjon. Figur 6 illustrerer et eksempel på én markør for hvert undersegment identifisert gjennom LMD regionale transkripsjonsmikromikk som også ga en bestemt immunohistokjemisk farging av tilsvarende nephron-undersegmentet.
For å demonstrere reproduserbarhet og forstå effekten av operatørvariabilitet, gjennomførte vi et eksperiment på en tumornephhrectomy-prøve. Denne prøven hadde glomeruli, PT og TAL re-dissekert for å øke tilliten til RNA sekvenseringsresultater og fungerer nå som en nyttig teknisk replikering. Måneder fra hverandre gjennomgikk denne prøven en andre forekomst av kryoseksjon, antistofffarging, LMD-spredning, RNA-ekstraksjon, bibliotekprep og RNA-sekvensering (figur 7) av glomeruli-, PT- og TAL-rommene. De to versjonene (v1 og v2) ble sammenlignet. De glomerulære, PT- og TAL-rommene var svært korrelert med r2-verdier > 0,95, lik den minimale batcheffekten av vår referanseRNA.
Figur 1: Representative bilder av nyrevevet.
(A) H & E flekk av en menneskelig referanse nyrevev. (B)Immunofluorescent bilde av menneskelig referanse nyrevev med farget tykk stigende lem segmenter før LMD og (C) umiddelbart etter disseksjon av enkelt tykk stigende lem struktur. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av referansenytal undersegmenter, visualisert ved 20x ved hjelp av en bestemt immunofluorescerende farging tilnærming.
(A) en Glomerulus, (B) Proksimal Tubule, (C) Tykk stigende lem, (D) Oppsamlingskanal, (E) Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 av ANOVA). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvalitetskontrollberegninger i segmental transkripsjonsmikromikk.
(A) Større enn 90% av pilotprøvene oppfylte disseksjonsområdet inngangsterskelen på 500.000 μm2. (B)Alle prøver unntatt en oppfylt ønsket RNA-inngang på minst 500 pg. (C) 100% av pilotprøvene oppfylte produsentens minimum DV200 terskel på 25% og (D) 100% av prøvene oppfylte vår minimumsterskel på 10.000 gener oppdaget. (E) Alle prøver unntatt en nådde et minimum totalt leseantall på 1 million. Som forventet korrelerer lavere disseksjonsområder med reduserte RNA-konsentrasjoner, lavere gentelling og lavere lestall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sekvensering av kvalitetskontroll.
(A)Sekvensering kjører ansette en referanse RNA (ikke quantile normalisert) sammenlignes med gjennomsnittlig uttrykk for alle løp. Det er sterk korrelasjon med minimum batcheffekt (alle R > 0,969). (B)Større enn 93% av våre løyper ble kartlagt med høy tillit (Q30 eller 99,9%). Vær oppmerksom på at Q30-verdier gis per kjørefelt med flere baner per kjøring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på immunohistokjemisk farging for å identifisere de valgte kjente markørene.
Bilder er avbildet for (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Immunohistochemistry bilder er hentet fra Human Protein Atlas. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på immunohistokjemisk farging for å illustrere uttrykk for utradisjonelle markørgener i relevante undersegmenter.
Avbildet transkripsjoner med tilsvarende immunohistochemistry inkluderer (A) SHANK3 i glomerulus, (B) ACSM2B i proksimal tubule, (C) RAP1GAP i den tykke stigende lem, og (D) L1CAM i oppsamlingskanalen. Immunohistochemistry bilder er hentet fra Human Protein Atlas. (*= p < 0,0001 av ANOVA) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Korrelasjon mellom to forskjellige disseksjoner med separat sekvensering av samme prøve.
En høy grad av korrelasjon ble observert mellom ulike disseksjoner i (A) glomerulus, (B) proksimal tubule, og (C) tykk stigende sløyfe av Henle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Markør | Segmentet | Fold endring | p-Verdi |
| NPHS1 (andre personer) | Glomerulus | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Proksimal tubule | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Tykk stigende lem | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 Inn | Samle kanal | 4.09 | 0.000133 |
| KOL6A2 | Interstitium (interstitium) | 7.19 | 1.47E-06 |
Tabell 1: Representative gjennomsnittsverdier for hvert delsegment av interesse blant tre nefkultomiprøver, sammenlignet med de gjenværende undersegmentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD-baserte transkripsjonsmikromer er en nyttig teknologi som forankrer genuttrykk til bestemte områder i vevet. Grunnlaget for denne teknologien og dens potensielle anvendelse i nyrene har blitt beskrevet tidligere8. Optimalisering, modernisering og effektivisering av fluorescensbasert disseksjon spesielt rettet mot høy nøyaktighetsspisse for nedstrøms RNA-sekvensering er imidlertid mindre allestedsnærværende. Fordi denne metodikken er romlig jordet i vevet, har den potensial til å avsløre roman eller undervurderte markører i vevsstrukturer, spesielt i sykdomsstater. Faktisk kan mange vanlige markører av celler endres med sykdom, og dermed stole bare på cellen RNA uttrykk markører for identitet bedømmelse uten romlig kontekst kan være utfordrende i sykdomstilstander. Derfor vil den romlig forankrede LMD-tilnærmingen sannsynligvis utfylle og gi en grunnsannhetsplattform for mange andre transkripsjonsteknologier som enkeltcelle og enkelt kjernefysisk RNA-sekvensering, som definerer celler hovedsakelig av deres genuttrykksprofil9. Videre gir dybden av genuttrykk fra LMD (opptil 20.000 gener per prøve) en annen fordel og viktig arena for å kryss-koble data fra flere kilder og ta høyde for endringer i genuttrykk som kanskje ikke er tydelig uten en viss dybde. Vurderingen av vevsøkonomi er et annet positivt trekk ved denne teknologien, der en tykkelse på mindre enn 100 μm totalt fra en frossen blokk kan være tilstrekkelig for et helt LMD-datasett. Dette gjør at restvev kan brukes til andre analytiske formål.
LMD har begrensninger. En forventet begrensning av laser mikrodisseksjon transkripsjonomisk datainnsamling er dens lavere gjennomstrømning natur. Fremtidig automatisering kan være viktig for å forbedreskalerbarhet 10,11. To ytterligere begrensninger av LMD transkripsjonsmikromikk inkluderer avhengighet av ekspertise og virkningen av vevskvalitet på dataresultater. Utilsiktet samling av celler og materiale utenfor interessesegmentet er en kjent begrensning fordi berikede avdelinger av celler samles inn, ikke en enkelt celle. LMD er avhengig av en brukers ferdigheter i å forstå vevsstrukturen og krever derfor en viss domenekompetanse. Dermed må enkeltpersoner trenes til å identifisere relevante regioner i nyrene med og uten antistofffarging. Endelig, effekten av vev kvalitet kan påvirke nedstrøms datakvalitet. LMD-protokollen fører til vevsnedbrytning, så kvaliteten på startmaterialet er viktig. Denne protokollen ble imidlertid optimalisert på arkiverte biopsier med flere prøver av bare moderat kvalitet. Dataene som er inkludert viser at den valgte transkripsjonsplattformen er robust.
I skrivendeliseringssettet som brukes og nedstrøms metodikken til RNA-sekvensering, må skreddersys spesielt for den forventede graden av RNA-nedbrytning. Fargeprotokollen beskrevet her ble vedtatt fordi den hadde den mest gunstige effekten på å minimere en slik effekt. I denne protokollen ble vev innebygd i OCT for å lette fremtidige sammenligninger på tvers av andre transkripsjonsteknologier. Formalin fast vev kan imidlertid være et alternativ.
Dataene som presenteres i dette manuskriptet avslører fordelene med regionale transkripsjonsmikromer, inkludert optimalisering, kvalitetskontrollberegninger og teknologiresultater. Etableringen av strenge pre-analytiske og analytiske kvalitetskontrollkriterier, og også etablering av solide bevis på rigor og reproduserbarhet er avgjørende for enhver metodikk. Fremtidige anvendelser av regionale transkripsjonsmikromer kan i stor grad grupperes i biologiske applikasjoner, tekniske fremskritt og analytisk fremgang. Fremtidige biologiske anvendelser kan være rettet mot avhør av vev fra uskadet, skadet og regenererende tubuli, samt tubuli i nærheten av betennelse. Disse rommene kan identifiseres i samme biopsi både av tradisjonelle morfologiske markører samt antistoffflekker for "pathway" spesifikke markører. De to antistoffmarkørene som er validert for bruk i denne teknologien, megalin og uromodulin, uttrykkes høyt i henholdsvis proksimal tubule og tykt stigende lem. Det er imidlertid mulig at disse markørene kan reduseres i alvorlig sykt vev. I slike situasjoner kan ytterligere antistoffvalidering av banespesifikke markører eller nye markører som ikke endrer uttrykksnivået, overvinne dette problemet.
LMD vil sannsynligvis være en passende metode for bruk i transkripsjonsavhør av andre organer. Valg og optimalisering av antistoffer som fungerer for rask farging vil være avgjørende. Et antistoff som fungerer i en vanlig fargeprotokoll, fungerer kanskje ikke nødvendigvis for den raske fargingsprotokollen, noe som sannsynligvis krever høy affinitetsantistoff. Et primært konjugert antistoff vil minimere trinnene som trengs og kan gi fordeler. Imidlertid kan bøyning av et antistoff mot fluoroforer endre bindingen, og piloteksperimenter må utføres før inkorporering av disse reagensene i protokollen.
Til slutt beskriver vi en rørledning for fluorescensbasert lasermikrodisseksjon for å isolere bestemte områder og strukturer i den menneskelige nyren for å muliggjøre en transkripsjonsanalyse. Denne tilnærmingen gir viktige fordeler og kan utvides til andre vev for å gi et vev basert molekylært avhør. Regionale transkripsjonsmikromikk utfyller andre transkripsjonsteknologier ved å gi et histopologisk anker for å forstå uttrykk, bistå i tolkningen av biologien og signaturen til helse og sykdom. Denne teknologien passer naturlig inn i visjonen for å bygge et transkripsjonsmikromisk atlas av nyrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Generelt: Forfatterne vil gjerne takke etterforskerne av Nyre Precision Medicine Project (www.kpmp.org) for deres nådige støtte og råd.
Finansiering: Støtte for dette arbeidet ble levert av NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning rapportert i dette manuskriptet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under prisnummer U2CDK114886.
Tilgjengelighet av data og materialer: Data er arkivert i Gene Expression Omnibus (GEO # venter)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
