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Biology

应用激光微分射发现人体肾脏组织中的区域转录学

doi: 10.3791/61371 Published: June 9, 2020

Summary

我们描述了人类肾脏的子段的激光微分射方案,包括球状、近肌管、厚升肢、收集管道和间质。然后从获得的隔间中分离RNA,进行RNA测序,以确定每个子段内转录签名的变化。

Abstract

人体肾脏组织的基因表达分析是了解平衡和疾病病理生理学的重要工具。需要提高这项技术的分辨率和深度,并将其扩展到组织内的细胞水平。虽然单核和单细胞RNA测序的使用已变得普遍,但从组织分离中获得的细胞的表达特征并不维持空间背景。基于特定荧光标记的激光微散射 (LMD) 将允许在已知本地化下分离特定结构和感兴趣的细胞组,从而能够在肾脏组织中获取空间锚定转录特征。我们优化了LMD方法,以快速荧光染色为指导,分离出人类肾脏内的五个不同的隔间,并从有价值的人类肾脏组织标本进行后续RNA测序。我们还提供质量控制参数,以便评估所收集标本的充分性。本手稿中概述的工作流程显示了这种方法的可行性,即高度自信地分离子段转录签名。此处介绍的方法也可用于替代相关抗体标记的其他组织类型。

Introduction

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研究组织标本的技术进步增进了对各种器官健康状况和疾病状况的了解。这些进展突出表明,病理学可以在有限的区域或特定的细胞类型开始,但对整个器官有重要影响。因此,在当今的个性化医学时代,了解细胞和区域层面的生物学非常重要,而不仅是全球的生物学。这在肾脏中尤为明显,它由各种专门的细胞和结构组成,这些细胞和结构对病理应激有微分的启动和/或反应。各类人类肾脏疾病的发病机理仍不为人所知。生成一种方法来研究人类肾脏间质的特定管状部分、结构或区域的基因表达变化,将增强发现区域特定变化的能力,这些变化可能告知疾病的发病机制。

人类肾脏活检标本是一种有限而宝贵的资源。因此,应优化肾组织转录经济学的技术,以节约组织。在细胞和区域一级研究转录学的现有方法包括单细胞RNA测序(scRNaseq)、单核RNAseq(snRNaseq)、原位空间杂交和激光微分(LMD)。后者非常适合精确隔离组织部位内感兴趣的区域或结构,用于下游RNA测序和分析2、3、4、5。LMD 可在解剖过程中使用荧光成像,依靠基于验证标记的特定细胞类型或结构进行识别。

激光微分解剖辅助区域转录学的独特特征包括:1) 保存细胞和结构的空间背景,补充单细胞技术,即通过表达而不是组织学识别细胞:2) 该技术因抗体标记定义表达特征而通知并受到其他成像技术的通知:3) 即使在疾病标记发生变化时识别结构的能力:4) 在大约20,000个基因中检测低表达的记录:和5)显着的组织经济性。该技术可扩展至肾脏活检,其核心厚度小于 100μm,是获取足够的RNA所必需的,并且能够使用存档的冷冻组织,这些组织通常可在大型存储库或学术中心6.

在随后的工作中,我们详细描述了区域和批量转录经济学技术,并优化了一种新的快速荧光染色方案,用于人体肾脏组织。这种方法改进了经典的LMD探索,因为它为间质和肾上分段提供了单独的表达数据,而不是聚合的管间表达。其中包括为确保严格性和可重复性而实施的质量保证和控制措施。该协议使细胞和感兴趣的区域可视化,从而从这些孤立区域令人满意地获取RNA,从而允许下游RNA测序。

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Protocol

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这项研究被印第安纳大学机构审查委员会(IRB)批准使用。

注:使用此协议与肾脏肾切除组织(高达2厘米的X和Y尺寸)保存在最佳切割温度(OCT)化合物,并存储在-80°C。 以限制RNA污染的方式执行所有工作,使用干净的一次性手套和面罩。确保所有表面的清洁。优化此协议的设备是具有脉冲紫外激光的激光微发射系统。

1. 冷冻剖射

  1. 在低温之前,将 1.2 μm LMD PPS-膜(聚(苯乙烯硫化物)滑入紫外线(在组织培养层流罩中)30 分钟。将幻灯片存储在室温下,以获得最佳的组织粘性。
  2. 将低温静电冷却至-20°C。 清洁工作表面并安装新的切割刀片。
  3. 将一个小滑动盒(用 RNase 表面净化溶液清洗)放在冷冻机房内,用新鲜切割的组织存储幻灯片。
  4. 将 OCT 中的标本粘附在组织支架上,并允许其平衡几分钟,以达到室温,并加强 OCT 块与持有人之间的粘附。使用热提取器帮助该过程。
  5. 将标本切成 12μm 的厚度,并使用滑动适配器将其贴在专用 LMD 幻灯片上。每张幻灯片每张幻灯片可容纳一个肾切除部分,或每张幻灯片最多可容纳两个肾脏活检部分。将滑梯存放在 -80 °C 下,并配有干燥盒,并存放在紧闭的塑料袋内,以防止滑动盒内积聚多余的水分。
  6. 用标本 ID、日期和幻灯片编号标记每个幻灯片。
  7. 在冷冻分离初始日期的 10 天内将幻灯片与标本一起使用。

2. 激光微分

  1. 染色前立即在无 RNase PBS 中准备 10% BSA 中的抗体混合 (Ab-Mix),添加以下信息:FITC-Phalloidin 的 4μL, 1.5 μL 的 DAPI、2 μL 的 Tamm-Horsfall 蛋白 (THP) 抗体直接与亚历克萨氟 546、3.3 μL 的 Rnase 抑制剂和 89.2 μL 的 10% BSA 在 PBS 中(达到 100μL 的体积)。
    注:替代抗体可用于代替THP抗体。例如,2 μL 的兆林/LRP2 抗体,直接与 Alexa Fluor 568 结合,可用于标记近焦管。Ab-Mix 包含 LRP2 或 THP 抗体(分别可视化近体管或粗升肢)。其他抗体可根据用户需求进行验证。
  2. 在冰冷(-20°C)100%丙酮中清洗滑梯1分钟,并将其移动到湿度室。
  3. 用无 Rnase PBS 清洗幻灯片顶部 30 s。 重复。
  4. 在无 Rnase Pbs 中用 10% 的 Bsa 清洗幻灯片顶部 30s。 重复。
  5. 应用 Ab 混合 5 分钟。
  6. 在无 Rnase Pbs 中用 10% 的 Bsa 清洗幻灯片顶部 30s。 重复。
  7. 空气干燥滑梯5分钟,并加载到激光微散射切割平台上。
  8. 安装适合 PCR 工作的集合管(自动切口 0.5 mL 微中心管),包含 50 μL 的 RNA 隔离套件中的提取缓冲区。
  9. 继续进行LMD。在最多 2 小时内完成每个 LMD 会话。
    1. 收集LMD前后免疫荧光图像,使用显微镜摄像头验证解剖的操作间变异性以及档案目的、培训和执行协议的质量评估。为了获得 0.5 – 1 ng 的RNA,至少需要 500,000 μm2 区域。这通常需要使用高达 8 x12 μm 厚的部分,以获得足够数量的材料,供所有感兴趣的子部分使用。
    2. 通过染色、形态和位置来识别感兴趣的区域,并使用大于 40 的激光功率将其除名。
      注:以下是解剖标准。近脉管由 FITC-法洛丁和 LRP2 标签定义。厚升肢由 THP 标记定义。收集管道由核形态 (DAPI) 定义,没有其他污渍。球菌由FITC-法洛丁和形态学定义。间质被定义为染色管之间的区域。
  10. 通过将两个 12 μm 部分贴在 LMD 幻灯片上并将整个部分解剖成提取缓冲区,获得批量横截面表达签名。
  11. LMD 流程完成后,关闭收集的微中心管并大力轻弹,以确保内容从盖子移动到管子底部
  12. 将管子以 3,000 x g 为 30 s 提供离心机。
  13. 将管子浸泡在 42 °C 水浴中 30 分钟。
  14. 将管子在 3,000 x g 下离心 2 分钟。
  15. 将超强元转移到一个新的0.5 mL管,并将其存储在-80°C中。

3.RNA隔离

注:对于此RNA隔离协议,我们已从商用RNA隔离套件中修改了协议。制造商的协议已修改,以满足为该项目设置的质量控制要求。

  1. 在每个RNA净化柱 (PC) 中添加 250 μL 的有条件缓冲区 (CB),并在室温下孵育 5 分钟。
  2. 离心所有 PC 1 分钟,在 16,000 x g
  3. 将 50 μL 的 70% 乙醇(在 Kit 中提供)加入带组织样本的管子中。通过上下管道将样品混合好。不要漩涡。不要离心。
  4. 将混合物在 100 x g( 绑定 RNA)下将混合物转移到有条件的 PC 和离心机中 2 分钟,在 16,000 x g 下快速跟随离心 30 秒(以消除流经)。重复此步骤,如果超过 1 管组织样本可用于任何给定的子段。
  5. 在 8,000 x g时,将 100μL 的洗涤缓冲区 1 (WB1) 添加到 PC 和离心机中 1 分钟。
  6. 每个样品准备 40 μL 的 DNase(将 5 μL 的 Dnase 添加到 35μL 的 RDD 缓冲区)。然后直接在PC膜上加入40微升的混合物,并在室温下孵育15分钟。
  7. 将 40 μL 的 WB1 添加到 PC 的膜上,在 8,000 x g下将离心机加到 15 s。
  8. 在 PC 膜上添加 100 μL 的洗涤缓冲区 2 (WB2),在 8,000 x g下将离心机加 1 分钟。
  9. 在PC膜上加入100μL的WB2,离心机2分钟,在16,000 x g,紧接着在16,000 x g下离心1分钟。
  10. 将PC转移到一个新的0.5 mL管。
  11. 在膜上加入 12 μL 的 Elution 缓冲区 (EB),并在室温下孵育 7 分钟。因此,所有汇集解剖组织样本的最终体积为每子段 12 μL。
  12. 将样品在1000 x g 下抽取1分钟,然后在16,000 x g下抽取2分钟。
  13. 将 2 μL 转移到用于生物分析器分析的新鲜管中(以防止冻结事件)。
  14. 将所有管子存放在-80°C中,直到准备好进一步处理。

4. RNA 测序

  1. 使用商用生物分析仪和用于测量少量RNA的芯片评估每个样本的质量,用于测序。
  2. 需要在库准备和测序之前遵循质量控制 (QC) 参数:散装 RNA 大于 4 ng,每个子段大于 0.5 - 1 ng:超过 200 核苷酸 (DV200) 的抄本百分比对于 LMD 标本(最佳 =75%)要求大于 25%。
  3. 使用商业 cDNA 库准备套件进行图书馆准备,用于少量退化 RNA。对于补充中列出的商业套件,我们建议使用选项 2,这需要至少 DV200 的 25%,并且没有碎裂。某些测序技术可能需要更高的最低 DV200 阈值,例如 30%7。
  4. 添加 cDNA 适配器和索引。
  5. 使用磁珠技术净化RNAseq库。
  6. 在 RNAseq 库放大步骤之前,使用商用 rRNA 去除套件耗尽核糖体 cDNA。
  7. 使用磁珠技术以 2 ng/μL cDNA 库浓度净化最终的 RNAseq 库。
  8. 在商业测序系统上执行 75 bp 配对端的 RNA 测序,批量读取/示例为 3000 万次读取/示例,子细分部分执行 1 亿次读取/示例。
  9. 使用参考RNA(25微克)与每次测序运行,以允许控制批次效果。我们的参考RNA的初始浓度为1微克/μL,而测序中使用的最终浓度为25 ng/μL。
  10. 利用 FastQC 应用程序进行数据分析,以评估测序、间源读取和线粒体读取的质量,并确定归因于基因的读数。
  11. 使用集成基因组学查看器 (IGV) 进行对齐和边缘 R/rbamtool 以进行成绩单表达测量。
  12. 删除读数少于 100,000 的样本。在筛选出用户定义阈值下表达的低表达基因后,Quantile 使数据集中的原始读数规范化。
  13. 将表达式量化为兴趣子细分与所有其他子细分的平均值和 log2 转换的比率。同一基因的相对表达可以比较子段和样本:然而,由于基因和RNA物种之间潜在的退化差异,比较两种不同基因之间的相对表达并不理想。
  14. 进行浓缩分析,比较特定于每个肾素子段的一组制造商的基因表达,同时对参考RNA样本进行分批比较。R值>0.9平均表达式1个标准偏差范围内的批量效应被认为是可以接受的。更高的批次效果分数需要额外的规范化。任何偏离接受批次效应的运行都可以标记。每次测序运行的 Q30 应大于 +90%。

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Representative Results

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样品

我们提供来自9个参考肾切除术(在印第安纳大学获得的3个标本和通过肾脏精密医学项目获得的6个标本)的数据,利用快速荧光染色方案分离肾肾部分和间歇区域。在这个过程中使用的部分是从已故的肾脏捐献者或未受影响的肿瘤肾切除术中获得的。这些样本没有病理学证据,如从邻近部分(图1A)采集的H&E污渍所示。

激光微分质量控制

通过独特的管状标记的抗体染色以及形态和结构地标,可以识别肾脏中的管状子段。 图1B-C 说明了代表性肾切除术管状细分段的染色和微小斑点。这是通过染色与DAPI(核),FITC-法利丁(F-actin),并在必要时额外的抗体来实现的。所使用的荧光染色使人能够高度自信地可视化肾脏子段,进一步以形态特征以及图像结构的空间定位为指导(图2)。例如,格洛梅鲁利是由法洛丁和DAPI染色与非常独特的形态揭示。同样,收集管道使用核形态和没有其他污渍进行可视化。巨林/LRP2抗体(直接与亚历克萨氟568结合)在这里用于识别近体管。厚升肢使用 Tamm-Horsfall 蛋白 (THP) 抗体(直接与亚历克萨氟 546 结合)进行可视化。相比之下,间质沿管外膜排泄,包括频闪和免疫细胞以及小毛细血管。

为了获得每个子段 0.5 - 1 ng 的足够RNA,我们寻求剖析 500,000 μm2的最低区域。这通常需要 5 到 8 个 12 μm 厚的部分(每张幻灯片 1 个部分)才能获得适合所有子段的足够材料。任何幻灯片的解剖在不到 2 小时内完成,以保持 RNA 质量,从而允许一个人在每张幻灯片上切割 ~4 段。从同一子段获得的组织从多个幻灯片中汇集,用于下游测序。获得 LMD 免疫荧光前后图像,以使用附加的相机验证感兴趣的子片段的集合。 图 3 标出解剖面积的成功率和最低 RNA 输入。在此代表性数据集中,满足最小区域输入的成功率为 +90%。如果源组织具有少量的 CD 或间质,则使用 8 张幻灯片后,这些片段的解剖面积可能会低于 500,000μm2。 根据用户的需求,可以削减其他幻灯片:然而,如 图3所见,如果面积接近50万μm2,所期望的基因检测计数具有较高的成功率(100%)总读数成功率为98.6%(1个标本低于QC指标)。因此,有足够的组织,以实现足够的基因和阅读计数,而不使用额外的组织。

测序输入质量控制

选定的商业库准备和测序平台允许对成绩单表达进行可重复的测量,即使高退化RNA的数量很少。最低RNA输入为500 pg,最小DV200(读数长度超过200核苷酸的比例)高于25%。没有最低林。以每个样本 1 亿次读数进行测序,我们力求使可用读数饱和,以便检测表达率低的读数。总读数可以根据用户的需要进行调整。

从两个 12 μm 散装横截面部分获取足够的 RNA 是很容易的,因此我们寻求获得 4 ng 的批量测序最低总 mRNA 量。正如协议中所描述的,每个子段的总RNA要求0.5-1 ng。隔离后,最佳RNA浓度超过50 pg/μL。低于此水平的RNA量可能导致基因检测和观察到的读数减少。大多数样本产生约20,000个基因,并产生100万个读数。制造商要求所有标本的 DV200 大于 25%(+75% 被认为是最佳标本)。虽然对RIN进行了测量,但激光微散射过程减少了RIN,RNA测序平台已针对支离破碎的RNA进行了优化。RNA 数量和质量在测序前由生物分析仪进行评估。快速染色会减少组织暴露在室温和条件下的时间,从而尽可能减少 RNA 的降解。测序输入的DV200质量控制指标也见图3。

测序输出质量控制

下游数据处理使用定量规范化,允许不同批次的样品进行比较。最低基因检测计数为 10,000,读数为 100 万,用作将样本纳入量子规范化的阈值。基因检测或读数较低的样本被排除在定量规范化和随后的比较分析之外。在98个被解剖的子片段样本中,只有1个没有达到这些阈值(图3)。Q30(以99.9%的置信度映射的读数比例)已经超过了每个测序实验的93%(图4)。

我们用每次测序运行对人参照 RNA (25 ng) 进行排序,以便在需要或需要此类更正时对批次效果进行更正。测得的批次效果应在R值>0.9的平均表达值的1个标准偏差以内。如果批次效果较高,则该测序运行需要额外的规范化。在这里,在图4中描述的四个测序实验中,批次效应一直低于 3%。因此,批量效应通常通过对所有测序运行的定量规范化来解决,与参考 RNA 不可知。尚未实施基于参考 RNA 的更正,但此信息可用,可根据特定分析的目标使用。

严格性和可重复性

在识别细胞类型和结构方面表现出严谨性非常重要。激光微分后,我们测试与其他隔间(表1)相比,在glomeruli、PT、TAL、CD和间质中富集已知标记物。浓缩分析用于比较预先确定的预期标记的基因表达。与其他子细分段的平均值相比,基因表达以兴趣子段表达的日志2 比率表示。这种表达指标是为人类样本选择的,因为它减少了个体间的变异性,便于比较不同标本的细胞和隔间类型。但是,在替代分析中也可以比较原始读数和定量规范化读数。 Figure 5 说明了这 5 个选定的已知标记的免疫组织化学染色示例,如《人类蛋白质图集》中所示。

因此,我们提供了正交数据源,为所收集的正确子段提供了信心:1) 包括段/段的抗体污渍和形态的成像,以及 2) 显示已知标记的表达输出表示在相应的子段中。

每个子细分中表达的基因的区域转录分析允许新颖和被低估的标记识别。 图 6 举例说明了通过 LMD 区域转录学识别的每个子细分的一个标记示例,该子段还对相应的肾分段产生了特定的免疫组织化学染色。

为了证明可重复性和了解操作者变异性的影响,我们对肿瘤肾切除样本进行了实验。该标本对glomeruli、PT和TAL进行了重新解剖,以提高RNA测序结果的信心,现在作为有用的技术复制品。相隔数月,该样本经历了第二例低温、抗体染色、LMD解剖、RNA提取、库预科和RNA测序(图7)的glomeruli、PT和TAL隔间。比较了两个版本(v1和v2)。球状、PT 和 TAL 隔间与 r2 值 >0.95 高度相关,类似于我们参考 RNA 的最小批量效应。

Figure 1
图1:肾组织的代表性图像。
A) 人体参考肾脏组织的H&E污渍。(B) 在LMD之前和(C)解剖单厚上升肢体结构后,人体参考肾组织的免疫荧光图像与染色的厚上升肢段。缩放条 = 100μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。

Figure 2
图2:参考肾分段的代表性图像,使用特定的免疫荧光染色方法可视化为20倍。
A) 一个Glomerulus, (B) 近体图布勒 , (C) 厚上升肢体 ,(D) 收集管道 ,(E) 间歇。(*= p =lt; 0.05, **= p =lt; 0.01, ***p =lt; 0.001 由 ANOVA) 。缩放条 = 100μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。

Figure 3
图3:细分转录经济学中的质量控制指标。
A) 超过90%的试验样本达到解剖面积输入阈值50万μm2。B) 除一个样品外,所有样品均达到所需的RNA输入,至少500 pg.(C) 100%的试点样品达到制造商最低DV200阈值25%,(D ) 100%的样品达到我们检测到的10,000个基因的最低阈值。E) 除一个样本外,所有样本的读数最低达到100万。不出所料,较低的解剖区域与RNA浓度降低、基因计数降低和读数降低相关。请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 4
图4:测序质量控制。
A) 使用参考 RNA(不定量规范化)的测序运行与所有运行的平均表达方式进行比较。与最小批量效应(所有 R >0.969)有很强的相关性。(B) 超过93%的读数在所有运行中都以高信心绘制(Q30或99.9%)。请注意,Q30 值以每个车道为基础提供,每次运行有多条车道。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 5
图5:免疫组织化学染色的例子,以识别选定的已知标记。
图像描绘为 (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2 。免疫化学图像来自人类蛋白质图集。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 6
图6:免疫组织化学染色的例子,以说明相关子段中非传统标记基因的表达。
描述与相应的免疫组织化学记录包括(A)SHANK3 在格洛梅鲁斯,(B)ACSM2B 在近体管,(C)RAP1GAP 在厚上升肢体, 和(D)L1CAM 在收集管道.免疫化学图像来自人类蛋白质图集。(*= p = lt; 0.0001 由 ANOVA) 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 7
图7:两个不同的解剖与同一样本的单独测序之间的相关性。
(A)球状、(B)近体管和(C)亨勒厚上升回路的不同解剖之间观察到高度的相关性。 请点击这里查看此数字的较大版本。

标记 折叠更改 p值
NPHS1 肾 小球 32.64 1.97E-08
LRP2 近似图布勒 4.69 1.21E-05
乌莫德 厚提升肢体 24.92 2.00E-07
SLC4A9 收集管道 4.09 0.000133
科尔6A2 间 质 7.19 1.47E-06

表1:与其余子部分相比,三个肾切除样本中每个感兴趣的子细分的代表性平均值。

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Discussion

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基于LMD的转录学是一种有用的技术,将基因表达锚定在组织内的特定区域。这项技术的基础及其在肾脏中的潜在应用以前曾被描述过8。然而,针对下游RNA测序的高精度解剖,荧光解剖的优化、现代化和精简并不普遍。由于这种方法在组织内具有空间基础,因此有可能揭示组织结构中新颖或被低估的标记物,尤其是在疾病状态下。事实上,细胞的许多常见标记可能随疾病而改变,因此,在没有空间背景的情况下,仅依靠细胞RNA表达标记进行身份判断在疾病状态中可能具有挑战性。因此,空间锚定的LMD方法可能会补充和提供一个地面真理平台,许多其他转录技术,如单细胞和单核RNA测序,其中定义细胞主要是由他们的基因表达配置文件9。此外,LMD 提供的基因表达深度(每个样本最多 20,000 个基因)提供了另一个优势和重要场所,可以交叉链接来自多个来源的数据,并说明基因表达的变化,如果没有一定的深度,这些变化可能并不明显。组织经济性的考虑是该技术的另一个积极特征,即冷冻块的厚度小于 100μm 的厚度可能足以用于整个 LMD 数据集。这允许剩余组织用于其他分析目的。

LMD有局限性。激光微局限转录数据采集的一个预期限制是其低通量性质。未来的自动化可能证明在提高可扩展性10,11中很重要。LMD转录经济学的另外两个局限性包括依赖专业知识和组织质量对数据结果的影响。在兴趣部分之外无意中收集细胞和材料是已知的局限性,因为收集的是细胞的丰富隔间,而不是单个细胞。LMD 依赖于用户理解组织结构的熟练程度,因此需要特定领域的专业知识。因此,必须培训个人识别肾脏中有关区域,无论有没有抗体染色。最后,组织质量的影响可能会影响下游数据质量。LMD 协议会导致组织退化,因此起始材料的质量非常重要。但是,此协议在存档活检上进行了优化,其中有几个样本的质量只有中等质量。包含的数据表明,选定的转录平台是强大的。

值得注意的是,所使用的隔离套件和RNA测序的下游方法必须专门针对RNA降解的预期程度进行定制。这里描述的染色议定书之所以获得通过,是因为它对尽量减少这种影响有最有利的影响。在此协议中,组织嵌入 OCT 中,以便于将来与其他转录技术进行比较。然而,正式的固定组织可能是一种替代。

本文稿中提供的数据揭示了区域转录经济学的好处,包括优化、质量控制指标和技术结果。制定严格的分析前和分析质量控制标准,以及建立严谨和可重复的可靠证据,对于任何方法都至关重要。区域转录经济学的未来应用可以大致分为生物应用、技术进步和分析进展。未来的生物应用可能旨在从未受伤、受伤和再生的管子以及靠近炎症的管子中检查组织。这些隔间可以通过传统的形态标记和"通路"特定标记的抗体污渍在同一活检中识别。验证用于该技术的两种抗体标记物,即巨林和乌罗莫杜林,分别在近肌管和厚升肢中高度表达。然而,这些标记有可能在严重疾病的组织中减少。在这些情况下,对不改变其表达水平的通路特定标记或新颖标记的附加抗体验证可能会克服此问题。

LMD可能是用于其他器官转录审讯的适当方法。选择和优化对快速染色起作用的抗体势在必行。在常规染色协议中工作的抗体不一定适用于快速染色协议,这可能需要高亲和力抗体。原发性共聚抗体将最大限度地减少所需的步骤,并可能提供优势。然而,抗体与荧光素的结合可能会改变结合,在将这些试剂纳入协议之前需要进行试点实验。

最后,我们描述了一种基于荧光的激光微切管,用于分离人类肾脏中的特定区域和结构,以便进行转录分析。这种方法提供了重要的优势,可以扩展到其他组织,以提供基于组织的分子审讯。区域转录学通过提供组织病理学锚来理解表达,协助解释生物学以及健康和疾病的特征,从而补充了其他转录技术。这项技术自然符合构建肾脏转录图集的愿景。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

一般: 作者要感谢肾脏精密医学项目(www.kpmp.org)的研究人员给予的亲切支持和建议。

资金: 国家卫生研究院/NIDDK K08DK107864(M.T.E.)为这项工作提供了支持:尼赫/尼德克UG3DK114923(T.M.E.,P.C.D.):R01DK099345(T.A.S.)。这份手稿中报道的研究得到了国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)肾脏精密医学项目(KPMP)(www.kpmp.org)的支持,获奖号码为U2CDK114886。

数据和材料可用性: 数据存档在基因表达综合(GEO #待定)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 270725-1L
AMPure Beads Beckman Coulter A63880
Bioanalyzer Agilent 2100
BSA VWR 0332-100G
DAPI ThermoFisher 62248
Desiccant Cartridge Bel-Art F42046-0000
DNAse Qiagen 79254 RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope Leica LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody Abcam ab76969 Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes ThermoFisher AB-0350
Microscope camera Leica DFC700T
PBS (RNAse Free) VWR K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488) ThermoFisher O7466
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT0204
PPS-membrane slides Leica 11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg Takara Clontech 636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip Agilent 5067-1513
RNAse Away ThermoFisher 7000
RNAse Inhibitor ThermoFisher AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq) Illumina NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 Takara Clontech 634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody R&D Systems AF5144 Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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应用激光微分射发现人体肾脏组织中的区域转录学
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Barwinska, D., Ferkowicz, M. J., Cheng, Y. H., Winfree, S., Dunn, K. W., Kelly, K. J., Sutton, T. A., Rovin, B. H., Parikh, S. V., Phillips, C. L., Dagher, P. C., El-Achkar, T. M., Eadon, M. T. Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (160), e61371, doi:10.3791/61371 (2020).More

Barwinska, D., Ferkowicz, M. J., Cheng, Y. H., Winfree, S., Dunn, K. W., Kelly, K. J., Sutton, T. A., Rovin, B. H., Parikh, S. V., Phillips, C. L., Dagher, P. C., El-Achkar, T. M., Eadon, M. T. Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (160), e61371, doi:10.3791/61371 (2020).

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