Summary
Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.
Abstract
L'analisi dell'espressione genica del tessuto renale umano è uno strumento importante per comprendere l'omeostasi e la fisiopatologia delle malattie. È necessario aumentare la risoluzione e la profondità di questa tecnologia ed estenderla al livello di cellule all'interno del tessuto. Sebbene l'uso del sequenziamento dell'RNA a singola e singola cellula si sia diffuso, le firme di espressione delle cellule ottenute dalla dissociazione tissutale non mantengono il contesto spaziale. La microdisezione laser (LMD) basata su specifici marcatori fluorescenti consentirebbe l'isolamento di strutture specifiche e gruppi cellulari di interesse con la localizzazione nota, consentendo così l'acquisizione di firme trascritomiche ancorate spazialmente nel tessuto renale. Abbiamo ottimizzato una metodologia LMD, guidata da una rapida macchia a base di fluorescenza, per isolare cinque compartimenti distinti all'interno del rene umano e condurre il successivo sequenziamento dell'RNA da preziosi campioni di tessuto renale umano. Presentiamo anche parametri di controllo qualità per consentire la valutazione dell'adeguatezza dei campioni raccolti. Il flusso di lavoro delineato in questo manoscritto mostra la fattibilità di questo approccio per isolare le firme trascrittimiche sottoserticate con grande fiducia. L'approccio metodologico qui presentato può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto con sostituzione di marcatori anticorpali pertinenti.
Introduction
I progressi tecnologici nello studio dei campioni di tessuto hanno migliorato la comprensione dello stato di salute e delle malattie in vari organi. Tali progressi hanno sottolineato che la patologia può iniziare in regioni limitate o in specifici tipi di cellule, ma hanno importanti implicazioni sull'intero organo. Pertanto, nell'attuale era della medicina personalizzata, è importante comprendere la biologia sia a livello cellulare che regionale e non solo a livello globale1. Ciò è particolarmente vero nel rene, che è composto da varie cellule e strutture specializzate che avviano e/o rispondono in modo differenziato allo stress patologico. La patogenesi di vari tipi di malattia renale umana non è ancora ben compresa. La generazione di una metodologia per studiare i cambiamenti nell'espressione genica in specifici segmenti tubolari, strutture o aree dell'interstizio nel rene umano migliorerà la capacità di scoprire cambiamenti specifici della regione che potrebbero informare sulla patogenesi della malattia.
Gli esemplari di biopsia renale umana sono una risorsa limitata e preziosa. Pertanto, le tecnologie che interrogano la trascritomica nel tessuto renale dovrebbero essere ottimizzate per economizzare il tessuto. I metodi disponibili per studiare la trascrittomica a livello cellulare e regionale includono il sequenziamento dell'RNA a singola cella (scRNaseq), il RNaseq nucleare singolo (snRNaseq), l'ibridazione spaziale in situ e la microdisezione laser (LMD). Quest'ultimo è adatto per un preciso isolamento di regioni o strutture di interesse all'interno di sezioni tissutali, per il sequenziamento e l'analisi dell'RNA a valle2,3,4,5. LMD può essere adottato per fare affidamento sull'identificazione di specifici tipi di cellule o strutture basate su marcatori convalidati utilizzando l'imaging a base di fluorescenza durante la dissezione.
Le caratteristiche uniche della trascrittomica regionale assistita da microdisezione laser includono: 1) la conservazione del contesto spaziale di cellule e strutture, che integra le tecnologie a singola cellula in cui le cellule sono identificate per espressione piuttosto che istologicamente; 2) la tecnologia informa ed è informata da altre tecnologie di imaging perché un marcatore anticorpale definisce le firme di espressione; 3) la capacità di identificare le strutture anche quando i marcatori cambiano nella malattia; 4) rilevazione di trascrizioni a bassa espressa in circa 20.000 geni; e 5) notevole economia tissutale. La tecnologia è scalabile a una biopsia renale con uno spessore inferiore a 100 μm di un nucleo necessario per una sufficiente acquisizione di RNA e consente l'uso di tessuti congelati archiviati, che sono comunemente disponibili in grandi depositi o centri accademici6.
Nel lavoro che ne è seguito, descriviamo in dettaglio la tecnologia trascrittamica regionale e di massa, ottimizzata con un nuovo protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per l'uso con tessuto renale umano. Questo approccio migliora le esplorazioni LMD classiche perché fornisce dati di espressione separati per i sottoserti di interstizio e nefrone rispetto all'espressione tubulointerstiziale aggregata. Sono incluse le misure di garanzia della qualità e di controllo attuate per garantire rigore e riproducibilità. Il protocollo consente la visualizzazione di cellule e regioni di interesse, con conseguente acquisizione soddisfacente di RNA da queste aree isolate per consentire il sequenziamento dell'RNA a valle.
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Protocol
Lo studio è stato approvato per l'uso da parte dell'Institutional Review Board (IRB) dell'Indiana University.
NOTA: Utilizzare questo protocollo con tessuto nefromia renale (fino a 2 cm sia nelle dimensioni X che Y) conservato nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) e conservato a -80 °C. Eseguire tutto il lavoro in modo da limiti la contaminazione da RNA, utilizzare guanti monouso puliti e una maschera facciale. Garantire la pulizia di tutte le superfici. L'apparecchiatura per la quale questo protocollo è stato ottimizzato è un sistema di microdisezione laser con laser UV pulsato.
1. Criosezione
- Esporre diapositive a membrana PPS LMD da 1,2 μm (solfuro di poli(p-fenilene) alla luce UV (in una cappa di flusso laminare di coltura tissutale) per 30 minuti, immediatamente prima della criosezione. Conservare le diapositive a temperatura ambiente per un'aderenza ottimale ai tessuti.
- Raffreddare il criostato a -20 °C. Pulire le superfici di lavoro e installare una nuova lama da taglio.
- Posizionare una piccola scatola scorrevole (pulita con soluzione di decontaminazione superficiale RNasi) all'interno della camera criostatica per conservare le diapositive con tessuto appena tagliato.
- Aderire il campione in OCT a un porta tessuto e consentirgli di equilibrare per alcuni minuti per raggiungere la temperatura della camera e rafforzare l'adesione tra il blocco OCT e il supporto. Aiutare il processo utilizzando un estrattore di calore.
- Tagliare il campione a uno spessore di 12 μm e apporrlo sul vetrino LMD specializzato, utilizzando l'adattatore di scorrimento. Ogni diapositiva contiene una sezione di nefrectomia per diapositiva o fino a due sezioni di biopsia renale per diapositiva. Conservare i vetrini a -80 °C con una cartuccia essiccante e all'interno di un sacchetto di plastica ben chiuso per evitare che l'umidità in eccesso si accumuli all'interno della scatola scorrevole.
- Etichettare ogni diapositiva con un ID campione, una data e un numero di diapositiva.
- Utilizzare le diapositive con campioni entro 10 giorni dalla data iniziale della criosezione.
2. Microdisezione laser
- Immediatamente prima della colorazione, preparare la miscela di anticorpi (Ab-Mix) in BSA al 10% in PBS privo di RNasi aggiungendo quanto segue: 4 μL di FITC-Phalloidin, 1,5 μL di DAPI, 2 μL di anticorpo della proteina Tamm-Horsfall (THP) coniugati direttamente ad Alexa Fluor 546, 3,3 μL di inibitore della RNasi e 89,2 μL di 10% di BSA in PBS (per raggiungere un volume di 100 μL).
NOTA: Anticorpi alternativi possono essere utilizzati al posto dell'anticorpo THP. Ad esempio, 2 μL di anticorpo megalina/LRP2, coniugato direttamente ad Alexa Fluor 568, possono essere utilizzati per etichettare il tubulo prossimale. L'Ab-Mix contiene anticorpi LRP2 o THP (per visualizzare rispettivamente tubuli prossimali o arti ascendenti spessi). Altri anticorpi possono essere convalidati in base alle esigenze dell'utente. - Lavare lo scivolo in ghiaccio freddo (-20 °C) acetone al 100% per 1 minuto e spostarlo nella camera di umidità.
- Lavare la parte superiore della diapositiva con PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.
- Lavare la parte superiore dello scivolo con BSA al 10% in PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.
- Applicare l'Ab-Mix per 5 min.
- Lavare la parte superiore dello scivolo con BSA al 10% in PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.
- Asciugare all'aria lo scivolo per 5 minuti e caricarlo sulla piattaforma di taglio della microdisezione laser.
- Installare i tubi di raccolta (tubi di microcentrifugo autoclavati da 0,5 ml) appropriati per il lavoro pcr, contenenti 50 μL di extraction buffer dal kit di isolamento dell'RNA.
- Procedere con LMD. Completa ogni sessione LMD entro un massimo di 2 ore.
- Raccogli immagini immunofluorescenza pre e post-LMD, utilizzando la fotocamera del microscopio per convalidare la dissezione per la variabilità inter-operatore, nonché scopi di archiviazione, formazione e valutazione della qualità del protocollo eseguito. Per ottenere 0,5 - 1 ng di RNA, è richiesta un'area minima di 500.000μm 2. Ciò richiede spesso l'uso di sezioni spesse fino a 8 x12 μm per ottenere una quantità sufficiente di materiale per tutti i sottoserti di interesse.
- Identificare le regioni di interesse macchiando, morfologia e posizione e asportandole utilizzando una potenza laser superiore a 40.
NOTA: Ecco i criteri di dissezione. Il tubulo prossimale è definito dall'etichettatura FITC-Phalloidin e LRP2. L'arto ascendente spesso è definito dall'etichettatura THP. Il condotto di raccolta è definito dalla morfologia nucleare (DAPI) e dall'assenza di altre macchie. Il glomerulus è definito da FITC-Phalloidin e morfologia. L'interstizio è definito come l'area tra i tubuli macchiati.
- Ottenere una firma di espressione di sezione trasversale di massa apporre due sezioni da 12 μm su una diapositiva LMD e sezionare le intere sezioni nel buffer di estrazione.
- Al termine del processo LMD, chiudere i tubi di microcentrifugo di raccolta e svolazzarlo vigorosamente per assicurarsi che il contenuto si sposti dal tappo alla parte inferiore del tubo
- Centrifugare i tubi a 3.000 x g per 30 s.
- Incubare i tubi in bagno d'acqua a 42 °C per 30 minuti.
- Centrifugare i tubi a 3.000 x g per 2 min.
- Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 0,5 ml e conservarlo in -80 °C.
3. Isolamento dell'RNA
NOTA: Per questo protocollo di isolamento dell'RNA, abbiamo adattato un protocollo da un kit di isolamento dell'RNA commerciale. Il protocollo del produttore è stato modificato per soddisfare i requisiti di controllo qualità stabiliti per il progetto.
- Aggiungere 250 μL di Tampone condizionato (CB) a ciascuna colonna di purificazione dell'RNA (PC) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifuga tutti i PC per 1 min a 16.000 x g.
- Aggiungere 50 μL di 70% di etanolo (fornito nel kit) nei tubi con campioni di tessuto. Mescolare bene i campioni pipettando su e giù. Non vortice. Non centrifugare.
- Trasferire la miscela in PC condizionati e centrifugare per 2 min a 100 x g (per legare l'RNA), seguire rapidamente con centrifugazione per 30 s a 16.000 x g (per rimuovere il flusso attraverso). Ripetere questo passaggio se sono disponibili più di 1 tubo con campioni di tessuto per un determinato sottosezione.
- Aggiungere 100 μL di Wash Buffer 1 (WB1) nei PC e centrifugare per 1 minuto a 8.000 x g.
- Preparare 40 μL di DNasi per ogni campione (aggiungere 5 μL di DNA a 35 μL di tampone RDD). Quindi aggiungere 40 μL della miscela direttamente sulla membrana del PC e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 40 μL di WB1 sulla membrana del PC e centrifugare per 15 s a 8.000 x g.
- Aggiungere 100 μL di Wash Buffer 2 (WB2) sulla membrana del PC e centrifugare per 1 min a 8.000 x g.
- Aggiungere 100 μL di WB2 sulla membrana del PC, centrifugare per 2 min a 16.000 x g,seguire immediatamente per centrifugazione per 1 min a 16.000 x g.
- Trasferire il PC su un nuovo tubo da 0,5 ml.
- Aggiungere 12 μL di Elution Buffer (EB) sulla membrana e incubare per 7 minuti a temperatura ambiente. Pertanto, il volume finale di tutti i campioni di tessuto sezionato raggruppati è di 12 μL per sottoseme.
- Centrifugare i campioni per 1 min a 1.000 x g e quindi per 2 minuti a 16.000 x g.
- Trasferire 2 μL in un tubo fresco per l'analisi del bioanalyzer (per prevenire eventi di congelamento-disgelo).
- Conservare tutti i tubi a -80 °C fino a quando non sono pronti per un'ulteriore lavorazione.
4. Sequenziamento dell'RNA
- Valutare ogni campione, destinato al sequenziamento, per la qualità utilizzando un Bioanalyzer commerciale e un chip dedicato alla misurazione di piccole quantità di RNA.
- Sono necessari seguenti parametri di controllo qualità (QC) prima della preparazione e del sequenziamento della libreria: quantità di RNA maggiore di 4 ng per la massa e maggiore di 0,5 - 1 ng per ogni sottosezione; La percentuale di trascrizioni più lunghe di 200 nucleotidi (DV200) deve essere superiore al 25% per i campioni LMD (ottimale > 75%).
- Eseguire la preparazione della biblioteca con un kit di preparazione della libreria cDNA commerciale destinato a piccole quantità di RNA degradato. Per il kit commerciale elencato nel supplemento, si consiglia di utilizzare l'opzione 2, che richiede un DV200 minimo del 25% e nessuna frammentazione. Alcune tecnologie di sequenziamento potrebbero richiedere soglie DV200 minime più elevate, ad esempio il 30%7.
- Aggiungere adattatori e indici cDNA.
- Purificare le librerie RNAseq utilizzando la tecnologia delle perline magnetiche.
- Esaurire il cDNA ribosomiale utilizzando un kit di rimozione dell'rRNA commerciale prima della fase di amplificazione della libreria RNAseq.
- Purificare l'ultima libreria RNAseq utilizzando la tecnologia delle perline magnetiche a una concentrazione di libreria cDNA da 2 ng/μL.
- Effettuare il sequenziamento dell'RNA di 75 bp abbinato su un sistema di sequenziamento commerciale con 30 milioni di letture/campioni per la massa e 100 milioni di letture/campioni per le sezioni sottoserticate.
- Utilizzare un RNA di riferimento (25 μg) ad ogni corsa di sequenziamento per consentire il controllo dell'effetto batch. La concentrazione iniziale del nostro RNA di riferimento è di 1 μg/μL, mentre la concentrazione finale utilizzata nel sequenziamento è di 25 ng/μL.
- Eseguire l'analisi dei dati utilizzando l'applicazione FastQC per valutare la qualità delle letture sequenzianti, intergeniche e mitocondriali e per determinare le letture attribuite a un gene.
- Utilizzare Integrative Genomics Viewer (IGV) per l'allineamento e edgeR/rbamtools per le misure di espressione della trascrizione.
- Rimuovere campioni con meno di 100.000 letture. Quantile normalizza le letture grezze nel set di dati dopo aver filtrato i geni poco espressi a una soglia definita dall'utente.
- Quantificare l'espressione come rapporto tra il sottosezione di interesse e la media di tutti gli altri sottoserti e log2-transform. L'espressione relativa dello stesso gene può essere confrontata tra sottosemi e campioni; tuttavia, non è ideale confrontare l'espressione relativa tra due geni diversi a causa di potenziali differenze di degradazione tra geni e specie di RNA.
- Effettuare un'analisi di arricchimento per confrontare l'espressione genica per un insieme di produttori specifici di ogni sottosezione di nefro, mentre i campioni di RNA di riferimento vengono confrontati tra i lotti. Un effetto batch entro 1 deviazione standard dell'espressione media con valore R > 0,9 è considerato accettabile. È necessaria una normalizzazione aggiuntiva per un punteggio di effetto batch più elevato. Qualsiasi esecuzione che si discosta dall'effetto batch accettato può essere contrassegnata. Il Q30 deve essere maggiore di >90% per ogni esecuzione di sequenziamento.
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Representative Results
Campioni
Presentiamo i dati di nove nefrectomie di riferimento (3 esemplari ottenuti presso l'Indiana University e 6 esemplari ottenuti attraverso Kidney Precision Medicine Project), utilizzando il protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per isolare i segmenti di nefro renale e le aree interstiziali. Le sezioni utilizzate in questo processo sono state ottenute da donatori renali deceduti o nefrectomie tumorali non colpite. Questi campioni non hanno avuto prove patologiche di malattia come visualizzato nella macchia H&E prelevata da sezioni contigue (Figura 1A).
Controllo di qualità della microdisezione laser
L'identificazione dei sottospasti tubolari nel rene viene effettuata attraverso la colorazione degli anticorpi di marcatori tubolari unici, nonché morfologia e punti di riferimento strutturali. La figura 1B-C illustra la colorazione e la microsezione di sottosezioni tubolari da una nefrectomia rappresentativa. Ciò si ottiene macchiando con DAPI (nuclei), FITC-Phalloidin (F-actin) e un anticorpo aggiuntivo se necessario. La colorazione a fluorescenza utilizzata ha permesso di visualizzare sottoseppi renali ad alto grado di confidenza, ulteriormente guidati da caratteristiche morfologiche e posizionamento spaziale delle strutture immagini (Figura 2). Ad esempio, i glomeruli sono rivelati dalla colorazione della phalloidina e del DAPI con morfologia molto distintiva. Allo stesso modo, i dotti di raccolta sono visualizzati usando la morfologia nucleare e l'assenza di altre macchie. L'anticorpo megalin/LRP2 (direttamente coniugato con Alexa Fluor 568) viene utilizzato qui per identificare i tubuli prossimali. L'arto ascendente spesso viene visualizzato utilizzando un anticorpo della proteina Tamm-Horsfall (THP) (coniugato direttamente ad Alexa Fluor 546). Al contrario, l'interstizio viene asportato lungo la membrana esterna dei tubuli e include cellule stromali e immunitarie così come piccoli capillari.
Per ottenere un RNA sufficiente di 0,5 - 1 ng per sottoseme, cerchiamo di sezionare un'area minima di 500.000 μm2. Ciò richiede generalmente da cinque a otto sezioni spesse da 12 μm (1 sezione per diapositiva) per ottenere materiale sufficiente per tutti i sottoserti. La dissezione di qualsiasi diapositiva viene completata in meno di 2 ore per preservare la qualità dell'RNA che consente di tagliare ~ 4 segmenti per diapositiva. Il tessuto acquisito dallo stesso sottosemento viene raggruppato da più diapositive per il sequenziamento a valle. Un'immagine immunofluorescenza pre e post-LMD è ottenuta per convalidare la raccolta di sottoserti di interesse utilizzando una fotocamera collegata. La figura 3 delinea i tassi di successo dell'area di dissezione e dell'input minimo di RNA. Il tasso di successo nel soddisfare l'input minimo dell'area è stato >90% in questo set di dati rappresentativo. Se il tessuto sorgente ha una piccola quantità del CD o dell'interstizio, c'è la possibilità che l'area di dissezione sia inferiore a 500.000 μm2 per questi segmenti dopo aver utilizzato 8 diapositive. Ulteriori diapositive potrebbero essere tagliate a seconda delle esigenze dell'utente; tuttavia, come si vede nella figura 3, se l'area è vicina a 500.000 μm2, il numero di geni rilevati desiderato ha un alto tasso di successo (100%) e il tasso di successo totale del conteggio delle lette è del 98,6% (1 campione è sceso al di sotto della metrica QC). Pertanto, c'era abbastanza tessuto per ottenere un numero sufficiente di geni e leggere senza utilizzare tessuti aggiuntivi.
Sequenziamento del controllo qualità input
La piattaforma di preparazione e sequenziamento della biblioteca commerciale selezionata consente misurazioni riproducibili dell'espressione della trascrizione, anche con basse quantità di RNA altamente degradato. L'ingresso minimo di RNA è di 500 pg e il DV200 minimo (proporzione di letture più lunghe di 200 nucleotidi di lunghezza) è superiore al 25%. Non esiste un RIN minimo. Sequenziando con 100 milioni di letture per campione, cerchiamo di saturare le letture disponibili al fine di rilevare trascrizioni poco espresse. Le letture totali possono essere regolate in base alle esigenze dell'utente.
È semplice ottenere RNA sufficiente da due sezioni di sezione trasversale sfusa da 12 μm, quindi cerchiamo di ottenere una quantità minima di mRNA totale più alta di 4 ng per il sequenziamento alla rinfusa. Come delineato nel protocollo, ogni sottosezione richiede 0,5-1 ng in RNA totale. La concentrazione ottimale di RNA è superiore a 50 pg/μL dopo l'isolamento. Quantità di RNA inferiori a questo possono portare a una riduzione del rilevamento genico e del conteggio delle lette osservato. La maggior parte dei campioni produce >20.000 geni rilevati e >1 milione di letture. Un DV200 superiore al 25% per tutti i campioni è richiesto dal produttore (>75% è considerato ottimale). Sebbene sia misurato RIN, il processo di microdisezione laser riduce il RIN e le piattaforme di sequenziamento dell'RNA sono state ottimizzate per l'RNA frammentato. La quantità e la qualità dell'RNA sono valutate da un bioanalizzatore prima del sequenziamento. La rapida macchia diminuisce la quantità di tempo in cui il tessuto è esposto alla temperatura ambiente e alle condizioni acquose, riducendo così al minimo, per quanto possibile, la degradazione dell'RNA. La metrica di controllo qualità DV200 per il sequenziamento dell'input si trova anche nella figura 3.
Sequenziamento del controllo qualità dell'output
L'elaborazione dei dati downstream utilizza la normalizzazione quantile per consentire il confronto tra campioni in lotti diversi. Un conteggio minimo del rilevamento genico di 10.000 e un conteggio minimo di lettura di 1 milione sono impiegati come soglie per includere campioni nella normalizzazione quantile. I campioni con un rilevamento genico o un numero di lettura inferiore sono esclusi dalla normalizzazione quantile e dalle successive analisi comparative. Solo 1 campione sottosezionato su 98 non ha rispettato queste soglie (figura 3). Il terzo trimestre (percentuale di letture mappate con una confidenza del 99,9%) è stato superiore al 93% per ogni esperimento di sequenziamento (Figura 4).
Sequenziamo un RNA di riferimento umano (25 ng) con ogni corsa di sequenziamento per consentire la correzione per l'effetto batch se tale correzione è desiderata o richiesta. L'effetto batch misurato deve essere entro 1 deviazione standard dell'espressione media con un valore R > 0,9. Se l'effetto batch è maggiore, è necessaria una normalizzazione aggiuntiva per l'esecuzione della sequenza. Qui, l'effetto batch è stato inferiore al 3% nei quattro esperimenti di sequenziamento descritti nella figura 4. Pertanto, l'effetto batch è tipicamente indirizzato con normalizzazione quantile per tutte le esecuzioni di sequenziamento, agnostico all'RNA di riferimento. Nessuna correzione basata sull'RNA di riferimento è stata ancora implementata, ma queste informazioni sono disponibili e potrebbero essere utilizzate a seconda degli obiettivi di una particolare analisi.
Rigore e riproducibilità
È importante dimostrare rigore nell'identificazione dei tipi e delle strutture cellulari. Dopo la microdisezione laser, testiamo l'arricchimento di marcatori noti nei glomeruli, PT, TAL, CD e interstizio rispetto agli altri compartimenti(tabella 1). Un'analisi di arricchimento viene utilizzata per confrontare l'espressione genica per marcatori attesi predeterminati. L'espressione genica è trasmessa come rapportilog 2 dell'espressione del sottosezione di interesse rispetto alla media degli altri sottoserti. Questa metrica di espressione è stata scelta per campioni umani in quanto riduce la variabilità inter-individuale, facilitando il confronto tra i tipi di cellule e compartimenti tra campioni. Tuttavia, le letture grezze e le letture normalizzate quantili possono anche essere confrontate in analisi alternative. Figure 5 illustra esempi di colorazione immunoistochimica di questi 5 marcatori noti selezionati, come presentato nell'Atlante delle proteine umane.
Pertanto, presentiamo fonti di dati ortogonali che danno fiducia al sottoseparto corretto raccolto: 1) l'imaging che include la macchia anticorpale e la morfologia del segmento / compartimento e 2) l'output di espressione che mostra marcatori noti sono espressi nel sottoseparto corrispondente.
L'analisi trascritomica regionale dei geni espressi in ciascun sottoseme consente un'identificazione marcatore nuova e sottovalutata. La figura 6 illustra un esempio di indicatore per ogni sottoseme identificato attraverso la trascritomica regionale LMD che ha anche prodotto una colorazione immunoistochimica specifica del corrispondente sottoseme di nefro.
Per dimostrare la riproducibilità e comprendere l'effetto della variabilità dell'operatore, abbiamo condotto un esperimento su un campione di nefromia tumorale. Questo esemplare ha fatto risezionare glomeruli, PT e TAL per aumentare la fiducia dei risultati del sequenziamento dell'RNA e ora funge da utile replica tecnica. A pochi mesi di distanza, questo campione è stato sottoposto a un secondo caso di criosezione, colorazione degli anticorpi, dissezione LMD, estrazione dell'RNA, preparazione della libreria e sequenziamento dell'RNA (Figura 7) dei compartimenti glomeruli, PT e TAL. Le due versioni (v1 e v2) sono state confrontate. I compartimenti glomerulare, PT e TAL erano altamente correlati con i valori r2 >0,95, simili all'effetto batch minimo del nostro RNA di riferimento.
Figura 1: Immagini rappresentative del tessuto renale.
(A) Macchia H&E di un tessuto renale di riferimento umano. (B) Immagine immunofluorescente del tessuto renale di riferimento umano con segmenti di arti ascendenti spessi macchiati prima dell'LMD e della (C) immediatamente dopo la dissezione di una singola struttura ascendente spessa. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di sottosezioni renali di riferimento, visualizzate a 20x utilizzando uno specifico approccio di colorazione immunofluorescente.
(A)a Glomerulus, (B) Tubulo prossimale, (C) Arto ascendente spesso, (D) Condotto di raccolta, (E) Interstizio. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 da ANOVA). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metriche di controllo qualità nella trascrittamica segmentale.
(A) Oltre il 90% dei campioni pilota ha raggiunto la soglia di ingresso dell'area di dissezione di 500.000 μm2. (B) Tutti i campioni, ad eccezione di uno, hannosoddisfatto l'ingresso di RNA desideratodialmeno 500 pg. (E) Tutti i campioni tranne uno hanno raggiunto un conteggio totale minimo di lettura di 1 milione. Come previsto, le aree di dissezione più basse sono correlate con concentrazioni di RNA ridotte, conteggi genetici più bassi e conteggi di lettura più bassi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sequenziamento del controllo di qualità.
(A) Le esecuzioni di sequenziamento che utilizzano un RNA di riferimento (non quantile normalizzato) vengono confrontate con l'espressione media di tutte le esecuzioni. Esiste una forte correlazione con l'effetto batch minimo (tutti R >0.969). (B) Oltre il 93% delle nostre letture in tutte le corse è stato mappato con grande fiducia (terzo trimestre o 99,9%). Si noti che i valori Q30 vengono forniti in base alla corsia con più corsie per corsa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempi di colorazione immunoistochimica per identificare i marcatori noti selezionati.
Le immagini sono raffigurate per (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Le immagini immunoistochimica sono ottenute dall'Atlante delle proteine umane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempi di colorazione immunoistochimica per illustrare l'espressione di geni marcatori non tradizionali nei sottoserti rilevanti.
Trascrizioni raffigurate con immunoistochimica corrispondente includono (A) SHANK3 in glomerulus, (B) ACSM2B in tubulo prossimale, (C) RAP1GAP nell'arto ascendente spesso e (D) L1CAM nel condotto di raccolta. Le immagini immunoistochimica sono ottenute dall'Atlante delle proteine umane. (*= p < 0,0001 di ANOVA) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Correlazione tra due dissezioni distinte con sequenziamento separato dello stesso campione.
È stato osservato un alto grado di correlazione tra diverse dissezioni nel (A) glomerulus, (B) tubulo prossimale, e (C) spesso anello ascendente di Henle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Marcatore | Segmento | Cambio di piegatura | valore p |
| NPHS1 | Glomerolo | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Tubulo prossimale | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Arto ascendente spesso | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Condotto di raccolta | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Interstizio | 7.19 | 1.47E-06 |
Tabella 1: Valori medi rappresentativi per ciascun sottosezione di interesse tra tre campioni di nefrectomia, rispetto ai restanti sottoserti.
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Discussion
La trascritomica basata su LMD è una tecnologia utile che ancora l'espressione genica a aree specifiche all'interno del tessuto. La base di questa tecnologia e la sua potenziale applicazione nel rene è stata descritta in precedenza8. Tuttavia, l'ottimizzazione, la modernizzazione e la razionalizzazione della dissezione basata sulla fluorescenza specificamente finalizzata alla dissezione ad alta precisione per il sequenziamento dell'RNA a valle è meno onnipresente. Poiché questa metodologia è spazialmente radicata all'interno del tessuto, ha il potenziale per rivelare marcatori nuovi o sottovalutati nelle strutture tissutali, specialmente negli stati di malattia. In effetti, molti marcatori comuni delle cellule possono cambiare con la malattia, quindi affidarsi solo ai marcatori di espressione dell'RNA cellulare per l'aggiudicazione dell'identità senza il contesto spaziale può essere impegnativo negli stati di malattia. Pertanto, è probabile che l'approccio LMD ancorato spazialmente integri e fornisca una piattaforma di verità fondamentale per molte altre tecnologie trascritomiche come il sequenziamento a singola cellula e a singolo RNA nucleare, che definiscono le cellule prevalentemente dal loro profilo di espressione genica9. Inoltre, la profondità dell'espressione genica fornita dall'LMD (fino a 20.000 geni per campione) fornisce un altro vantaggio e un luogo importante per collegare i dati da più fonti e tenere conto dei cambiamenti nell'espressione genica che potrebbero non essere evidenti senza una certa profondità. La considerazione dell'economia dei tessuti è un'altra caratteristica positiva di questa tecnologia, per cui uno spessore inferiore a 100 μm totali da un blocco congelato potrebbe essere sufficiente per un intero set di dati LMD. Ciò consente di utilizzare il tessuto avanzi per altri scopi analitici.
L'LMD ha dei limiti. Una limitazione anticipata dell'acquisizione di dati trascrittomici a microdisezione laser è la sua minore natura di produttività. L'automazione futura potrebbe rivelarsi importante per migliorarela scalabilità 10,11. Altre due limitazioni della trascritomica LMD includono la dipendenza dalle competenze e l'impatto della qualità dei tessuti sui risultati dei dati. La raccolta involontaria di cellule e materiale al di fuori del segmento di interesse è una limitazione nota perché vengono raccolti compartimenti arricchiti di cellule, non una singola cella. LMD si basa sulla competenza di un utente nella comprensione della struttura tissutale e richiede quindi una certa competenza di dominio. Pertanto, gli individui devono essere addestrati a identificare le regioni rilevanti nel rene con e senza colorazione anticorpale. Infine, l'effetto della qualità dei tessuti può influire sulla qualità dei dati a valle. Il protocollo LMD porta alla degradazione dei tessuti, quindi la qualità del materiale di partenza è importante. Tuttavia, questo protocollo è stato ottimizzato su biopsie archiviate con diversi campioni di qualità solo moderata. I dati inclusi mostrano che la piattaforma trascrittamica selezionata è robusta.
Da notare che il kit di isolamento utilizzato e la metodologia downstream del sequenziamento dell'RNA devono essere personalizzati specificamente per il grado previsto di degradazione dell'RNA. Il protocollo di colorazione qui descritto è stato adottato perché ha avuto l'effetto più favorevole sulla minimizzazione di tale effetto. In questo protocollo, il tessuto è stato incorporato nello Strumento di personalizzazione di Office al fine di facilitare futuri confronti tra altre tecnologie trascritomiche. Tuttavia, il tessuto fisso di formalina può essere un'alternativa.
I dati presentati in questo manoscritto rivelano i vantaggi della trascritomica regionale, tra cui l'ottimizzazione, le metriche di controllo qualità e i risultati tecnologici. La definizione di rigorosi criteri preatti analitici e analitici di controllo della qualità, non solo la creazione di prove solide di rigore e riproducibilità sono essenziali per qualsiasi metodologia. Le future applicazioni della trascritomica regionale possono essere ampiamente raggruppate in applicazioni biologiche, progressi tecnici e progressi analitici. Le future applicazioni biologiche possono essere finalizzate all'interrogatorio di tessuti da tubuli illesi, feriti e rigeneranti, nonché tubuli in prossimità dell'infiammazione. Questi compartimenti possono essere identificati nella stessa biopsia sia con marcatori morfologici tradizionali che con macchie anticorpali per marcatori specifici "percorso". I due marcatori anticorpali convalidati per l'uso in questa tecnologia, megalina ed uromodulina, sono altamente espressi rispettivamente nel tubulo prossimale e nell'arto ascendente spesso. Tuttavia, è possibile che questi marcatori possano essere ridotti in tessuti gravemente matti. In queste situazioni, un'ulteriore convalida anticorpale di marcatori specifici del percorso o nuovi marcatori che non cambiano il loro livello di espressione può superare questo problema.
È probabile che l'LMD sia un metodo appropriato da utilizzare nell'interrogatorio trascritomico di altri organi. La selezione e l'ottimizzazione degli anticorpi che funzionano per una colorazione rapida sarà imperativa. Un anticorpo che funziona in un normale protocollo di colorazione potrebbe non funzionare necessariamente per il protocollo di colorazione rapida, che probabilmente richiede anticorpi ad alta affinità. Un anticorpo coniugato primario ridurrà al minimo i passaggi necessari e può offrire vantaggi. Tuttavia, la coniugazione di un anticorpo contro i fluorofori può alterare il legame e gli esperimenti pilota devono essere eseguiti prima di incorporazione di questi reagenti nel protocollo.
In conclusione, descriviamo una pipeline per la microdisezione laser a base di fluorescenza per isolare aree e strutture specifiche nel rene umano per consentire un'analisi trascrittomica. Questo approccio offre importanti vantaggi e può essere esteso ad altri tessuti per fornire un interrogatorio molecolare basato sui tessuti. La trascritomica regionale completa altre tecnologie trascritomiche fornendo un'ancora istopatologica per comprendere l'espressione, aiutando nell'interpretazione della biologia e nella firma della salute e della malattia. Questa tecnologia si inserisce naturalmente nella visione per la costruzione di un atlante trascritomico del rene.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Generale: Gli autori ringraziano gli investigatori del Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) per il loro gentile supporto e consiglio.
Finanziamento: Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), con il numero di premio U2CDK114886.
Disponibilità di dati e materiali: I dati vengono archiviati nel Gene Expression Omnibus (GEO # in sospeso)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
