Summary
우리는 사구체, 근위 관, 두꺼운 상승 사지, 수집 덕트 및 간질염을 포함하여 인간 신장의 하위 세그먼트의 레이저 미세 절제에 대한 프로토콜을 설명합니다. RNA는 얻어진 구획및 RNA 시퀀싱으로부터 분리되어 각 하위 세그먼트 내의 전사 서명의 변화를 결정한다.
Abstract
인간 신장 조직의 유전자 발현 분석은 항상성 및 질병 병리학을 이해하는 중요한 도구입니다. 이 기술의 해상도와 깊이를 증가시키고 조직 내의 세포 수준으로 확장하는 것이 필요합니다. 단일 핵 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석의 사용이 널리 퍼져 있지만, 조직 해리로부터 얻은 세포의 발현 서명은 공간 맥락을 유지하지 못한다. 레이저 미세 절제 (LMD)는 특정 형광 마커에 기초하여 알려진 국소화와 관심의 특정 구조 및 세포 그룹의 격리를 허용하여 신장 조직에서 공간적으로 고정 된 전사 적 서명을 획득 할 수 있게합니다. 우리는 빠른 형광 계 얼룩에 의해 유도LMD 방법론을 최적화했습니다, 인간 신장 내의 5개의 별개의 구획을 격리하고 귀중한 인간 신장 조직 견본에서 후속 RNA 순서를 실시하기 위하여. 우리는 또한 수집 된 표본의 적합성 평가를 가능하게하는 품질 관리 매개 변수를 제시합니다. 이 원고에 설명된 워크플로우는 이 접근 방식의 타당성을 보여 주며, 높은 확신을 가지고 하위 세그먼트 전사 서명을 분리합니다. 여기에 제시된 방법론적 접근법은 또한 관련 항체 마커의 대체를 가진 그밖 조직 모형에 적용될 수 있습니다.
Introduction
조직 표본을 연구하는 기술 발전은 다양한 장기에서 건강과 질병의 상태에 대한 이해를 향상했습니다. 그 같은 어드밴스는 병리학이 제한된 지역 또는 특정 세포 모형에서 시작할 수 있다는 것을 강조했습니다, 그러나 전체 기관에 중요한 연루가 있습니다. 따라서, 현재 개인화된 의학의 시대에, 세포와 지역 적 수준 모두에서 생물학을 이해하는 것이 중요하고 전 세계적으로1. 이것은 다양 한 전문된 세포와 병리학적 스트레스에 분화 및/또는 반응 하는 구조로 구성 되는 신장에서 특히 사실이다. 인간 신장 병의 각종 모형의 병신은 아직도 잘 이해되지 않습니다. 특정 관 세그먼트에서 유전자 발현의 변화를 연구하는 방법론을 생성, 구조 또는 인간의 신장에 있는 interstitium의 지역은 질병의 병인에 통보할 수 있는 지역 특정 변경을 밝히는 기능을 향상할 것입니다.
인간의 신장 생검 표본은 제한적이고 귀중한 자원입니다. 따라서 신장 조직에서 전사학을 심문하는 기술은 조직을 경제화하도록 최적화되어야 합니다. 세포 및 지역 수준에서 전사학을 연구하는 이용 가능한 방법은 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNaseq), 단일 핵 RNaseq(snRNaseq), 현장에서 공간 혼성화 및 레이저 미세 절(LMD)을 포함한다. 후자는 다운스트림 RNA 시퀀싱 및분석2,3,4,5에대한 조직 섹션 내의 관심 영역 또는 구조의 정확한 격리에 적합합니다. LMD는 해부 도중 형광 기지를 둔 화상 진찰을 사용하여 검증된 마커를 기반으로 특정 세포 모형 또는 구조물의 식별에 의지하기 위하여 채택될 수 있습니다.
레이저 미세 절 보조 지역 전사학의 독특한 특징은 다음과 같습니다 : 1) 세포와 구조의 공간 컨텍스트의 보존, 이는 세포가 조직학적으로 보다는 발현에 의해 식별되는 단하나 세포 기술을 보완; 2) 항체 마커가 발현 서명을 정의하기 때문에 기술은 다른 이미징 기술에 의해 통보되고 통보된다. 3) 마커가 질병에서 변경되는 경우에도 구조를 식별하는 능력; 4) 대략 20,000의 유전자에 있는 낮은 발현된 전사체의 검출; 그리고 5) 놀라운 조직 경제. 이 기술은 충분한 RNA 획득에 필요한 코어의 100 μm 두께 미만의 신장 생검으로 확장가능하며, 대형 저장소 또는 학술 센터6에서일반적으로 제공되는 보관된 냉동 조직의 사용을 가능하게 한다.
후속 작업에서, 우리는 인간 신장 조직과 함께 사용하기위한 새로운 빠른 형광 염색 프로토콜에 최적화 된 지역 및 대량 전사 기술을 자세히 설명합니다. 이 방법은 고전적인 LMD 탐색을 개선하는데, 이는 골재 튜튜인터테리아식과는 달리 간질 및 신장계 하위 세그먼트에 대한 별도의 식 데이터를 제공하기 때문입니다. 엄격하고 재현성을 보장하기 위해 구현된 품질 보증 및 제어 조치가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포와 관심 영역의 시각화를 가능하게 하여 이러한 고립된 영역에서 RNA를 만족스러운 획득하여 다운스트림 RNA 시퀀싱을 허용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 인디애나 대학의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 사용을 위해 승인되었습니다.
참고: 신장 신장 절제술 조직(X 및 Y 치수 모두에서 최대 2cm)을 사용하여 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물에 보존되어 -80°C에 저장됩니다. RNA 오염을 제한하고 깨끗한 일회용 장갑과 얼굴 마스크를 사용하는 방식으로 모든 작업을 수행하십시오. 모든 표면의 청결을 보장합니다. 이 프로토콜을 최적화한 장비는 펄스 UV 레이저를 특징으로 하는 레이저 마이크로디섹션 시스템입니다.
1. 냉동 절제
- 1.2 μm LMD PPS-멤브레인(폴리(p-phenylene 황화물)을 자외선(조직 배양 라미나르 플로우 후드)에 30분 간 미끄러져 냉동절부전을 노출한다. 최적의 조직 준수를 위해 실온에서 슬라이드를 저장합니다.
- 저온을 -20°C로 식힙니다. 작업 표면을 청소하고 새로운 절단 블레이드를 설치합니다.
- 냉동실 내부에 작은 슬라이드 박스(RNase 표면 오염 제거 용액으로 세척)를 배치하여 갓 자른 조직으로 슬라이드를 보관합니다.
- 10월에 시편을 조직 홀더에 부착하고 챔버 온도에 도달하고 OCT 블록과 홀더 사이의 접착력을 강화하기 위해 몇 분 동안 평형화할 수 있도록 한다. 열 추출기사용으로 공정을 지원합니다.
- 시편을 12 μm 두께로 자르고 슬라이드 어댑터를 사용하여 전문 LMD 슬라이드에 부착합니다. 각 슬라이드는 슬라이드 당 또는 슬라이드 당 최대 2 개의 신장 생검 섹션을 보유합니다. 슬라이드를 -80°C에 건조카트리지와 단단히 닫힌 비닐 봉지 안에 저장하여 과도한 수분이 슬라이드 박스 내부에 축적되는 것을 방지합니다.
- 각 슬라이드에 표본 ID, 날짜 및 슬라이드 번호로 레이블을 지정합니다.
- 극저온 절제의 초기 날짜로부터 10 일 이내에 표본이있는 슬라이드를 사용합니다.
2. 레이저 마이크로 디스섹션
- 염색 직전, FITC-Phalloidin의 4 μL을 추가하여 RNase-free PBS에서 항체 믹스(Ab-Mix)를 10% BSA로 준비합니다. DAPI의 1.5 μL, 탐-호르스폴 단백질(THP)의 2μL, 알렉사 플루어 546, RNase 억제제의 3.3 μL, PBS에서 10% BSA의 89.2 μL(100 μL의 부피에 도달)에 직접 공주된다.
참고: 대체 항체는 THP 항체 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 알렉사 플루어(568)에 직접 컨쥬게이트된 메가린/LRP2 항체의 2μL은 근위 튜블러를 라벨에 부착하는 데 사용될 수 있다. Ab-Mix에는 LRP2 또는 THP 항체가 포함되어 있습니다(근위 튜벌레 또는 두꺼운 오름팔다리를 각각 시각화합니다). 다른 항체는 사용자 요구에 따라 검증될 수 있다. - 차가운 얼음 (-20 °C)에서 슬라이드를 1 분 동안 100 % 아세톤으로 씻고 습도 챔버로 이동합니다.
- 30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS와 슬라이드의 상단을 세척.
- 30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS에서 10% BSA와 슬라이드의 상단을 세척.
- Ab-Mix를 5분 간 적용합니다.
- 30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS에서 10% BSA와 슬라이드의 상단을 세척.
- 공기는 5 분 동안 슬라이드를 건조하고 레이저 미세 절삭 플랫폼에로드합니다.
- RNA 격리 키트로부터 추출 버퍼 50μL을 포함하는 PCR 작업에 적합한 수집 튜브(자동 0.5mL 마이크로센심분리기 튜브)를 설치합니다.
- LMD를 진행합니다. 대부분의 2시간 이내에 각 LMD 세션을 완료합니다.
- 현미경 카메라를 사용하여 전·후 LMD 면역형광 이미지를 수집하여 작업자 간 가변성뿐만 아니라 수행된 프로토콜의 보관 목적, 교육 및 품질 평가를 검증합니다. RNA의 0.5 - 1 ng를 얻기 위해서는 최소 500,000 μm2 영역이 필요합니다. 이것은 종종 관심의 모든 하위 세그먼트에 대한 재료의 충분한 양을 얻기 위해 최대 8 x12 μm 두께의 섹션의 사용을 필요로한다.
- 스테인딩, 형태 및 위치로 관심 영역을 식별하고 40보다 큰 레이저 전력을 사용하여 이를 소비합니다.
참고: 해부 기준은 다음과 같습니다. 근위 관은 FITC-Phalloidin 및 LRP2 라벨링에 의해 정의됩니다. 두꺼운 오름차순 사지는 THP 라벨링에 의해 정의됩니다. 수집 덕트는 핵 형태학(DAPI) 및 기타 염색의 부재에 의해 정의됩니다. 사구체는 FITC-판로이드 및 형태에 의해 정의됩니다. 간질은 스테인드 튜블러 사이의 영역으로 정의됩니다.
- 두 개의 12 μm 단면을 LMD 슬라이드에 부착하고 전체 섹션을 추출 버퍼로 해부하여 벌크 단면 식 서명을 가져옵니다.
- LMD 프로세스가 완료되면 수집 마이크로 센심 분리기 튜브를 닫고 적극적으로 움직여 내용이 캡에서 튜브 바닥으로 이동하도록 합니다.
- 30 s에 대 한 3,000 x g에서 튜브원심 분리.
- 튜브를 42°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다.
- 2 분 동안 3,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 새로운 0.5 mL 튜브로 상체를 전송하고 -80 °C에 저장합니다.
3. RNA 절연
참고 : 이 RNA 격리 프로토콜의 경우 상용 RNA 격리 키트의 프로토콜을 적용했습니다. 제조업체의 프로토콜은 프로젝트에 대해 설정된 품질 관리 요구 사항을 충족하도록 수정되었습니다.
- 각 RNA 정제 컬럼(PC)에 250 μL의 컨디셔닝 버퍼(CB)를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 원심 분리기 모든 PC는 16,000 x g에서1 분 동안 .
- 조직 샘플이 있는 튜브에 70%의 에탄올(키트제공)의 50μL을 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 샘플을 잘 섞는다. 소용돌이하지 마십시오. 원심 분리하지 마십시오.
- 혼합물을 100 x g에서 2 분 동안 조건부 PC및 원심분리기로 옮기십시오 (RNA를 결합하려면), 신속하게 16,000 x g에서 30 s에 대한 원심 분리 (통해 흐름을 제거하기 위해)에 따라. 조직 샘플이 있는 1개 이상의 튜브가 지정된 하위 세그먼트에 사용할 수 있는 경우 이 단계를 반복하십시오.
- 8,000 x g에서 1분 동안 PC와 원심분리기에 100 μL의 워시 버퍼 1(WB1)을 넣습니다.
- 각 샘플당 40 μL의 DNase를 준비하십시오(RDD 버퍼의 35 μL에 DNase 5 μL 추가). 그런 다음 PC의 멤브레인에 직접 혼합물의 40 μL을 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다.
- PC의 멤브레인에 WB1의 40 μL을 추가하고 원심분리기를 8,000 x g에서 15s에 추가합니다.
- PC 멤브레인에 워시 버퍼 2(WB2)의 100 μL을 추가하고 원심분리기는 8,000 x g에서 1분 동안 추가합니다.
- PC의 멤브레인에 WB2의 100 μL을 추가, 16,000 x g에서2 분 원심 분리기, 즉시 16,000 x g에서1 분 원심 분리에 의해 다음.
- PC를 새로운 0.5mL 튜브로 전송합니다.
- 12 μL의 용출 버퍼(EB)를 멤브레인에 넣고 실온에서 7분 동안 배양합니다. 따라서, 풀로 풀화된 모든 해부된 조직 샘플의 최종 부피는 하위 세그먼트당 12 μL이다.
- 원심 분리는 1,000 x g에서 1 분 동안 샘플을 원심분리한 다음 16,000 x g에서2 분 동안.
- 2 μL을 생체 분석기 분석을 위한 신선한 튜브로 전송합니다(동결 해동 이벤트를 방지하기 위해).
- 추가 처리를 위해 준비될 때까지 모든 튜브를 -80°C에 보관하십시오.
4. RNA 염기서열 분석
- 상용 Bioanalyzer및 소량의 RNA를 측정하는 데 전념하는 칩을 사용하여 품질을 위해 시퀀싱을 위한 각 샘플을 평가합니다.
- 라이브러리 준비 및 시퀀싱 전에 품질 관리(QC) 매개 변수에 따라 필요한: 대량에 대해 4ng보다 큰 RNA의 수량과 각 하위 세그먼트에 대해 0.5 – 1 ng보다 큰; 200개의 뉴클레오티드(DV200)를 초과하는 녹취록의 퍼센트는 LMD 표본(최적 > 75%)의 경우 25% 이상이어야 합니다.
- 소량의 저하된 RNA를 위한 상업용 cDNA 라이브러리 준비 키트로 라이브러리 준비를 수행합니다. 보충교재에 기재된 상용 키트의 경우 옵션 2를 사용하는 것이 좋습니다. 일부 시퀀싱 기술은 30%7과같은 더 높은 최소 DV200 임계값을 요구할 수 있습니다.
- cDNA 어댑터 및 인덱스를 추가합니다.
- 마그네틱 비드 기술을 사용하여 RNAseq 라이브러리를 정화합니다.
- RNAeq 라이브러리 증폭 단계 전에 상업용 rRNA 제거 키트를 사용하여 리보소말 cDNA를 고갈시다.
- 2 ng/μL cDNA 라이브러리 농도에서 자기 비드 기술을 사용하여 최종 RNAseq 라이브러리를 정화합니다.
- 상용 시퀀싱 시스템에서 75bp 의 RNA 시퀀싱을 수행하여 3천만 개의 읽기/샘플을 대량으로, 하위 세그먼트 섹션의 경우 1억 개의 읽기/샘플을 제공합니다.
- 모든 시퀀싱 실행과 함께 참조 RNA(25 μg)를 사용하여 배치 효과를 제어할 수 있습니다. 우리의 참조 RNA의 초기 농도는 1 μg/μL이고, 시퀀싱에 활용되는 최종 농도는 25 ng/μL입니다. 라이브러리 준비 중에 별도의 샘플로 참조 RNA를 실행하고 매번 모든 LMD 시편과 함께 실행한다.
- FastQC 응용 프로그램을 활용하여 시퀀싱, 간질 및 미토콘드리아 판독의 품질을 평가하고 유전자에 기인하는 읽기를 결정하는 데이터 분석을 수행합니다.
- 통합 유전체학 뷰어(IGV)를 사용하여 정렬 및 edgeR/rbamtools를 사용하여 성적증명서 발현 측정을 제공합니다.
- 100,000개 미만의 읽기로 샘플을 제거합니다. 정량적 사용자 정의 임계값에서 낮은 발현 유전자를 필터링 한 후 데이터 세트에서 원시 판독을 정규화합니다.
- 다른 모든 하위 세그먼트 및 log2 변환의 평균에 대한 관심 하위 세그먼트의 비율로 식을 정량화합니다. 동일한 유전자의 상대적 발현은 하위 세그먼트 및 샘플에 걸쳐 비교될 수 있습니다. 그러나, 유전자와 RNA 종에 걸친 저하의 잠재적 인 차이로 인해 두 개의 다른 유전자 사이의 상대적 발현을 비교하는 것은 이상적이지 않다.
- 참조 RNA 샘플은 배치 전반에 걸쳐 비교되는 동안, 각 nephron 하위 세그먼트에 특정 제조 업체의 집합에 대한 유전자 발현을 비교하는 농축 분석을 수행. R 값 > 0.9를 사용하는 평균 식의 1표준 편차 내에서 일괄 처리 효과가 허용되는 것으로 간주됩니다. 더 높은 배치 효과 점수에는 추가 정규화가 필요합니다. 허용된 일괄 처리 효과에서 벗어난 모든 실행은 플래그를 지정할 수 있습니다. Q30은 각 시퀀싱 실행에 대해 >90%보다 커야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
샘플
우리는 신장 신장 신장 세그먼트 및 간질 지역을 격리하기 위하여 급속한 형광 염색 프로토콜을 활용하여 9개의 참조 신장 절제술 (인디애나 대학에서 얻은 3개의 견본 및 신장 정밀 의학 프로젝트를 통해 얻은 6개의 견본)에서 데이터를 제시합니다. 이 과정에서 활용된 단면은 죽은 신장 기증자 또는 영향을 받지 않는 종양 신장 절제술에서 얻어졌습니다. 이들 샘플은 인접한 섹션에서 채취한 H&E얼룩(도 1A)에서가시화된 질병의 병리학적 증거를 갖지 못했다.
레이저 미세 절 품질 관리
신장에 있는 관 하위 세그먼트의 식별은 독특한 관 마커의 항체 염색뿐만 아니라 형태학 및 구조적인 랜드 마크를 통해 달성됩니다. 도 1B-C는 대표적인 신장 절제술에서 관 하위 세그먼트의 염색 및 미세 절을 보여줍니다. 이것은 DAPI (핵), FITC-Phalloidin (F-actin) 및 필요에 따라 추가 항체로 염색함으로써 달성된다. 사용된 형광 염색은 높은 수준의 자신감으로 신장 하위 세그먼트를 시각화할 수 있게 하었으며, 이미지 구조의 공간 위치뿐만 아니라 형태학적 특징에 의해 더 유도되었다(도2). 예를 들어, 글로메룰리는 매우 독특한 형태와 함께 염색 하는 phalloidin와 DAPI 염색에 의해 밝혀. 마찬가지로, 덕트를 수집하는 것은 핵 형태와 다른 얼룩의 부재를 사용하여 시각화됩니다. 메가린/LRP2 항체(알렉사 플루오르 568에 직접 컨쥬게이드)는 근해 튜블러를 식별하는 데 사용된다. 두꺼운 상승 사지는 탐-호르스폴 단백질(THP) 항체(알렉사 플루오르(546)에 직접 공주함)을 사용하여 시각화된다. 대조적으로, 간질은 관의 외부 막을 따라 절제되고 기질과 면역 세포뿐만 아니라 작은 모세 혈관을 포함한다.
서브 세그먼트당 0.5 ~1ng의 충분한 RNA를 얻기 위해 최소 면적500,000 μm2를해부하고자 합니다. 이것은 일반적으로 모든 하위 세그먼트에 대한 충분한 재료를 얻기 위해 5 ~ 8 개의 12 μm 두께 섹션 (슬라이드 당 1 섹션)이 필요합니다. 슬라이드의 해부는 슬라이드 당 ~ 4 세그먼트를 절단 할 수있는 RNA 품질을 보존하기 위해 2 시간 이내에 완료됩니다. 동일한 하위 세그먼트에서 획득된 조직은 다운스트림 시퀀싱을 위해 여러 슬라이드에서 풀링됩니다. LMD 전후 면역형광 이미지는 부착된 카메라를 사용하여 관심 있는 하위 세그먼트의 컬렉션을 검증하기 위해 얻어진다. 도 3은 해부 면적및 최소 RNA 입력의 성공률을 묘사합니다. 최소 영역 입력을 충족하는 성공률은 이 대표적인 데이터 집합에서 >90%였습니다. 소스 조직이 CD 또는 간질의 양이 적으면, 8개의 슬라이드를 이용한 후 이러한 세그먼트에 대해 해부 면적이 500,000 μm2 미만일 가능성이 있다. 사용자의 필요에 따라 추가 슬라이드를 잘라낼 수 있습니다. 그러나 도 3에서볼 수 있듯이, 면적이 500,000 μm2에가까우면, 원하는 유전자 검출 횟수는 높은 성공률(100%)을 갖는다. 총 판독 횟수 성공률은 98.6%입니다(표본 1편이 QC 지표보다 낮음). 따라서, 충분한 유전자를 달성하고 추가 조직을 활용하지 않고 카운트를 읽을 수있는 충분한 조직이 있었다.
입력 품질 관리 시퀀싱
선택된 상용 라이브러리 준비 및 시퀀싱 플랫폼은 고도로 저하된 RNA의 낮은 수량에도 불구하고 성적증명서 발현을 재현할 수 있는 측정을 가능하게 합니다. 최소 RNA 입력은 500 pg이고 최소 DV200(길이200개 이상의 뉴클레오티드 보다 더 긴 판독비율)은 25% 이상이다. 최소 RIN은 없습니다. 샘플당 1억 개의 판독으로 시퀀싱하여 저발현 성적증명서를 감지하기 위해 사용 가능한 판독을 포화시키려고 합니다. 전체 읽기는 사용자의 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
2개의 12 μm 벌크 단면 단면에서 충분한 RNA를 얻는 것은 간단합니다, 그래서 우리는 대량 시퀀싱을 위한 4 ng의 더 높은 최소 총 mRNA 수량을 얻기 위하여 노력합니다. 프로토콜에서 설명된 바와 같이, 각 하위 세그먼트는 총 RNA에서 0.5-1 ng를 필요로 한다. 최적 RNA 농도는 격리 후 50 pg/μL 이상입니다. 이보다 RNA 양은 감소된 유전자 검출으로 이끌어 낼 수 있고 관찰된 수를 읽습니다. 샘플의 대부분은 20,000개의 유전자가 검출되고 >1백만 개의 판독을 산출합니다. 모든 시편에 대해 25% 이상의 DV200은 제조업체에서 요구합니다(>75%는 최적이라고 간주됩니다). RIN을 측정하지만 레이저 미세 절의 공정은 RIN을 감소시키고 RNA 염기서열 분석 플랫폼은 단편화된 RNA에 최적화되었습니다. RNA 수량 및 품질은 시퀀싱 전에 바이오 분석기에서 평가됩니다. 급속한 얼룩은 조직이 실온 및 수성 조건에 노출되는 시간의 양을 감소시켜 RNA의 저하 가능성을 최소화합니다. 시퀀싱 입력을 위한 DV200 품질 관리 메트릭도 그림 3에서발견됩니다.
시퀀싱 출력 품질 관리
다운스트림 데이터 처리는 정량 적 정규화를 사용하여 서로 다른 배치의 샘플 간의 비교를 허용합니다. 최소 유전자 검출 횟수는 10,000개이고 최소 판독 횟수는 1백만 개로 정량적 정상화에 샘플을 포함하는 임계값으로 사용됩니다. 유전자 검출 또는 판독 수가 낮은 샘플은 정량 적 정상화 및 후속 비교 분석에서 제외됩니다. 해부된 하위 세그먼트 샘플 98개 중 1개만 이러한 임계값을 충족하지못했습니다(그림 3). Q30(99.9% 신뢰도)은 각 시퀀싱실험(그림 4)에대해 93%를 초과했습니다.
이러한 보정이 원하거나 필요한 경우 배치 효과를 보정할 수 있도록 각 시퀀싱 실행으로 인간 참조 RNA(25 ng)를 서열한다. 측정된 배치 효과는 R 값 > 0.9를 가진 평균 식의 1 표준 편차 내에 있어야 합니다. 일괄 처리 효과가 더 높은 경우 해당 시퀀싱 실행에 대해 추가 정규화가 필요합니다. 여기서, 도 4에묘사된 4개의 시퀀싱 실험에서 배치 효과는 3% 미만이었다. 따라서, 배치 효과는 전형적으로 모든 시퀀싱 실행에 대한 정량 적 정규화로 해결되고, 참조 RNA에 불가지론적이다. RNA 참조에 근거하여 아무 보정도 아직 구현되지 않았습니다, 그러나 이 정보는 유효하고 특정 분석의 목표에 따라 사용될 수 있었습니다.
엄격함과 재현성
세포 유형 및 구조를 식별하는 데 있어 엄격함을 입증하는 것이 중요합니다. 레이저 마이크로절 후, 다른 구획(표1)에비해 사구, PT, TAL, CD 및 간질에서 공지된 마커의 농축을 테스트합니다. 농축 분석은 미리 결정된 예상 마커에 대한 유전자 발현을 비교하기 위해 사용됩니다. 유전자 발현은 다른 서브 세그먼트의 평균에 비해 관심 의 하위 세그먼트의 발현의 로그2 비율로 전달된다. 이 식 메트릭은 개인 간 가변성을 감소시켜 표본 간에 셀과 구획 유형 간의 비교를 용이하게 하기 때문에 인간 샘플에 대해 선택되었습니다. 그러나 원시 읽기 및 정량화 된 읽기는 대체 분석에서도 비교될 수 있습니다. 피규어e 5는 인간 단백질 아틀라스에 제시된 바와 같이 이들 5개의 알려진 마커의 면역히스토케화학 염색의 예를 보여줍니다.
따라서, 우리는 수집되는 올바른 하위 세그먼트에 자신감을 빌려주는 직교 데이터 소스를 제시한다: 1) 세그먼트/구획의 항체 얼룩 및 형태학을 포함하는 이미징, 및 2) 공지된 마커를 나타내는 발현 출력은 해당 하위 세그먼트로 표현된다.
각 하위 세그먼트에서 발현된 유전자의 지역 전사 분석은 신규하고 과소평가된 마커 식별을 허용합니다. 도 6은 또한 해당 네프론 하위 세그먼트의 특정 면역 히스토케미컬 염색을 산출LMD 지역 전사학을 통해 확인된 각 하위 세그먼트에 대한 하나의 마커의 예를 도시한다.
재현성을 입증하고 작업자 가변성의 효과를 이해하기 위해 종양 신장 절제술 샘플에 대한 실험을 수행했습니다. 이 시편은 RNA 시퀀싱 결과의 신뢰를 높이기 위해 사구, PT 및 TAL을 재해부였으며 이제 유용한 기술적 복제역할을 한다. 몇 달 간격으로, 이 샘플은 저온 절제, 항체 염색, LMD 해부, RNA 추출, 라이브러리 준비 및 RNA 시퀀싱(그림7)의실로메룰리, PT 및 TAL 구획의 두 번째 인스턴스를 거쳤습니다. 두 버전(v1 및 v2)을 비교했습니다. 사구체, PT 및 TAL 구획은 참조 RNA의 최소 배치 효과와 유사한 r2 값 >0.95와 매우 상관관계가 있었습니다.
그림 1: 신장 조직의 대표적인 이미지입니다.
(A)인간 기준 신장 조직의 H&E 얼룩. (B)LMD 전에 염색된 두꺼운 상승 사지 세그먼트를 가진 인간 기준 신장 조직의 면역형이미지 및(C)단일 두꺼운 상승 사지 구조의 해부 직후. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 특정 면역 형광 염색 접근법을 사용하여 20x에서 시각화된 참조 신장 하위 세그먼트의 대표적인 이미지.
(a))는 글로메루스,(B)근위 투불,(C)두꺼운 오름차순 사지,(D)수집 덕트,(E)간질. (*= p&05, **= p&01, ***= p<, 0.001 By ANOVA). 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세그먼트 전사학의 품질 관리 메트릭입니다.
(A)파일럿 샘플의 90% 이상이 500,000 μm2의해부 면적 입력 임계값을 충족하였다. (B)1개를 제외한 모든 시료는 최소 500 pg.(C)파일럿 샘플의 100%가 제조업체의 최소 DV200 임계값을 25%로 충족하고(D)샘플의 100%가 검출된 최소 10,000개의 유전자임계값을 충족하였다. (E)1개를 제외한 모든 샘플은 최소 총 판독 횟수 인 100만 개에 도달했습니다. 예상대로, 낮은 해부 영역은 감소 된 RNA 농도와 상관 관계, 낮은 유전자 수, 낮은 읽기 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 품질 관리 시퀀싱.
(A)기준 RNA를 채용하는 시퀀싱 실행(정량화되지 않음)은 모든 실행의 평균 발현과 비교된다. 최소 배치 효과(모든 R>0.969)와 강한 상관 관계가 있습니다. (B)전체 실행에서 우리의 판독의 93 % 이상이 높은 신뢰 (Q30 또는 99.9 %)로 매핑되었다. Q30 값은 런당 여러 차선으로 차선 별로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 선택된 공지된 마커를 식별하기 위한 면역히스토케미칼 염색의 예.
이미지는(A)NPHS1(B)LRP2(C)UMOD(D)SLC4A9(E)COL6A2에 대한 묘사된다. 면역히스토케심은 인간 단백질 아틀라스로부터 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 관련 하위 세그먼트에서 비전통적인 마커 유전자의 발현을 예시하기 위해 면역히스토케미칼 염색의 예.
상응하는 면역히스토케와 함께 묘사된 성적증명서는(A)SHANK3를 사구체로,(B)근위 관에 ACSM2B,(C)RAP1GAP을 두꺼운 상승 사지에서, 및(D)L1CAM을 수집 덕트에서 포함한다. 면역히스토케심은 인간 단백질 아틀라스로부터 얻어진다. (*= p&0.0001 By ANOVA) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 동일한 샘플의 별도의 시퀀싱을 가진 두 개의 별개의 해부 간의 상관 관계입니다.
(A)사구체,(B)근위 관,(C)헨의 두꺼운 오름차순 루프에서 상이한 해부 사이에 높은 수준의 상관관계가 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 마커 | 세그먼트 | 접이식 변화 | p-값 |
| NPHS1 | 글로메루스 | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | 동체 투굴 | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | 두꺼운 오름차순 사지 | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | 덕트 수집 | 4.09 | 0.000133 |
| 콜6A2 | 인터스티튬 | 7.19 | 1.47E-06 |
표 1: 나머지 하위 세그먼트에 비해 세 개의 신장 절제술 샘플 중 관심 있는 각 하위 세그먼트에 대한 대표 평균 값입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD 기반 전사학은 조직 내의 특정 영역에 유전자 발현을 고정시키는 유용한 기술이다. 이 기술의 기초와 신장에 그것의 잠재적인 응용은 이전에 기술되었습니다8. 그러나, 특히 다운스트림 RNA 시퀀싱을 위한 고정밀 해부를 겨냥한 형광 계 해분의 최적화, 현대화 및 합리화는 덜 유비쿼터스이다. 이 방법론은 조직 내 공간적으로 접지되기 때문에 조직 구조에서 새로운 또는 과소 평가 된 마커를 드러낼 가능성이 있습니다. 사실, 세포의 많은 일반적인 마커는 질병으로 변경될 수 있습니다, 따라서 공간 맥락없이 정체성 판결에 대한 세포 RNA 발현 마커에 만 의존하는 것은 질병 상태에서 도전적 일 수있다. 따라서, 공간적으로 고정된 LMD 접근법은 유전자 발현 프로파일9에의해 주로 세포를 정의하는 단일 세포 및 단일 핵 RNA 시퀀싱과 같은 많은 다른 전사 기술에 대한 지상 진실 플랫폼을 보완하고 제공할 가능성이 높다. 더욱이, LMD(샘플당 최대 20,000개의 유전자)가 제공하는 유전자 발현의 깊이는 여러 소스로부터 데이터를 교차 연결하고 특정 깊이 없이는 명백하지 않을 수 있는 유전자 발현의 변화를 고려하는 또 다른 이점및 중요한 장소를 제공한다. 조직 경제의 고려는 이 기술의 또 다른 긍정적인 특징이며, 동결된 블록에서 총 100μm 미만의 두께가 전체 LMD 데이터 집합에 충분할 수 있습니다. 이것은 남은 조직이 그밖 분석 목적을 위해 이용될 수 있습니다.
LMD에는 제한이 있습니다. 레이저 미세 절 전사 데이터 수집의 한 가지 예상 한계는 낮은 처리량 특성입니다. 미래의 자동화는 확장성 향상에 중요 할 수 있습니다10,11. LMD 전사학의 두 가지 추가 제한은 전문 지식에 대한 의존성과 조직 품질이 데이터 결과에 미치는 영향을 포함합니다. 관심 세그먼트 외부의 셀 및 물질의 부주의한 수집은 단일 셀이 아닌 세포의 농축 구획을 수집하기 때문에 알려진 한계입니다. LMD는 조직 구조를 이해하는 데 있어 사용자의 숙련도에 의존하므로 특정 도메인 전문 지식이 필요합니다. 따라서, 개인은 항체 염색의 유무에 관계없이 신장에 있는 관련 지구를 확인하기 위하여 훈련되어야 합니다. 마지막으로, 조직 품질의 효과는 다운스트림 데이터 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. LMD 프로토콜은 조직 저하로 이어지므로 시작 물질의 품질이 중요합니다. 그러나, 이 프로토콜은 적당한 품질의 몇몇 견본을 가진 보관된 생검에 최적화되었습니다. 포함된 데이터는 선택한 전사 플랫폼이 견고하다는 것을 보여줍니다.
참고, 사용되는 절연 키트 및 RNA 시퀀싱의 다운스트림 방법론은 예상되는 RNA 분해 정도에 맞게 특별히 조정되어야 한다. 여기에 설명된 염색 프로토콜은 이러한 효과를 최소화하는 데 가장 유리한 영향을 미쳤기 때문에 채택되었다. 이 프로토콜에서 조직은 다른 전사 기술에 걸쳐 향후 비교를 용이하게하기 위해 OCT에 내장되었다. 그러나, 포르말린 고정 조직은 대안일 수 있다.
이 원고에 제시된 데이터는 최적화, 품질 관리 메트릭 및 기술 결과를 포함한 지역 전사학의 이점을 보여줍니다. 엄격한 사전 분석 및 분석 품질 관리 기준의 확립, 또한 엄격성과 재현성의 확실한 증거의 확립은 모든 방법론에 필수적이다. 향후 지역 전사학의 적용은 생물학적 응용, 기술 발전 및 분석 진행으로 광범위하게 그룹화될 수 있습니다. 미래의 생물학적 응용 프로그램은 부상, 부상, 및 염증에 가까운 튜블러뿐만 아니라 튜블러를 재생에서 조직의 심문을 목표로 할 수있다. 이 구획은 전통적인 형태학적 마커뿐만 아니라 "통로"특정 마커에 대한 항체 얼룩에 의해 모두 동일한 생검에서 확인할 수 있습니다. 이 기술, 메갈린 및 우로모둘린에서 사용하기 위해 검증된 두 개의 항체 마커는 근위 튜블러와 두꺼운 오름팔에서 각각 높게 발현된다. 그러나, 이러한 마커가 가혹하게 병들게 병들게 된 조직에서 감소될 수 있다. 이러한 상황에서, 그들의 발현 수준을 변경하지 않는 통로 특정 마커 또는 새로운 마커의 추가 항체 유효성 검사는 이 문제점을 극복할 수 있다.
LMD는 다른 장기의 전사 심문에서 사용하기에 적합한 방법이 될 가능성이 높습니다. 급속한 염색을 위해 작동하는 항체의 선택 그리고 최적화는 필수적일 것입니다. 일반 염색 프로토콜에서 작동하는 항체는 반드시 높은 친화성 항체를 필요로 하는 급속한 염색 프로토콜을 위해 작동하지 않을 수 있습니다. 1 차 적인 공인 된 항체는 필요한 단계를 최소화하고 이점을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 형광에 대한 항체의 결합은 결합을 변경할 수 있으며, 파일럿 실험은 프로토콜에서 이러한 시약을 통합하기 전에 수행되어야 한다.
결론적으로, 우리는 전사 분석을 가능하게 하기 위하여 인간 신장에 있는 특정 지역 및 구조물을 격리하기 위하여 형광 계 레이저 미세 절부에 대한 파이프라인을 기술합니다. 이 접근은 중요한 이점을 제공하고 조직 기지를 둔 분자 심문을 제공하기 위하여 그밖 조직으로 확장될 수 있습니다. 지역 전사학은 표현을 이해하는 조직학적 앵커를 제공하고 생물학의 해석과 건강과 질병의 서명을 지원함으로써 다른 전사 기술을 보완합니다. 이 기술은 신장의 전사 아틀라스를 구축하기위한 비전 내에서 자연스럽게 맞습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
일반: 저자는 신장 정밀 의학 프로젝트 (www.kpmp.org)의 조사자들에게 은혜로운 지원과 조언을 감사드립니다.
자금 조달: 이 작업에 대한 지원은 NIH /NIDDK K08DK107864 (M.T.E.)에 의해 제공되었다; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). 이 원고에서 보고된 연구는 국립 당뇨병 및 소화 및 신장 질환 연구소(NIDDK) 신장 정밀 의학 프로젝트(KPMP),(www.kpmp.org)에 의해 지원되었으며, 수상 번호 U2CDK114886에 의해 지원되었다.
데이터 및 재료 가용성: 데이터는 유전자 발현 옴니버스에 보관됩니다(GEO # 보류 중)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
