Summary
Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.
Abstract
El análisis de la expresión génica del tejido renal humano es una herramienta importante para entender la homeostasis y la fisiopatología de la enfermedad. Se necesita aumentar la resolución y profundidad de esta tecnología y extenderla al nivel de las células dentro del tejido. Aunque el uso de secuenciación única de ARN nuclear y unicelular se ha generalizado, las firmas de expresión de las células obtenidas de la disociación tisular no mantienen el contexto espacial. La microdisección láser (LMD) basada en marcadores fluorescentes específicos permitiría el aislamiento de estructuras específicas y grupos celulares de interés con localización conocida, permitiendo así la adquisición de firmas transcriptómicas ancladas espacialmente en el tejido renal. Hemos optimizado una metodología LMD, guiada por una mancha rápida a base de fluorescencia, para aislar cinco compartimentos distintos dentro del riñón humano y llevar a cabo la posterior secuenciación de ARN de valiosas muestras de tejido renal humano. También presentamos parámetros de control de calidad para permitir la evaluación de la adecuación de los especímenes recogidos. El flujo de trabajo descrito en este manuscrito muestra la viabilidad de este enfoque para aislar firmas transcriptómicas sub-segmentales con alta confianza. El enfoque metodológico que se presenta aquí también puede aplicarse a otros tipos de tejidos con la sustitución de marcadores de anticuerpos relevantes.
Introduction
Los avances tecnológicos en el estudio de muestras de tejidos han mejorado la comprensión del estado de salud y enfermedades en varios órganos. Estos avances han puesto de relieve que la patología puede comenzar en regiones limitadas o en tipos celulares específicos, pero tienen implicaciones importantes en todo el órgano. Por lo tanto, en la era actual de la medicina personalizada, es importante entender la biología tanto a nivel celular como regional y no sólo a nivel mundial1. Esto es particularmente cierto en el riñón, que se compone de varias células especializadas y estructuras que inician y/o responden diferencialmente al estrés patológico. La patogénesis de varios tipos de enfermedad renal humana todavía no se entiende bien. Generar una metodología para estudiar los cambios en la expresión génica en segmentos tubulares específicos, estructuras o áreas del interstitium en el riñón humano mejorará la capacidad de descubrir cambios específicos de la región que podrían informar sobre la patogénesis de la enfermedad.
Los especímenes de biopsia renal humana son un recurso limitado y precioso. Por lo tanto, las tecnologías que interrogan la transcriptómica en el tejido renal deben optimizarse para economizar el tejido. Los métodos disponibles para estudiar la transcriptómica a nivel celular y regional incluyen secuenciación de ARN de una sola célula (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridación espacial in situ y microdissección láser (LMD). Este último es adecuado para el aislamiento preciso de regiones o estructuras de interés dentro de las secciones de tejido, para secuenciación y análisis de ARN aguas abajo2,3,4,5. La LMD se puede adoptar para basarse en la identificación de tipos o estructuras celulares específicas basadas en marcadores validados utilizando imágenes basadas en fluorescencia durante la disección.
Las características únicas de la transcriptómica regional asistida por microdisección láser incluyen: 1) la preservación del contexto espacial de las células y estructuras, que complementa las tecnologías unicelulares donde las células se identifican por expresión en lugar de histológicamente; 2) la tecnología informa y es informada por otras tecnologías de imágenes porque un marcador de anticuerpos define firmas de expresión; 3) la capacidad de identificar estructuras incluso cuando los marcadores cambian en la enfermedad; 4) detección de transcripciones poco expresadas en aproximadamente 20.000 genes; y 5) notable economía de tejidos. La tecnología es escalable a una biopsia renal con menos de 100 μm de espesor de un núcleo necesario para la adquisición suficiente de ARN y permite el uso de tejido congelado archivado, que comúnmente están disponibles en grandes repositorios o centros académicos6.
En el trabajo subsiguiente, describimos la tecnología de transcriptómica regional y a granel en detalle, optimizada con un nuevo protocolo de tinción rápida de fluorescencia para su uso con tejido renal humano. Este enfoque mejora las exploraciones lmd clásicas porque proporciona datos de expresión independientes para los subsegmentos de interstitium y nefrón en lugar de la expresión tubulointersticial agregada. Se incluyen las medidas de control y garantía de calidad implementadas para garantizar el rigor y la reproducibilidad. El protocolo permite la visualización de células y regiones de interés, lo que resulta en la adquisición satisfactoria de ARN de estas áreas aisladas para permitir la secuenciación de ARN aguas abajo.
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Protocol
El estudio fue aprobado para su uso por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Indiana.
NOTA: Utilice este protocolo con tejido de nefrectomía renal (hasta 2 cm en las dimensiones X e Y) conservado en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y almacenado a -80 °C. Realice todo el trabajo de una manera que limite la contaminación por ARN, use guantes desechables limpios y una máscara facial. Asegúrese de la limpieza de todas las superficies. El equipo para el que se optimizó este protocolo es un sistema de microdisección láser con láser UV pulsado.
1. Criosección
- Exponer 1,2 μm LMD PPS-membrana (poli(sulfuro de fenileno) se desliza a la luz UV (en una campana de flujo laminar de cultivo de tejido) durante 30 minutos, inmediatamente antes de la criosección. Guarde las diapositivas a temperatura ambiente para una adherencia óptima del tejido.
- Enfríe el criostato a -20 °C. Limpie las superficies de trabajo e instale una nueva hoja de corte.
- Coloque una pequeña caja deslizante (limpiada con solución de descontaminación superficial RNase) dentro de la cámara criostato para almacenar diapositivas con tejido recién cortado.
- Adhiera la muestra en OCT a un soporte de tejido y deje que se equilible durante unos minutos para alcanzar la temperatura de la cámara y fortalecer la adherencia entre el bloque OCT y el soporte. Ayudar al proceso mediante el uso de un extractor de calor.
- Corte la muestra a un espesor de 12 μm y colótela en la diapositiva LMD especializada, utilizando el adaptador de diapositivas. Cada diapositiva contiene una sección de nefrectomía por diapositiva o hasta dos secciones de biopsia renal por diapositiva. Guarde las diapositivas a -80 °C con un cartucho desecante y dentro de una bolsa de plástico bien cerrada para evitar que el exceso de humedad se acumule dentro de la caja deslizante.
- Etiquete cada diapositiva con un ID de muestra, fecha y número de diapositiva.
- Utilice las diapositivas con muestras dentro de los 10 días a partir de la fecha inicial de criosección.
2. Microdisección láser
- Inmediatamente antes de la tinción, prepare la Mezcla de Anticuerpos (Ab-Mix) en 10% BSA en RNase-free PBS añadiendo lo siguiente: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL de anticuerpo tamm-horsfall protein (THP) conjugado directamente a Alexa Fluor 546, 3,3 μL de inhibidor de la anasa y 89,2 μL del 10% de BSA en PBS (para alcanzar un volumen de 100 μL).
NOTA: Se pueden utilizar anticuerpos alternativos en lugar del anticuerpo THP. Por ejemplo, 2 μL de anticuerpo megalíndrico/LRP2, directamente conjugado a Alexa Fluor 568, se pueden utilizar para etiquetar el tubérculo proximal. El Ab-Mix contiene anticuerpo LRP2 o THP (para visualizar tubulos proximales o extremidades ascendentes gruesas, respectivamente). Otros anticuerpos pueden ser validados de acuerdo con las necesidades del usuario. - Lave el tobogán en frío helado (-20 °C) 100% acetona durante 1 min y muévalo a la cámara de humedad.
- Lave la parte superior de la diapositiva con RNase-free PBS durante 30 s. Repita.
- Lave la parte superior de la diapositiva con un 10% de BSA en RNase-free PBS durante 30 s. Repita.
- Aplique ab-mix durante 5 minutos.
- Lave la parte superior de la diapositiva con un 10% de BSA en RNase-free PBS durante 30 s. Repita.
- Seque al aire el tobogán durante 5 minutos y cárguelo en la plataforma de corte por microdisección láser.
- Instale los tubos de recogida (tubos de microcentrífuga autoclavados de 0,5 ml) adecuados para el trabajo de PCR, que contienen 50 μL de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN.
- Proceda con LMD. Complete cada sesión LMD en un plazo máximo de 2 horas.
- Recoger imágenes de inmunofluorescencia pre y post-LMD, utilizando la cámara del microscopio para validar la disección para la variabilidad entre operadores, así como fines de archivo, formación y evaluación de calidad del protocolo realizado. Para obtener 0,5 – 1 ng de ARN, se requiere un mínimo de 500.000 μm2 de área. Esto a menudo requiere el uso de hasta 8 secciones de hasta 8 x12 μm de espesor para obtener una cantidad suficiente de material para todos los subsegmentos de interés.
- Identifique las regiones de interés manchando, morfología y ubicación e incidarlas utilizando potencia láser superior a 40.
NOTA: Estos son los criterios de disección. El tubérculo proximal se define mediante el etiquetado FITC-Phalloidin y LRP2. La extremidad ascendente gruesa se define mediante el etiquetado THP. El conducto de recogida se define por morfología nuclear (DAPI) y ausencia de otras manchas. El glomérculo se define por FITC-Phalloidin y morfología. El intersticio se define como el área entre tubulos manchados.
- Obtenga una firma de expresión transversal masiva colocando dos secciones de 12 μm en una diapositiva LMD y diseccionando todas las secciones en el búfer de extracción.
- Una vez finalizado el proceso LMD, cierre los tubos de microcentrífuga de recogida y deslícelo vigorosamente para asegurarse de que el contenido se moviera de la tapa a la parte inferior del tubo
- Centrífuga los tubos a 3.000 x g durante 30 s.
- Incubar los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 30 min.
- Centrífuga los tubos a 3.000 x g durante 2 minutos.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 0,5 ml y guárdelo en -80 °C.
3. Aislamiento de ARN
NOTA: Para este protocolo de aislamiento de ARN, hemos adaptado un protocolo de un kit comercial de aislamiento de ARN. El protocolo del fabricante se ha modificado para cumplir con los requisitos de control de calidad establecidos para el proyecto.
- Añadir 250 μL de amortiguador condicionado (CB) a cada columna de purificación de ARN (PC) e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Centrífuga todos los PC durante 1 min a 16.000 x g.
- Agregue 50 μL de etanol al 70% (proporcionado en el Kit) en los tubos con muestras de tejido. Mezcle bien las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo. No vórtice. No centrífugas.
- Transferir la mezcla a PC acondicionados y centrífuga durante 2 minutos a 100 x g (para unir ARN), siga rápidamente con centrifugación durante 30 s a 16.000 x g (para eliminar el flujo a través). Repita este paso si hay más de 1 tubo con muestras de tejido disponibles para cualquier subsegmento dado.
- Añadir 100 μL de wash buffer 1 (WB1) en los PC y centrífuga durante 1 minuto a 8.000 x g.
- Preparar 40 μL de DNase por cada muestra (Añadir 5 μL de DNase a 35 μL de búfer RDD). A continuación, añadir 40 μL de la mezcla directamente en la membrana del PC e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 40 μL de WB1 en la membrana de PC, y centrífuga para 15 s a 8.000 x g.
- Añadir 100 μL de wash buffer 2 (WB2) en la membrana de PC, y centrífuga durante 1 min a 8.000 x g.
- Añadir 100 μL de WB2 en la membrana de PC, centrífuga durante 2 min a 16.000 x g,seguido inmediatamente por centrifugación durante 1 min a 16.000 x g.
- Transfiera el PC a un nuevo tubo de 0,5 ml.
- Añadir 12 μL de Elution Buffer (EB) en la membrana e incubar durante 7 min a temperatura ambiente. Por lo tanto, el volumen final de todas las muestras de tejido diseccionado agrupadas es de 12 μL por subsegmento.
- Centrífuga las muestras durante 1 min a 1.000 x g y luego durante 2 min a 16.000 x g.
- Transfiera 2 μL a un tubo fresco para el análisis de Bioanalyzer (para prevenir eventos de congelación y descongelación).
- Almacene todos los tubos a -80 °C hasta que estén listos para su posterior procesamiento.
4. Secuenciación de ARN
- Evaluar cada muestra, destinada a la secuenciación, para la calidad utilizando un Bioanalyzer comercial y un chip dedicado a medir pequeñas cantidades de ARN.
- Se requieren siguientes parámetros de control de calidad (QC) antes de la preparación y secuenciación de la biblioteca: Cantidad de ARN superior a 4 ng para granel y superior a 0,5 – 1 ng para cada subsegmento; El porcentaje de transcripciones superiores a 200 nucleótidos (DV200) debe ser superior al 25% para las muestras lmd (óptimo > 75%).
- Lleve a cabo la preparación de la biblioteca con un kit comercial de preparación de la biblioteca cDNA destinado a pequeñas cantidades de ARN degradado. Para el kit comercial enumerado en el suplemento, sugerimos el uso de la opción 2, que requiere un DV200 mínimo del 25% y ninguna fragmentación. Algunas tecnologías de secuenciación pueden requerir umbrales mínimos de DV200 más altos, como 30%7.
- Agregue adaptadores e índices cDNA.
- Purifique las bibliotecas RNAseq utilizando tecnología de cuentas magnéticas.
- Agote el cDNA ribosomal utilizando un kit comercial de eliminación de ARN antes del paso de amplificación de la biblioteca RNAseq.
- Purifique la biblioteca RNAseq final utilizando tecnología de cuentas magnéticas a una concentración de biblioteca cDNA de 2 ng/μL.
- Lleve a cabo la secuenciación de ARN de 75 bp de extremo emparejado en un sistema de secuenciación comercial con 30 millones de lecturas/muestra para granel y 100 millones de lecturas/muestra para secciones subsegcionales.
- Utilice un ARN de referencia (25 μg) con cada ejecución de secuenciación para permitir el control del efecto de lote. La concentración inicial de nuestro ARN de referencia es de 1 μg/μL, mientras que la concentración final utilizada en la secuenciación es de 25 ng/μL.
- Realizar análisis de datos utilizando la aplicación FastQC para evaluar la calidad de las lecturas secuenciatorias, intergénicas y mitocondriales y para determinar las lecturas atribuidas a un gen.
- Utilice el Visor de genómica integrativa (IGV) para la alineación y edgeR/rbamtools para las medidas de expresión de transcripción.
- Retire muestras con menos de 100.000 lecturas. Quantile normaliza las lecturas sin procesar en el conjunto de datos después de filtrar genes expresados humildemente en un umbral definido por el usuario.
- Cuantifique la expresión como una relación del subsegmento de interés con respecto al promedio de todos los demás subsegmentos y log2-transform. La expresión relativa del mismo gen puede compararse entre subsegmentos y muestras; sin embargo, no es ideal comparar la expresión relativa entre dos genes diferentes debido a posibles diferencias en la degradación entre los genes y las especies de ARN.
- Realice un análisis de enriquecimiento para comparar la expresión génica de un conjunto de fabricantes específicos de cada subsegmento de nefrón, mientras que las muestras de ARN de referencia se comparan entre lotes. Un efecto de lote dentro de 1 desviación estándar de expresión media con valor R > 0.9 se considera aceptable. Se requiere una normalización adicional para una puntuación de efecto por lotes más alta. Cualquier ejecución que se desvíe del efecto de lote aceptado se puede marcar. El Q30 debe ser mayor que >90% para cada ejecución de secuenciación.
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Representative Results
Muestras
Presentamos datos de nueve nefrectomías de referencia (3 muestras obtenidas en la Universidad de Indiana y 6 muestras obtenidas a través de Kidney Precision Medicine Project), utilizando el protocolo de tinción rápida de fluorescencia para aislar segmentos de nefrones renales y áreas intersticiales. Las secciones utilizadas en este proceso se obtuvieron de donantes renales fallecidos o nefrectomías tumorales no afectadas. Estas muestras no tenían evidencia patológica de la enfermedad visualizada en la mancha de H&E tomada de secciones contiguas(Figura 1A).
Control de calidad de microdisección láser
La identificación de subsegmentos tubulares en el riñón se realiza a través de la tinción de anticuerpos de marcadores tubulares únicos, así como morfología y puntos de referencia estructurales. La Figura 1B-C ilustra la tinción y microdisección de subsegmentos tubulares de una nefrectomía representativa. Esto se logra manchando con DAPI (núcleos), FITC-Phalloidin (F-actin) y un anticuerpo adicional según sea necesario. La tinción de fluorescencia utilizada hizo posible visualizar subsegmentos renales con un alto grado de confianza, guiados además por entidades morfológicas, así como por el posicionamiento espacial de las estructuras en imágenes(Figura 2). Por ejemplo, los glomérulos son revelados por la faloidina y la tinción DAPI con morfología muy distintiva. Del mismo modo, la recolección de conductos se visualiza utilizando morfología nuclear y la ausencia de otras manchas. El anticuerpo megalin/LRP2 (directamente conjugado a Alexa Fluor 568) se utiliza aquí para identificar tubulos proximales. La gruesa extremidad ascendente se visualiza utilizando un anticuerpo de proteína Tamm-Horsfall (THP) (directamente conjugado a Alexa Fluor 546). Por el contrario, el intersticio se exque a lo largo de la membrana externa de los túbulos e incluye células estromales e inmunes, así como pequeños capilares.
Para obtener un ARN suficiente de 0,5 – 1 ng por subsegmento, buscamos diseccionar un área mínima de 500.000 μm2. Esto generalmente requiere de cinco a ocho secciones de 12 μm de espesor (1 sección por diapositiva) para obtener suficiente material para todos los subsegmentos. La disección de cualquier diapositiva se completa en menos de 2 horas para preservar la calidad del ARN, lo que permite cortar ~4 segmentos por diapositiva. El tejido adquirido del mismo subsegmento se agrupa a partir de varias diapositivas para la secuenciación aguas abajo. Se obtiene una imagen de inmunofluorescencia pre y post-LMD para validar la colección de subsegmentos de interés utilizando una cámara conectada. La Figura 3 delinea las tasas de éxito del área de disección y la entrada mínima de ARN. La tasa de éxito de cumplir con la entrada mínima de área fue de >90% en este conjunto de datos representativo. Si el tejido de origen tiene una pequeña cantidad de CD o interstitium, existe la posibilidad de que el área de disección esté por debajo de 500.000 μm2 para estos segmentos después de utilizar 8 diapositivas. Se podrían cortar diapositivas adicionales en función de las necesidades del usuario; sin embargo, como se ve en la Figura 3, si el área está cerca de 500.000 μm2, el recuento deseado de genes detectados tiene una alta tasa de éxito (100%) y la tasa total de éxito del recuento de lectura es del 98,6% (1 espécimen cayó por debajo de la métrica qc). Por lo tanto, había suficiente tejido para lograr suficiente gen y leer recuentos sin utilizar tejido adicional.
Control de calidad de entrada de secuenciación
La plataforma de preparación y secuenciación de la biblioteca comercial seleccionada permite mediciones reproducibles de la expresión de transcripción, incluso con bajas cantidades de ARN altamente degradado. La entrada mínima de ARN es de 500 pg y el DV200 mínimo (proporción de lecturas de más de 200 nucleótidos de longitud) está por encima del 25%. No hay rin mínimo. Secuenciando con 100 millones de lecturas por muestra, buscamos saturar las lecturas disponibles con el fin de detectar transcripciones poco expresadas. Las lecturas totales se pueden ajustar de acuerdo con las necesidades del usuario.
Es sencillo obtener suficiente ARN de dos secciones transversales a granel de 12 μm, por lo que buscamos obtener una cantidad mínima de ARNM mínima más alta de 4 ng para la secuenciación a granel. Como se delinea en el protocolo, cada subsegmento requiere 0,5-1 ng en el ARN total. La concentración óptima de ARN está por encima de 50 pg/μL después del aislamiento. Las cantidades de ARN inferiores a esta puede conducir a una reducción de la detección de genes y recuentos de lectura observados. La mayoría de las muestras producen >20.000 genes detectados y >1 millón lee. Un DV200 superior al 25% para todas las muestras es requerido por el fabricante (>75% se considera óptimo). Aunque rin se mide, el proceso de microdisección láser reduce rin y las plataformas de secuenciación de ARN se han optimizado para ARN fragmentado. La cantidad y la calidad del ARN son evaluadas por un bioanalizador antes de la secuenciación. La mancha rápida disminuye la cantidad de tiempo que el tejido está expuesto a temperatura ambiente y condiciones acuosas, minimizando así en la medida de lo posible, la degradación del ARN. La métrica de control de calidad DV200 para la entrada de secuenciación también se encuentra en la Figura 3.
Control de calidad de salida de secuenciación
El procesamiento de datos posterior utiliza la normalización cuantilo para permitir la comparación entre muestras en diferentes lotes. Un recuento mínimo de detección de genes de 10.000 y un recuento mínimo de lectura de 1 millón se emplean como umbrales para incluir muestras en la normalización cuantítil. Las muestras con menor detección de genes o recuentos de lectura se excluyen de la normalización cuantilo y de los análisis comparativos posteriores. Sólo 1 de las 98 muestras subsegcionales diseccionadas no pudo alcanzar estos umbrales (Figura 3). El Q30 (proporción de lecturas mapeadas con un 99,9% de confianza) ha sido superior al 93% por cada experimento de secuenciación (Figura 4).
Secuenciamos un ARN de referencia humana (25 ng) con cada ejecución de secuenciación para permitir la corrección del efecto por lotes si dicha corrección es deseada o necesaria. El efecto de lote medido debe estar dentro de 1 desviación estándar de expresión media con un valor R > 0,9. Si el efecto lote es mayor, se requiere una normalización adicional para esa ejecución de secuenciación. Aquí, el efecto lote ha estado por debajo del 3% en los cuatro experimentos de secuenciación representados en la Figura 4. Por lo tanto, el efecto por lotes se aborda normalmente con normalización cuantítil para todas las ejecuciones de secuenciación, agnóstica al ARN de referencia. Todavía no se ha implementado ninguna corrección basada en el ARN de referencia, pero esta información está disponible y podría utilizarse en función de los objetivos de un análisis en particular.
Rigor y reproducibilidad
Es importante demostrar rigor en la identificación de tipos y estructuras celulares. Después de la microdisección láser, probamos para el enriquecimiento de marcadores conocidos en el glomeruli, PT, TAL, CD e interstitium en comparación con los otros compartimentos (Tabla 1). Se utiliza un análisis de enriquecimiento para comparar la expresión génica de los marcadores esperados predeterminados. La expresión génica se transmite como relaciones de registro2 de la expresión del subsegmento de interés en comparación con la media de los otros subsegmentos. Esta métrica de expresión fue elegida para muestras humanas, ya que reduce la variabilidad inter-individual, facilitando las comparaciones entre los tipos de células y compartimentos entre muestras. Sin embargo, las lecturas crudas y las lecturas normalizadas cuantificadas también se pueden comparar en análisis alternativos. La Figurae 5 ilustra ejemplos de tinción inmunohistoquímica de estos 5 marcadores conocidos seleccionados, tal como se presentan en el Atlas de Proteínas Humanas.
Por lo tanto, presentamos fuentes de datos ortogonales que dan confianza al subsegmento correcto que se está recopilando: 1) las imágenes que incluyen la mancha de anticuerpos y la morfología del segmento/compartimiento, y 2) la salida de expresión que muestra los marcadores conocidos se expresan en el subsegmento correspondiente.
El análisis transcriptómico regional de genes expresados en cada subsegmento permite una identificación de marcadores novedosa y poco apreciada. La Figura 6 ilustra un ejemplo de un marcador para cada subsegmento identificado a través de la transcriptómica regional LMD que también produjo una tinción inmunohistoquímica específica del subsegmento de nefrón correspondiente.
Para demostrar la reproducibilidad y comprender el efecto de la variabilidad del operador, realizamos un experimento en una muestra de nefrectomía tumoral. Este espécimen tuvo el glomérulo, PT y TAL reseccionados para aumentar la confianza de los resultados de secuenciación de ARN y ahora sirve como una réplica técnica útil. Con meses de diferencia, esta muestra se sometió a una segunda instancia de criosección, tinción de anticuerpos, disección LMD, extracción de ARN, preparación de bibliotecas y secuenciación de ARN(Figura 7)de los compartimentos glomérulo, PT y TAL. Se compararon las dos versiones (v1 y v2). Los compartimentos glomerulares, PT y TAL estaban altamente correlacionados con valores r2 >0.95, similar al efecto mínimo por lotes de nuestro ARN de referencia.
Figura 1: Imágenes representativas del tejido renal.
(A) Mancha de H&E de un tejido renal de referencia humana. (B) Imagen inmunofluorescente del tejido renal de referencia humana con segmentos de extremidades ascendentes gruesas manchadas antes de LMD y (C) inmediatamente después de la disección de una sola estructura gruesa de las extremidades ascendentes. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de subsegmentos renales de referencia, visualizadas a 20 veces utilizando un enfoque específico de tinción inmunofluorescente.
(A) un Glomerulus, (B) Tubule proximal, (C) Extremidad ascendente gruesa, (D) Recogiendo conducto, (E) Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 por ANOVA). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Métricas de control de calidad en transcriptómica segmental.
(A) Más del 90 % de las muestras piloto cumplieron con el umbral de entrada del área de disección de 500.000 μm2. (B) Todas las muestras excepto una cumplieron con la entrada de ARN deseada de al menos 500 pg. (C) el 100% de las muestras piloto cumplieron con el umbral mínimo de DV200 del fabricante del 25% y (D) el 100% de las muestras cumplieron con nuestro umbral mínimo de 10.000 genes detectados. (E) Todas las muestras excepto una alcanzaron un recuento total mínimo de lectura de 1 millón. Como era de esperar, las áreas de disección más bajas se correlacionan con concentraciones reducidas de ARN, recuentos de genes más bajos y recuentos de lectura más bajos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Control de calidad de secuenciación.
(A) Las ejecuciones de secuenciación que emplean un ARN de referencia (no cuantificado normalizado) se comparan con la expresión media de todas las ejecuciones. Hay una fuerte correlación con el efecto de lote mínimo (todo R >0.969). B) Más del 93% de nuestras lecturas en todas las corridas fueron mapeadas con alta confianza (Q30 o 99.9%). Tenga en cuenta que los valores Q30 se proporcionan por carril con varios carriles por carrera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de tinción inmunohistoquímica para identificar los marcadores conocidos seleccionados.
Las imágenes se representan para (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Las imágenes de inmunohistoquímica se obtienen del Atlas de Proteínas Humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplos de tinción inmunohistoquímica para ilustrar la expresión de genes marcadores notradicionales en subsegmentos relevantes.
Las transcripciones representadas con la inmunohistoquímica correspondiente incluyen (A) SHANK3 en glomérulo, (B) ACSM2B en tubérculo proximal, (C) RAP1GAP en la extremidad ascendente gruesa, y (D) L1CAM en el conducto de recolección. Las imágenes de inmunohistoquímica se obtienen del Atlas de Proteínas Humanas. (*= p < 0,0001 por ANOVA) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Correlación entre dos disecciones distintas con secuenciación independiente de la misma muestra.
Se observó un alto grado de correlación entre diferentes disecciones en el (A) glomérulo, (B) tubérculo proximal, y (C) bucle ascendente grueso de Henle. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Marcador | Segmento | Cambio de pliegue | p-Valor |
| NPHS1 | Glomérulo | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Tubérculo proximal | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Extremidad ascendente gruesa | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Recogida de conductos | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Intersticio | 7.19 | 1.47E-06 |
Cuadro 1: Valores medios representativos para cada subsegmento de interés entre tres muestras de nefrectomía, en comparación con los subsegmentos restantes.
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Discussion
La transcriptómica basada en LMD es una tecnología útil que ancla la expresión génica a áreas específicas dentro del tejido. La base de esta tecnología y su aplicación potencial en el riñón se ha descrito anteriormente8. Sin embargo, la optimización, modernización y racionalización de la disección basada en la fluorescencia específicamente dirigida a la disección de alta precisión para la secuenciación de ARN aguas abajo es menos omnipresente. Debido a que esta metodología está espacialmente arraigada dentro del tejido, tiene el potencial de revelar marcadores novedosos o poco apreciados en las estructuras de los tejidos, especialmente en los estados de la enfermedad. De hecho, muchos marcadores comunes de células pueden cambiar con la enfermedad, por lo tanto, confiar sólo en los marcadores de expresión de ARN celular para la adjudicación de identidad sin el contexto espacial puede ser un desafío en los estados de la enfermedad. Por lo tanto, es probable que el enfoque LMD anclado espacialmente complemente y proporcione una plataforma de verdad en tierra para muchas otras tecnologías transcriptómicas como la secuenciación de ARN de una sola célula y nuclear única, que definen las células predominantemente por su perfil de expresión génica9. Además, la profundidad de expresión génica proporcionada por lmd (hasta 20.000 genes por muestra) proporciona otra ventaja e importante lugar para vincular datos de múltiples fuentes y tener en cuenta cambios en la expresión génica que pueden no ser evidentes sin una cierta profundidad. La consideración de la economía tisular es otra característica positiva de esta tecnología, por la cual un espesor de menos de 100 μm en total de un bloque congelado podría ser suficiente para todo un dataset LMD. Esto permite que el tejido sobrante se utilice para otros fines analíticos.
El LMD tiene limitaciones. Una limitación prevista de la adquisición de datos transcriptómicos de microdissección láser es su menor naturaleza de rendimiento. La automatización futura puede resultar importante para mejorar la escalabilidad10,11. Dos limitaciones adicionales de la transcriptómica lmd incluyen la dependencia de la experiencia y el impacto de la calidad del tejido en los resultados de datos. La recolección involuntaria de células y material fuera del segmento de interés es una limitación conocida porque se recogen compartimentos enriquecidos de celdas, no una sola celda. LMD se basa en el dominio de un usuario en la comprensión de la estructura del tejido y, por lo tanto, requiere una cierta experiencia en el dominio. Por lo tanto, los individuos deben ser entrenados para identificar regiones relevantes en el riñón con y sin manchas de anticuerpos. Por último, el efecto de la calidad del tejido puede afectar a la calidad de los datos aguas abajo. El protocolo LMD conduce a la degradación de los tejidos, por lo que la calidad del material de partida es importante. Sin embargo, este protocolo se optimizó en biopsias archivadas con varias muestras de calidad moderada. Los datos incluidos muestran que la plataforma transcriptómica seleccionada es robusta.
Cabe destacar que el kit de aislamiento utilizado y la metodología descendente de la secuenciación de ARN deben adaptarse específicamente para el grado esperado de degradación del ARN. El protocolo de tinción descrito aquí fue adoptado porque tuvo el efecto más favorable en minimizar ese efecto. En este protocolo, el tejido se integró en OCT con el fin de facilitar futuras comparaciones entre otras tecnologías transcriptómicas. Sin embargo, el tejido fijo de formalina puede ser una alternativa.
Los datos presentados en este manuscrito revelan los beneficios de la transcriptómica regional, incluyendo la optimización, las métricas de control de calidad y los resultados tecnológicos. El establecimiento de rigurosos criterios de control de calidad prean analíticos y analíticos, así como el establecimiento de pruebas sólidas de rigor y reproducibilidad es esencial para cualquier metodología. Las aplicaciones futuras de la transcriptómica regional se pueden agrupar ampliamente en aplicaciones biológicas, avances técnicos y progreso analítico. Las aplicaciones biológicas futuras pueden estar dirigidas a la interrogación de tejido de tubulos no heridos, heridos y regeneradores, así como tubulos cerca de la inflamación. Estos compartimentos se pueden identificar en la misma biopsia tanto por marcadores morfológicos tradicionales como por manchas de anticuerpos para marcadores específicos de "camino". Los dos marcadores de anticuerpos validados para su uso en esta tecnología, la megalína y la uromodulina, están altamente expresados en el tubérculo proximal y la extremidad ascendente gruesa respectivamente. Sin embargo, es posible que estos marcadores puedan reducirse en tejido gravemente enfermo. En estas situaciones, la validación adicional de anticuerpos de marcadores específicos de la vía o marcadores novedosos que no cambian su nivel de expresión puede superar este problema.
Es probable que lmd sea un método apropiado para usar en el interrogatorio transcriptómico de otros órganos. La selección y optimización de anticuerpos que funcionan para una tinción rápida será imprescindible. Un anticuerpo que funciona en un protocolo regular de tinción puede no funcionar necesariamente para el protocolo de tinción rápida, que probablemente requiere anticuerpos de alta afinidad. Un anticuerpo principal conjugado minimizará los pasos necesarios y puede ofrecer ventajas. Sin embargo, la conjugación de un anticuerpo a los fluoróforos puede alterar la unión, y los experimentos piloto deben realizarse antes de la incorporación de estos reactivos en el protocolo.
En conclusión, describimos un gasoducto para la microdissección láser basada en fluorescencia para aislar áreas y estructuras específicas en el riñón humano para permitir un análisis transcriptómico. Este enfoque ofrece ventajas importantes y se puede extender a otros tejidos para proporcionar un interrogatorio molecular basado en tejidos. La transcriptómica regional complementa otras tecnologías transcriptómicas proporcionando un ancla histopatológica para entender la expresión, ayudando en la interpretación de la biología y la firma de la salud y la enfermedad. Esta tecnología encaja naturalmente dentro de la visión para construir un atlas transcriptómico del riñón.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
General: Los autores quieren agradecer a los investigadores del Proyecto de Medicina de Precisión Renal (www.kpmp.org) por su amable apoyo y asesoramiento.
Financiación: El soporte para este trabajo fue proporcionado por el NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Proyecto de Medicina de Precisión Renal (KPMP) del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), (www.kpmp.org), bajo el número de premio U2CDK114886.
Disponibilidad de datos y materiales: Los datos se archivan en el Ómnibus de expresión génica (GEO # pendiente)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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