Summary
מוצג כאן פרוטוקול כדי לפתוח באופן חולף את מחסום הדם - מוח (BBB) או במוקד או בכל מוח העכבר כדי לספק נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית ולהפעיל מיקרוגליה. כמו כן מוצגת שיטה לזהות את המסירה של נוגדנים והפעלת מיקרוגליה על ידי היסטולוגיה.
Abstract
רק חלק קטן מהנוגדנים הטיפוליים הממוקדים במחלות מוח נלקחים על ידי המוח. אולטרסאונד ממוקד מציע אפשרות להגביר את ספיגת הנוגדנים ואת המעורבות באמצעות פתיחה חולפת של מחסום הדם - מוח (BBB). במעבדה שלנו, אנו מפתחים גישות טיפוליות למחלות ניווניות שבהן נוגדן בפורמטים שונים מועבר על פני BBB באמצעות microbubbles, במקביל עם יישום אולטרסאונד ממוקד דרך הגולגולת מיקוד כתמים מרובים, גישה שאנו מכנים סריקת אולטרסאונד (SUS). ההשפעות המכניות של microbubbles ואולטרסאונד על כלי הדם מגביר את התחבורה paracellular על פני BBB על ידי הפרדה חולפת צמתים הדוקים ומשפר טרנסציטוזיס בתיווך שלפוחית, ומאפשר נוגדנים וחומרים טיפוליים לחצות ביעילות. יתר על כן, אולטרסאונד גם מקל על ספיגת נוגדנים מהמוח interstitial לתוך תאי המוח כגון נוירונים שבהם הנוגדן מתפשט בכל גוף התא ואפילו לתהליכים neuritic. במחקרים שלנו, נוגדנים המסומנים בפלואורסצנטיות מוכנים, מעורבבים עם מיקרו-בועות על בסיס שומנים פנימיים ומוזרקים לעכברים מיד לפני ש- SUS מוחל על המוח. ריכוז הנוגדנים המוגבר במוח מכמת לאחר מכן. כדי להסביר שינויים בהומיאוסטזיס המוח נורמלי, פאגוציטוזה microglial יכול לשמש סמן הסלולר. הנתונים שנוצרו מראים כי אספקת אולטרסאונד של נוגדנים היא גישה אטרקטיבית לטיפול במחלות ניווניות.
Introduction
אולטרסאונד טיפולי הוא טכנולוגיה מתפתחת שמטרתה לטפל במחלות מוח באופן לא פולשני, בין היתר על ידי הקלת גישה של סוכנים טיפוליים למוח1,2,3. כמו רק חלק קטן של נוגדנים טיפוליים מיקוד מחלות מוח נלקחים על ידי ונשמר במוח4, אולטרסאונד טיפולי מציע את האפשרות להגדיל את ספיגתם ומעורבות היעד 5,6.
במעבדה שלנו, אנו מפתחים גישות טיפוליות למחלות ניווניות שבהן נוגדן בפורמטים שונים מועבר מעבר למחסום הדם - מוח (BBB) באמצעות מיקרו-בועות. כדי להשיג זאת, אולטרסאונד מוחל דרך הגולגולת לתוך המוח בנקודות מרובות באמצעות מצב סריקה שאנו מתייחסים כמו סריקת אולטרסאונד (SUS)7. האינטראקציה המכנית בין אנרגיית האולטרסאונד, המיקרו-בועות המוזרקות תוך ורידי לבין כלי הדם במוח מפרידה באופן חולף בין הצמתים ההדוקים של ה- BBB בנפח sonication נתון, ומאפשרת לנוגדנים ולמטענים אחרים כולל חומרים טיפוליים לחצות ביעילות את המחסום הזה7,8,9 . יתר על כן, אולטרסאונד הוכח כדי להקל על ספיגת נוגדנים מהמוח interstitial לתוך תאי המוח, כגון נוירונים, שבו הנוגדן מתפשט בכל גוף התא ואפילו לתוך תהליכים neuritic5,10.
מחלת אלצהיימר מאופיינת β עמילואיד ופתולוגיה טאו11, ושלל מודלים של בעלי חיים זמינים לנתח מנגנונים פתוגניים ולאמת אסטרטגיות טיפוליות. גישת SUS, שבאמצעותה אולטרסאונד מוחל בתבנית רציפה על פני המוח כולו, כאשר חוזר על עצמו על פני מספר מפגשי טיפול, יכול להפחית פתולוגיה של פלק עמילואיד במוחם של עמילואיד-β-הפקדת עמילואיד מקדים חלבון עמילואיד (APP) עכברים מוטנטיים ולהפעיל microglia אשר תופסים את העמילואיד, המוביל לשיפור בתפקוד הקוגניטיבי7. פתיחת BBB עם אולטרסאונד ו microbubbles גם מפחית פתולוגיה טאו pR5, K3 ו rTg4510 tau עכברים מהונדסים 5,12,13. חשוב לציין, בעוד מיקרוגליה להסיר פיקדונות חלבון חוץ תאיים, אחד ממנגנוני הסיווג הבסיסיים עבור פתולוגיות תוך-ניורוניות הנגרמות על ידי SUS הוא ההפעלה של autophagy עצביים12.
כאן, אנו מתארים תהליך ניסיוני, שבאמצעותו מכינים נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית, ולאחר מכן מעורבבים עם מיקרו-בועות מבוססות שומנים פנימיים, ואחריהן הזרקה רטרואורביטלית לעכברים מורדמים. הזרקה Retroorbital היא חלופה הזרקת וריד הזנב אשר מצאנו להיות יעיל באותה מידה ופשוט יותר לבצע שוב ושוב. זה מיד לאחר מכן על ידי החלת SUS על המוח. כדי לקבוע את ספיגת הנוגדנים הטיפוליים, עכברים מוקרבים וריכוז הנוגדנים המוגבר במוח מכמת לאחר מכן. כבא כוח של השינוי בהומיאוסטזיס במוח, פעילות פאגוציטית מיקרוגליאלית נקבעת על ידי היסטולוגיה ושחזור תלת-ממדי נפחי.
הנתונים שנוצרו מראים כי אספקת אולטרסאונד של נוגדנים היא גישה אטרקטיבית פוטנציאלית לטיפול במחלות ניווניות. הפרוטוקול יכול להיות מיושם באופן דומה על מועמדים אחרים לתרופה, כמו גם מטעני מודל כגון dextrans מסומן פלואורסצנטית של גדלים מוגדרים14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת קווינסלנד.
1. הכנת מיקרו-בועות בתוך הבית
- שקול יחס טוחנת 9:1 של 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ו 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[אמינו (פוליאתילןגליקול)-2000] (מלח אמוניום). 0.5 מ"ג של תערובת שומנים בדם נדרש לכל 1 מ"ל של פתרון microbubble. לחלופין, שומנים ניתן לקנות כבר בכלורופורם, אם באמצעות שומנים מומסים מראש להמשיך לשלב 1.3.
- ממיסים את השומנים בנפח קטן של כלורופורם בכוס זכוכית.
- התאדו את הכלורופורם עם מאייד או זרם חנקן.
- Rehydrate סרט השומנים היבש עם 10 מ"ל של PBS + 10% גליצרול + 10% פרופילן גליקול פתרון כי כבר מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- מניחים את תמיסת השומנים rehydrated ב sonicator אמבט מים להגדיר 55 °C (מעל טמפרטורת ההיתוך של השומנים) ו sonicate עד מומס לחלוטין.
- פתרון שומנים Aliquot לתוך בקבוקונים HPLC autoclaved 1.5 מ"ל בורג על כובעי septa.
- שאפו את כל האוויר בבקבוקון עם מזרק 5 מ"ל המצויד במחט 27 גרם וליצור ואקום בבקבוקון.
- הוסף octofluoropropane לבקבוקון עם המזרק הכלול, מושך את הגז מן המיכל. מלא את הבקבוקון עם 1-2 מ"ל של octafluoropropane על ידי קריאת הנפח במזרק.
- אוטמים כל בקבוקון בסרט פרפין ומכניסים למקרר.
- ביום הניסוי, להביא את הבקבוקון לטמפרטורת החדר, להוסיף 0.5 מ"ל של 0.9% פתרון NaCl לבקבוקון, ולאחר מכן למקם את הבקבוקון במיזוג להתסיסה במשך 45 s (זמן מוגדר מראש) כדי לייצר את microbubbles.
2. בקרת איכות microbubble באמצעות מונה קולטר
- הוציאו את תמיסת המיקרו-בועות מהמיזוג ואווררו את הגז מהבקבוקון על ידי פירסינג של הספטה עם מחט של 19 גרם.
- לדלל את פתרון microbubble על ידי ביצוע שני שלבים 1:5,000 דילול סדרתי על ידי הוספת 100 μL של פתרון microbubble לתוך 5 מ"ל של פתרון זרימה מסונן באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 19 G, ולאחר מכן לוקח 100 μL של 1:50 פתרון microbubble מדולל צינורות לתוך פתרון זרימה מסונן 10 מ"ל בקובט באמצעות pipette.
- ודא כי מיכל אלקטרוליט יש פתרון זרימה מספיק וכי מיכל האשפה ריק.
- מניחים את הקובט במשטח מונה קולטר ולנעול אותו למקומו. השתמש בצמצם של 30 מיקרומטר לרכישת מדגם.
- בתוכנה, טען את שיטת ההפעלה הסטנדרטית (SOM), ולאחר מכן בחר ערוך SOM | הריכוז. הזן דילול 5000x.
- בתוכנה, בחר שם קובץ מתאים. לדוגמה, microbubble_1_date.
- טען ואבטח את הקובט לתוך הפלטפורמה.
- בתוכנה בחר הפעל| הצג בתצוגה מקדימה וודא שריכוז הדגימה הוא פחות מ- 10%. אם מספר זה גבוה מ- 10%, בצע דילול חדש של microbubbles עם גורם דילול גבוה יותר.
- בחר 'התחל' כדי להתחיל ברכישת המדגם כדי לקבל את הקריאה הראשונית.
- יש לשטוף את הצמצם של מונה קולטר בתמיסת זרימה מסוננת לאחר כל מדידה. חזור על שלבים 2.2-2.9 כדי להשיג 3 עותקים משוכפלים.
- מניחים cuvette עם פתרון microbubble מדולל לתוך אמבט מים sonicator ו sonicate במשך 30 שניות.
- למדוד את הפתרון עם microbubbles sonicated תווית ריקה.
- בתוכנה, הפחת את הקריאה הסופית מההקראה הראשונית. זה מפחית חלקיקים שאינם microbubbles ואינם מכילים גז.
- בחר הצג תוצאות בתוכנה, כדי להציג את ריכוז המיקרו-בועות, התפלגות הגודל, הגודל הממוצע וריכוז הנפח.
3. תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים
- להשיג פתרון 1 מ"ג / מ"ל של עכבר IgG ב- PBS ללא תוספים.
- תווית 1 מ"ג של עכבר IgG עם AlexaFluor 647 ב 0.1 M נתרן ביקרבונט חיץ על ידי ביצוע ההוראות של היצרנים הממוקמים בערכה. כמות זו של IgG שכותרתו פלואורסצנטית מספיקה כדי לבצע הליך זה על 5-7 עכברים בוגרים שבו מינון 5 מ"ג / קילוגרם של נוגדן מנוהל.
- הוסף את הצבע לפתרון של IgG במאגר 0.1 M נתרן ביקרבונט ודגר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לטהר את הנוגדן המסומן בפלואורסצנטיות על ידי הזרמת תמיסת הנוגדנים לעמודת ספין וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 5 דקות. צבע חינם יישאר במיטת העמודים.
- השתמש ספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז החלבון. מדוד את הספיגה של פתרון מצומד ב 280 ננומטר ו 650 ננומטר (A280 ו A650). חשב את ריכוז החלבון במדגם באמצעות המשוואה:
ריכוז חלבון (M) = [A280 - (A650 x 0.03)] x גורם דילול / 203,000. - השתמש בספקטרופוטומטר כדי לחשב את מידת התוויות באמצעות המשוואה:
שומות צבע לכל חלבון מול = A650 x גורם דילול / 239 000 x ריכוז חלבון (M).
הערה: מידה מקובלת של תיוג היא 3-7 מולים צבע לכל חלבון מול ובדרך כלל מתקבלת מידת התיוג היא סביב 6.
4. הגדרת אולטראסאונד
- באמצעות מערכת אולטרסאונד ממוקדת, להוסיף את מרווח 5 מ"מ לבולוס מים כדי למקם את מוקד אולטרסאונד 9 מ"מ מתחת לתחתית בולוס המים.
- מלא את בולוס המים עם כ 300 מ"ל של מים deionized כי כבר degassed עם degasser מוטבע במשך 20 דקות (תכולת חמצן צריך להיות מתחת 3 עמודים לדקה). מניחים את המערך הטבעתי לתוך בולוס מים מלאים ולהשתמש במראה דנטלית כדי לבדוק כי אין בועות אוויר על פני השטח. אם קיים על פני השטח, להסיר את המערך הטבעתי ולהחליף אותו בולוס מים.
- הפעל את תוכנת היישום. בתפריט צורת גל, בחר הגדר מחזור עבודה של צורת גל. ההגדרות הן PRF (Hz) 10, מחזור עבודה 10%, מיקוד 80 מ"מ, תדר מרכז 1 MHz, משרעת (לחץ שלילי שיא MPa) 0.65 MPa, אינדקס מכני = 0.65. הקש Set כדי להגדיר את צורת הגל ולאחסן אותה בזיכרון.
הערה: מערכת האולטרסאונד הממוקדת מכוילת מראש על ידי היצרן ממדידות שנלקחו על ידי הידרופון מכויל. - בתוכנת מערכת אולטרסאונד ממוקדת, להגדיר תוכנית טיפול. זה דורש הגדרת אזור טיפול המורכב מאתרי טיפול בודדים מרובים, והגדרת פעולות שיש לנקוט בכל אחד מאתרי הטיפול האלה. במקרה זה, אזור הטיפול הוא חצי הכדור אחד של מוח העכבר.
- בחלון בקר התנועה, עבור לכרטיסיה סריקה והזן ערך התחלה, עצירה והגדלה עבור תנועה בממד x, והתחל, עצור והגדל ערך עבור תנועה בכיוון y. הזן ערכים עבור X: התחל -4, עצור 3.50 ו- Y: -3.00, עצור 3, תוספת קבועה 1.5, # לולאות: 1.
- הגדר את הפעולות עבור אתרי טיפול. בחלון בקר התנועה, בחר בלחצן אירוע . בחלון עריכת סקריפטים, בחר רשימה של פעולות שיבוצעו בסדר שנבחר בכל אתר טיפול. הגדר סוג תנועה לרשת רסטר בחלק העליון של חלון קובץ ה- Script. בכרטיסיה 'אירועים', בחרו ' הוסף פעולות ' כדי להעביר אותן לחלונית ה-Script, והוסיפו את 'העבר באופן סינכרוני', 'הפעל הפעל' arb, ' המתן', 'עצור מהגורם מפעיל arb'. לחץ על פעולת ההמתנה ובחר זמן המתנה של 6,000 אלפיות השנייה.
הערה: הגדרות אלה יהפכו את הטיפול לרשת של 6 x 5 נקודות טיפול במרווחים של 1.5 מ"מ זה מזה, כאשר לכל נקודה יש משך טיפול של 6 שניות. משך הזמן הכולל כדי sonicate מוח עכבר הוא כ 3 דקות. רשת טיפול בגודל זה מתאימה לעכברי C57/Bl6 בוגרים במשקל של כ-30 גרם. גודל הרשת של כתמי טיפול ניתן לכוונן למעלה או למטה בהתאם לגודל העכבר.
5. הכנת בעלי חיים
- שקול את העכבר עם איזון מדויק ל 0.1g.
- עכבר מרדים עם 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו 6 מ"ג/ק"ג xylazine תוך-אפריטוני. בדיקה להיעדר רפלקסים עם צביטת בוהן. לחלופין, עכברים יכולים להיות מורדמים עם איזופלוריין באמצעות מנגנון הרדמה שאפתני מתאים עם מסכת פנים מתאימה. אם באמצעות איזופלוראן, העכבר צריך להיות ממוקם על כרית חום במהלך אולטרסאונד כדי למנוע היפותרמיה.
- השתמש סכין גילוח חשמלי כדי לגלח את השיער מראש החיה, ולאחר מכן להחיל קרם להסרת שיער עם ניצן כותנה, להשאיר על במשך 2-3 דקות או עד השיער הוא ניגב לנקות עם חתיכת גזה לחה. יש לדאוג כי קרם הסרת שיער לא מקבל בעיניים של העכבר.
- סמן את מרכז ראש העכבר בסמן קבוע. למתמר יש חור במרכזו וניתן ליישר את המוקד ואת מוקד המתמר באופן חזותי.
- מלאו סירת שקילה קטנה שבעבר נחתכה התחתית והוחלפה בניילון נצמד המודבק לתחתית סירת השקילה בג'ל אולטרסאונד. זה משמש מרווח 8 מ"מ ומספק צימוד טוב לראש העכבר ומאפשר בדיקה חזותית של המוקד של המתמר מיושר עם ראש העכבר.
6. הכנת מיקרו-בועות
- מחממים בקבוקון מיקרו-בועות לטמפרטורת החדר. כדי להפעיל, להוסיף 0.5 מ"ל של 0.9% פתרון NaCl לבקבוקון ומניחים במיזוג כדי להתסיס במשך 45 שניות כדי לייצר את microbubbles.
- לפרוק את הבקבוקון על ידי פירסינג הספטה עם מחט 27 G.
7. טיפול אולטרסאונד
- הפוך את הבקבוקון של microbubbles בעדינות לצייר 1 μL / g משקל גוף של הפתרון. לזה להוסיף פתרון של נוגדן שכותרתו פלואורסצנטית ומערבבים בעדינות במזרק. הנפח המרבי מוזרק הוא 150 μL.
הערה: microbubbles מוכן בתוך הבית הם בערך פי 60 פחות מרוכז מאשר בשימוש קליני (למשל, microbubbles Definity). כוונן את הנפח או הריכוז כך שמספר המיקרו-בועות המוזרקות דומות לאלה המשמשות קלינית (כלומר. Definity 1.2 x 108 microbubbles/kg משקל גוף). - הזרקו את תמיסת המיקרו-בועות והנוגדנים רטרואקטיבית, תוך הקפדה להזריק בעדינות ובאיטיות. לאחר מכן, להחיל משחה עיניים על העיניים של העכבר.
- מקם את העכבר במחזיק הראש (ראה טבלת חומרים) ותקן את האף של העכבר. לאחר מכן מניחים את סירת השקילה הקטנה המלאה בג'ל אולטרסאונד על הראש.
- מנמיכים את בולוס המים עד שהוא יושב על גבי ג'ל אולטרסאונד בסירת השקילה.
- השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את מוקד המתמר למרכז הראש. בחר איפוס מקור בכרטיסיית התנועה.
- בחר סריקה מלאה. שלבים 7.3-7.6 ייקחו 2 דקות.
- לקבלת עקביות, הגדר טיימר כדי להבטיח השהיה של 2 דקות בין הזרקת microbubbles ובחירת סריקה מלאה.
- לאחר השלמת הטיפול, יש למרוח משחה עיניים על העיניים ולהניח את העכבר בתא התאוששות מחומם. אם היפותרמיה נצפתה במהלך ההליך, כרית התחממות ניתן להציב מתחת לעכבר כדי לספק חום משלים במהלך ההליך.
8. קציר ועיבוד רקמות
- בנקודת הזמן של עניין לאחר משלוח אולטרסאונד (לפחות 1 שעות כדי לזהות רמות גבוהות של נוגדן במוח) עמוק להרדים את העכבר עם מנת יתר של פתרון Pentobarbitone (100 מ"ג /ק"ג) ו transcardially לעקור את העכבר עם 30 מ"ל PBS. זלוף טוב נדרש כדי לזהות באופן ספציפי נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית שהועברו למוח.
- לאסוף את המוח ולתקן על ידי טבילה ב 4% PFA עבור 24 שעות ב 4 °C (60 °F) ולאחר מכן לשטוף עם PBS.
- דמיינו את המוח בסורק אינפרא-אדום על-ידי הנחת המוח על המגש ועל-ידי רכישת תמונה בערוץ 700 ננומטר.
הערה: לאחר קיבעון, המוח מוסר מה-PFA, נשטף ב-PBS וחתוך. לחלופין, זה יכול להיות ממוקם בתמיסת קריו-מגן אתילן גליקול עבור 24 שעות ב 4 °C (4 °F) או עד שקוע, ולאחר מכן עבר cryoprotectant חדש המכיל בקבוקון וממוקם ב -20 °C (20 °F) לאחסון לטווח ארוך. - חלק את הקור במוח ב-PBS באמצעות רטט. להדביק את המוח לפלטפורמה לחתוך 30-40 קטעי מיקרומטר ולאסוף לתוך PBS.
הערה: Lysosomal autofluorescence (נפוץ בקטעים מבעלי חיים מעל 12 חודשים) צריך להיות מולבן על ידי הארה לילה של החלקים בתיבת תא אור, בטמפרטורת החדר וב PBS המכיל אזיד (0.02%) כדי לחסום את הצמיחה חיידקית.
9. כתמי רקמות ורכישת תמונה
- העבר מקטעים לפתרון חסימה (5% BSA ב- 0.2% Triton / PBS) עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את החלקים 3x על ידי החלפת הפתרון עם 0.2% טריטון / PBS.
- קטעי דגירה ב 4 °C (4 °F) לילה עם הנוגדנים העיקריים נגד Iba1 (דילול 1:1,000) ו CD68 (דילול 1:500), ב 0.2% טריטון / PBS, ואחריו 3x שטף עם 0.2% טריטון / PBS.
- חלקי דגירה ל-2 שעות בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים (דילול 1:500), ואחריהם 3x שוטף עם 0.2% טריטון/PBS בלבד.
הערה: הגרעינים יכולים להיות מוכתמים גם באמצעות פתרון DAPI (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). - העבר את המקטעים לשקופית וכיסוי עם מדיית הרכבה קשיחה. אפשר מספיק זמן לאמצעי ההרכבה להתמצק לפני הדמיה ורכישת תמונה (בן לילה).
- עם מיקרוסקופ קונפוקלי להשיג תמונות z-stack (לפחות 10 מיקרומטר עומק ו 0.3 מיקרומטר גודל צעד, 10 תמונות לכל בעל חיים) של אזור המוח ממוקד אולטרסאונד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל ומטרה של לפחות 40x הגדלה.
הערה: הקפידו לרכוש תמונות בטווח הדינמי של האותות, תוך הימנעות מחשיפה מתחת/יתר. שמור את קבצי התמונה בתבנית התוכנה המתאימה המשמשת את המיקרוסקופ.
10. ניתוח תמונה
- המר את קבצי המיקרוסקופיה z-stack באמצעות יבואן קבצי התוכנה לניתוח תמונה.
- פתח את הקבצים שהומרו לתוכנה והתאם את עוצמת ערוץ Iba1 כדי לצפות בתאים מיקרוגליאליים.
- חתוך תא מיקרוגלי בודד על-ידי ציור תיבה סביבו, בחר 'חתוך' ושמור את הקובץ החדש.
- בנה את עיבוד פני השטח התלת-ממדי של אות IBA1 על-ידי:
- פתח את קובץ Imaris של תא בודד שנוצר בשלב הקודם.
- הוסף משטח לקובץ.
- בחר את הערוץ המתאים לכתם Iba1.
- החלת סף שאמור לחפוף לכתם Iba1
- בחר רק את מבנה העניין היוצר את תא העניין המיקרוגליאלי
- סיים את התהליך
- השגה ותיעוד של עוצמת הקול של הכתמת Iba1
- בניית רינדור פני השטח התלת-ממדי של כתמי CD68
- בתוך קובץ המשנה של משטח IBA1, להסוות את ערוץ CD68 ולהסיר את voxels מחוץ להכתמת IBA1
- הוספת משטח חדש לקובץ
- בחירת הערוץ המתאים לכתם CD68
- החלת סף שאמור לחפוף את כתמי CD68 והוא תואם ככל האפשר לאמצעי האחסון הכתמים
- סיים את התהליך, שכן רק המבנים התוך-מיקרוגליים CD68 יהיו נוכחים בקובץ זה, ולכן, הם אינם דורשים שלב סינון סף נוסף
- השגה ורישום של המספר ואמצעי האחסון הממוצע של המבנים החיוביים של CD68
- חשב את אמצעי האחסון היחסי של מבני CD68 לפי מבני IBA1 המתאימים לו כמדד להפעלה מיקרוגליאלית במצב פאגוציטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית מועברים למוח וניתן לזהותם, יחד עם הפעלת מיקרוגליה. המסקנה שניתן להסיק היא שימוש באולטרסאונד ממוקד ובמיקרו-בועות משפר באופן משמעותי את ספיגת המוח של נוגדנים ויכול לספק נוגדנים לכל המוח או לחצי הכדור של עכבר בעת שימוש במצב סריקה. איור 1 מציג את התקן יישום האולטרסאונד TIPS (רכיבים שונים המסומנים בתווית) המשמש לפתיחת ה- BBB. איור 2 מראה את התוצאות הייצוגיות ממדידות מונה קולטר של גודל וריכוז אשר יש להשיג כאשר microbubbles מיוצרים כראוי. כדי לדמיין בקלות את המסירה, הנוגדנים סומנו בצבע פלואורסצנטי אדום בהרבה. ספיגת נוגדנים על ידי המוח ניתן לדמיין בקלות במוח כולו או קטעים באמצעות סורק אינפרא אדום או באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על מקטעי המוח. מקטעי המוח מראים את מיקום הנוגדן המסומן בפלואורסצנטיות ברמה מיקרוסקופית. באיור 3 מוצגות תוצאות מייצגות לסריקת משלוח אולטרסאונד להיפוקמפוס של נוגדן נגד טאו בעל תווית פלואורסצנטית. כדי לבחון כל שינוי של הומאוסטזיס המוח נורמלי כתוצאה של SUS ולידה נוגדנים, קריאה אחת הייתה התוכן ליזוזומלי microglial ביחס phagocytosis. איור 4 מציג כתמים מייצגים של מיקרוגליה באמצעות Iba1 והסמן הספציפי לליזום המיקרוגליאני CD68 כדי לקבוע אם מיקרוגליה הופכת לפאגוציטית יותר בעקבות מסירת הנוגדן.
איור 1: מערכת האולטרסאונד הממוקדת המשמשת להעברת אולטרסאונד עם רכיבים קריטיים מסומנים. (א) מחזיק הג'ל הביתי המשמש כמרווח 8 מ"מ. (ב) הצג דרך המתמר המציג כיצד היעד מיושר עם המוקד באופן חזותי (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדידות בקרת איכות של מיקרו-בזקים מוכנים בתוך הבית. (A) ציוד מונה קולטר המשמש להשגת סטטיסטיקות סיכום (B) והתפלגות גודל של מיקרו-בועות במספר (C) ובהפצת אמצעי אחסון (D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: העברת נוגדן בעל תווית פלואורסצנטית למוח באמצעות SUS. (A) שבר נוגדן בעל תווית פלואורסצנטית ספציפי לאיזופורם טאו המועבר בכוחות עצמו, SUS בכוחות עצמו, וטיפול משולב חשף ספיגה מוגברת של הנוגדן על ידי חצי הכדור קולי כאשר בשילוב עם SUS באמצעות הדמיה פלואורסצנטית כמעט אינפרא אדום של חצי הכדור אחד של המוח. הוחלה טבלת חיפוש למעלה (LUT), עם עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר ביחידות שרירותיות המוצגות בצבעים חמים יותר. (ב) כימות הפלואורסצנטיות נעשה מבלי להפחית את רמות השליטה של SUS בלבד של פלואורסצנטיות ברקע. SEM ± ממוצע מוצג. (ג) ספיגה מוגברת של הנוגדן המסומן בפלואורסצנטיות על ידי נוירונים בהיפוקמפוס המוצגים בתמונות הגדלה נמוכות וגבוהות של מקטעי המוח. בטיפול המשולב, הנוגדן מתפשט לגופי תאים ואפילו דנדריטים כפי שמוצג לנוירונים בהיפוקמפוס. כחול = DAPI, מגנטה = שבר נוגדן. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תיוג אימונופלואורסצנטי מייצג עבור מיקרוגליה, המציג את המורפולוגיה הצפויה של מיקרוגליה ומעובד בתלת-ממד עם תוכנת ניתוח התמונה. מורפולוגיה Microglia הוא ציין בירוק ורמות והפצה של CD68 הוא ציין באדום. סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. ירוק = Iba1, אדום = CD68. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית יכולים להיות מועברים למוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד יחד עם microbubbles מיושם במצב סריקה. אספקת נוגדנים, מורפולוגיה מיקרוגליאלית והגדלה ליזומלית ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר אולטרסאונד סריקה. מיקרוגליה יכולה לקלוט את נוגדני הליזוזוזומים והאנטיגנים שלהם שהנוגדנים נקשרו אליהם בתהליך בתיווך קולטן Fc4.
ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להשיג פתיחה BBB חוזרת ונשנית משלוח נוגדנים באמצעות שיטה זו. זה קריטי כדי להבטיח צימוד טוב בין מתמר אולטרסאונד וראש העכבר. הסר את כל השיער על הראש של העכבר ולוודא כי אין בועות אוויר בצימוד. המאפיינים של microbubbles מוכן בתוך הבית הם קריטיים להצלחה. Microbubbles חייב להיות ריכוז מספיק של 108 microbubbles / mL והתפלגות גודל כך מעל 90% של microbubbles הם מתחת 10 מיקרובבלים בקוטר. הסיבה לכך היא כי microbubbles גדול יותר ידועים להיות מסונן מתוך זרימת הדם על ידי הריאות. גודל חציוני מקובל הוא בין 1-3 מיקרומטר. Microbubbles חייב להיות מטופלים מוזרקים בעדינות כדי למנוע להרוס אותם במזרק. חשוב כי אולטרסאונד להיות מיושם לא יאוחר מ 2 דקות בעקבות הזרקת microbubbles אשר ניתן להשיג עם תרגול. מיקוד של מוח שלם או חצי הכדור כולו מושגת בקלות עם גישת SUS ודיוק של מיקוד לא סביר להיות בעיה בעת מיקוד אזורים גדולים. אזור מוח קטן יותר כגון ההיפוקמפוס או הסטריאטום יכול גם להיות ממוקד בהצלחה אבל במקרה זה חשוב כי המוקד חופף את האזור ממוקד. הגובה של מוח עכבר דומה לאורך הצירי של קרן האולטרסאונד הממוקדת ב 1 MHz באמצעות מתמר אולטרסאונד טיפוסי, כך המתמר צריך להיות מועבר רק בממד x ו y ולא את ממד z. זה יכול להיקבע על ידי הידע של קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור מבנה מוח מסוים ועל ידי צפייה של תפרים lambdoid ו sagittal דרך העור המנוטרל של העכבר.
כאן אנו מדגימים טכניקה המשתמשת זריקות retroorbital כדי לספק microbubbles ונוגדנים. חלופה זריקות retroorbital היא זריקות וריד הזנב שהוא גם טכניקה יעילה כדי לספק microbubbles ונוגדנים. היתרונות של הזרקה retroorbital הוא שזה מבחינה טכנית פחות מאתגר מאשר זריקות וריד הזנב, והוא יכול לחזור על עצמו מספר פעמים (עין לסירוגין של הזרקה) עם סיכון מינימלי מאוד של נזק לרקמות.
אם לא מזוהה נוגדן בעל תווית פלואורסצנטית במוח, סביר להניח כי ה- BBB לא נפתח. פתרון בעיות צריך להתמקד בהשגת פתרון microbubble מרוכז והזרקתו כדי לא להרוס את microbubbles ולהעביר את אולטרסאונד בתוך שתי דקות של זמן ההזרקה. אם לא מתרחשת פתיחת BBB, ניתן להגדיל את הגדרת הלחץ השלילי שיא, עם האזהרה כי לחצים שליליים שיא גבוהים יותר להגדיל את הסיכוי לגרום microhemorrhages אשר איננו מזהים בהגדרת לחץ שלילי שיא של 0.65 MPa באמצעות ההגדרות המתוארות. בהתאם לספציות האנטיגן של הנוגדן דפוס ההכתמה יהיה שונה. תבנית ההכתמה המתקבלת בעת הזרקת נוגדן נגד טאו מוצגת באיור 2.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון של נוגדנים וכל עוד פתיחה עקבית של BBB מתקבל, איגוד של הנוגדן למטרה במוח ניתן להעריך. גישת אולטרסאונד הסריקה משיגה פתיחה של BBB על פני מוח עכבר שלם באופן לשחזור.
מגבלה של טכניקה זו היא כי המופע וההיקף של פתיחת BBB אינו נצפה בעוד העכבר חי. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי הכללת הדמיית MRI עם סוכן ניגוד גדליניום להליך, אבל זה מגדיל באופן משמעותי את הזמן והעלות של ההליך.
מתואר כאן הוא sonication יחיד וניהול יחיד של פרוטוקול נוגדנים אשר ניתן להשתמש בו כדי לקבוע כמה ספיגה מוגברת של נוגדנים ניתן להשיג, כמו גם איפה הם ממוקמים במוח לאחר הלידה. הפרוטוקול יכול לשמש גם במחקר אורך כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של אספקת נוגדנים. במחקר טיפול ניתן לחזור על הפרוטוקול עם מרווח בין טיפול של שבוע או יותר על מנת להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של נוגדן המועבר למוח. הפוטנציאל הטיפולי של הנוגדן המועבר על ידי אולטרסאונד ניתן להעריך במודלים עכבר מהונדסים של מחלות ניווניות. קריאות של השפעה טיפולית יכולות לכלול בדיקות התנהגותיות, והיסטולוגיה וביוכימיה לרמות של חלבונים פתולוגיים למשל טאו, עמילואיד-β או סינוקלאין.
לסיכום, התווינו שיטה לפתיחת מחסום הדם מוח בעכברים כדי לספק נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית. שיטה זו תעניין חוקרים המעריכים גישות טיפוליות למחלות ניווניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים בתמיכת האחוזה של ד"ר קלם ג'ונס AO, המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה [GNT1145580, GNT1176326], קרן המתכת וממשלת מדינת קווינסלנד (DSITI, המחלקה למדע, טכנולוגיית מידע וחדשנות).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
