Summary
Præsenteret her er en protokol til forbigående at åbne blod-hjerne-barrieren (BBB) enten fokalt eller i hele en musehjerne for at levere fluorescerende mærkede antistoffer og aktivere microglia. Også præsenteret er en metode til at detektere levering af antistoffer og mikroglia aktivering ved histologi.
Abstract
Kun en lille brøkdel af terapeutiske antistoffer rettet mod hjernesygdomme optager hjernen. Fokuseret ultralyd giver mulighed for at øge optagelsen af antistoffer og engagement gennem forbigående åbning af blod-hjerne-barrieren (BBB). I vores laboratorium udvikler vi terapeutiske tilgange til neurodegenerative sygdomme, hvor et antistof i forskellige formater leveres på tværs af BBB ved hjælp af mikrobobler, samtidig med fokuseret ultralydsapplikation gennem kraniet rettet mod flere pletter, en tilgang, vi kalder scanning ultralyd (SUS). De mekaniske virkninger af mikrobobler og ultralyd på blodkar øger paracellulær transport over BBB ved forbigående at adskille tætte kryds og forbedrer vesikelmedieret transcytose, hvilket gør det muligt for antistoffer og terapeutiske midler effektivt at krydse. Desuden letter ultralyd også optagelsen af antistoffer fra den interstitielle hjerne til hjerneceller såsom neuroner, hvor antistoffet fordeler sig gennem cellelegemet og endda i neuritiske processer. I vores undersøgelser fremstilles fluorescerende mærkede antistoffer, blandes med internt tilberedte lipidbaserede mikrobobler og injiceres i mus umiddelbart før SUS påføres hjernen. Den øgede antistofkoncentration i hjernen kvantificeres derefter. For at tage højde for ændringer i normal hjernehomeostase kan mikroglial fagocytose anvendes som en cellulær markør. De genererede data tyder på, at ultralydslevering af antistoffer er en attraktiv tilgang til behandling af neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Terapeutisk ultralyd er en ny teknologi, der sigter mod at behandle hjernesygdomme på en ikke-invasiv måde, dels ved at lette adgangen til terapeutiske midler til hjernen1,2,3. Da kun en lille brøkdel af terapeutiske antistoffer rettet mod hjernesygdomme opfanges af og bevares i hjernen4, giver terapeutisk ultralyd mulighed for at øge deres optagelse og målrette engagement5,6.
I vores laboratorium udvikler vi terapeutiske tilgange til neurodegenerative sygdomme, hvor et antistof i forskellige formater leveres på tværs af blod-hjerne-barrieren (BBB) ved hjælp af mikrobobler. For at opnå dette påføres ultralyd gennem kraniet ind i hjernen på flere steder ved hjælp af en scanningstilstand, vi kalder scanning ultralyd (SUS)7. Den mekaniske interaktion mellem ultralydsenergien, de intravenøst injicerede mikrobobler og hjernevaskulaturen adskiller forbigående BBB's stramme kryds i et givet sonikeringsvolumen, hvilket gør det muligt for antistoffer og andre laster, herunder terapeutiske midler, effektivt at krydse denne barriere7,8,9 . Desuden har ultralyd vist sig at lette optagelsen af antistoffer fra den interstitielle hjerne til hjerneceller, såsom neuroner, hvor antistoffet fordeler sig gennem hele cellekroppen og endda i neuritiske processer5,10.
Alzheimers sygdom er karakteriseret ved en amyloid-β- og tau-patologi11, og der findes et væld af dyremodeller til at dissekere patogene mekanismer og validere terapeutiske strategier. En SUS-tilgang, hvorved ultralyd anvendes i et sekventielt mønster over hele hjernen, når det gentages over flere behandlingssessioner, kan reducere amyloid plaquepatologi i hjernen hos amyloid-β-deponerende amyloid precursor protein (APP) mutant mus og aktivere microglia, der optager amyloid, hvilket fører til forbedring af kognitiv funktion7. BBB-åbning med ultralyd og mikrobobler reducerer også tau-patologi i pR5, K3 og rTg4510 tau transgene mus5,12,13. Det er vigtigt, at mens microglia fjerner ekstracellulære proteinaflejringer, er en af de underliggende clearancemekanismer for intraneuronale patologier induceret af SUS aktiveringen af neuronal autofagi12.
Her skitserer vi en eksperimentel proces, hvorved fluorescerende mærkede antistoffer fremstilles og derefter blandes med interne lipidbaserede mikrobobler efterfulgt af retroorbital injektion i bedøvende mus. Retroorbital injektion er et alternativ til haleveneinjektion, som vi har fundet ud af at være lige så effektiv og enklere at udføre gentagne gange. Dette efterfølges straks af påføring af SUS på hjernen. For at bestemme den terapeutiske antistofoptagelse ofres mus, og den øgede antistofkoncentration i hjernen kvantificeres derefter. Som en proxy for ændringen i hjernens homeostase bestemmes mikroglial fagocytisk aktivitet af histologi og volumetrisk 3D-rekonstruktion.
De genererede data tyder på, at ultralydslevering af antistoffer er en potentielt attraktiv tilgang til behandling af neurodegenerative sygdomme. Protokollen kan på samme måde anvendes på andre lægemiddelkandidater såvel som modellaster såsom fluorescerende mærket dextrans af definerede størrelser14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af den dyreetiske komité ved University of Queensland.
1. Intern mikroboble forberedelse
- Et molært forhold på 9:1 på 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin og 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] (ammoniumsalt) afvejes. 0,5 mg lipidblanding kræves pr. 1 ml mikrobobleopløsning. Alternativt kan lipider købes allerede i chloroform, hvis du bruger foropløste lipider til trin 1.3.
- Opløs lipidet i et lille volumen chloroform i et glasbægerglas.
- Fordamp chloroformen med en fordamper eller en nitrogenstrøm.
- Rehydrer den tørrede lipidfilm med 10 ml PBS + 10% glycerol + 10% propylenglycolopløsning, der er filtreret gennem 0,22 μm filter.
- Placer den rehydrerede lipidopløsning i et vandbad sonicator indstillet til 55 °C (over lipidernes smeltetemperatur) og sonikere, indtil den er fuldt opløst.
- Aliquot lipidopløsning i autoklavede 1,5 ml HPLC hætteglas og skrue på septahætterne.
- Aspirer al luften i hætteglasset med en 5 ml sprøjte udstyret med en 27 G nål og skab et vakuum i hætteglasset.
- Tilsæt octofluorpropan til hætteglasset med den medfølgende sprøjte, og træk gassen op fra beholderen. Fyld hætteglasset med 1-2 ml octafluorpropan ved at læse volumenet i sprøjten.
- Forsegl hvert hætteglas med paraffinfilm og afkøles.
- På forsøgsdagen bringes hætteglasset til stuetemperatur, tilsættes 0,5 ml 0,9% NaCl-opløsning til hætteglasset, anbringes derefter hætteglasset i en amalgamator og omrøres i 45 s (forudindstillet tid) for at producere mikroboblerne.
2. Mikroboblekvalitetskontrol ved hjælp af en skærtæller
- Tag mikrobobleopløsningen ud af amalgamatoren og udluft gassen fra hætteglasset ved at gennembore septaen med en 19 G nål.
- Mikrobobleopløsningen fortyndes ved at udføre totrins 1:5.000 serielle fortyndinger ved at tilsætte 100 μL mikrobobleopløsning i 5 ml filtreret flowopløsning ved hjælp af en 1 ml sprøjte med 19 G nål og derefter tage 100 μL 1:50 fortyndet mikrobobleopløsning og pipettere til 10 ml filtreret flowopløsning i en kuvette ved hjælp af en pipette.
- Kontroller, at elektrolyttanken har tilstrækkelig flowopløsning, og at affaldstanken er tom.
- Anbring kuvetten i skærtællerplatformen, og lås den på plads. Brug en blænde på 30 μm til prøveanskaffelse.
- I softwaren skal du indlæse standarddriftsmetoden (SOM) og derefter vælge Rediger SOM | koncentration. Indtast 5000x fortynding.
- I softwaren skal du vælge et passende filnavn. For eksempel microbubble_1_date.
- Læg kuvetten i platformen, og fastgør den.
- Vælg Kør i softwaren| Forhåndsvisning og kontrollér, at prøvekoncentrationen er mindre end 10 %. Hvis dette tal er højere end 10%, skal du udføre en ny fortynding af mikroboblerne med en højere fortyndingsfaktor.
- Vælg 'Start' for at begynde en erhvervelse af prøven for at opnå den første udlæsning.
- Skyl blænden på Coulter tælleren med filtreret flowopløsning efter hver måling. Gentag trin 2.2-2.9 for at få 3 replikater.
- Placer en kuvette med fortyndet mikrobobleopløsning i et sonikatorvandbad og sonikat i 30 s.
- Mål opløsningen med sonikerede mikrobobler og mærk som tom.
- I softwaren skal du trække den endelige udlæsning fra den oprindelige udlæsning. Dette trækker partikler, der ikke er mikrobobler og ikke indeholder gas.
- Vælg Vis resultater i softwaren for at få vist mikroboblekoncentrationen, størrelsesfordelingen, gennemsnitsstørrelsen og volumenkoncentrationen.
3. Fluorescerende antistofmærkning
- Der opnås en 1 mg/ml opløsning af musens IgG i PBS uden tilsætningsstoffer.
- Mærk 1 mg mus IgG med AlexaFluor 647 i 0,1 M natriumbicarbonatbuffer ved at følge producentens anvisninger i sættet. Denne mængde fluorescerende mærket IgG er tilstrækkelig til at udføre denne procedure på 5-7 voksne mus, hvor en dosis antistof på 5 mg/kg administreres.
- Tilsæt farvestoffet til opløsningen af IgG i 0,1 M natriumbicarbonatbuffer og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Rens det fluorescerende mærkede antistof ved at pipettere antistofopløsningen i en spinsøjle og centrifugere ved 1.000 x g i 5 minutter. Gratis farvestof forbliver i søjlesengen.
- Brug et spektrofotometer til at måle proteinkoncentrationen. Den konjugerede opløsnings absorbans måles ved 280 nm og 650 nm (A280 og A650). Beregn koncentrationen af protein i prøven ved hjælp af ligningen:
Proteinkoncentration (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x fortyndingsfaktor / 203.000. - Brug et spektrofotometer til at beregne graden af mærkning ved hjælp af ligningen:
molfarvestof pr. molprotein = A650 x fortyndingsfaktor / 239 000 x proteinkoncentration (M).
BEMÆRK: En acceptabel grad af mærkning er 3-7 mol farvestof pr. Molprotein, og typisk opnået grad af mærkning er omkring 6.
4. Ultralyd opsætning
- Ved hjælp af det fokuserede ultralydssystem tilsættes 5 mm afstandsrummet til vandbolus for at placere ultralydsfokus 9 mm under bunden af vandbolussen.
- Fyld vandbolus med ca. 300 ml deioniseret vand, der er afgasset med en inline afgasser i 20 minutter (iltindholdet skal være under 3 ppm). Placer det ringformede array i den fyldte vandbolus, og brug et tandspejl til at kontrollere, at der ikke er luftbobler på overfladen. Hvis det er til stede på overfladen, skal du fjerne det ringformede array og udskifte det i vandbolusen.
- Start applikationssoftwaren. Vælg Angiv bølgeformens arbejdscyklus i bølgeformmenuen. Indstillingerne er PRF (Hz) 10, arbejdscyklus 10%, fokus 80 mm, centerfrekvens 1 MHz, amplitude (MPa peak negativtryk) 0,65 MPa, mekanisk indeks = 0,65. Tryk på Indstil for at definere bølgeformen og gemme den i hukommelsen.
BEMÆRK: Det fokuserede ultralydssystem er forkalibreret af producenten fra målinger foretaget af en kalibreret hydrofon. - I den fokuserede ultralydssystemsoftware skal du definere en behandlingsplan. Dette kræver, at der defineres et behandlingsområde bestående af flere individuelle behandlingssteder, og at der defineres foranstaltninger, der skal træffes på hvert af disse behandlingssteder. I dette tilfælde er behandlingszonen en halvkugle af musehjernen.
- I bevægelsescontrollervinduet skal du gå til fanen Scan og Indtast start-, stop- og stigningsværdi for bevægelse i x-dimensionen og start-, stop- og stigningsværdi for bevægelse i y-retningen. Indtast værdier for X: start -4, stop 3.50 og Y: -3.00, stop 3, Trin 1.5, # sløjfer: 1.
- Definer handlingerne for behandlingssteder. I vinduet bevægelsescontroller skal du vælge knappen Hændelse . I vinduet Scriptredigering skal du vælge en liste over handlinger, der skal udføres i den rækkefølge, der er valgt på hvert behandlingssted. Indstil Bevægelsestype til rastergitter øverst i scriptvinduet. På fanen Hændelser skal du vælge Tilføj handlinger for at flytte dem til scriptpanelet og tilføje Flyt synkront, Start udløser arb, vent, Stop udløser arb. Klik på ventehandlingen, og vælg en ventetid på 6.000 ms.
BEMÆRK: Disse indstillinger vil gøre behandlingen til et 6 x 5 gitter af behandlingspletter med en afstand på 1,5 mm fra hinanden, hvor hvert sted har en behandlingsvarighed på 6 s. Den samlede varighed til sonikering af en musehjerne er ca. 3 minutter. Dette størrelsesbehandlingsgitter er velegnet til voksne C57/Bl6-mus, der vejer ca. 30 g. Størrelsen på gitteret af behandlingspletter kan justeres op eller ned afhængigt af musens størrelse.
5. Tilberedning af dyr
- Vej musen med en vægt, der er nøjagtig til 0,1 g.
- Anæstesi mus med 90 mg / kg ketamin og 6 mg / kg xylazin intraperitonealt. Test for fravær af reflekser med en tåklemme. Alternativt kan mus bedøves med isofluran ved hjælp af et passende inhalationsbedøvelsesapparat med en passende ansigtsmaske. Hvis du bruger isofluran, skal musen placeres på en varmepude under ultralydet for at forhindre hypotermi.
- Brug en elektrisk barbermaskine til at barbere håret fra dyrets hoved, påfør derefter hårfjerningscreme med en vatpind, lad det sidde i 2-3 minutter, eller indtil håret tørres af med et fugtigt stykke gasbind. Pas på, at hårfjerningscremen ikke kommer i musens øjne.
- Marker midten af musens hoved med en permanent markør. Transduceren har et hul i midten, og transducerfokus og brændpunkt kan justeres visuelt.
- Fyld en lille vejebåd, der tidligere har fået bunden skåret af og erstattet med plastfolie limet fast i bunden af vejebåden med ultralydsgel. Dette fungerer som en 8 mm afstandsstykke og giver god kobling til musens hoved og muliggør visuel inspektion af transducerens fokus på linje med musens hoved.
6. Forberedelse af mikroboble
- Varm et mikroboblehætteglas til stuetemperatur. For at aktivere tilsættes 0,5 ml 0,9% NaCl-opløsning til hætteglasset og anbringes i en amalgamator for at omrøre i 45 s for at producere mikroboblerne.
- Udluft hætteglasset ved at gennembore septaen med en 27 G nål.
7. Ultralydsbehandling
- Vend hætteglasset med mikrobobler om, og udtræk forsigtigt 1 μL/g kropsvægt af opløsningen. Til dette tilsættes opløsning af fluorescerende mærket antistof og blandes forsigtigt i sprøjten. Det maksimale indsprøjtede volumen er 150 μL.
BEMÆRK: Internt tilberedte mikrobobler er ca. 60 gange mindre koncentreret end de klinisk anvendte (f.eks. Definity-mikrobobler). Juster volumen eller koncentration, således at antallet af injicerede mikrobobler svarer til dem, der er klinisk anvendt (dvs. Definitet 1,2 x 108 mikrobobler/kg legemsvægt). - Injicer mikroboble- og antistofopløsningen retroorbitalt, og pas på at injicere forsigtigt og langsomt. Påfør derefter oftalmisk salve på musens øjne.
- Placer musen i hovedholderen (se Materialetabel) og fastgør musens næse. Placer derefter den ultralydgelfyldte lille vejebåd oven på hovedet.
- Sænk vandbolussen, indtil den sidder oven på ultralydsgelen i vejebåden.
- Brug joysticket til at flytte transducerfokus til midten af hovedet. Vælg Nulstil Oprindelse under fanen Bevægelse.
- Trin 7.3-7.6 tager 2 minutter.
- For konsistens skal du indstille en timer for at sikre en forsinkelse på 2 minutter mellem indsprøjtning af mikrobobler og valg af komplet scanning.
- Når behandlingen er afsluttet, skal du anvende oftalmisk salve på øjnene og placere musen i et opvarmet genopretningskammer. Hvis hypotermi observeres under proceduren, kan en opvarmningspude placeres under musen for at give supplerende varme under proceduren.
8. Høst og forarbejdning af væv
- På det tidspunkt, hvor det er interessant efter ultralydslevering (mindst 1 time for at detektere høje niveauer af antistof i hjernen) bedøves musen dybt med en overdosis Pentobarbitonopløsning (100 mg / kg) og transkardielt perfuser musen med 30 ml PBS. En god perfusion er nødvendig for specifikt at detektere fluorescerende mærkede antistoffer, der er blevet leveret til hjernen.
- Saml hjernen og fikser ved nedsænkning i 4% PFA i 24 timer ved 4 °C, vask derefter med PBS.
- Forestil dig hjernen i en infrarød scanner ved at placere hjernen på bakken og ved at få et billede i 700 nm-kanalen.
BEMÆRK: Efter fiksering fjernes hjernen fra PFA, vaskes i PBS og sektioneres. Alternativt kan det anbringes i kryoprotektiv opløsning af ethylenglycol i 24 timer ved 4 °C, eller indtil det er nedsænket, og derefter flyttes til et nyt kryoprotektivt middel indeholdende hætteglas og anbringes ved -20 °C til langtidsopbevaring. - Sektion hjernen kold i PBS ved hjælp af et vibratom. Lim hjernen på platformen og skær 30-40 μm sektioner og saml i PBS.
BEMÆRK: Lysosomal autofluorescens (udbredt i sektioner fra dyr, der er ældre end ca. 12 måneder) skal bleges ved belysning natten over af sektionerne i en lyskammerkasse, ved stuetemperatur og i PBS indeholdendeazid (0,02%) for at blokere bakterievækst.
9. Vævsfarvning og billedoptagelse
- Overfør sektioner til blokerende opløsning (5% BSA i 0,2% Triton/PBS) i 2 timer ved stuetemperatur, vask derefter sektionerne 3x ved at erstatte opløsningen med 0,2% Triton/PBS.
- Inkuber sektioner ved 4 °C natten over med de primære antistoffer mod Iba1 (fortynding 1:1.000) og CD68 (fortynding 1:500), i 0,2 % Triton/PBS, efterfulgt af 3x vaske med 0,2 % Triton/PBS.
- Inkuber sektioner i 2 timer ved stuetemperatur med fluorescerende sekundære antistoffer (fortynding 1:500) efterfulgt af 3x vaske med kun 0,2% Triton/PBS.
BEMÆRK: Kernerne kan også farves ved hjælp af DAPI-opløsning (0,5 μg / ml). - Overfør sektionerne til et dias og dækslip med hårdt indstillede monteringsmedier. Giv tilstrækkelig tid til, at monteringsmediet størkner inden visualisering og billedoptagelse (natten over).
- Med et konfokalmikroskop opnås z-stack-billeder (mindst 10 μm dybde og 0,3 μm trinstørrelse, 10 billeder pr. Dyr) af det ultralydsmålrettede hjerneområde ved hjælp af et konfokalmikroskop og et mål på mindst 40x forstørrelse.
BEMÆRK: Vær forsigtig med at få billeder inden for signalets dynamiske område, så du undgår under-/overeksponering. Gem billedfilerne i det tilsvarende softwareformat, der bruges af mikroskopet.
10. Billedanalyse
- Konverter z-stack mikroskopi filer ved hjælp af billedanalyse software filimportør.
- Åbn de konverterede filer i softwaren, og juster intensiteten af Iba1-kanalen for at observere mikrogliale celler.
- Beskær en enkelt mikroglial celle ved at tegne en boks omkring den, vælg 'beskær' og gem den nye fil.
- Byg 3D-overfladegengivelsen af IBA1-signalet ved at:
- Åbn den Imaris-fil med en enkelt celle, der blev genereret i det foregående trin.
- Føj en overflade til filen.
- Vælg den kanal, der svarer til Iba1-farvningen.
- Anvend en tærskel, der skal overlappe Iba1-farvningen
- Vælg kun den struktur af interesse, der danner den mikrogliale celle af interesse
- Afslut processen
- Hent og registrer volumenet af Iba1-farvningen
- Byg 3D-overfladegengivelsen af CD68-farvningen
- Inde i IBA1-overfladeunderfilen skal du maskere CD68-kanalen og fjerne voxellerne uden for IBA1-farvningen
- Føj en ny overflade til filen
- Vælg den kanal, der svarer til CD68-farvningen
- Påfør en tærskel, der skal overlappe CD68-farvningen og er så tæt som muligt at matche farvningsvolumenerne
- Afslut processen, da kun de intramikrogliale CD68-strukturer vil være til stede i denne fil, og de kræver derfor ikke et andet tærskelfiltreringstrin
- Opnå og registrer antallet og det gennemsnitlige volumen af cd68-positive strukturer
- Beregn det relative volumen af CD68-strukturer pr. Dets tilsvarende IBA1-strukturer som et mål for mikroglial aktivering i en fagocytisk tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol leveres fluorescerende mærkede antistoffer til hjernen og kan detekteres sammen med mikrogliaaktivering. Den konklusion, der kan drages, er brugen af fokuseret ultralyd og mikrobobler markant forbedrer hjernens optagelse af antistoffer og kan levere antistoffer til hele hjernen eller halvkuglen af en mus, når den anvendes i en scanningstilstand. Figur 1 viser TIPS ultralyd applikationsenhed (forskellige komponenter mærket), der bruges til at åbne BBB. Figur 2 viser de repræsentative resultater fra Coulter counter målinger af størrelse og koncentration, som skal opnås, når mikroboblerne produceres korrekt. For let at visualisere leveringen blev antistofferne mærket med et langt rødt fluorescerende farvestof. Antistofoptagelse af hjernen kan let visualiseres i hele hjernen eller sektioner ved hjælp af en infrarød scanner eller ved hjælp af fluorescerende mikroskopi på hjernesektioner. Hjernesektioner viser placeringen af det fluorescerende mærkede antistof på et mikroskopisk niveau. Repræsentative resultater for scanning ultralyd levering til hippocampus af fluorescerende mærket anti-tau antistof RN2N er vist i figur 3. For at observere enhver ændring af normal hjernehomeostase som følge af SUS og antistoflevering var en udlæsning det mikrogliale lysosomale indhold i forhold til fagocytose. Figur 4 viser repræsentativ farvning for mikroglia ved hjælp af Iba1 og den mikrogliale lysosomspecifikke markør CD68 for at bestemme, om mikroglia bliver mere fagocytisk efter levering af antistoffet.
Figur 1: Det fokuserede ultralydssystem, der bruges til at levere ultralyd med kritiske komponenter, der mærkes. A) Den hjemmelavede gelholder, der fungerer som en afstandsholder på 8 mm. (B) Se gennem transduceren, der viser, hvordan målet er justeret med fokus visuelt (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kvalitetskontrolmålinger af internt tilberedte mikrobobler. A) Coulter-tællerudstyr, der anvendes til at opnå sammenfattende statistik (B) og størrelsesfordeling af mikrobobler i antal (C) og volumenfordeling (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Levering af fluorescerende mærket antistof i hjernen ved hjælp af SUS. (A) Et fluorescerende mærket antistoffragment, der er specifikt for en tau-isoform leveret alene, SUS alene, og en kombinationsbehandling afslørede øget optagelse af antistoffet af en sonikeret halvkugle, når den kombineres med SUS ved hjælp af nær infrarød fluorescerende billeddannelse af en halvkugle i hjernen. En opslagstabel (LUT) blev anvendt med højere fluorescensintensitet i vilkårlige enheder vist i varmere farver. (B) Kvantificering af fluorescens blev udført uden at fratrække sus-kontrolniveauerne for baggrundsfluorescens. Gennemsnitlig ± SEM vist. (C) Øget optagelse af det fluorescerende mærkede antistof af hippocampale neuroner vist i billeder med lav og høj forstørrelse af hjernesektioner. I kombinationsbehandlingen fordeler antistoffet sig i cellelegemer og endda dendritter som vist for hippocampale neuroner. Blå = DAPI, magenta = antistoffragment. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ immunofluorescensmærkning for microglia, der viser den forventede morfologi af microglia og gengivet i 3D med billedanalysesoftwaren. Microglia morfologi observeres i grønt og niveauer og fordeling af CD68 observeres i rødt. Skalabjælke 10 μm. Grøn= Iba1, rød=CD68. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorescerende mærkede antistoffer kan leveres til hjernen ved hjælp af fokuseret ultralyd sammen med mikrobobler anvendt i scanningstilstand. Antistoflevering, mikroglial morfologi og lysosomal forstørrelse kan detekteres ved fluorescensmikroskopi efter scanning ultralyd. Microglia kan tage op i deres lysosomer antistoffer og antigener, som antistofferne har bundet til i en Fc-receptor-medieret proces4.
Der er en række kritiske trin for at opnå gentagelig BBB-åbning og antistoflevering ved hjælp af denne metode. Det er afgørende at sikre god kobling mellem ultralydstransduceren og musens hoved. Fjern alt håret på musens hoved og sørg for, at der ikke er luftbobler i koblingen. Egenskaberne ved de internt tilberedte mikrobobler er afgørende for succes. Mikrobobler skal have en tilstrækkelig koncentration på 108 mikrobobler/ml og en størrelsesfordeling, således at over 90 % af mikroboblerne er under 10 μm i diameter. Dette skyldes, at større mikrobobler vides at blive filtreret ud af cirkulationen af lungerne. En acceptabel medianstørrelse er mellem 1 -3 μm. Mikrobobler skal håndteres og injiceres forsigtigt for at undgå at ødelægge dem i sprøjten. Det er vigtigt, at ultralydet påføres senest 2 minutter efter injektionen af mikroboblerne, hvilket kan opnås med praksis. Målretning af en hel hjerne eller hele halvkugle opnås let med SUS-tilgangen, og nøjagtigheden af målretning er usandsynligt at være et problem, når man målretter mod store regioner. En mindre hjerneregion som hippocampus eller striatum kan også med succes målrettes, men i dette tilfælde er det vigtigt, at fokus overlapper den målrettede region. Højden på en musehjerne svarer til den aksiale længde af den fokuserede ultralydsstråle ved 1 MHz ved hjælp af en typisk ultralydstransducer, således at transduceren kun behøver at blive flyttet i x- og y-dimensionen og ikke z-dimensionen. Dette kan bestemmes af kendskabet til stereotaksiske koordinater for en bestemt hjernestruktur og ved at se lambdoid og sagittale suturer gennem musens depilerede hud.
Her demonstrerer vi en teknik, der bruger retroorbitale injektioner til at levere mikrobobler og antistof. Et alternativ til retroorbitale injektioner er haleveneinjektioner, som også er en effektiv teknik til at levere mikrobobler og antistoffer. Fordelene ved retroorbital injektion er, at det er teknisk mindre udfordrende end haleveneinjektioner og kan gentages flere gange (skiftevis injektionsøje) med meget minimal risiko for vævsskade.
Hvis der ikke påvises fluorescerende mærket antistof i hjernen, er det sandsynligt, at BBB ikke åbnede. Fejlfinding bør fokusere på at opnå en koncentreret mikrobobleopløsning og injicere den for ikke at ødelægge mikroboblerne og levere ultralydet inden for to minutter efter injektionstiden. Hvis der ikke opstår nogen BBB-åbning, kan indstillingen af maksimalt negativt tryk øges med det forbehold, at højere toptryk øger risikoen for at forårsage mikroblødninger, som vi ikke registrerer ved en maksimal negativ trykindstilling på 0,65 MPa ved hjælp af de beskrevne indstillinger. Afhængigt af antigensspecifikiteten af antistoffet vil farvningsmønsteret være anderledes. Farvningsmønsteret opnået ved injektion af et anti-tau-antistof er vist i figur 2.
Denne teknik kan anvendes på en række antistoffer, og så længe der opnås konsekvent BBB-åbning, kan binding af antistoffet til et mål i hjernen vurderes. Scanning ultralyd tilgang opnår åbning af BBB på tværs af en hel musehjerne på en reproducerbar måde.
En begrænsning af denne teknik er, at forekomsten og omfanget af BBB-åbningen ikke observeres, mens musen er i live. Denne begrænsning kunne overvindes ved at inkludere MR-billeddannelse med gadoliniumkontrastmiddel til proceduren, men dette øger signifikant tid og omkostninger ved proceduren.
Beskrevet her er en enkelt sonikering og enkelt administration af antistofprotokol, som kan bruges til at bestemme, hvor meget øget optagelse af antistoffer der kan opnås, samt hvor de er placeret i hjernen efter fødslen. Protokollen kan også bruges i en longitudinel undersøgelse til at vurdere terapeutiske virkninger af antistoflevering. I et behandlingsstudie kan protokollen gentages med et interbehandlingsinterval på en uge eller længere for at evaluere det terapeutiske potentiale af et antistof, der leveres til hjernen. Det terapeutiske potentiale af antistoffet leveret ved ultralyd kan vurderes i transgene musemodeller af neurodegenerative sygdomme. Aflæsninger af terapeutisk effekt kan omfatte adfærdsmæssige tests og histologi og biokemi for niveauerne af patologiske proteiner for eksempel tau, amyloid-β eller synuclein.
Afslutningsvis har vi skitseret en metode til at åbne blodhjernebarrieren i mus for at levere fluorescerende mærkede antistoffer. Denne metode vil være af interesse for forskere, der evaluerer terapeutiske tilgange til neurodegenerative sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender støtte fra boet efter Dr. Clem Jones AO, National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], Metal Foundation og delstatsregeringen i Queensland (DSITI, Institut for Videnskab, Informationsteknologi og Innovation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
