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Neuroscience

केंद्रित स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर मस्तिष्क में एंटीबॉडी का वितरण

Published: July 18, 2020 doi: 10.3791/61372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute, The University of Queensland

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को क्षणिक रूप से खोलने के लिए या तो फोकल रूप से या माउस मस्तिष्क में फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी वितरित करने और माइक्रोग्लिया को सक्रिय करने के लिए है। इसके अलावा प्रस्तुत एंटीबॉडी और histology द्वारा microglia सक्रियण के वितरण का पता लगाने के लिए एक विधि है.

Abstract

मस्तिष्क रोगों को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एंटीबॉडी का केवल एक छोटा सा अंश मस्तिष्क द्वारा लिया जाता है। केंद्रित अल्ट्रासाउंड रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के क्षणिक उद्घाटन के माध्यम से एंटीबॉडी और सगाई के उत्थान को बढ़ाने की संभावना प्रदान करता है। हमारी प्रयोगशाला में, हम न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित कर रहे हैं जिसमें विभिन्न प्रारूपों में एक एंटीबॉडी को बीबीबी में माइक्रोबबल्स का उपयोग करके वितरित किया जाता है, खोपड़ी के माध्यम से केंद्रित अल्ट्रासाउंड एप्लिकेशन के साथ सहवर्ती कई धब्बों को लक्षित करता है, एक दृष्टिकोण जिसे हम स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड (एसयूएस) के रूप में संदर्भित करते हैं। रक्त वाहिकाओं पर माइक्रोबबल्स और अल्ट्रासाउंड के यांत्रिक प्रभाव ों से बीबीबी में परकोशिकीय परिवहन को क्षणिक रूप से तंग जंक्शनों को अलग करके बढ़ा दिया जाता है और पुटिका-मध्यस्थता ट्रांससाइटोसिस को बढ़ाता है, जिससे एंटीबॉडी और चिकित्सीय एजेंटों को प्रभावी ढंग से पार करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड भी अंतरालीय मस्तिष्क से मस्तिष्क कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स में एंटीबॉडी के उत्थान की सुविधा प्रदान करता है जहां एंटीबॉडी पूरे सेल शरीर में और यहां तक कि न्यूरिटिक प्रक्रियाओं में भी वितरित होता है। हमारे अध्ययनों में, फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी तैयार किए जाते हैं, इन-हाउस तैयार लिपिड-आधारित माइक्रोबबल्स के साथ मिश्रित होते हैं और एसयूएस को मस्तिष्क पर लागू करने से तुरंत पहले चूहों में इंजेक्ट किया जाता है। मस्तिष्क में बढ़ी हुई एंटीबॉडी एकाग्रता को तब परिमाणित किया जाता है। सामान्य मस्तिष्क होमोस्टैसिस में परिवर्तन के लिए खाते के लिए, माइक्रोग्लियल फागोसाइटोसिस का उपयोग सेलुलर मार्कर के रूप में किया जा सकता है। उत्पन्न डेटा से पता चलता है कि एंटीबॉडी का अल्ट्रासाउंड वितरण न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है।

Introduction

चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड एक उभरती हुई तकनीक है जिसका उद्देश्य मस्तिष्क की बीमारियों का इलाज एक noninvasive तरीके से करना है, भाग में मस्तिष्क 1,2,3 के लिए चिकित्सीय एजेंटों की पहुंच की सुविधा प्रदान करके। जैसा कि मस्तिष्क की बीमारियों को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एंटीबॉडी का केवल एक छोटा सा अंश मस्तिष्क 4 में लिया जाता है और बनाए रखा जाता है, चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड उनके उत्थान और लक्ष्य सगाई को बढ़ाने की संभावना प्रदान करता है5,6।

हमारी प्रयोगशाला में, हम न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित कर रहे हैं जिसमें विभिन्न प्रारूपों में एक एंटीबॉडी माइक्रोबबल्स का उपयोग करके रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में वितरित की जाती है। इसे प्राप्त करने के लिए, अल्ट्रासाउंड को एक स्कैनिंग मोड का उपयोग करके कई स्थानों में मस्तिष्क में खोपड़ी के माध्यम से लागू किया जाता है जिसे हम स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड (एसयूएस) 7 के रूप में संदर्भित करते हैं। अल्ट्रासाउंड ऊर्जा के बीच यांत्रिक बातचीत, अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किए गए माइक्रोबबल्स और मस्तिष्क वास्कुलचर क्षणिक रूप से किसी दिए गए sonication मात्रा में BBB के तंग जंक्शनों को अलग करता है, जिससे एंटीबॉडी और चिकित्सीय एजेंटों सहित अन्य कार्गो को प्रभावी ढंग से इस बाधा को पार करने की अनुमति मिलती है7,8,9 . इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड को अंतरालीय मस्तिष्क से मस्तिष्क कोशिकाओं में एंटीबॉडी के उत्थान की सुविधा के लिए दिखाया गया है, जैसे कि न्यूरॉन्स, जहां एंटीबॉडी पूरे सेल शरीर में और यहां तक कि न्यूरिटिक प्रक्रियाओं में भी वितरित होता है5,10।

अल्जाइमर रोग एक एमाइलॉइड-β और ताऊ पैथोलॉजी 11 की विशेषता है, और रोगजनक तंत्र को विच्छेदित करने और चिकित्सीय रणनीतियों को मान्य करने के लिए पशु मॉडल का एक मेजबान उपलब्ध है। एक एसयूएस दृष्टिकोण, जिसके द्वारा अल्ट्रासाउंड को पूरे मस्तिष्क में एक अनुक्रमिक पैटर्न में लागू किया जाता है, जब कई उपचार सत्रों में दोहराया जाता है, तो अमाइलॉइड-β-जमा करने वाले एमिलॉइड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) उत्परिवर्ती चूहों के दिमाग में अमाइलॉइड पट्टिका विकृति को कम कर सकता है और माइक्रोग्लिया को सक्रिय कर सकता है जो अमाइलॉइड लेता है, जिससे संज्ञानात्मक कार्य में सुधार होता है। अल्ट्रासाउंड और microbubbles के साथ BBB खोलने भी pR5, K3 और rTg4510 ताऊ ट्रांसजेनिक mice5,12,13 में ताऊ विकृति को कम कर देता है। महत्वपूर्ण रूप से, जबकि माइक्रोग्लिया बाह्य कोशिकीय प्रोटीन जमा को हटा देता है, एसयूएस द्वारा प्रेरित इंट्रान्यूरॉनल पैथोलॉजी के लिए अंतर्निहित निकासी तंत्र में से एक न्यूरोनल ऑटोफैगी 12 का सक्रियण है।

यहां, हम एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करते हैं, जिसके द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी तैयार किए जाते हैं, और फिर इन-हाउस लिपिड-आधारित माइक्रोबबल्स के साथ मिश्रित होते हैं, जिसके बाद एनेस्थेटिक चूहों में रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन होता है। रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन पूंछ शिरा इंजेक्शन का एक विकल्प है जिसे हमने बार-बार प्रदर्शन करने के लिए समान रूप से प्रभावी और सरल पाया है। इसके तुरंत बाद मस्तिष्क में एसयूएस लागू किया जाता है। चिकित्सीय एंटीबॉडी अपटेक को निर्धारित करने के लिए, चूहों की बलि दी जाती है और मस्तिष्क में बढ़ी हुई एंटीबॉडी एकाग्रता को तब परिमाणित किया जाता है। मस्तिष्क होमोस्टैसिस में परिवर्तन के प्रॉक्सी के रूप में, माइक्रोग्लियल फागोसाइटिक गतिविधि हिस्टोलॉजी और वॉल्यूमेट्रिक 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा निर्धारित की जाती है।

उत्पन्न डेटा से पता चलता है कि एंटीबॉडी का अल्ट्रासाउंड वितरण न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के लिए एक संभावित आकर्षक दृष्टिकोण है। प्रोटोकॉल को इसी तरह अन्य दवा उम्मीदवारों के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही मॉडल कार्गो जैसे कि फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए डेक्सट्रांस परिभाषित आकार14।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को क्वींसलैंड विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. इन-हाउस माइक्रोबबल तैयारी

  1. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine और 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] (अमोनियम नमक) के 9: 1 दाढ़ अनुपात का वजन करें। माइक्रोबबल समाधान के प्रति 1 मिलीलीटर लिपिड मिश्रण के 0.5 मिलीग्राम की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, लिपिड को पहले से ही क्लोरोफॉर्म में खरीदा जा सकता है, यदि पूर्व-भंग लिपिड का उपयोग करके चरण 1.3 पर आगे बढ़ते हैं।
  2. लिपिड को कांच के बीकर में क्लोरोफॉर्म की एक छोटी मात्रा में भंग करें।
  3. एक बाष्पीकरणकर्ता या नाइट्रोजन धारा के साथ क्लोरोफॉर्म वाष्पित करें।
  4. पीबीएस के 10 मिलीलीटर + 10% ग्लिसरॉल + 10% प्रोपलीन ग्लाइकोल समाधान के साथ सूखे लिपिड फिल्म को फिर से हाइड्रेट करें जिसे 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है।
  5. 55 डिग्री सेल्सियस (लिपिड के पिघलने के तापमान से ऊपर) के लिए सेट एक पानी स्नान sonicator में rehydrated लिपिड समाधान जगह और पूरी तरह से भंग जब तक sonicate.
  6. Autoclaved 1.5 mL HPLC शीशियों में लिपिड समाधान और सेप्टा कैप पर पेंच।
  7. एक 27 जी सुई से सुसज्जित एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ शीशी में हवा के सभी aspirate और शीशी में एक वैक्यूम बनाने के लिए।
  8. शामिल सिरिंज के साथ शीशी में ऑक्टोफ्लोरोप्रोपेन जोड़ें, कनस्तर से गैस को खींचते हुए। सिरिंज में मात्रा पढ़कर 1-2 मिलीलीटर ऑक्टाफ्लोरोप्रोपेन के साथ शीशी भरें।
  9. पैराफिन फिल्म के साथ प्रत्येक शीशी सील और प्रशीतित.
  10. प्रयोग के दिन, शीशी को कमरे के तापमान पर लाएं, शीशी में 0.9% NaCl समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, फिर शीशी को एक समामेलक में रखें और माइक्रोबबल्स का उत्पादन करने के लिए 45 एस (प्रीसेट समय) के लिए आंदोलन करें।

2. Microbubble गुणवत्ता नियंत्रण एक coulter काउंटर का उपयोग कर

  1. अमलगमक से माइक्रोबबल समाधान निकालें और 19 जी सुई के साथ सेप्टा को भेदकर शीशी से गैस को बाहर निकालें।
  2. 19 जी सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए प्रवाह समाधान के 5 मिलीलीटर में 5 मिलीलीटर में 100 μL माइक्रोबबल समाधान जोड़कर दो-चरण 1: 5,000 सीरियल dilutions का प्रदर्शन करके माइक्रोबबल समाधान को पतला करें, और फिर 1: 50 पतला माइक्रोबबल समाधान के 100 μL लें और एक पिपेट का उपयोग करके एक क्यूवेट में 10 मिलीलीटर फ़िल्टर किए गए प्रवाह समाधान में pipetting करें।
  3. जांचें कि इलेक्ट्रोलाइट टैंक में पर्याप्त प्रवाह समाधान है और अपशिष्ट टैंक खाली है।
  4. कूल्टर काउंटर प्लेटफ़ॉर्म में क्यूवेट रखें और इसे जगह में लॉक करें। नमूना अधिग्रहण के लिए एक 30 μm एपर्चर का उपयोग करें।
  5. सॉफ़्टवेयर में, मानक ऑपरेटिंग विधि (SOM) लोड करें, फिर एकाग्रता | SOM संपादित करें का चयन करें। 5000x तनुकरण दर्ज करें.
  6. सॉफ़्टवेयर में, एक उपयुक्त फ़ाइल नाम चुनें. उदाहरण के लिए, microbubble_1_date।
  7. लोड और मंच में cuvette सुरक्षित.
  8. सॉफ़्टवेयर में चलाएँ का चयन करें | पूर्वावलोकन करें और सत्यापित करें कि नमूना एकाग्रता 10% से कम है। यदि यह संख्या 10% से अधिक है, तो एक उच्च कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ माइक्रोबबल्स का एक नया कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
  9. प्रारंभिक रीडआउट प्राप्त करने के लिए नमूने का अधिग्रहण शुरू करने के लिए 'प्रारंभ' का चयन करें।
  10. प्रत्येक माप के बाद फ़िल्टर किए गए प्रवाह समाधान के साथ कूल्टर काउंटर के एपर्चर को कुल्ला करें। 3 प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए चरण 2.2-2.9 दोहराएँ।
  11. एक sonicator पानी स्नान में पतला microbubble समाधान के साथ एक cuvette जगह और 30 s के लिए sonicate.
  12. sonicated microbubbles और लेबल के साथ समाधान को रिक्त के रूप में मापें।
  13. सॉफ़्टवेयर में, प्रारंभिक रीडआउट से अंतिम रीडआउट घटाएं। यह किसी भी कण को घटाता है जो माइक्रोबबल्स नहीं हैं और गैस नहीं होते हैं।
  14. माइक्रोबबल एकाग्रता, आकार वितरण, औसत आकार और वॉल्यूम एकाग्रता प्रदर्शित करने के लिए सॉफ़्टवेयर में प्रदर्शन परिणाम का चयन करें.

3. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबलिंग

  1. किसी भी additives के बिना PBS में माउस IgG का एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान प्राप्त करें।
  2. किट में स्थित निर्माताओं के निर्देशों का पालन करके 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट बफर में एलेक्साफ्लोर 647 के साथ माउस आईजीजी के 1 मिलीग्राम लेबल करें। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले आईजीजी की यह मात्रा 5-7 वयस्क चूहों पर इस प्रक्रिया को करने के लिए पर्याप्त है जहां एंटीबॉडी की 5 मिलीग्राम / किलोग्राम खुराक प्रशासित की जाती है।
  3. 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट बफर में आईजीजी के समाधान के लिए डाई जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एक स्पिन कॉलम में एंटीबॉडी समाधान pipetting और 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर centrifuging द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी शुद्ध. नि: शुल्क डाई कॉलम बिस्तर में रहेगा।
  5. प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। संयुग्मी समाधान के अवशोषण को 280 एनएम और 650 एनएम (A280 और A650) पर मापें। समीकरण का उपयोग करके नमूने में प्रोटीन की सांद्रता की गणना करें:
    प्रोटीन सांद्रता (एम) = [A280 - (A650 x 0.03)] x कमजोर पड़ने का कारक / 203,000।
  6. समीकरण का उपयोग करके लेबलिंग की डिग्री की गणना करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें:
    मोल्स डाई प्रति मोल प्रोटीन = A650 x कमजोर पड़ने कारक / 239 000 x प्रोटीन एकाग्रता (एम)।
    नोट: लेबलिंग की एक स्वीकार्य डिग्री प्रति मोल प्रोटीन 3-7 मोल्स डाई है और आमतौर पर लेबलिंग की डिग्री प्राप्त की जाती है जो लगभग 6 होती है।

4. अल्ट्रासाउंड सेट-अप

  1. केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करते हुए, अल्ट्रासाउंड फोकस को पानी के बोलस के नीचे 9 मिमी की स्थिति के लिए पानी के बोलस में 5 मिमी स्पेसर जोड़ें।
  2. लगभग 300 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ पानी के बोलस को भरें जिसे 20 मिनट के लिए एक इनलाइन डेगैसर के साथ डीगैस किया गया है (ऑक्सीजन सामग्री 3 पीपीएम से नीचे होनी चाहिए)। भरे हुए पानी के बोलस में कुंडलाकार सरणी रखें और यह जांचने के लिए एक दंत दर्पण का उपयोग करें कि सतह पर कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। यदि सतह पर मौजूद है, तो कुंडलाकार सरणी को हटा दें और इसे पानी के बोलस में बदल दें।
  3. अनुप्रयोग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें। तरंग मेनू में, तरंग शुल्क चक्र सेट करें का चयन करें। सेटिंग्स PRF (हर्ट्ज) 10, शुल्क चक्र 10%, फोकस 80 मिमी, केंद्र आवृत्ति 1 मेगाहर्ट्ज, आयाम (MPa पीक नकारात्मक दबाव) 0.65 MPa, यांत्रिक सूचकांक = 0.65 हैं। तरंग को परिभाषित करने और इसे स्मृति में संग्रहीत करने के लिए सेट करें दबाएँ.
    नोट: केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रणाली एक कैलिब्रेटेड हाइड्रोफोन द्वारा लिए गए माप से निर्माता द्वारा पूर्व-कैलिब्रेटेड है।
  4. केंद्रित अल्ट्रासाउंड सिस्टम सॉफ़्टवेयर में, एक उपचार योजना को परिभाषित करें। इसके लिए एक उपचार क्षेत्र को परिभाषित करने की आवश्यकता होती है जिसमें कई व्यक्तिगत उपचार साइटें शामिल होती हैं, और उन उपचार स्थलों में से प्रत्येक पर किए जाने वाले कार्यों को परिभाषित करना होता है। इस मामले में, उपचार क्षेत्र माउस मस्तिष्क का एक गोलार्ध है।
  5. गति नियंत्रक विंडो में, स्कैन टैब पर जाएँ और प्रारंभ दर्ज करें , x आयाम में गति के लिए रोकें और वृद्धि मान, और y दिशा में गति के लिए प्रारंभ, रोकें और वृद्धि मान प्रारंभ करें, रोकें और वृद्धि मान दर्ज करें. X के लिए मान दर्ज करें: प्रारंभ -4, 3.50 और Y रोकें: -3.00, स्टॉप 3, वेतन वृद्धि 1.5, # loops: 1.
  6. उपचार साइटों के लिए कार्यों को परिभाषित करें। गति नियंत्रक विंडो में, ईवेंट बटन का चयन करें। स्क्रिप्ट संपादन विंडो में, उन क्रियाओं की एक सूची का चयन करें जिन्हें प्रत्येक उपचार साइट पर चयनित क्रम में निष्पादित किया जाएगा. स्क्रिप्ट विंडो के शीर्ष पर रास्टर ग्रिड के लिए आंदोलन प्रकार सेट करें। ईवेंट टैब में उन्हें स्क्रिप्ट पैनल पर ले जाने के लिए क्रियाएँ जोड़ें का चयन करें, और सिंक्रोनस रूप से ले जाएँ जोड़ें, ट्रिगर arb प्रारंभ करें , प्रतीक्षा करें, ट्रिगर arb रोकें । प्रतीक्षा क्रिया पर क्लिक करें और 6, 000 ms के प्रतीक्षा समय का चयन करें।
    नोट: ये सेटिंग्स उपचार के 6 x 5 ग्रिड का इलाज करेंगी, जो 1.5 मिमी के अलावा 1.5 मिमी की दूरी पर है, प्रत्येक स्थान पर 6 एस की उपचार अवधि होगी। माउस मस्तिष्क sonicate करने के लिए कुल अवधि लगभग 3 मिनट है। यह आकार उपचार ग्रिड लगभग 30 ग्राम वजन वाले वयस्क C57 / Bl6 चूहों के लिए उपयुक्त है। उपचार के धब्बों के ग्रिड के आकार को माउस के आकार के आधार पर ऊपर या नीचे समायोजित किया जा सकता है।

5. पशु तैयारी

  1. 0.1g करने के लिए एक संतुलन सटीक के साथ माउस वजन.
  2. 90 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 6 मिलीग्राम / किग्रा xylazine intraperitoneally के साथ एनेस्थेटिक माउस। एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ सजगता की अनुपस्थिति के लिए परीक्षण. वैकल्पिक रूप से, चूहों को एक उपयुक्त फेस मास्क के साथ एक उपयुक्त साँस लेने वाले एनेस्थेटिक उपकरण का उपयोग करके आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटिक किया जा सकता है। यदि आइसोफ्लुरेन का उपयोग कर रहे हैं, तो माउस को हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए अल्ट्रासाउंड के दौरान हीट पैड पर रखा जाना चाहिए।
  3. जानवर के सिर से बालों को शेव करने के लिए एक इलेक्ट्रिक रेजर का उपयोग करें, फिर एक कपास की कली के साथ बाल हटाने की क्रीम लागू करें, 2-3 मिनट के लिए छोड़ दें या जब तक कि बालों को धुंध के नम टुकड़े के साथ साफ नहीं किया जाता है। ध्यान रखें कि माउस की आंखों में हेयर रिमूवल क्रीम न आए।
  4. माउस के सिर के केंद्र को एक स्थायी मार्कर के साथ चिह्नित करें। ट्रांसड्यूसर के केंद्र में एक छेद होता है और ट्रांसड्यूसर फोकस और फोकल स्पॉट को नेत्रहीन रूप से संरेखित किया जा सकता है।
  5. एक छोटी वजन नाव को भरें जिसने पहले नीचे काट दिया था और अल्ट्रासाउंड जेल के साथ वजन नाव के नीचे चिपके प्लास्टिक रैप के साथ बदल दिया था। यह एक 8 मिमी स्पेसर के रूप में कार्य करता है और माउस के सिर को अच्छा युग्मन प्रदान करता है और माउस के सिर के साथ संरेखित ट्रांसड्यूसर के फोकस के दृश्य निरीक्षण की अनुमति देता है।

6. Microbubble तैयारी

  1. कमरे के तापमान के लिए एक माइक्रोबबल शीशी गर्म करें। सक्रिय करने के लिए, शीशी के लिए 0.9% NaCl समाधान के 0.5 mL जोड़ें और माइक्रोबबल्स का उत्पादन करने के लिए 45 s के लिए आंदोलन करने के लिए एक समामेलक में रखें।
  2. एक 27 जी सुई के साथ सेप्टा भेदी द्वारा शीशी वेंट.

7. अल्ट्रासाउंड उपचार

  1. माइक्रोबबल्स की शीशी को उलटें और धीरे से समाधान के 1 μL / g बॉडीवेट को खींचें। इस फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के समाधान को जोड़ने के लिए और सिरिंज में धीरे से मिश्रण. इंजेक्ट की गई अधिकतम मात्रा 150 μL है।
    नोट: इन-हाउस तैयार माइक्रोबबल्स नैदानिक रूप से उपयोग किए जाने वाले (उदाहरण के लिए, Definity microbubbles) की तुलना में लगभग 60 गुना कम केंद्रित हैं। मात्रा या एकाग्रता को समायोजित करें जैसे कि इंजेक्ट किए गए माइक्रोबबल्स की संख्या नैदानिक रूप से उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान है (यानी। Definity 1.2 x 108 microbubbles / किग्रा शरीर का वजन)।
  2. माइक्रोबबल और एंटीबॉडी समाधान को रेट्रोऑर्बिट रूप से इंजेक्ट करें, धीरे-धीरे और धीरे-धीरे इंजेक्ट करने का ध्यान रखें। फिर, माउस की आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
  3. माउस को हेड होल्डर में रखें (सामग्री की तालिका देखें) और माउस की नाक को ठीक करें। फिर अल्ट्रासाउंड जेल से भरी छोटी वजन वाली नाव को सिर के ऊपर रखें।
  4. पानी बोलस को कम करें जब तक कि यह वजन नाव में अल्ट्रासाउंड जेल के शीर्ष पर न बैठ जाए।
  5. सिर के केंद्र में ट्रांसड्यूसर फोकस को स्थानांतरित करने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग करें। गति टैब में मूल रीसेट करें का चयन करें।
  6. पूर्ण स्कैन का चयन करें। चरण 7.3-7.6 में 2 मिनट का समय लगेगा।
  7. स्थिरता के लिए, माइक्रोबबल्स को इंजेक्ट करने और पूर्ण स्कैन का चयन करने के बीच 2 मिनट की देरी सुनिश्चित करने के लिए एक टाइमर सेट करें।
  8. उपचार पूरा होने के बाद, आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें और माउस को एक गर्म वसूली कक्ष में रखें। यदि प्रक्रिया के दौरान हाइपोथर्मिया मनाया जाता है, तो प्रक्रिया के दौरान पूरक गर्मी प्रदान करने के लिए माउस के नीचे एक वार्मिंग पैड रखा जा सकता है।

8. ऊतक कटाई और प्रसंस्करण

  1. अल्ट्रासाउंड डिलीवरी के बाद ब्याज के समय बिंदु पर (मस्तिष्क में एंटीबॉडी के उच्च स्तर का पता लगाने के लिए कम से कम 1 ज) पेंटोबार्बिटोन समाधान (100 मिलीग्राम / किग्रा) की अधिक मात्रा के साथ माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज़ करें और ट्रांसकार्डियल रूप से माउस को 30 एमएल पीबीएस के साथ पारफ्यूज करें। विशेष रूप से फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक अच्छा परफ्यूजन आवश्यक है जो मस्तिष्क को वितरित किया गया है।
  2. मस्तिष्क को इकट्ठा करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 4% पीएफए में विसर्जन करके ठीक करें, फिर पीबीएस के साथ धोएं।
  3. मस्तिष्क को ट्रे पर रखकर और 700 एनएम चैनल में एक छवि प्राप्त करके एक अवरक्त स्कैनर में मस्तिष्क की छवि बनाएं।
    नोट: निर्धारण के बाद, मस्तिष्क को पीएफए से हटा दिया जाता है, पीबीएस में धोया जाता है और विभाजित किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, इसे एथिलीन ग्लाइकोल क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए या जलमग्न होने तक रखा जा सकता है, और फिर शीशी युक्त एक नए क्रायोप्रोटेक्टेंट में ले जाया जा सकता है और लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  4. एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके पीबीएस में मस्तिष्क की ठंड को अनुभाग करें। मंच के लिए मस्तिष्क गोंद और 30-40 μm वर्गों में कटौती और पीबीएस में इकट्ठा.
    नोट: लाइसोसोमल ऑटोफ्लोरेसेंस (लगभग 12 महीने से अधिक उम्र के जानवरों के वर्गों में प्रचलित) को एक प्रकाश कक्ष बॉक्स में वर्गों की रातभर रोशनी से ब्लीच किया जाना चाहिए, कमरे के तापमान पर और पीबीएस में एज़ाइड (0.02%) युक्त जीवाणु विकास को अवरुद्ध करने के लिए।

9. ऊतक धुंधला और छवि अधिग्रहण

  1. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान (0.2% ट्राइटन / पीबीएस में 5% बीएसए) में अनुभागों को स्थानांतरित करें, फिर समाधान को 0.2% ट्राइटन / पीबीएस के साथ बदलकर अनुभाग 3x को धोएं।
  2. Iba1 (कमजोर पड़ने 1: 1,000) और CD68 (कमजोर पड़ने 1: 500) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को इनक्यूबेट करें, 0.2% ट्राइटन / पीबीएस में, इसके बाद 0.2% ट्राइटन / पीबीएस के साथ 3x वॉश।
  3. फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1: 500) के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद केवल 0.2% ट्राइटन / पीबीएस के साथ 3x धोया जाता है।
    नोट: नाभिक को DAPI समाधान (0.5 μg / mL) का उपयोग करके भी दाग दिया जा सकता है।
  4. अनुभागों को स्लाइड पर स्थानांतरित करें और हार्ड-सेट बढ़ते मीडिया के साथ कवरस्लिप करें। विज़ुअलाइज़ेशन और छवि अधिग्रहण (रातोंरात) से पहले मजबूत करने के लिए बढ़ते माध्यम के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें।
  5. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ z-स्टैक छवियों (कम से कम 10 μm गहराई और 0.3 μm कदम आकार, प्रति पशु 10 छवियों) अल्ट्रासाउंड लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के एक confocal माइक्रोस्कोप और कम से कम 40x आवर्धन के एक उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त करें।
    नोट: सिग्नल डायनेमिक रेंज के भीतर छवियों को प्राप्त करने के लिए सावधान रहें, अंडर-/ माइक्रोस्कोप द्वारा उपयोग किए जाने वाले संगत सॉफ़्टवेयर प्रारूप में छवि फ़ाइलों को सहेजें.

10. छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर फ़ाइल आयातक का उपयोग कर z-स्टैक माइक्रोस्कोपी फ़ाइल कनवर्ट करें।
  2. सॉफ़्टवेयर में परिवर्तित फ़ाइलों को खोलें और माइक्रोग्लियल कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए Iba1 चैनल की तीव्रता को समायोजित करें।
  3. इसके चारों ओर एक बॉक्स खींचकर एक एकल माइक्रोग्लियल सेल को क्रॉप करें, 'क्रॉप' चुनें और नई फ़ाइल को सहेजें।
  4. IBA1 संकेत के 3D सतह प्रतिपादन का निर्माण करें:
    1. पिछले चरण में जनरेट की गई एकल कक्ष Imaris फ़ाइल खोलें।
    2. फ़ाइल में कोई सतह जोड़ें.
    3. Iba1 धुंधला करने के लिए इसी चैनल का चयन करें।
    4. Iba1 धुंधला ओवरलैप करना चाहिए जो थ्रेशोल्ड लागू करें
    5. केवल ब्याज की उस संरचना का चयन करें जो ब्याज के माइक्रोग्लियल सेल का निर्माण कर रही है
  5. प्रक्रिया को अंतिम रूप देना
    1. प्राप्त करें और Iba1 धुंधला की मात्रा रिकॉर्ड
    2. CD68 धुंधला की 3D सतह रेंडरिंग बनाएँ
    3. IBA1 सतह सबफ़ाइल के अंदर, CD68 चैनल मुखौटा और IBA1 धुंधला के बाहर voxels को हटाने
    4. फ़ाइल में कोई नई सतह जोड़ें
    5. CD68 धुंधला करने के लिए संगत चैनल का चयन करें
    6. एक थ्रेशोल्ड लागू करें जो CD68 धुंधला ओवरलैप करना चाहिए और जितना संभव हो उतना बारीकी से धुंधला वॉल्यूम से मेल खाता है
    7. प्रक्रिया को अंतिम रूप दें, क्योंकि इस फ़ाइल में केवल इंट्रा-माइक्रोग्लियल CD68 संरचनाएं मौजूद होंगी और इस प्रकार, उन्हें किसी अन्य थ्रेशोल्ड फ़िल्टरिंग चरण की आवश्यकता नहीं है
    8. CD68 धनात्मक संरचनाओं की संख्या और औसत वॉल्यूम प्राप्त करें और रिकॉर्ड करें
    9. एक फागोसाइटिक अवस्था में माइक्रोग्लियल सक्रियण के उपाय के रूप में इसके संबंधित IBA1 संरचनाओं के प्रति CD68 संरचनाओं की सापेक्ष मात्रा की गणना करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी को मस्तिष्क में वितरित किया जाता है और माइक्रोग्लिया सक्रियण के साथ-साथ इसका पता लगाया जा सकता है। निष्कर्ष है कि तैयार किया जा सकता है केंद्रित अल्ट्रासाउंड और microbubbles का उपयोग स्पष्ट रूप से एंटीबॉडी के मस्तिष्क uptake को बढ़ाता है और एक स्कैनिंग मोड में उपयोग किया जाता है जब एक माउस के पूरे मस्तिष्क या गोलार्ध के लिए एंटीबॉडी वितरित कर सकते हैं. चित्रा 1 TIPS अल्ट्रासाउंड अनुप्रयोग डिवाइस (लेबल विभिन्न घटकों) जो BBB को खोलने के लिए उपयोग किया जाता है से पता चलता है। चित्रा 2 आकार और एकाग्रता के कुल्टर काउंटर माप से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है जो माइक्रोबबल्स के सही ढंग से उत्पादित होने पर प्राप्त किया जाना चाहिए। डिलीवरी को आसानी से देखने के लिए, एंटीबॉडी को एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया था। मस्तिष्क द्वारा एंटीबॉडी अपटेक को आसानी से पूरे मस्तिष्क या वर्गों में एक अवरक्त स्कैनर का उपयोग करके या मस्तिष्क वर्गों पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। मस्तिष्क अनुभाग एक माइक्रोस्कोपिक स्तर पर फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के स्थान को दिखाते हैं। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटी-ताऊ एंटीबॉडी RN2N के हिप्पोकैम्पस को अल्ट्रासाउंड डिलीवरी को स्कैन करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3 में दिखाए गए हैं। एसयूएस और एंटीबॉडी वितरण के परिणामस्वरूप सामान्य मस्तिष्क होमियोस्टैसिस के किसी भी परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए, एक रीड-आउट फागोसाइटोसिस के संबंध में माइक्रोग्लियल लाइसोसोमल सामग्री थी। चित्रा 4 Iba1 और माइक्रोग्लिया लाइसोसोम विशिष्ट मार्कर CD68 का उपयोग करके माइक्रोग्लिया के लिए प्रतिनिधि धुंधला दिखाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि एंटीबॉडी के वितरण के बाद माइक्रोग्लिया अधिक फागोसाइटिक बन जाता है या नहीं।

Figure 1
चित्रा 1: महत्वपूर्ण घटकों लेबल किया जा रहा के साथ अल्ट्रासाउंड देने के लिए इस्तेमाल किया ध्यान केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रणाली. (ए) घर का बना जेल धारक 8 मिमी स्पेसर के रूप में कार्य करता है। (बी) ट्रांसड्यूसर के माध्यम से देखें जो दिखाता है कि लक्ष्य को नेत्रहीन (सी) फोकस के साथ कैसे संरेखित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इन-हाउस तैयार माइक्रोबबल्स की गुणवत्ता नियंत्रण माप। (ए) कुल्टर काउंटर उपकरण का उपयोग सारांश सांख्यिकी (बी) और संख्या (सी) और वॉल्यूम वितरण (डी) में माइक्रोबबल्स के आकार वितरण को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एसयूएस का उपयोग करके मस्तिष्क में फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी का वितरण। (ए) एक फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी टुकड़ा जो अपने दम पर वितरित ताऊ आइसोफोर्म के लिए विशिष्ट है, एसयूएस अपने दम पर, और एक संयोजन उपचार ने मस्तिष्क के एक गोलार्ध के निकट अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके एसयूएस के साथ संयुक्त होने पर एक सोनिकेटेड गोलार्ध द्वारा एंटीबॉडी के बढ़ते उत्थान का खुलासा किया। एक लुक-अप-टेबल (एलयूटी) लागू किया गया था, जिसमें गर्म रंगों में प्रदर्शित मनमानी इकाइयों में उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता थी। (बी) प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के एसयूएस-केवल नियंत्रण स्तरों को घटाए बिना किया गया था। SEM ± माध्य दिखाया गया है. (सी) मस्तिष्क वर्गों की कम और उच्च आवर्धन छवियों में दिखाए गए हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी का बढ़ा हुआ अपटेक। संयोजन उपचार में, एंटीबॉडी कोशिका निकायों और यहां तक कि डेंड्राइट्स में वितरित करता है जैसा कि हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के लिए दिखाया गया है। ब्लू = DAPI, मैजेंटा = एंटीबॉडी टुकड़ा. स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोग्लिया के लिए प्रतिनिधि immunofluorescence लेबलिंग, माइक्रोग्लिया की अपेक्षित आकृति विज्ञान दिखा रहा है और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी में प्रस्तुत किया। माइक्रोग्लिया आकृति विज्ञान हरे रंग में मनाया जाता है और CD68 के स्तर और वितरण लाल रंग में मनाया जाता है। स्केल बार 10 μm. हरा = Iba1, लाल = CD68. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी को स्कैनिंग मोड में लागू माइक्रोबबल्स के साथ केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके मस्तिष्क में वितरित किया जा सकता है। एंटीबॉडी वितरण, माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान और लाइसोसोमल इज़ाफ़ा स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है। माइक्रोग्लिया अपने लाइसोसोम एंटीबॉडी और एंटीजन में ले जा सकता है जो एंटीबॉडी ने एफसी-रिसेप्टर-मध्यस्थता प्रक्रिया 4 में बाध्य किया है।

इस विधि का उपयोग करके दोहराए जाने योग्य बीबीबी खोलने और एंटीबॉडी वितरण प्राप्त करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर और माउस के सिर के बीच अच्छा युग्मन सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। माउस के सिर पर सभी बालों को हटा दें और सुनिश्चित करें कि युग्मन में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। इन-हाउस तैयार माइक्रोबबल्स की विशेषताएं सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। माइक्रोबबल्स में 108 माइक्रोबबल्स / एमएल की पर्याप्त एकाग्रता होनी चाहिए और एक आकार वितरण होना चाहिए ताकि 90% से अधिक माइक्रोबबल्स व्यास में 10 μm से नीचे हों। ऐसा इसलिए है क्योंकि बड़े माइक्रोबबल्स को फेफड़ों द्वारा परिसंचरण से बाहर फ़िल्टर करने के लिए जाना जाता है। एक स्वीकार्य माध्यिका आकार 1 -3 μm के बीच है। माइक्रोबबल्स को सिरिंज में उन्हें नष्ट करने से बचने के लिए धीरे से संभाला और इंजेक्ट किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि अल्ट्रासाउंड को माइक्रोबबल्स के इंजेक्शन के बाद 2 मिनट से अधिक समय के बाद लागू नहीं किया जाए जिसे अभ्यास के साथ प्राप्त किया जा सकता है। एक पूरे मस्तिष्क या पूरे गोलार्ध का लक्ष्यीकरण आसानी से एसयूएस दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया जाता है और लक्ष्यीकरण की सटीकता बड़े क्षेत्रों को लक्षित करते समय एक समस्या होने की संभावना नहीं है। हिप्पोकैम्पस या स्ट्रिएटम जैसे छोटे मस्तिष्क क्षेत्र को भी सफलतापूर्वक लक्षित किया जा सकता है, लेकिन इस मामले में यह महत्वपूर्ण है कि फोकस लक्षित क्षेत्र को ओवरलैप करता है। एक माउस मस्तिष्क की ऊंचाई एक विशिष्ट अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके 1 मेगाहर्ट्ज पर केंद्रित अल्ट्रासाउंड बीम की अक्षीय लंबाई के समान है, ताकि ट्रांसड्यूसर को केवल एक्स और वाई आयाम में स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो, न कि जेड आयाम। यह एक विशेष मस्तिष्क संरचना के लिए स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक के ज्ञान द्वारा और माउस की depilated त्वचा के माध्यम से लैम्ब्डोइड और sagittal टांके को देखकर निर्धारित किया जा सकता है।

यहां हम एक ऐसी तकनीक का प्रदर्शन करते हैं जो माइक्रोबबल्स और एंटीबॉडी देने के लिए रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन का उपयोग करती है। रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन का एक विकल्प पूंछ शिरा इंजेक्शन है जो माइक्रोबबल्स और एंटीबॉडी को वितरित करने के लिए एक प्रभावी तकनीक भी है। रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन के फायदे यह है कि यह तकनीकी रूप से पूंछ शिरा इंजेक्शन की तुलना में कम चुनौतीपूर्ण है, और ऊतक क्षति के बहुत कम जोखिम के साथ कई बार (इंजेक्शन की वैकल्पिक आंख) दोहराया जा सकता है।

यदि मस्तिष्क में कोई फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी का पता नहीं लगाया जाता है, तो यह संभव है कि बीबीबी नहीं खुला। समस्या निवारण को एक केंद्रित माइक्रोबबल समाधान प्राप्त करने और इसे इंजेक्ट करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए ताकि माइक्रोबबल्स को नष्ट न किया जा सके और इंजेक्शन समय के दो मिनट के भीतर अल्ट्रासाउंड वितरित न किया जा सके। यदि कोई बीबीबी उद्घाटन नहीं होता है, तो चोटी नकारात्मक दबाव सेटिंग को बढ़ाया जा सकता है, चेतावनी के साथ कि उच्च चोटी के नकारात्मक दबाव माइक्रोहेमोररेज पैदा करने की संभावना को बढ़ाते हैं जो हम वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके 0.65 एमपीए की चरम नकारात्मक दबाव सेटिंग पर पता नहीं लगाते हैं। एंटीबॉडी की एंटीजन विशिष्टता के आधार पर धुंधला पैटर्न अलग होगा। एंटी-ताऊ एंटीबॉडी इंजेक्ट करते समय प्राप्त धुंधला पैटर्न चित्र 2 में दिखाया गया है।

इस तकनीक को एंटीबॉडी की एक श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है और जब तक लगातार बीबीबी उद्घाटन प्राप्त किया जाता है, तब तक मस्तिष्क में एक लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी के बंधन का आकलन किया जा सकता है। स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड दृष्टिकोण एक पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से एक पूरे माउस मस्तिष्क में बीबीबी के उद्घाटन को प्राप्त करता है।

इस तकनीक की एक सीमा यह है कि माउस के जीवित होने के दौरान बीबीबी उद्घाटन की घटना और सीमा नहीं देखी जाती है। इस सीमा को प्रक्रिया में गैडोलिनियम कंट्रास्ट एजेंट के साथ एमआरआई इमेजिंग को शामिल करके दूर किया जा सकता है, लेकिन यह प्रक्रिया के समय और लागत को काफी बढ़ाता है।

यहां वर्णित एक एकल sonication और एंटीबॉडी प्रोटोकॉल का एकल प्रशासन है जिसका उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि एंटीबॉडी के कितने बढ़े हुए उत्थान को प्राप्त किया जा सकता है, साथ ही साथ वे प्रसव के बाद मस्तिष्क में कहां स्थित हैं। प्रोटोकॉल का उपयोग एंटीबॉडी वितरण के चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए एक अनुदैर्ध्य अध्ययन में भी किया जा सकता है। एक उपचार अध्ययन में प्रोटोकॉल को मस्तिष्क को दिए गए एंटीबॉडी की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक सप्ताह या उससे अधिक समय के अंतर-उपचार अंतराल के साथ दोहराया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड द्वारा वितरित एंटीबॉडी की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में किया जा सकता है। चिकित्सीय प्रभाव के रीड-आउट में व्यवहार परीक्षण शामिल हो सकते हैं, और उदाहरण के लिए पैथोलॉजिकल प्रोटीन के स्तर के लिए हिस्टोलॉजी और बायोकेमिस्ट्री ताऊ, एमिलॉइड-β या सिन्यूक्लिन।

अंत में, हमने फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी वितरित करने के लिए चूहों में रक्त मस्तिष्क बाधा को खोलने के लिए एक विधि को रेखांकित किया है। यह विधि न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए रुचि की होगी।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ क्लेम जोन्स एओ, ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद [GNT1145580, GNT1176326], मेटल फाउंडेशन, और क्वींसलैंड की राज्य सरकार (DSITI, विज्ञान, सूचना प्रौद्योगिकी और नवाचार विभाग) की संपत्ति द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti 850365C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] Avanti 880128C
AlexaFluor 647 antibody labeling kit Thermo Fisher A20186
CD68 antibody AbD Serotec MCA1957GA Use 1:1000 dilution
Chloroform Sigma-Aldrich 372978
Coulter Counter (Multisizer 4e)
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo FIsher A-11008 Use 1:500 dilution
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-11077 Use 1:500 dilution
head holder (model SG-4N, Narishige Japan)
Iba1 antibody Wako 019-19741 Use 1:1000 dilution
Image analysis software Beckman Coulter #8547008
Isoflow flow solution Beckman Coulter B43905
Near infrared imaging system Odyssey Fc Licor 2800-03
Octafluoropropane Arcadophta 0229NC
Propylene Glycol Sigma-Aldrich P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System) Philips Research TIPS_007
Bitplane

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References

  1. Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
  2. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
  3. Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
  4. Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
  5. Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
  6. Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
  7. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
  8. Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
  9. Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
  10. Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
  11. Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
  12. Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
  13. Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
  14. Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).

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केंद्रित स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर मस्तिष्क में एंटीबॉडी का वितरण
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Leinenga, G., Bodea, L. G., Koh, W.… More

Leinenga, G., Bodea, L. G., Koh, W. K., Nisbet, R. M., Götz, J. Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound. J. Vis. Exp. (161), e61372, doi:10.3791/61372 (2020).

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