Summary
本文介绍，如何产生E型肝炎病毒（HEV）的高病毒滴度库存，以有效感染肝细胞的有效方法。通过提出的方法，可以收获非包络和包络病毒颗粒，并用于接种各种细胞系。
Abstract
E型肝炎病毒是肝硬化和肝衰竭的主要原因，全球患病率呈上升趋势。单链RNA病毒主要通过输血、卫生条件差和受污染的食品传播。迄今为止，标签外药物利巴韦林（RBV）是许多患者的首选治疗。尽管如此，特定的 HEV 治疗仍有待确定。到目前为止，由于缺乏有效的 HEV 细胞培养系统，有关 HEV 生命周期和发病机制的知识受到严重阻碍。一个强大的细胞培养系统对于研究病毒生命周期至关重要，其中也包括病毒发病机制。与这里描述的方法，可以产生病毒滴答声高达3 x 106焦点形成单位/mL （FFU/mL） 的非包络 HEV 和高达 5 x 104 FFU/mL 的包络 HEV。使用这些粒子，可以感染各种不同来源的细胞，包括原细胞和人类，以及动物细胞系。来自质粒的传染性 HEV 颗粒的产生构成了一个无限的来源，这使得该协议非常有效。
Introduction
E型肝炎是一种被低估的疾病，全世界患病率正在上升。每年约有2000万人感染，导致7万多人死亡。基础代理，E型肝炎病毒（HEV），最近被重新分配，现在被归入家族赫佩维利达，包括基因正畸病毒和皮西赫佩病毒。各种起源的HEV被分类在物种正畸病毒 A-D 包括从人类，猪，兔子，大鼠，鸟类和其他哺乳动物的分离2。目前，8种不同基因型（GT）的正向型、单链RNA病毒已发现2种。虽然它们的序列特征、传播途径和地理分布不同，但它们的基因组结构却高度保守。更具体地说，7.2 kbp HEV基因组分为3个主要的开放读取帧（ORF1-3）。ORF1对宿主细胞内成功复制所需的所有酶进行编码，ORF2对帽状蛋白进行编码，ORF3蛋白作为组装和释放传染性颗粒所需的功能离子通道。一旦被释放到基础或全息流明HV存在于两个，准病毒和非包络/裸种，取决于病毒是否来自血液或粪便，分别4,4，5。
虽然GT1和GT2主要发现在发展中国家只感染人类6通过粪便-口腔路线，GT3，GT4和GT7主要发生在发达国家1，77与各种物种作为1水库， 例如，猪8，大鼠9，鸡10，11，10,11鹿12，驼鹿13，蝙蝠14，兔子15，16，,16野猪17和更多,7，18，19，,19提供动物病7，20，21，22,21,的证据。7,除了卫生条件差23种和受污染的食品,,12、24、25、26，25,通过输血和器官移植传播的1224食品也有27种、28,种。HEV 是肝硬化和肝衰竭的常见原因29，特别是对于预先存在的肝病患者、免疫功能低下的个人（基因型 3、4 和 7）和孕妇（基因型 1）。值得注意的是，也有肝外表现，如造血病30，31，32，,32神经紊乱33和肾损伤34。30,
迄今为止，标签外药物利巴韦林（RBV）是许多感染患者的首选治疗35，36。35,36然而，治疗失败和临床长期效果不佳的病例已经报告。治疗失败与病毒突变和慢性感染患者37，38，39,的病毒异质性增加有关。相反，最近欧洲的回顾性多中心研究未能将聚合酶突变与RBF治疗失败40相关。在临床观察和体外实验中，干扰素41、42、43、索福斯布韦41,42,4344、45、,45锌盐46和硅酸盐47、48也显示出抗47,48病毒作用。然而，由于对 HEV 生命周期及其发病机制缺乏了解，仍有待发现特定的 HEV 治疗。因此，迫切需要一个强大的细胞培养系统进行病毒学研究和开发新的抗病毒药物。
不幸的是，与其他肝炎病毒一样，HEV很难在常规细胞系中传播，而且通常进展非常缓慢，导致病毒负荷低。然而，一些组能够通过生成细胞系子球50或调整介质补充剂51来促进病毒负荷。最近cDNA克隆52的生成和原发性患者通过传世53、54的适应，进一步改善了细胞培养中的 HEV 传播55。在该协议中，我们使用细胞培养的基因组适应Kernow-C1菌株（称为p6_WT）54和含有复制增强突变（称为p6_G1634R）37的突变株。Kernow-C1 是 HEV 细胞培养中最常用的菌株，能够产生高病毒载量。通过评估病毒RNA拷贝数，可以进行体外监测的 HEV 复制。然而，这些技术不允许评估产生的传染性颗粒的数量。因此，我们建立了免疫荧光染色，以确定焦点成形单位（FFU/mL）。
此处描述的方法56可用于产生全长传染性病毒颗粒，这些颗粒能够感染各种细胞类型，包括原发细胞和哺乳动物细胞系。这是破译 HEV 感染和tropism 的重要方面的基本先决条件。无需接种通常有限的患者隔离。来自质粒的传染性 HEV 颗粒的产生构成了一个无限的来源，这使得该协议具有相当的效率。此外，该系统可用于反向遗传学，使研究体内识别的基因组改变及其对 HEV 复制和健身的影响。该技术克服了许多限制，可以路径的药物开发，突变研究和评估病毒宿主相互作用，如限制或进入因素。
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Protocol
注：所有实验在BSL-2条件下进行。所有与E型肝炎病毒RNA或传染性病毒接触的材料，在处置前，必须用4%的Kohrsolin FF从烟罩内的废物容器中正确冲洗。
1. 质粒制备
- 接种含有100μg/mL安皮西林的200 mL LB介质，用转化的Escherichia大肠杆菌JM109加入全长 HEV gtnow-C1p6 序列的质粒编码 （pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54或 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37）.在37°C下在永久搅拌（170 rpm）下孵育16小时。
注：质粒分离是使用质粒提取试剂盒进行的（参见材料表）。 - 按照制造协议，在 6，000 x g 和 4 °C 下旋转 200 mL的隔夜培养，10 分钟，然后丢弃上经剂。细菌颗粒可以冷冻并储存在-20°C。
- 通过10 mL血清移液器和移液器上下移液，将细菌颗粒重新填充在4 mL的再增液缓冲液中。此外，漩涡严格。
- 加入 4 mL 预预热 Lysis 缓冲液 （30-40 °C）。轻轻反转几次，在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
- 添加 4.8 mL 中和缓冲液，轻轻反转，确保 lysate 定量中和（参见制造商的说明）。然后在11，000 x g和4°C下离心20分钟。
- 将 2 厘米 x 2 厘米的木耳片放在 1 mL 非滤芯中，在 10 mL 血清移液器中重新装压、莱西和中和上清液，将 1 mL 尖端与耳塞添加到血清移液器尖端，并在新的 50 mL 管中过滤上清液。
注：如有必要，中分在4°C下储存长达30分钟。 - 在几个步骤中，将过滤的上清液的 750 μL 应用于总共 4 个滤芯柱（套件中提供），并在 11，000 x g的离心机上以 30 s。
- 用 500 μL 预预热 （50 °C） 洗涤缓冲液 AW 在 11，000 x g 30 s 下洗涤每个滤芯柱两次，然后丢弃流经。
- 用 600 μL 的洗涤缓冲液 A4 洗涤每个滤芯柱，以 11，000 x g离心 30 秒。丢弃流经，以 11，000 x g离心将滤芯柱干燥 2 分钟。
- 通过将 60 μL 的洗脱缓冲液转移到过滤柱的中心，从每个过滤柱中筛选质粒 DNA。在RT下孵育1分钟，在11，000 x g下离心1分钟。
- 使用分光光度计结合脱氧核糖核酸并测量提取的质粒DNA的浓度。
2. 线性化和DNA纯化
图1：质粒线性化和DNA纯化的原理图实验设置。请单击此处查看此图的较大版本。
注：线性化在体外转录期间增加RNA产量（步骤3）
- 要线性化质粒DNA（图1）混合10μg的模板DNA（在步骤1中提取），10μL的缓冲液，2μL的MluI，并调整到100μL的体积与H 2O。
- 在37°C下孵育1小时，通过阿加罗斯凝胶电泳确认质粒的线性化（例如，在1%的糖糖凝胶上加载非消化和消化质粒DNA[1μL每个]，并在120V常量下运行电泳）。
- 按照制造商的DNA提取协议（见材料表，图1），混合500μL的结合缓冲液，在套件中提供，与100μL的线性DNA。将样品涂抹到滤芯柱上，以 17，800 x g 的离心机30 s。 丢弃流经，将滤芯柱放回同一管中。
- 通过添加 650 μL 的洗涤缓冲液和离心 17，800 x g 30 s 来清洗滤芯柱。丢弃流经，将滤芯柱放回同一管中。要去除残留的洗涤缓冲液，请将离心机干燥至 17，800 x g，为 60 秒，然后将每个滤芯柱放在干净的 1.5 mL 微离心管中。
- 通过将60μL的预预热H2O（PCR等级，70°C）转移到过滤器的中心来转移DNA。在70°C下孵育1分钟，在18，000 x g下离心1分钟。使用分光光度计测量纯化DNA的浓度。
注：将DNA储存在-20°C，直到体外转录。
3. 全长 HEV 基因型 3 p6 DNA 和 RNA 纯化的体外转录
图2：体外转录和RNA纯化的原理图实验设置。请单击此处查看此图的较大版本。
注：体外转录是利用质粒DNA产生病毒基因组RNA所必需的。
- 用于体外转录混合 20 μL 的 5x T7 转录缓冲液、10 mM DTT、100 U 的核糖核酸酶抑制剂、25 mM ATP、CTP 和 UTP、12.5 mM GTP、5 mM Ribo m7G Cap 模拟、2 μg 线性 DNA 模板和 80 U T7 RNA 聚合酶。用无核酸酶填充高达100μL的H2O，混合良好，在37°C下孵育2小时。
注：步骤 3.1 至 3.1.2 后，可以短期储存在 -20 °C。- 加入2μL的T7RNA聚合酶，在37°C下混合好，再孵育2小时。
- 要消化初始DNA模板，加入7.5μL的DNase（无RNase，1 U/μL），在37°C下混合并孵育30分钟。
注：使用RNA时，用表面除污染剂清洁所有表面和移液器，以避免降解。此外，确保所有反应管都是无 RNase 和无菌的。仅使用带过滤器的尖端，仅使用无 RNase 和无菌水稀释。
- 按照制造公司提取RNA的协议（参见材料表，图2），通过混合330μL的Lysis缓冲液和330μL的100%乙醇，制备Lysis缓冲液和100%乙醇的预混料，用于每次体外转录反应。加入660μL的Lysis缓冲乙醇预混到110μL的RNA和涡流中。将样品装载在过滤柱上，以 8000 x g离心 30 s。丢弃流经，将滤芯柱放回同一管中。
- 以 8000 x g 添加 600 μL 的洗涤缓冲液和离心机，30 s. 丢弃流经，将滤芯柱放回同一管中。加入 350 μL 的洗涤缓冲液，并在 8000 x g下离心 2 分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。将每个滤芯柱放在干净的 1.5 mL 微离心管中。打开滤芯柱盖，让柱干燥 3 分钟。
- 通过将 50 μL 无 RNase H2O 放入滤芯柱的中心来使 RNA 高。在RT下孵育1分钟，随后在8，000 x g下进行离心1分钟。通过将1μLRNA加载到阿加罗斯凝胶上，然后使用分光光度计测量提取的RNA的浓度，检查RNA的完整性。
注：将RNA储存在-80°C，直到电穿孔，并在冰上专门解冻RNA，以避免降解。
4. 为细胞培养衍生 HEV （HEVcc） 生产准备 HepG2 细胞
图3：用于制备 HepG2 细胞的原理图实验设置，用于细胞培养衍生 HEV （HEVcc） 生产。请单击此处查看此图的较大版本。
注：为避免污染，在生物安全2级设施中的无菌条件下进行细胞制备、电穿孔、感染、收获和细胞固定。在37°C的孵化步骤，涉及细胞完成在5%CO2培养箱。
- 为 HEVcc 生产准备 HepG2 细胞（图3），在完整的 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM） 的种子细胞（见表1）到 15 厘米胶原蛋白（见表 1，无菌过滤器 PBS-醋酸混合通过 0.2 μm 网格添加胶原蛋白）涂层培养皿。在37°C下孵育，直到细胞90%汇合。
注：每15厘米的培养皿含有90%的汇合细胞，将产生足够的细胞，最多4个电穿孔。 - 用 10 mL 的 1x PBS 轻轻取出介质和洗涤细胞一次。通过将3 mL的0.05%的尝试-EDTA添加到细胞中，并在37°C下孵育，直到细胞完全分离。在10 mL DMEM完整介质中重新悬浮细胞，将细胞悬浮液转移到50 mL管中。确定单元格总数。
- 由于每个电穿孔需要 5 x 106细胞，因此在新的 50 mL 管中传输适当的体积，用 1x PBS 填充至少 35 mL。在200 x g下离心细胞5分钟，并小心丢弃上一代，而不会干扰细胞颗粒。
- 在200 x g下再次用35 mL的1x PBS清洗细胞5分钟，将细胞放在冰上，不要取出1xPBS，以保持细胞悬浮。
5. HepG2细胞的电穿孔
图4：HepG2细胞电穿孔的电图实验设置。请单击此处查看此图的较大版本。
- 对于 HepG2 细胞的电穿孔 （图 4） 通过补充 384 μL 的 Cytomix （见表1）与 2 mM ATP 和 5 mM 谷胱甘肽，每电穿孔制备 400 μL 的 Cytomix 完成。使用前准备新鲜，直接放在冰上。
注意：正确但快速执行以下步骤至关重要。因此，请确保一切准备得当。 - 小心地取出 1x PBS，而不干扰步骤 4.4 中的细胞颗粒。在400μL的细胞混合中重新发送5 x10 6个细胞，并加入5μgRNA，从步骤3.2.2。使用 975 μF、270 V，使用电穿孔系统将溶液转移到 4 mm 的保素盒和脉冲中一次。
- 电穿孔后转移细胞尽快用巴氏移液器进入11 mL DMEM完成每电穿孔。
注：为确保RNA成功转染到 HepG2 细胞中，将执行转染控制 （TC）。预期转染率在 ORF2 阳性细胞的 40-60% 之间变化。
- 电穿孔后转移细胞尽快用巴氏移液器进入11 mL DMEM完成每电穿孔。
- 将 10 mL 的电分细胞转移到涂有胶原蛋白的 10 厘米培养盘中。将 1.3 x 105电保护电池 （300 μL） 添加到一个孔的胶原蛋白涂层 24 微蒂板携带盖滑 （后来用作转染控制）.均匀分布细胞，在37°C下孵育。
- 24小时后，更换10厘米菜的介质，更换为10 mL新鲜DMEM完成。不要更改转染控制的介质。在37°C下再孵育6天。
- 通过继续免疫荧光染色方案（步骤8），根据细胞密度，停止24孔板5-7 d电穿孔后转染控制。转染效率的计算方法是计算将 ORF2 正细胞数与细胞总数规范化。
6. 细胞内和细胞外 HEVcc 的收获
图5：用于采集细胞内和细胞外 HEVcc 的原理图实验设置。请单击此处查看此图的较大版本。
- 要收获细胞外 HEVcc（图 5），请通过 0.45 μm 网格过滤 6 天后从 10 厘米培养皿获得的上清液，以清除任何细胞碎屑。储存收获的细胞外HVcc在4°C当天感染，否则储存在-80°C。
- 要收获细胞内 HEVcc （图 5），用 1x PBS 洗涤细胞，通过添加 1.5 mL 的 0.05% trypsin-EDTA 来洗涤细胞和尝试。在37°C下孵育，直到细胞完全分离。加入10 mL的DMEM完成，冲洗板分离细胞和转移细胞悬浮到50mL管。用 PBS 清洗细胞两次。在200 x g下离心5分钟。
- 丢弃上一提液，每次电穿孔时将细胞颗粒重新在 1.6 mL 的 DMEM 中。将细胞悬浮液转移到 2 mL 反应管中。
注意：不要使用更大的体积，因为它会大大减少病毒载量。 - 冷冻（在液氮中）和解冻细胞。重复此序列 3 次。
注：由于解解效率受损，不要为3个冷冻和解冻循环汇集多个电穿孔（1.6 mL）。不要在循环之间涡旋细胞悬浮液。确保缓慢解冻细胞悬浮液（例如室温或冰上），以最大限度地提高病毒载量。 - 高速离心机以10，000 x g的速度将磨碎的细胞分离10分钟，以分离细胞碎片。将上一液转移到新管子中。以上一液感染，否则储存在-80°C。
- 可选地，使用集中器集中细胞外和细胞内 HEVcc 以增加病毒载量（根据制造商的协议）。
- 丢弃上一提液，每次电穿孔时将细胞颗粒重新在 1.6 mL 的 DMEM 中。将细胞悬浮液转移到 2 mL 反应管中。
7. HepG2/C3A细胞感染细胞内和细胞外HVcc
图6：HepG2/C3A细胞感染的图形实验设置，细胞内和细胞外HVcc。请单击此处查看此图的较大版本。
注：HepG2/C3A细胞的感染应确保产生传染性颗粒。此外，收获的细胞内和细胞外HVcc的滴定用于计算FFU/mL中的病毒滴定剂。这以后称为感染控制 （IC）。
- 为准备 HepG2/C3A 细胞的 HEVcc 感染 （图 6），预热最小基本介质 （MEM） 完成 （见表 1）至 37 °C。
- 种子 2 x 104细胞/井在 100 μL 到胶原蛋白涂层 96 孔微刺激板前一天步骤 6.确保用 1x PBS 填充最外层的孔，以防止内部 60 孔内的介质蒸发。在37°C孵育24小时。
- 通过将50微升（从步骤6.1）添加到前一天播种的 HepG2/C3A 细胞中，感染细胞外 HEVcc。通过上下移液和连续稀释六次 1：3，将 50 μL 转移到下一个井中，混合均好。对技术复制执行串行稀释的重复。
- 通过将25μL上流液（从步骤6.2.3）添加到前一天播种的 HepG2/C3A 细胞，感染细胞内 HEVcc。通过上下移液和连续稀释六次 1：5，将 25 μL 转移到下一个井中，混合均好。执行重复串行稀释以进行技术复制。
- 在 37 °C 下 7 d 后，继续使用免疫荧光染色协议（步骤 8）来阻止感染。
8. 转染和感染控制的免疫荧光染色
图7：转染和感染控制的免疫荧光染色的示意图实验设置。请单击此处查看此图的较大版本。
- 对于免疫荧光染色（图7），用1x PBS洗3x，通过分配350μL（转染控制[TC]）或50μL（感染控制[IC]）每井4%固定溶液来固定细胞。在RT孵育15分钟，然后用1xPBS小心洗涤两次。
注：该协议可以暂停在这里的转染控制，直到感染的 HepG2/C3A 细胞也停止。将井盘存放在4°C。还要用准膜密封，以防止蒸发。 - 通过添加 350 μL （TC） 或 50 μL （IC） 的 0.2% Triton X-100 （在 1° PBS 中） 在 RT 下 5 分钟，使细胞渗透。然后用 1x PBS 小心洗涤两次，然后用 350 μL （TC） 或 50 μL （IC） 5% 的马血清 （在 1x PBS） 的块在 RT 下在轨道摇床 （30 rpm） 的恒定搅拌下 1 小时。
注：准备小塑料盘（30毫米），在里面放置一个潮湿的纸巾和石蜡膜层在上面，形成一个潮湿的房间。然后将 TC 盖滑面朝上转移到石蜡薄膜上。TC 的以下步骤将在潮湿室中执行。 - 每井每井加入70μL（TC）或25μL（IC）原抗体抗 ORF2 8282（HEV 特异性兔高免疫血清，1：5，000 在 5% 马血清中），并在轨道摇床（30 rpm）的恒定搅拌下在 4 °C 下孵育。
- 用 1x PBS 小心洗涤两次，加入 70 μL （TC） 或 25 μL （IC） 的二次抗体山羊抗兔子 488 （1：1，000 在 5% 马血清中）。在黑暗中在轨道摇床（30 rpm）的不断搅拌下孵育1小时。再次，小心用 1x PBS 洗涤两次
- 加入 70 μL （TC） 或 25 μL （IC） 的 DAPI（1：10，000 在 H 2 O 中），孵育 1 分钟。用 H2O 小心洗涤两次。从潮湿室中拿出盖滑，将 6 μL 的安装试剂倒置在盖滑轨上（仅适用于 TC），让安装试剂在黑暗中 RT 干燥 16 小时。将 IC 储存在水中，直到成像并用石蜡膜密封板，以避免因蒸发而干燥。
- 拍摄图像以确认感染成功。
注：使用市售的抗 ORF2 1E6 抗体57（5%马血清中的 1：200）和二级抗体驴抗小鼠（5% 马血清中的 1：1，000）获得可比结果
9. FFU 测定
注：一个 FFU 定义为一个或多个 ORF2 阳性细胞，由至少三个负细胞从另一个 FFU 分离。
- 对于细胞外 HEVcc 开始计算两个孔在两个最低稀释中的所有 ORF2 阳性 foci。总共应计算四口井。每毫升的焦形成单位 （FFU） 可以使用以下方程计算：
注：预期滴答声在 102 和5 x 104 FFU/mL 之间变化。 - 对于细胞内 HEVcc，开始计算在观察到 50 到 100 个 foci 的井中所有 ORF2 阳性 foci。此外，在下一个较高的稀释中计算两个孔。总共应计算四口井。每毫升的焦形成单位 （FFU） 可以使用以下方程计算：
注：预期滴答声在 105 和3 x 106 FFU/mL 之间变化。因子 20x 和 40x 用于推断每 50 μL 和 25 μL 至 1 mL 的 FFU 数，并可相应地进行调整。
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Representative Results
在该协议中，我们描述了高滴度传染性 HEVcc 的生产。第一步是分离质粒DNA（pBluescript_SK_HEVp654和pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37，图8a），然后通过限制消化线性化，并纯化为体外转录（图1）。通过使用凝胶电泳将非消化质粒DNA与消化质粒DNA进行比较，可以验证成功的线性化。除了大小移位外，只有一个 DNA 波段应可见，表示线性形式。当线性形式上方和下方的两个波段（分别表示划线圆和超coil形式）完全减小时，线性化就完成了（图8b）。纯化DNA的产率应超过150纳克/μL。只有当这些特征为真时，线性DNA才应用于体外转录。体外转录RNA应使用凝胶电泳进行检查，在低RNase的显著性情况下，应显示不同的波段，而不是模糊的涂片（图8c）。此外，纯化的RNA产量应超过500纳克/μL 体外转录RNA（图2）最终被电分入 HepG2 细胞进行病毒生成（图3和图4）。通过转染控制的免疫荧光染色来监测成功的电穿孔（图9a）。转染效率应超过40%（图9b）。复制缺陷突变体用作负控制，以确保 ORF2 染色的特异性，因为预期没有 ORF2 表达（图 9c）。孵育7天后，通过收集和过滤细胞培养上超前液，收获包络（细胞外）HEVcc。非包络（细胞内）HEVcc通过几个冻结和解冻循环从细胞中释放。为了清除任何细胞碎片，细胞分离物以高速离心（图5）。随后，这两种 HEVcc 物种都被用来通过串行稀释感染 HepG2/C3A 细胞（图 6 和图 9d）。根据上面的方程（见步骤9），病毒滴定器由FFU计算确定。
图 9 中描述了代表性结果。转染控制应包括约50%ORF2阳性细胞，以保证有效产生大量病毒（图9a，b）。ORF2阳性细胞越小，滴度越低。精确遵循协议中提到的步骤，将为非包络（细胞内）HEVcc 生成介于 105和 3 x10 6 6 FFU/mL 之间的滴定剂。对于在 102和 5 x 104 FFU/mL 之间的包络（细胞外）HEVcc 奶嘴（图 9e）。此外，G1634R突变体观察到FFU计数升高。在计算基因组拷贝与传染性病毒颗粒的比例时，发现p6_WT和p6_G1634R的细胞内 HEVcc 与细胞外 HEVcc 相比，其特异性感染率更高（图 9f）。
图8：体外转录RNA的生成。
（A） 分离质粒DNA的吸收光谱示例。（B） 非消化和消化质粒DNA的凝胶电泳.（C） 体外转录RNA的凝胶电泳.请单击此处查看此图的较大版本。
图9：高滴度 HEVcc 生产的代表性结果。
（A） 电穿孔 HepG2 细胞的转染控制。转染细胞被染色的抗 ORF2 抗体（绿色，LS-Bio）和 DAPI（蓝色）。（B） 转染效率的计算方法是将 ORF2 阳性细胞的数量与总细胞数进行规范化计算。（C） 复制缺陷突变体对免疫荧光染色进行负对，以确保 ORF2 特异性。（D） 为FFU测定，对所生产的病毒库存进行连续稀释。ORF2 正细胞以白色表示。（E） 病毒滴度由FFU计数计算，（ F） 病毒载量由qPCR确定，并规范化为FFU/mL。柱分别显示了38和10个独立实验的均值和标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本。
| 工作解决方案 | 浓度 | 体积 |
| 胶原 | 40 mL | Pbs |
| 40 μl | 醋酸 | |
| 1 mL | 胶原蛋白 R 溶液 0.4% 无菌 | |
| 细胞混合 | 120 米 | 氯化钾 |
| 0.15 mM | 卡克2 | |
| 10 mM | K2HPO4 （pH7.4） | |
| 25 米 | Hepes | |
| 2 mM | 埃格塔 | |
| DMEM 完成 | 500 mL | 德梅姆 |
| 5 mL | 笔/笔 | |
| 5 mL | 梅姆尼亚 （100 倍） | |
| 5 mL | L-格鲁塔明 | |
| 50 mL | 胎儿牛血清 | |
| Mem 完成 | 500 mL | Mem |
| 5 mL | 丙酸钠 | |
| 5 mL | 庆大霉素 | |
| 5 mL | 梅姆尼亚 （100 倍） | |
| 5 mL | L-谷氨酰胺 | |
| 50 mL | 超低 Igg |
表1：缓冲区组成表。
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Discussion
从质粒制备开始，DNA产量应超过150纳克/μL，以便能够从同一质粒存量进行多重线性化，从而最大限度地降低关键基因组序列由细菌引起的突变的风险。此外，通过凝胶电泳检查完全质粒线性化的限制摘要（图8b）也很重要。缺乏线性质粒DNA会导致滚动圆扩增，导致体外转录效率降低。此外，应确认RNA完整性，以评估样品中RNA酶的丰度（图8c）。只有这样，才应考虑目标细胞的电穿孔。请注意，在开始制备 HepG2 细胞之前，请确保一切准备就绪，避免长时间等待。特别是，确保细胞和RNA的短期储存在细胞混合，直到电穿孔。为了在电穿孔期间避免细胞加热，必须事先冷却冰上的缓冲液。脉冲的持续时间不应超过 20-25 ms 和 270 V。电穿孔后，细胞需要快速转移到新鲜介质中，以确保细胞的生存能力。在感染目标细胞之前，应检查TC的 ORF2 阳性细胞的百分比。如果 TC 显示没有 ORF2 阳性细胞，则很可能是电穿孔失败或染色不起作用，并且应重复实验。
收获细胞内 HEVcc 时应特别注意冻结和解冻周期的速度。病毒滴定剂可以通过在液氮中执行冻结，而不是在-80°C时增加。相反，解冻应该以最慢的方式进行，建议在冰上储存，直到细胞悬浮液完全被清算。尽管如此，也可以在室温下，在37°C的培养箱或水浴中解冻细胞悬浮液，但是解冻的速度越快，滴答声就会减少。
根据以下实验，也可以在 MEM 完成或 1x PBS 中执行冻结和解冻周期，而不会显著损失病毒滴滴剂，但是，应该记住，这会导致细胞外 HEVcc 在与细胞内 HEVcc 不同的介质中。
按照协议的这些关键步骤，对于非包络（细胞内）HEVcc，预期滴答声在 105和 3 x10 6 FFU/mL 之间变化。对于102和5 x 104 FFU/mL之间的包络（细胞外）HEVcc奶嘴等待（图9e）。到目前为止，采用 HEV 细胞培养系统的研究主要通过 qPCR 监测病毒复制和传播。对RNA基因组拷贝的评估却无法对传染性粒子的组装和释放提供见解。
先前的研究58成功地在细胞培养中传播患者分离物，最大滴答声为103 TCID50/mL。正如最近所示，也可以成功地通过细胞培养中的 HEVcc，并调整我们的协议，以适应其他菌株，如 47832c 和 83-2，它们不含有插入在超可变区域56中。此外，患者衍生序列是否可以克隆到 Bluescript 载体骨干，并且仍然产生高病毒滴答声未经过测试。通过引入的方法，可以收获非包络和包络的病毒颗粒，并用于接种各种天真的细胞系，如 A549、Huh7.5、Jeg-3 和原发性人类和猪肝细胞，为今后的应用提供益处，如 HEV 培养、发病机制、药物开发、病毒和宿主相互作用、活化研究、中和抗体等。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢苏珊娜·艾默生对E型肝炎病毒p6克隆。HEV特异性兔高免疫血清由德国弗里德里希·勒夫勒研究所的雷纳·乌尔里希提供。此外，我们感谢波鸿鲁尔大学分子和医学病毒学系的所有成员的支持和讨论。图1-7是用BioRender.com。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
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