Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En celle kulturmodel for produktion af høj titer Hepatitis E Virus Lagre

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61373
* These authors contributed equally

Summary

Beskrevet her er en effektiv metode til, hvordan man producerer høje virale titer lagre af hepatitis E-virus (HEV) til effektivt at inficere hepatoma celler. Med den præsenterede metode kan både ikke-kappes samt kappede virale partikler høstes og bruges til at vaccinere forskellige cellelinjer.

Abstract

Hepatitis E-virus er den hyppigste årsag til skrumpelever og leversvigt med stigende prævalens på verdensplan. Den enkeltsnørede RNA-virus overføres overvejende ved blodtransfusioner, utilstrækkelige sanitære forhold og forurenede fødevarer. Til dato off-label stof ribavirin (RBV) er behandlingen af valg for mange patienter. Ikke desto mindre er der stadig en specifik HEV-behandling, der skal identificeres. Hidtil har viden om HEV livscyklus og patogenese været alvorligt hæmmet på grund af manglen på en effektiv HEV celle kultur system. Et robust cellekultursystem er afgørende for studiet af den virale livscyklus, som også omfatter den virale patogenese. Med den metode, der er beskrevet her, kan man producere virale titere på op til 3 x10 6 fokus danner enhed / ml (FFU / ml) af ikke-indhyllet HEV og op til 5 x10 4 FFU / ml af indhyllet HEV. Ved hjælp af disse partikler er det muligt at inficere en række celler af forskellig oprindelse, herunder primære celler og mennesker samt dyrecellelinjer. Produktionen af infektiøse HEV partikler fra plasmider udgør en uendelig kilde, hvilket gør denne protokol overordentlig effektiv.

Introduction

Hepatitis E er en temmelig undervurderet sygdom med stigende prævalens på verdensplan. Omkring 20 millioner infektioner resultere i mere end 70.000 dødsfald om året1. Den underliggende agent, Hepatitis E virus (HEV), blev omfordelt for nylig og er nu klassificeret i familien Hepeviridae herunder slægterne Orthohepevirus og Piscihepevirus. HEV af forskellig oprindelse er klassificeret inden for arten Orthohepevirus A-D, herunder isolater fra mennesker, svin, kaniner, rotter, fugle og andre pattedyr2. På nuværende tidspunkt er otte forskellige genotyper (GT) af den positivtorienterede, enkeltsnørede RNA-virus blevet identificeret2. Selv om de er forskellige med hensyn til deres sekvensidentitet, transmissionsveje og geografiske fordeling, bevares deres genomiske struktur i høj grad. Mere specifikt er 7,2 kbp HEV-genomet opdelt i 3 større åbne læserammer (ORF1-3). Mens ORF1 koder alle enzymer, der er nødvendige for en vellykket replikation i værtscellen, koder ORF2 kapsidproteinet, og ORF3-proteinet fungerer som en funktionel ionkanal, der kræves til samlingog frigivelse af infektiøse partikler 3. Når frigivet i basal eller apical lumen HEV findes i både, quasienveloped og ikke-indhyllet / nøgne arter, afhængigt af om virus stammer fra blod eller afføring, henholdsvis4,5.

Mens GT1 og GT2 hovedsageligt findes i udviklingslandene udelukkende inficere mennesker6 via fækal-oral rute, GT3, GT4 og GT7 overvejende forekommer i de udviklede lande1,7 med en række arter, der tjener som reservoirer, f.eks.svin 8, rotte9,kylling 10,,11,hjorte 12,desmerdyr13,bat14,kanin 15,,16,vildsvin 17 og mange flere7,18,19, som viser zoonose7,20,21,22. Ud over utilstrækkelige sanitæreforhold 23 og kontamineredefødevarer 12,24,25,26er overførsel via blodtransfusion og organtransplantation også mulig27,28. HEV er en almindelig årsag til skrumpelever og leversvigt29, især hos patienter med allerede eksisterende leversygdom, immunkompromitterede personer (genotype 3, 4 og 7) og gravide kvinder (genotype 1). Bemærk, at der også er ekstrahepatiske manifestationer såsom hæmatopoietisk sygdom30,,31,,32, neurologiske lidelser33 og nyreskade34.

Til dato, off-label stof ribavirin (RBV) er behandlingen af valg for mange inficerede patienter35,36. Der er dog rapporteret tilfælde af behandlingssvigt og dårlige kliniske langsigtede resultater. Behandlingssvigt har været forbundet med viral mutagenese og øget viral heterogenitet hos kronisk inficerede patienter37,,38,39. Tværtimod var en nylig europæisk retrospektiv multicenterundersøgelse ikke i stand til at korrelere polymerasemutationer til RBV-behandlingssvigt40. I kliniske observationer og in vitro-forsøg har interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, zinksalte46 og silvestrol47,48 også vist antivirale virkninger. Ikke desto mindre, en specifik HEV behandling er stadig at finde, hæmmet af den manglende viden om HEV livscyklus og dens patogenese. Der er derfor et presserende behov for et robust cellekultursystem til virologiske undersøgelser og udvikling af nye antiviralelægemidler 49.

Desværre, ligesom andre hepatitis virus, HEV er vanskeligt at udbrede i konventionelle cellelinjer og normalt skrider meget langsomt fører til lav viral belastninger. Ikke desto mindre, nogle grupper var i stand til at øge viral belastninger ved generering af cellelinje subkloner50 eller justering af medier kosttilskud51. For nylig blev generationen af cDNA-kloner52 og tilpasningen af primære patientisolater ved at passere53,54 yderligere HEV-formering icellekulturen 55. I denne protokol brugte vi genomet af en cellekultur tilpasset Kernow-C1 stamme (benævnt p6_WT)54 og en mutant stamme huser en replikationsfremmende mutation (benævnt p6_G1634R)37. Kernow-C1 er den hyppigst anvendte stamme i HEV cellekultur og er i stand til at producere høje virale belastninger. Ved at vurdere virale RNA kopi numre, HEV replikation kan overvåges in vitro. Ikke desto mindre gør disse teknikker det ikke muligt at vurdere antallet af infektiøse partikler, der produceres. Derfor har vi etableret en immunofluorescens farvning til at bestemme Focus Danner Enheder (FFU / ml).

Den her beskrevne metode56 kan bruges til at producere infektiøse viruspartikler i fuld længde, som er i stand til at inficere en række celletyper fra forskellige oprindelser, herunder primærceller og pattedyrcellelinjer. Dette er en grundlæggende forudsætning for at dechifrere vigtige aspekter af HEV-infektion og tropisme. Der er ikke behov for vaccination med normalt begrænsede patientisolater. Produktionen af infektiøse HEV partikler fra plasmider udgør en uendelig kilde, hvilket gør denne protokol sammenligneligt effektiv. Desuden kan dette system anvendes til omvendt genetik, der gør det muligt at undersøge in vivo-identificeret genomændring og deres indvirkning på HEV-replikation og -kondition. Denne teknik overvinder mange begrænsninger og kan bane vejen for udvikling af lægemidler, mutageneseundersøgelser og evaluering af virus-vært interaktioner såsom begrænsning eller indrejse faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle eksperimenter udføres under BSL-2-tilstand. Alle materialer, der kommer i kontakt med Hepatitis E-virus RNA eller infektiøs virus skal skylles ordentligt med 4% Kohrsolin FF fra en affaldsbeholder inde i emhætten før bortskaffelse.

1. Plasmid præparat

  1. Podning 200 ml LB medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin med omdannet Escherichia coli JM109 indarbejde en plasmid kodning for fuld længde HEV gt3 Kernow-C1p6 sekvens (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 eller pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Inkuberes i 16 timer ved 37 °C under permanent omrøring (170 o/min).
    BEMÆRK: Plasmid-isolationen blev udført ved hjælp af et plasmidekstraktionssæt (se materialetabel).
  2. Efter fremstillingsprotokollen skal 200 ml overnatningskultur ned og 6.000 x g og 4 °C i 10 min. Den bakterielle pellet kan fryses og opbevares ved -20 °C.
    1. Genopstævdning af bakteriepels i 4 ml Resuspension buffer ved at pipettere op og ned med en 10 ml serologisk pipette og en pipettemand. Derudover vortex strengt.
    2. Der tilsættes 4 ml forvarmet Lysis-buffer (30-40 °C). Inverter forsigtigt i flere gange og inkuber ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
    3. Der tilsættes 4,8 ml neutraliseringsbuffer, inverter forsigtigt, og sørg for, at lysatet er kvantitativt neutraliseret (se producentens beskrivelse). Centrifugering ved 11.000 x g og 4 °C i 20 min.
    4. Et 2 cm x 2 cm mullstykke anbringes i en 1 ml ikke-filterspids, belastningen resuspenderet, lyseret og neutraliseret supernatant i 10 ml serologisk pipet, tilsættes 1 ml spids med mull til spidsen af den serologiske pipetten og filtreres supernatanten i et nyt 50 ml rør.
      BEMÆRK: Supernatant kan opbevares ved 4 °C i op til 30 min.
    5. I flere trin anvendes 750 μL af den filtrerede supernatant på i alt 4 filterkolonner (medfølger i sættet) og centrifuge ved 11.000 x g i 30 s. Kassér flow-through og gentag denne sekvens, indtil alle supernatant er anvendt på filterkolonnerne.
    6. Hver filtersøjle vaskes to gange med 500 μL forvarmet vaskebuffer AW (50 °C) ved 11.000 x g i 30 s, og derefter kasseres strømningsoverførslen.
    7. Hver filtersøjle vaskes med 600 μL vaskebuffer A4 ved centrifugering ved 11.000 x g i 30 s. Gennemstrømningen kasseres, og filterkolonnerne tørres ved centrifugering ved 11.000 x g i 2 min.
    8. Elut plasmid-DNA'et fra hver filterkolonne ved at overføre 60 μL el-sporionsbuffer til midten af filterkolonnerne. Inkuberes i 1 min. ved RT og centrifuge ved 11.000 x g i 1 min.
    9. Kombiner eluater og mål koncentrationen af det ekstraherede plasmid-DNA ved hjælp af et spektrofotometer.

2. Linearisering og DNA-rensning

Figure 1
   
Figur 1: Skematisk eksperimentel opsætning til plasmid linearisering og DNA-rensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: Lineariseringen øger RNA-udbyttet under in vitro-transskription (trin 3)

  1. For at linearisere plasmid-DNA (figur 1) blandes 10 μg af skabelonens DNA (ekstraheret i trin 1), 10 μL af bufferen, 2 μL MluI og justeres til et volumen på 100 μL med H2O.
    1. Inkuberes i 1 time ved 37 °C, og kræft lineariseringen af plasmid ved agarosegelelektroforese (f.eks. belastning af ikke-fordøjet og fordøjet plasmid-DNA [1 μL DNA hver] på en 1% agarosegel og kør elektroforese ved 120 V konstant strøm).
  2. Efter fabrikantens protokol for DNA-ekstraktion (se materialetabel, figur 1), blandes 500 μL bindingsbuffer, der er angivet i sættet, med 100 μL lineært DNA. Prøven påføres en filterkolonne, og centrifuge ved 17.800 x g i 30 s. Kassér gennemstrømningen, og læg filterkolonnerne tilbage i samme rør.
    1. Filterkolonnen vaskes ved at tilsætte 650 μL vaskebuffer og centrifugering ved 17.800 x g i 30 s. Gennemstrømningen kasseres, og filterkolonnen anbringes igen i samme rør. For at fjerne den resterende vaskebuffer tørres centrifuge ved 17.800 x g i 60 s, og hver filtersøjle anbringes i et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør bagefter.
    2. Eluter DNA ved at overføre 60 μL forvarmet H2O (PCR-kvalitet, 70 °C) ind i midten af filteret. Inkuberes i 1 min. ved 70 °C og centrifugeres ved 18.000 x g i 1 min. Mål koncentrationen af det rensede DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
      BEMÆRK: Opbevar DNA ved -20 °C indtil in vitro-transskription.

3. In vitro transskription af HEV-genotype 3 p6 DNA- og RNA-rensning i fuld længde

Figure 2
   
Figur 2: Skematisk eksperimentel opsætning til in vitro-transskription og RNA-rensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: In vitro transskription er nødvendig for at producere viralgenomisk RNA fra plasmid DNA.

  1. Til in vitro transskription blandes 20 μL 5x T7 transskriptionsbuffer, 10 mM DTT, 100 U ribonucleasehæmmer, 25 mM ATP, CTP og UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg lineariseret DNA-skabelon og 80 U af T7 RNA polymerase. Der fyldes op til 100 μL med nukleasefri H2O, der blandes godt, og inkuberes i 2 timer ved 37 °C.
    BEMÆRK: Kortvarig opbevaring ved -20 °C er mulig efter trin 3.1 til 3.1.2.
    1. Der tilsættes 2 μL T7 RNA-polymerase, blandes godt og inkuberes i yderligere 2 timer ved 37 °C.
    2. For at fordøje den oprindelige DNA-skabelon tilsættes 7,5 μL DNase (RNase fri, 1 U/μL), blandes godt og inkuberes ved 30 min ved 37 °C.
      BEMÆRK: Rengør alle overflader og pipetter med overfladedekontaminant for RNase, når der arbejdes med RNA for at undgå nedbrydning. Sørg også for, at alle reaktionsrør er RNase-fri og steril. Brug kun spidser med filtre og fortyndes udelukkende med RNase-fri og sterilt vand.
  2. Efter fremstillingens protokol for RNA-ekstraktion (se materialetabel, figur 2), fremstilles en forblanding af Lysis-buffer og 100 % ethanol ved at blande 330 μL Lysis-buffer og 330 μL ethanol for hver in vitro-transskriptionsreaktion. Der tilsættes 660 μL Lysis buffer-ethanol forblanding til 110 μL RNA og vortex. Prøven på en filterkolonne og centrifuge ved 8000 x g i 30 s. Kassér gennemstrømningen, og placer filterkolonnen tilbage i samme rør.
    1. Der tilsættes 600 μL vaskebuffer og centrifuge ved 8000 x g i 30 s. Gennemstrømningen kasseres, og filtersøjlen anbringes tilbage i samme rør. Der tilsættes 350 μL vaskepude og centrifuge ved 8000 x g i 2 min. for at fjerne den resterende vaskepude. Hver filtersøjle anbringes i et rent mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Åbn låget på filterkolonnen og lad kolonnen tørre i 3 min.
    2. Elute RNA ved at placere 50 μL RNase fri H2O i midten af filterkolonnen. Inkuberes i 1 min. ved RT og derefter centrifuge ved 8.000 x g i 1 min. Kontroller RNA-integriteten ved at lægge 1 μL RNA på en agarosegel og måle koncentrationen af ekstraheret RNA ved hjælp af et spektrofotometer.
      BEMÆRK: Opbevar RNA ved -80 °C indtil elektroporation og optø RNA udelukkende på is for at undgå nedbrydning.

4. Forberedelse af HepG2 celler til cellekultur afledt HEV (HEVcc) produktion

Figure 3
   
Figur 3: Skematisk eksperimentel opsætning til fremstilling af HepG2-celler til cellekulturafledt HEV (HEVcc) produktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: For at undgå kontaminering blev der udført forberedelse af celler, elektroporation, infektion, høst og cellefiksering under sterile forhold på et biosikkerhedsniveau 2-anlæg. Inkubation trin ved 37 °C, der involverer celler blev udført i en 5% CO2 inkubator.

  1. For at forberede HepG2-celler til HEVcc-produktion (figur 3) dannes frøceller i komplet Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) (se tabel 1) på en kollagen på 15 cm (se tabel 1, sterilt filter PBS- eddikesyre blandes gennem 0,2 μm mesh, før der tilsættes kollagen) belagt kulturskål. Inkuberes ved 37 °C, indtil cellerne er 90% sammenflydende.
    BEMÆRK: Hver 15 cm skål, der indeholder 90% sammenløbsceller, genererer nok celler til op til 4 elektroporation.
  2. Fjern forsigtigt mediet fra pladen og vask cellerne én gang med 10 ml 1x PBS. Trypsinize celler ved at tilføje 3 ml af 0,05% trypsin-EDTA på cellerne og inkubere ved 37 °C, indtil cellerne er løsrevet helt. Resuspend celler i 10 ml DMEM komplet medium og overføre celle suspension i en 50 ml rør. Bestem det samlede antal celler.
  3. Da hver elektroporation kræver 5 x 106 celler, overføres det relevante volumen i et nyt 50 ml-rør og fyldes op til mindst 35 ml med 1x PBS. Centrifugeceller ved 200 x g i 5 min. og kassér forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepellet.
  4. Vask cellerne igen med 35 ml 1x PBS ved 200 x g i 5 min. Placer cellerne på is, og fjern ikke 1x PBS endnu for at holde cellerne i suspension.

5. Elektroporation af HepG2-celler

Figure 4
   
Figur 4: Skematisk eksperimentel opsætning til elektroporation af HepG2-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Til elektroporation af HepG2-celler (figur 4) forberedes 400 μL Cytomix komplet pr. elektroporation ved at supplere 384 μL Cytomix (se tabel 1) med 2 mM ATP og 5 mM Glutathion. Forbered frisk lige før brug og sted direkte på is.
    BEMÆRK: En korrekt, men hurtig udførelse af følgende trin er afgørende. Sørg derfor for, at alt er forberedt korrekt.
  2. Fjern forsigtigt 1x PBS uden at forstyrre cellepelleten fra trin 4.4. Resuspend 5 x 106 celler i 400 μL Cytomix komplet og tilsættes 5 μg RNA fra trin 3.2.2. Opløsningen overføres til en 4 mm cuvette og puls én gang med 975 μF, 270 V i 20 ms med et elektroporationssystem.
    1. Efter elektroporation overføres celler så hurtigt som muligt med en Pasteur pipette til 11 ml DMEM komplet pr. elektroporation.
      BEMÆRK: For at sikre, at RNA er transficeret i HepG2-celler, vil der blive udført en transinfektionskontrol (TC). Forventede transfektionshastigheder varierer mellem 40-60% af ORF2-positive celler.
  3. Overfør 10 ml elektroporerede celler til en 10 cm kulturskål belagt med kollagen. Der tilsættes 1,3 x 105 elektroprogresserede celler (300 μL) i en brønd af en kollagenbelagt 24-mikrotitreplade med dækslet (senere brugt som transinfektionskontrol). Cellerne fordeles jævnt og inkuberes ved 37 °C.
    1. Efter 24 timer ændres mediet på 10 cm skålen og udskiftes med 10 ml frisk DMEM komplet. Medium for transfektionskontrol må ikke ændres. Inkuberes i yderligere 6 dage ved 37 °C.
  4. Transfektionskontrollen standses i 24 brøndplade 5-7 d efter elektroporation afhængigt af celletætheden ved at fortsætte med immunfluorescensfarvningsprotokollen (trin 8). Transfektionseffektiviteten beregnes ved at tælle antallet af ORF2-positive celler, der normaliseres, til det samlede antal celler.

6. Høst af intra- og ekstracellulær HEVcc

Figure 5
   
Figur 5: Skematisk eksperimentel opsætning til høst af intra- og ekstracellulær HEVcc. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis du vil høste ekstracellulære HEVcc (Figur 5), filtreres supernatanten, der er fremstillet af 10 cm skålen efter 6 dage (trin 5.3.1), gennem en 0,45 μm mesh for at fjerne eventuelle cellerester. Opbevars høstet ekstracellulært HEVcc ved 4 °C for infektion samme dag, ellers opbevares ved -80 °C.
  2. Hvis du vil høste intracellulær HEVcc (Figur 5),vaskes celler med 1x PBS og trypsinizes ved at tilføje 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 °C, indtil cellerne er helt afmonteret. Der tilsættes 10 ml DMEM komplet, skylleplade for at løsne celler og overføre celler suspension i 50 ml rør. Vask celler to gange med PBS. Centrifuge ved 200 x g i 5 min.
    1. Supernatanten kasseres, og cellepelleten genanvendes igen i 1,6 ml DMEM komplet pr. elektroporation. Cellesuspensionen overføres til et 2 ml reaktionsrør.
      BEMÆRK: Brug ikke større mængder, da det dramatisk ville reducere virale belastninger.
    2. Fryses (i flydende nitrogen) og tø celler. Gentag denne sekvens 3 gange.
      BEMÆRK: Der må ikke sammensømre mere end én elektroporation (1,6 ml) for de 3 fryse- og optøningscyklusser, da lysiseffektiviteten vil blive forringet. Cellesuspensionen må ikke hvirvles ind mellem cyklusserne. Sørg for at optø celleophæng langsomt (f.eks. stuetemperatur eller på is) for at maksimere virusbelastningen.
    3. Højhastighedscentrifuge de lyserede celler i 10 min ved 10.000 x g for at adskille celleaffald. Overfør supernatanten i et nyt rør. Tag supernatant for infektion, ellers opbevares ved -80 °C.
    4. Koncentrer eventuelt den ekstra- og intracellulære HEVcc ved hjælp af en koncentrator for at øge virusbelastningen (i henhold til producentens protokol).

7. Infektion af HepG2/C3A-celler med intra- og ekstracellulær HEVcc

Figure 6
   
Figur 6: Skematisk eksperimentel opsætning for infektion af HepG2/C3A celler med intra- og ekstracellulær HEVcc. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: Infektionen af HepG2/C3A-celler skal sikre, at der produceres infektiøse partikler. Derudover anvendes titreringen af den høstede intracellulære og ekstracellulære HEVcc til at beregne virustitrene i FFU/ml. Dette vil senere blive omtalt som infektionskontrol (IC).

  1. Forvarm Minimal Essential Medium (MEM) komplet (se tabel 1 ) til 37 °C for at forberede HepG2/C3A-celler til HEVcc-infektion ( figur6) er afsluttet (SE Tabel 1) til 37 °C.
    1. Frø 2 x 104 celler/brønd i 100 μL på kollagen belagt 96 godt mikrotiter plade en dag før trin 6. Sørg for at fylde de yderste brønde med 1x PBS for at forhindre fordampning af mediet inde i de interne 60 brønde. Inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
    2. Inficere med ekstracellulære HEVcc ved at tilføje 50 μL af supernatanten (fra trin 6.1) til HepG2/C3A cellerne seedet dagen før. Bland godt ved at pipettere op og ned og fortyndes serielt seks gange 1:3 ved at overføre 50 μL til den næste brønd. Udfør dubletter af serielle fortynding for tekniske replikater.
    3. Infect med intracellulære HEVcc ved at tilsætte 25 μL supernatant (fra trin 6.2.3) til HepG2/C3A cellerne seedet dagen før. Bland godt ved at pipettere op og ned og fortyndes serielt seks gange 1:5 ved at overføre 25 μL til den næste brønd. Udfør dubletter seriel fortynding for teknisk replikering.
    4. Efter 7 d ved 37 °C stoppe infektionen ved at fortsætte med immunofluorescens farvning protokol (trin 8).

8. Immunofluorescens farvning af transfektion- og infektionskontrol

Figure 7
   
Figur 7: Skematisk eksperimentel opsætning for immunfluorescens farvning af transfection og infektion kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. For immunfluorescens farvning (Figur 7), vask 3x med 1x PBS og fastgør celler ved dispensering af 350 μL (transinfektionskontrol [TC]) eller 50 μL (infektionskontrol [IC]) på 4% Fikseringsopløsning pr. brønd. Inkuber i 15 minutter ved RT og vask omhyggeligt to gange med 1x PBS bagefter.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her for transfection kontrol, indtil infektionen af HepG2/C3A celler er stoppet så godt. Der opbevares en brøndplade ved 4 °C. Også forsegle med parafilm for at forhindre fordampning.
  2. Permeabilize celler ved at tilføje 350 μL (TC) eller 50 μL (IC) på 0,2% Triton X-100 (i 1 × PBS) i 5 min ved RT. Vask derefter omhyggeligt to gange med 1x PBS og bloker med 350 μL (TC) eller 50 μL (IC) på 5% Horse Serum (i 1x PBS) i 1 time ved RT under konstant omrøring på en orbital shaker (30 rpm).
    BEMÆRK: Forbered lille plastskål (30 mm) ved at placere et fugtigt væv indeni og et paraffinfilmlag ovenpå, hvilket skaber et fugtigt kammer. Overfør derefter TC-dækslet med opad på paraffinfilmen. Følgende trin for TC vil blive udført i det fugtige kammer.
  3. Der tilsættes 70 μL (TC) eller 25 μL (IC) af det primære antistof anti-ORF2 8282 (HEV-specifikt kaninhypimmune serum,1:5.000 i 5% hesteserum) pr. brønd og inkuberer natten over ved 4 °C under konstant omrøring på en orbital shaker (30 rpm).
    1. Der vaskes omhyggeligt to gange med 1x PBS, og der tilsættes 70 μL (TC) eller 25 μL (IC) af sekundær antigedens antikanin 488 (1:1.000 i 5 % hesteserum). Inkuberes i 1 time under konstant omrøring på en orbital shaker (30 rpm) i mørke. Igen, omhyggeligt vaskes to gange med 1x PBS
  4. Der tilsættes 70 μL (TC) eller 25 μL DAPI (1:10.000 i H2O) og inkuberes omhyggeligt to gange med H2O. Tag dækslet ud af det fugtige kammer, monter dækslet med 6 μL monteringsreagens på hovedet på et dækselsglas (kun for TC) og lad monteringsreaagst tørre i 16 timer ved RT i mørke. Opbevar IC i vand, indtil billeddannelse og forsegle pladen med paraffinfilm for at undgå tørring på grund af fordampning.
  5. Tag billeder for at bekræfte vellykket transfektion og infektion.
    BEMÆRK: Sammenlignelige resultater blev opnået ved hjælp af det kommercielt tilgængelige anti-ORF2 1E6antistof 57 (1:200 i 5 % hesteserum) og et sekundært antistofæsel antimus (1:1.000 i 5 % horse serum)

9. FFU-bestemmelse

BEMÆRK: En FFU defineres som en eller flere ORF2-positive celler, der er adskilt fra en anden FFU af mindst tre negative celler.

  1. For ekstracellulære HEVcc begynde at tælle alle ORF2-positive foci af de to brønde i de to laveste fortyndinger. I alt fire brønde skal tælles. Fokusdannende enheder (FFU) pr. milliliter kan beregnes med følgende ligning:

    Equation 1
    BEMÆRK: Forventede titere varierer mellem 102 og 5 x 104 FFU/ml.
  2. For intracellulær HEVcc begynder at tælle alle ORF2-positive foci i brønde, hvor mellem 50 og 100 foci observeres. Derudover tæller de to brønde i den næste højere fortynding. I alt fire brønde skal tælles. Fokusdannende enheder (FFU) pr. milliliter kan beregnes med følgende ligning:

    Equation 2
    BEMÆRK: Forventede titere varierer mellem 105 og 3 x 106 FFU/ml. Faktorerne 20x og 40x anvendes til at ekstrapolere antallet af FFU pr. 50 μL og 25 μL til 1 ml og kan tilpasses i overensstemmelse hermed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokol beskriver vi produktionen af høj titer infektiøse HEVcc. Det første skridt er at isolere plasmid DNA (pBluescript_SK_HEVp654 og pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figur 8a), som derefter er lineariseret ved begrænsning fordøjelse og renset for in vitro transskription (Figur 1). En vellykket linearisering kan verificeres ved at sammenligne det ikke-fordøjede plasmid-DNA med det fordøjede plasmid-DNA ved hjælp af gelelektroforese. Ud over et størrelsesskift bør der kun være ét DNA-bånd, der repræsenterer den lineære form. Lineariseringen er komplet, når de to andre bånd over og under den lineære form, der repræsenterer den hakkede cirkel og den supercoiled form, henholdsvis er helt formindsket (Figur 8b). Udbyttet af det rensede DNA skal overstige 150 ng/μL. Kun hvis disse egenskaber holder stik, bør det lineære DNA anvendes til in vitro-transskription. Det in vitro-transskriberede RNA bør kontrolleres lige så godt ved hjælp af gelelektroforese, og i tilfælde af lav RNase-abundancy bør der være forskellige bånd i stedet for en sløret udtværing (figur 8c). Desuden bør det rensede RNA-udbytte overstige 500 ng/μL Det in vitro transskriberede RNA (figur 2) elektroporrer i HepG2-celler til virusproduktion (figur 3 og figur 4). Vellykket elektroporation overvåges af transfektionskontrollens immunfluorescensfarvning (Figur 9a). Transinfektionseffektiviteten bør overstige 40 % (figur 9b). En repliking mangelfuld mutant tjener som en negativ kontrol, for at sikre specificitet af ORF2 farvning, da ingen ORF2 udtryk forventes (Figur 9c). Efter 7 dages inkubation høstes den kappede (ekstracellulære) HEVcc ved at indsamle og filtrere cellekulturens supernatant. Ikke-indhyllet (intracellulære) HEVcc frigives fra cellerne ved flere fryse og tø cykler. For at fjerne eventuelle cellerester centrifugeres cellelyatet ved høj hastighed (figur 5). Efterfølgende anvendes begge HEVcc-arter til at inficere HepG2/C3A-celler ved seriel fortynding (figur 6 og figur 9d). Ifølge ligningerne ovenfor (se trin 9) bestemmes virale titere af FFU-beregningen.

Repræsentative resultater er afbildet i figur 9. Transfektionskontrollen bør omfatte ca. 50 % ORF2-positive celler for at sikre, at der produceres en effektiv mængde virus (figur 9a,b). Jo mindre ORF2-positive celler jo lavere titeren vil være. Præcis efter de trin, der er nævnt i protokollen vil generere titere, der varierer mellem 105 og 3 x 106 FFU / ml for ikke-indhyllet (intracellulære) HEVcc. For de kappede (ekstracellulære) HEVcc titre mellem 102 og 5 x104 FFU/ml forventes (Figur 9e). Derudover blev der observeret forhøjede FFU-tal for G1634R-mutanten. Ved beregning af forholdet mellem genomkopier og infektiøse viruspartikler viste det sig, at de producerede intracellulære HEVcc for både p6_WT og p6_G1634R var lavere end den ekstracellulære HEVcc, hvilket tyder på en højere specifik infektivitet af de ikke-indhyllede HEV-arter (Figur 9f).

Figure 8
   
Figur 8: Generation af in vitro transskriberede RNA.
(A) Eksempel på et absorbansspektrum af isoleret Plasmid-DNA. (B) Gelelektroforese af ikke-fordøjet og fordøjet Plasmid-DNA. (C) Gelelektroforese af in vitro transskriberet RNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
   
Figur 9: Repræsentative resultater af produktion med høj titer HEVcc.
(A) Transfektionskontrol af elektroporerede HepG2-celler. Transficerede celler blev plettet med anti-ORF2 antistof (grøn, LS-Bio) og DAPI (blå). (B) Transfektionseffektiviteten blev beregnet ved antallet af ORF2-positive celler normaliseret til antallet af samlede celler. (C) En replikationsplektantist tjener som en negativ kontrol for immunfluorescens farvning for at sikre ORF2-specificitet. DD) For FFU blev der foretaget serielle fortyndinger af de producerede viruslagre. ORF2 positive celler er afbildet i hvidt. (E) Viraltitere blev beregnet ved FFU-optælling, og (F) virale belastninger blev bestemt ved qPCR og normaliseret til FFU/ml. Søjler viser henholdsvis middel- og standardafvigelsen på henholdsvis 38 og 10 uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Arbejdsløsning Koncentration Volumen
Kollagen 40 ml Pbs
40 μl Eddikesyre
1 ml Kollagen R opløsning 0,4% steril
Cytomix (Cytomix) 120 mM KCl (KCl)
0,15 mM CaKl. 2
10 mM K2HPO4 (pH 7,4)
25 mM HEPES (HEPES)
2 mM EGTA
DMEM afsluttet 500 ml DMEM (DMEM)
5 ml Pen/Strep
5 ml MEM NEAA (100X)
5 ml L-Glutamin
50 ml Føtalt kvægserum
MEM afsluttet 500 ml Mem
5 ml Natriumblyuvat
5 ml Gentamycin (Gentamycin)
5 ml MEM NEAA (100X)
5 ml L-glutamin
50 ml ultra-lav IgG

Tabel 1: Tabel over buffersammensætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Begyndende med plasmidpræparatet bør DNA-udbyttet overstige 150 ng/μL for at kunne udføre flere lineariseringer fra samme plasmidbestand, hvilket minimerer risikoen for bakterieinduceret mutagenese af afgørende genomsekvenser. Desuden er det vigtigt at kontrollere begrænsningen fordøje for den komplette plasmid linearisering ved gel elektroforese (Figur 8b). En mangel på lineariseret plasmid DNA ville fremkalde rullende cirkel forstærkning forårsager in vitro transskription at være mindre effektiv. Desuden skal RNA-integriteten bekræftes for at vurdere forekomsten af RNases i prøven (figur 8c). Først derefter bør en elektroporation af målceller overvejes. Bemærk, før du starter med udarbejdelsen af HepG2 celler, sørg for alt er ved hånden og velforberedt undgå lange ventetider. Især sikre kort tid opbevaring af cellerne og RNA i Cytomix indtil elektroporation. For at omgå opvarmningen af cellerne under elektroporation er det vigtigt at afkøle bufferen på is på forhånd. Pulsens varighed må ikke overstige 20-25 ms og 270 V. Efter elektroporation kræver cellerne en hurtig overførsel til frisk medium for at sikre cellernes levedygtighed. Før infektion af målceller skal TC kontrolleres for procentdelen af ORF2-positive celler. Hvis TC ikke viser nogen ORF2-positive celler, er det mest sandsynligt, at elektroporationen er slået fejl, eller farvningen ikke virkede, og forsøget bør gentages.

Ved høst intracellulære HEVcc særlig opmærksomhed bør være opmærksom på hastigheden af fryse og tø cykler. Viral titere kan øges ved at udføre frysning i flydende nitrogen i stedet for ved -80 °C. Tværtimod bør optøningen finde sted på den langsomste måde, der tyder på opbevaring på is, indtil cellesuspensionen er helt afviklet. Ikke desto mindre er det også muligt at tø celleaffjedringen op ved stuetemperatur i en 37 °C inkubator eller vandbad, men jo hurtigere optøningen vil blive udført, jo mere vil titerne falde.

Afhængigt af følgende eksperimenter er det også muligt at gøre fryse og tø cykler i MEM komplet eller 1x PBS uden dramatisk tab af virale titers, dog, man skal huske på, at dette forårsager den ekstracellulære HEVcc at være i et andet medium end den intracellulære HEVcc.

Efter disse afgørende trin i protokollen varierer de forventede titere mellem 10 5 og3 x 106 FFU/ml for den ikke-indhyllede (intracellulære) HEVcc. For de kappede (ekstracellulære) HEVcc titre mellem 102 og 5 x10 4 FFU/ml afventes (Figur 9e). Hidtil, undersøgelser beskæftiger HEV cellekultur systemer overvåge viral replikation og formering overvejende af qPCR. Vurderingen af RNA-genomkopier giver endnu ingen indsigt i samling og frigivelse af infektiøse partikler.

En tidligere undersøgelse58 held formeret patient isolater i cellekultur med maksimal titere på 103 TCID50/ml. Som vist for nylig, er det også muligt at kunne passage HEVcc i cellekultur og tilpasse vores protokol til andre stammer, såsom 47832c og 83-2, som ikke havnen en indsættelse i hypervariable region56. Også, om patient afledt sekvenser kan klones ind i Bluescript vektor rygrad og stadig give høje virale titers blev ikke testet. Med den indførte metode ikke-kappede såvel som kappeindfattede virale partikler kan høstes og bruges til at vaccinere en række naive cellelinjer såsom A549, Huh7.5, Jeg-3 og primære humane og svin hepatocytter, hvilket giver en fordel for fremtidige anvendelser såsom undersøgelse af HEV tropisme, patogenese, lægemiddeludvikling, viral og vært interaktioner, inaktivering undersøgelser, neutralisere antistoffer og mange flere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Suzanne Emerson for hepatitis E-virus p6 klon. HEV-specifik kanin hyperimmune serum blev venligt leveret af Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Tyskland. Desuden takker vi alle medlemmer af Institut for Molekylær og Medicinsk Virologi ved Ruhr Universitet Bochum for deres støtte og diskussion. Figur 1-7 blev genereret med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm mesh Sarstedt 83.1826 Harvest extracellular Virus
4 % Histofix CarlRoth P087.4 Immunofluorescence
Acetic acid CarlRoth 6755.1 Collagen working solution
Amicon Ultra-15 Merck Millipore UFC910024 Virus harvesting
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593 Selection of transformed bacteria
ATP Roche 11140965001 in vitro transcription and electroporation
BioRender BioRender Figure Generation
CaCl2 Roth 5239.2 Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile Serva 47256.01 Collagen working solution
CTP Roche 11140922001 in vitro transcription
Cuvette Biorad 165-2088 Electroporation
DAPI Invitrogen D21490 Immunofluorescence
DMEM gibco 41965-039 Cell culture
DNAse Promega M6101 in vitro transcription
DTT Promega included in P2077 in vitro transcription
EGTA Roth 3054.3 Cytomix
Escherichia coli JM109 Promega L2005 Transformation
Fetal bovine serum gibco 10270106 Cell culture
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01 Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System BioRad 1652660 Electroporation
Gentamycin gibco 15710049 Cell culture
GTP Roche 11140957001 in vitro transcription
H2O Braun 184238001 Immunofluorescence
Hepes Invitrogen 15630-03 Cytomix
Horse serum gibco 16050122 Immunofluorescence
K2HPO4 Roth P749.1 Cytomix
KCL Roth 6781.3 Cytomix
KH2PO4 Roth 3904.2 Cytomix
L-Glutamin gibco 25030081 Cell culture
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5G Cytomix
MEM gibco 31095-029 Cell culture
MEM NEAA (100×) gibco 11140-035 Cell culture
MgCl2 Roth 2189.2 Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One Thermo Fisher ND-ONE-W DNA/RNA concentration
MluI enzyme NEB R0198L Linearization
NEB buffer NEB included in R0198L Linearization
NucleoSpin Plasmid kit Macherey & Nagel 740588.250 Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit Macherey & Nagel 740948.250 RNA purification
PBS gibco 70011051 Cell culture
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) Todt et.al Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) Shukla et al. GenBank accession no. JQ679013 Virus production
Primary antibody 1E6 LS-Bio C67675 Immunofluorescence
Primary antibody 8282 Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog Promega P1711 in vitro transcription
RNase away CarlRoth A998.3 RNA purification
RNasin (RNase inhibitor) Promega N2515 in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 Thermo Fisher A-21202 Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 Thermo Fisher A-11008 Immunofluorescence
Sodium Pyruvat gibco 11360070 Cell culture
T7 RNA polymerase Promega P2077 in vitro transcription
Transcription Buffer Promega included in P2077 in vitro transcription
Triton X-100 CarlRoth 3051.3 Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %) gibco 15400054 Cell culture
ultra-low IgG gibco 1921005PJ Cell culture
UTP Roche 11140949001 in vitro transcription

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
  2. Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
  3. Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
  4. Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
  5. Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
  6. Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
  7. Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
  8. Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
  9. Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, Pt 3 750-758 (2010).
  10. Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
  11. Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
  12. Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
  13. Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
  14. Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
  15. Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
  16. Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
  17. Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
  18. Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
  19. Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
  20. Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
  21. Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
  22. Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
  23. Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
  24. Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, Pt 3 912-917 (2007).
  25. Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
  26. Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
  27. Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
  28. Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany - results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
  29. Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
  30. Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
  31. Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
  32. Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
  33. Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
  34. Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
  35. Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
  36. Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
  37. Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
  38. Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
  39. Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
  40. Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
  41. Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
  42. Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
  43. Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
  44. Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
  45. van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
  46. Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
  47. Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
  48. Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
  49. Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
  50. Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
  51. Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
  52. Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
  53. Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
  54. Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
  55. Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
  56. Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
  57. Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
  58. Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).

Tags

Immunologi og infektion hepatitis E-virus quasienveloped infektiøse virale partikler cellekultur fokusdannende enheder virusproduktion enkelt strandede RNA-virus
En celle kulturmodel for produktion af høj titer Hepatitis E Virus Lagre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meister, T. L., Klöhn, M.,More

Meister, T. L., Klöhn, M., Steinmann, E., Todt, D. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (160), e61373, doi:10.3791/61373 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter