Summary
Hier beschreven is een effectieve methode voor het produceren van hoge virale titer voorraden van hepatitis E-virus (HEV) om efficiënt te infecteren hepatoma cellen. Met de gepresenteerde methode kunnen zowel niet-omhulde, als omhulde virale deeltjes worden geoogst en gebruikt voor het inenten van verschillende cellijnen.
Abstract
Hepatitis E-virus is de belangrijkste oorzaak van levercirrose en leverfalen met toenemende prevalentie wereldwijd. Het enkelstrende RNA-virus wordt voornamelijk overgedragen door bloedtransfusies, ontoereikende hygiënische omstandigheden en besmette voedingsproducten. Tot op heden is het off-label medicijn ribavirin (RBV) de behandeling naar keuze voor veel patiënten. Niettemin moet een specifieke HEV-behandeling nog worden vastgesteld. Tot nu toe is de kennis over de HEV levenscyclus en pathogenese ernstig belemmerd door het ontbreken van een efficiënt HEV-celkweeksysteem. Een robuust celkweeksysteem is essentieel voor de studie van de virale levenscyclus, die ook de virale pathogenese omvat. Met de hier beschreven methode kan men virale titers produceren tot 3 x 106 focusvormende eenheid/mL (FFU/mL) van niet-omhulde HEV en tot 5 x 104 FFU/mL van omhulde HEV. Met behulp van deze deeltjes is het mogelijk om een verscheidenheid aan cellen van verschillende oorsprong te infecteren, waaronder primaire cellen en menselijke, evenals dierlijke cellijnen. De productie van besmettelijke HEV-deeltjes uit plasmiden vormt een oneindige bron, wat dit protocol buitengewoon efficiënt maakt.
Introduction
Hepatitis E is een vrij onderschatte ziekte met toenemende prevalentie wereldwijd. Ongeveer 20 miljoen infecties resulteren in meer dan 70.000 sterfgevallen per jaar1. Het onderliggende middel, het Hepatitis E-virus (HEV), werd onlangs overgeplaatst en is nu ingedeeld binnen de familie Hepeviridae, waaronder het geslacht Orthohepevirus en het Piscihepevirus. HEV van verschillende oorsprong zijn ingedeeld binnen de soort Orthohepevirus A-D met inbegrip van isolaten van mensen, varkens, konijnen, ratten, vogels en andere zoogdieren2. Op dit moment zijn acht verschillende genotypes (GT) van het positief georiënteerde, enkelstrengs RNA-virus geïdentificeerd2. Hoewel ze verschillen in hun sequentie-identiteit, routes van transmissie en geografische spreiding, is hun genomische structuur zeer behouden. Meer specifiek, de 7.2 kbp HEV genoom is verdeeld in 3 grote open leesframes (ORF1-3). Terwijl ORF1 alle enzymen codeert die nodig zijn voor een succesvolle replicatie binnen de hostcel, codeert ORF2 het capsid-eiwit en werkt het ORF3-eiwit als een functioneel ionenkanaal dat nodig is voor de assemblage en afgifte van infectieuze deeltjes3. Eenmaal vrijgegeven in de basale of apical lumen HEV bestaat in zowel, quasi-veloped en niet-gehulde / naakte soorten, afhankelijk van de vraag of het virus afkomstig is van bloed of uitwerpselen, respectievelijk4,5.
Terwijl GT1 en GT2 zijn vooral te vinden in ontwikkelingslanden uitsluitend infecteren mensen6 via de fecale orale route, GT3, GT4 en GT7 komen voornamelijk voor in ontwikkelde landen1,7 met een verscheidenheid aan soorten die als reservoirs, b.v. varkens8, rat9, kip10,11, herten12, mongoose13, vleermuis14, konijn15,16, wilde zwijnen17 en nog veel meer7,18,19, die aantonen dat zoönose7,20,21,22. Naast ontoereikende hygiënische omstandigheden23 en besmette voedingsproducten12,24,25,26, is overdracht via bloedtransfusie en orgaantransplantaties ook mogelijk27,28. HEV is een veel voorkomende oorzaak van levercirrose en leverfalen29 vooral bij patiënten met reeds bestaande leverziekte, immuungecompromitteerde individuen (genotype 3, 4 en 7) en zwangere vrouwen (genotype 1). Van belang zijn er ook extrahepatische manifestaties zoals hematopoietische ziekte30,31,32, neurologische aandoeningen33 en nierletsel34.
Tot op heden is het off-label medicijn ribavirin (RBV) de keuzebehandeling voor veel geïnfecteerde patiëntenvan 35,36. Er zijn echter gevallen van falen van de behandeling en slechte klinische resultaten op lange termijn gemeld. Het falen van de behandeling is gekoppeld aan virale mutagenese en verhoogde virale heterogeniteit bij chronisch geïnfecteerde patiënten37,38,39. Integendeel, een recente Europese retrospectieve multicenter studie was niet in staat om polymerase mutaties te correleren met RBV behandeling falen40. In klinische waarnemingen en in vitro experimenten hebben interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, zinkzouten46 en silvestrol47,48 ook antivirale effecten vertoond. Niettemin moet er nog een specifieke HEV-behandeling worden gevonden, die wordt belemmerd door het gebrek aan kennis over de HEV-levenscyclus en de pathogenese ervan. Daarom is een robuust celkweeksysteem voor virologische studies en de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen dringend nodig49.
Helaas, net als andere hepatitis virussen, HEV is moeilijk te verspreiden in conventionele cellijnen en meestal vordert zeer langzaam leidt tot lage virale belastingen. Niettemin, sommige groepen waren in staat om virale belastingen te stimuleren door de generatie van de cellijn subklonen50 of de aanpassing van de media supplementen51. Onlangs is de generatie van cDNA klonen52 en de aanpassing van de primaire patiënt isolaten door passaging53,54 verder verbeterde HEV voortplanting in celcultuur55. In dit protocol gebruikten we het genoom van een celcultuur aangepaste Kernow-C1 stam (aangeduid als p6_WT)54 en een mutant stam herbergen een replicatie-verbeterende mutatie (aangeduid als p6_G1634R)37. Kernow-C1 is de meest gebruikte stam in HEV celcultuur en is in staat om hoge virale belastingen te produceren. Door het beoordelen van virale RNA kopie nummers, HEV replicatie kan worden gecontroleerd in vitro. Deze technieken maken het echter niet mogelijk om het aantal besmettelijke deeltjes te beoordelen. Daarom hebben we een immunofluorescentie kleuring vastgesteld om Focus Forming Units (FFU/mL) te bepalen.
De hier beschreven methode56 kan worden gebruikt om infectieuze virale deeltjes over de hele lengte te produceren die in staat zijn om een verscheidenheid aan celtypen van verschillende oorsprong te infecteren, waaronder primaire cellen en zoogdiercellijnen. Dit is een fundamentele voorwaarde om belangrijke aspecten van HEV-infectie en tropisme te ontcijferen. Er is geen noodzaak voor inenting met meestal beperkte patiënt isolaten. De productie van besmettelijke HEV-deeltjes uit plasmiden vormt een oneindige bron, wat dit protocol vergelijkbaar efficiënt maakt. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor omgekeerde genetica waardoor in vivo geïdentificeerde genoomwijziging en hun impact op HEV-replicatie en fitness mogelijk zijn. Deze techniek overwint vele beperkingen en kan de weg vinden voor medicijnontwikkeling, mutagenesestudies en de evaluatie van virushostinteracties zoals beperking of toegangsfactoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd onder BSL-2 voorwaarde. Alle materialen die in contact komen met hepatitis E virus RNA of infectieuze virus moet goed worden gespoeld met 4% Kohrsolin FF uit een afvalcontainer in de kap voorafgaand aan verwijdering.
1. Plasmidvoorbereiding
- Inoculat 200 mL LB medium met 100 μg/mL ampicilline met getransformeerde Escherichia coli JM109 met een plasmide codering voor de full-length HEV gt3 Kernow-C1p6 sequentie (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 of pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Incubeer voor 16 uur bij 37 °C bij permanente agitatie (170 rpm).
OPMERKING: Plasmid isolatie werd uitgevoerd met behulp van een plasmi extractie kit (zie Tabel van materialen). - Volgens het fabricageprotocol, spin 200 mL van de nachtcultuur op 6.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en gooi de supernatant. De bacteriële pellet kan worden ingevroren en opgeslagen bij -20 °C.
- Resuspend de bacteriële pellet in 4 mL resuspensie buffer door pipet op en neer met een 10 mL serologische pipet en een pipet man. Bovendien, vortex rigoureus.
- Voeg 4 mL voorverwarmde Lyse buffer (30-40 °C) toe. Omkeren zachtjes voor meerdere malen en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Voeg 4,8 mL neutralisatiebuffer toe, draai voorzichtig om en zorg ervoor dat het lysaat kwantitatief wordt geneutraliseerd (zie beschrijving van de fabrikant). Dan centrifugeren op 11.000 x g en 4 °C gedurende 20 minuten.
- Plaats een 2 cm x 2 cm mull stuk in een 1 mL niet-filterpunt, laad opnieuw, lysed en geneutraliseerde supernatant in 10 mL serologische pipet, voeg 1 mL tip met mull aan punt van de serologische pipet en filter de supernatant in een nieuwe 50 mL buis.
LET OP: Supernatant kan indien nodig maximaal 30 minuten bij 4 °C worden bewaard. - In verschillende stappen passen 750 μL van de gefilterde supernatant toe op een totaal van 4 filterkolommen (aanwezig in de kit) en centrifuge bij 11.000 x g voor 30 s. Gooi de doorstroom weg en herhaal deze volgorde totdat alle supernatant op de filterkolommen is aangebracht.
- Was elke filterkolom twee maal met 500 μL voorverwarmde (50 °C) wasbuffer AW bij 11.000 x g voor 30 s en gooi de flow-through daarna weg.
- Was elke filterkolom met 600 μL wasbuffer A4 door te centrifugeren op 11.000 x g voor 30 s. Gooi de doorstroom weg en droog de filterkolommen door centrifugatie op 11.000 x g gedurende 2 min.
- Elute de plasmide DNA van elke filterkolom door 60 μL elutiebuffer over te brengen naar het midden van de filterkolommen. Incubeer gedurende 1 min bij RT en centrifuge bij 11.000 x g gedurende 1 min.
- Combineer eluates en meet de concentratie van het geëxtraheerde plasmide DNA met behulp van een spectrofotometer.
2. Linearisatie en DNA-zuivering
Figuur 1: Schematische experimentele opstelling voor de plasmid linearisatie en DNA-zuivering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
OPMERKING: De linearisatie verhoogt de RNA-opbrengst tijdens in vitro transcriptie (stap 3)
- Om het plasmide DNA (figuur 1) te lineariseren, meng je 10 μg van het sjabloon-DNA (geëxtraheerd in stap 1), 10 μL van de buffer, 2 μL MluI en pas aan op een volume van 100 μL met H2O.
- Incubeer gedurende 1 h bij 37 °C en bevestig linearisatie van het plasmid door agarose gel elektroforese (bijvoorbeeld belasting niet-verteerd en verteerd plasmide DNA [1 μL DNA per stuk] op een 1% agarose gel en run elektroforese bij 120 V constante stroom).
- Volgens het protocol van de fabrikant voor DNA-extractie (zie Tabel van Materialen, figuur 1), meng 500 μL bindingsbuffer, voorzien in de kit, met 100 μL gelinelineiseerd DNA. Breng het monster aan op een filterkolom en centrifuge op 17.800 x g voor 30 s. Gooi de doorstroom weg en plaats de filterkolommen terug in dezelfde buis.
- Was de filterkolom door 650 μL wasbuffer en centrifugatie toe te voegen bij 17.800 x g voor 30 s. Gooi de doorstroom weg en plaats de filterkolom terug in dezelfde buis. Om de resterende Wasbuffer te verwijderen, droog centrifuge op 17.800 x g voor 60 s en plaats elke filterkolom in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis achteraf.
- Elute DNA door 60 μL van voorverwarmde H2O (PCR-kwaliteit, 70 °C) over te brengen naar het midden van het filter. Incubeer gedurende 1 min bij 70 °C en centrifuge bij 18.000 x g gedurende 1 min. Meet de concentratie van het gezuiverde DNA met behulp van een spectrofotometer.
LET OP: Bewaar DNA bij -20 °C tot in vitro transcriptie.
3. In-vitro transcriptie van full-length HEV genotype 3 p6 DNA en RNA zuivering
Figuur 2: Schematische experimentele opstelling voor de in vitro transcriptie en RNA-zuivering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
OPMERKING: In vitro transcriptie is noodzakelijk om virale genomic RNA te produceren uit plasmide DNA.
- Voor in vitro transcriptiemix 20 μL 5x T7 transcriptiebuffer, 10 mM DTT, 100 U ribonuclease remmer, 25 mM ATP, CTP en UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg lineair DNA-sjabloon en 80 U van T7 RNA polymerase. Vul tot 100 μL met nucleasevrije H2O, meng goed en broed gedurende 2 uur bij 37 °C.
LET OP: Korte termijn opslag bij -20 °C is mogelijk na stap 3.1 tot 3.1.2.- Voeg 2 μL T7 RNA polymerase toe, meng goed en broed nog 2 uur bij 37 °C.
- Om de eerste DNA-sjabloon te verteren, voegt u 7,5 μL DNase (RNase vrij, 1 U/μL) toe, meng goed en incubeer bij 30 min bij 37 °C.
OPMERKING: Reinig alle oppervlakken en pipetten met oppervlaktedecontaminant voor RNase bij het werken met RNA om afbraak te voorkomen. Zorg er ook voor dat alle reactiebuizen RNase-vrij en steriel zijn. Gebruik alleen tips met filters en verdun uitsluitend met RNase-vrij en steriel water.
- Bereid volgens het protocol van de vervaardiging voor RNA-extractie (zie Tabel van materialen, figuur 2)een premix van Lysis-buffer en 100% ethanol voor door 330 μL lysisbuffer en 330 μL van 100% ethanol te mengen voor elke in-vitro transcriptiereactie. Voeg 660 μL Lysis buffer-ethanol premix toe aan 110 μL RNA en vortex. Laad het monster op een filterkolom en centrifuge op 8000 x g voor 30 s. Gooi de doorstroom weg en plaats de filterkolom terug in dezelfde buis.
- Voeg 600 μL wasbuffer en centrifuge toe bij 8000 x g voor 30 s. Gooi de doorstroom weg en plaats de filterkolom terug in dezelfde buis. Voeg 350 μL wasbuffer en centrifuge toe bij 8000 x g gedurende 2 minuten om de restwasbuffer te verwijderen. Plaats elke filterkolom in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. Open het deksel van de filterkolom en laat de kolom 3 minuten drogen.
- Elute RNA door 50 μL RNase vrije H2O in het midden van de filterkolom te plaatsen. Incubeer gedurende 1 min bij RT en vervolgens 8.000 x g gedurende 1 min. Controleer de RNA-integriteit door 1 μL RNA op een agarosegel te laden en meet de concentratie van geëxtraheerd RNA met behulp van een spectrofotometer.
OPMERKING: Sla RNA op bij -80 °C tot elektroporatie en ontdooi uitsluitend RNA op ijs om afbraak te voorkomen.
4. Voorbereiding van HepG2 cellen voor celcultuur afgeleid HEV (HEVcc) productie
Figuur 3: Schematische experimentele opstelling voor de bereiding van HepG2 cellen voor celcultuur afgeleid HEV (HEVcc) productie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, werden de bereiding van cellen, elektroporatie, infectie, oogst en celfixatie onder steriele omstandigheden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2-faciliteit. Incubatiestappen bij 37 °C waarbij cellen betrokken zijn, werden uitgevoerd in een CO2-incubator van 5%.
- Om HepG2-cellen voor te bereiden op hevcc-productie (figuur 3), zaadcellen in volledige Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (zie tabel 1) op een collageen van 15 cm (zie tabel 1, steriele filter PBS- azijnzuurmix door 0,2 μm mesh alvorens collageen toe te voegen) gecoate kweekschotel. Incubeer bij 37 °C tot de cellen 90% samenvloeiend zijn.
LET OP: Elke schaal van 15 cm met 90% confluent cellen genereert voldoende cellen voor maximaal 4 elektroporatie. - Verwijder het medium voorzichtig uit de plaat en was de cellen eenmaal met 10 mL 1x PBS. Probeer cellen te onderzoeken door 3 mL van 0,05% trypsine-EDTA aan de cellen toe te voegen en in tecubateren bij 37 °C totdat cellen volledig zijn losgemaakt. Resuspend cellen in 10 mL DMEM compleet medium en breng de cel suspensie in een 50 mL buis. Bepaal het totale aantal cellen.
- Aangezien elke elektroporatie 5 x 106 cellen vereist, breng het juiste volume in een nieuwe 50 mL buis en vul tot ten minste 35 mL met 1x PBS. Centrifugecellen op 200 x g gedurende 5 minuten en gooi de supernatant voorzichtig weg zonder de celpellet te verstoren.
- Was cellen opnieuw met 35 mL van 1x PBS op 200 x g gedurende 5 min. Plaats cellen op ijs en verwijder nog geen 1x PBS, om de cellen in suspensie te houden.
5. Elektroporatie van HepG2-cellen
Figuur 4: Schematische experimentele opstelling voor de elektroporatie van HepG2-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Voor elektroporatie van HepG2-cellen (figuur 4) bereid 400 μL Cytomix volledig per elektroporatie door 384 μL Cytomix (zie tabel 1) aan te vullen met 2 mM ATP en 5 mM Glutathion. Bereid vers vlak voor gebruik en plaats direct op ijs.
LET OP: Een correcte maar snelle uitvoering van de volgende stappen is cruciaal. Zorg er daarom voor dat alles goed is voorbereid. - Verwijder voorzichtig 1x PBS zonder de celpellet vanaf stap 4.4 te verstoren. Resuspend 5 x 106 cellen in 400 μL cytomix compleet en voeg 5 μg RNA toe vanaf stap 3.2.2. Breng de oplossing over in een 4 mm cuvette en pulseer eenmaal met 975 μF, 270 V voor 20 ms met een elektroporatiesysteem.
- Na elektroporatie brengen cellen zo snel mogelijk met een Pasteur pipet in 11 mL DMEM compleet per elektroporatie.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat RNA met succes wordt omgezet in HepG2-cellen, wordt een transfectiecontrole (TC) uitgevoerd. De verwachte transfectiepercentages variëren tussen 40-60% van orf2-positieve cellen.
- Na elektroporatie brengen cellen zo snel mogelijk met een Pasteur pipet in 11 mL DMEM compleet per elektroporatie.
- Breng 10 mL elektrogevormde cellen over in een 10 cm cultuurschaal bedekt met collageen. Voeg 1,3 x 105 elektrogezuiverde cellen (300 μL) toe in een put van een met collageen gecoate 24-microtitreplaat met een afdeksel (later gebruikt als transfectiecontrole). Verdeel cellen gelijkmatig en broed bij 37 °C.
- Na 24 uur, verander het medium van de 10 cm schotel en vervang door 10 mL verse DMEM compleet. Wijzig het medium van de transfectiecontrole niet. Nog 6 dagen incubeer bij 37 °C.
- Stop de transfectiecontrole in 24 putplaat 5-7 d na elektroporatie, afhankelijk van de celdichtheid door door te gaan met het immunofluorescentie-kleuringsprotocol (stap 8). De transfectie-efficiëntie wordt berekend door het aantal ORF2-positieve cellen te tellen dat is genormaliseerd op het totale aantal cellen.
6. Oogsten van intra- en extracellulaire HEVcc
Figuur 5: Schematische experimentele opstelling voor het oogsten van intra- en extracellulaire HEVcc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Om extracellulaire HEVcc (figuur 5) te oogsten, filtert u de supernatant, verkregen uit de 10 cm schotel na 6 dagen (stap 5.3.1), door een gaas van 0,45 μm om celresten te verwijderen. Bewaar geoogst extracellulair HEVcc bij 4 °C voor dezelfde dag infectie, anders op te slaan bij -80 °C.
- Om intracellulaire HEVcc(figuur 5)te oogsten, was cellen met 1x PBS en trypsinize door 1,5 mL van 0,05% trypsin-EDTA toe te voegen. Incubeer bij 37 °C tot de cellen volledig zijn losgemaakt. Voeg 10 mL DMEM compleet toe, spoel plaat om cellen los te maken en breng de suspensie van cellen over naar een buis van 50 mL. Was cellen twee keer met PBS. Centrifuge op 200 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi de supernatant weg en verleg de celpellet opnieuw in 1,6 mL DMEM volledig per elektroporatie. Breng de celsuspensie over in een 2 mL-reactiebuis.
OPMERKING: Gebruik geen grotere volumes omdat het de virale belasting drastisch zou verminderen. - Vries (in vloeibare stikstof) en dooicellen. Herhaal deze volgorde 3 keer.
OPMERKING: Niet meer dan één elektroporatie (1,6 mL) bundelen voor de 3 vries- en dooicycli, omdat de lyse-efficiëntie zou worden aangetast. Niet vortex de cel suspensie tussen de cycli. Zorg ervoor dat de celsuspensie langzaam ontdooit (bijvoorbeeld kamertemperatuur of op ijs) om de virale belasting te maximaliseren. - De cellen met hoge snelheid centrifugeren gedurende 10 minuten 10 minuten bij 10.000 x g om celpuin te scheiden. Breng de supernatant in een nieuwe buis. Neem de supernatant voor infectie, anders op te slaan op -80 °C.
- Concentreer de extra- en intracellulaire HEVcc eventueel met behulp van een concentrator om de virale belasting te verhogen (volgens het protocol van de fabrikant).
- Gooi de supernatant weg en verleg de celpellet opnieuw in 1,6 mL DMEM volledig per elektroporatie. Breng de celsuspensie over in een 2 mL-reactiebuis.
7. Infectie van HepG2/C3A cellen met intra- en extracellulaire HEVcc
Figuur 6: Schematische experimentele opstelling voor de infectie van HepG2/C3A cellen met intra- en extracellulaire HEVcc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
OPMERKING: De infectie van HepG2/C3A-cellen moet ervoor zorgen dat infectieuze deeltjes worden geproduceerd. Daarnaast wordt de titratie van het geoogste intracellulaire en extracellulaire HEVcc gebruikt om de virustiters in FFU/mL te berekenen. Dit zal later worden aangeduid als infectie controle (IC).
- HepG2/C3A-cellen voorbereiden op HEVcc-infectie (figuur 6), prewarm Minimal Essential Medium (MEM) compleet (zie tabel 1) tot 37 °C.
- Zaad 2 x 104 cellen/goed in 100 μL op het collageen gecoat 96 goed microtiter plaat een dag voor stap 6. Zorg ervoor dat u de buitenste putten te vullen met 1x PBS om verdamping van het medium te voorkomen in de interne 60 putten. Incubeer bij 37 °C voor 24 uur.
- Infecteer met extracellulaire HEVcc door 50 μL van de supernatant (vanaf stap 6.1) toe te voegen aan de HepG2/C3A cellen die de dag ervoor zijn gezaaid. Meng goed door pipetting op en neer en serieel verdunnen zes keer 1:3 door het overbrengen van 50 μL in de volgende put. Dubbele seriële verdunning uitvoeren voor technische replicaties.
- Infecteer met intracellulaire HEVcc door 25 μL supernatant (van stap 6.2.3) toe te voegen aan de HepG2/C3A cellen die de dag ervoor zijn gezaaid. Meng goed door pipetting op en neer en serieel verdunnen zes keer 1:5 door het overbrengen van 25 μL in de volgende put. Uitvoeren van duplicaten seriële verdunning voor technische replicatie.
- Na 7 d bij 37 °C stopt de infectie door verder te gaan met het immunofluorescentie-kleuringsprotocol (stap 8).
8. Immunofluorescentie kleuring van transfectie- en infectiebestrijding
Figuur 7: Schematische experimentele opstelling voor de immunofluorescentie kleuring van transfectie en infectie controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Voor immunofluorescentie vlekken (Figuur 7), wassen 3x met 1x PBS en fix cellen door het verstrekken van 350 μL (transfectie controle [TC]) of 50 μL (infectiebestrijding [IC]) van 4% Fixatie oplossing per goed. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT en daarna twee keer voorzichtig wassen met 1x PBS.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken voor de transfectiecontrole totdat ook de infectie van HepG2/C3A-cellen is gestopt. Bewaar goed plaat op 4 °C. Verzegel ook met parafilm om verdamping te voorkomen. - Permeabiliseren cellen door toevoeging van 350 μL (TC) of 50 μL (IC) van 0,2% Triton X-100 (in 1 × PBS) gedurende 5 minuten bij RT. Was vervolgens twee maal voorzichtig met 1x PBS en blok met 350 μL (TC) of 50 μL (IC) van 5% Horse Serum (in 1x PBS) voor 1 uur PBS bij RT onder constante agitatie op een orbitale shaker (30 rpm).
OPMERKING: Bereid kleine plastic schotel (30 mm) door het plaatsen van een vochtig weefsel binnen en een paraffine film laag op de top, het creëren van een vochtige kamer. Breng vervolgens de TC-cover slip naar boven op de paraffinefilm. De volgende stappen voor de TC worden uitgevoerd in de vochtige kamer. - Voeg 70 μL (TC) of 25 μL (IC) van primair antilichaam anti-ORF2 8282 (HEV-specifieke konijn hyperimmune serum, 1:5.000 in 5% Horse Serum) per put en incubeer 's nachts bij 4 °C onder constante agitatie op een orbitale shaker (30 rpm).
- Zorgvuldig twee maal wassen met 1x PBS en voeg 70 μL (TC) of 25 μL (IC) secundaire antilichaam geit anti-konijn 488 (1:1.000 in 5 % Horse serum). Incubeer gedurende 1 uur onder constante agitatie op een orbitale shaker (30 rpm) in het donker. Nogmaals, zorgvuldig wassen twee keer met 1x PBS
- Voeg 70 μL (TC) of 25 μL (IC) van DAPI (1:10.000 in H2O) toe en incubeer gedurende 1 min. Zorgvuldig twee maal wassen met H2O. Haal de afdekslip uit de vochtige kamer, monteer de cover slip met 6 μL van het montagereagens ondersteboven op een afdekplaat (alleen voor TC) en laat het monteren van reagens 16 uur drogen bij RT in het donker. Bewaar IC in water tot beeldvorming en verzegel de plaat met paraffinefolie om te voorkomen dat u droogt als gevolg van verdamping.
- Neem foto's om succesvolle transfectie en infectie te bevestigen.
OPMERKING: Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van het commercieel verkrijgde anti-ORF2 1E6-antilichaam57 (1:200 in 5 % Paardenserum) en een secundaire anti-ezelantimuis van antilichamen (1:1.000 in 5 % Paardenserum)
9. FFU-vaststelling
OPMERKING: Een FFU wordt gedefinieerd als een of meer ORF2-positieve cellen gescheiden van een andere FFU door ten minste drie negatieve cellen.
- Voor extracellulaire HEVcc beginnen alle ORF2-positieve foci van de twee putten tellen in de twee laagste verdunningen. In totaal moeten vier putten worden geteld. De focusvormende eenheden (FFU) per milliliter kunnen worden berekend met de volgende vergelijking:
LET OP: Verwachte titers variëren tussen 102 en 5 x 104 FFU/mL. - Voor intracellulaire HEVcc beginnen alle ORF2-positieve foci tellen in putten waar tussen de 50 tot 100 foci worden waargenomen. Tel bovendien de twee putten in de volgende hogere verdunning. In totaal moeten vier putten worden geteld. De focusvormende eenheden (FFU) per milliliter kunnen worden berekend met de volgende vergelijking:
LET OP: Verwachte titers variëren tussen 105 en 3 x 106 FFU/mL. De factoren 20x en 40x worden gebruikt om het aantal FFU per 50 μL en 25 μL tot 1 mL te extrapoleren en kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol beschrijven we de productie van high titer infectieuze HEVcc. De eerste stap is het isoleren van plasmide DNA (pBluescript_SK_HEVp654 en pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figuur 8a), die vervolgens wordt gelinealiseerd door beperking van de spijsvertering en gezuiverd voor in vitro transcriptie (Figuur 1). Een succesvolle linearisatie kan worden geverifieerd door het niet-verteerde plasmid-DNA te vergelijken met het verteerde plasmid-DNA met behulp van gelelektroforese. Naast een grootteverschuiving mag slechts één DNA-band zichtbaar zijn die de lineaire vorm weergeeft. De linearisatie is voltooid wanneer de twee andere banden boven en onder de lineaire vorm, die respectievelijk de gejate cirkel en de supercoiled vorm weergeeft, volledig worden verminderd(figuur 8b). De opbrengst van het gezuiverde DNA moet meer dan 150 ng/μL bedragen. Alleen als deze kenmerken waar zijn, moet het gelinelineiseerde DNA worden gebruikt voor in vitro transcriptie. De in vitro getranscribeerd RNA moet ook worden gecontroleerd met behulp van gel elektroforese en in het geval van lage RNase abundancy moet vertonen verschillende banden in plaats van een wazig uitstrijkje (Figuur 8c). Bovendien moet de gezuiverde RNA-opbrengst meer dan 500 ng/μL bedragen Het in vitro getranscribeerde RNA (figuur 2) wordt uiteindelijk geëlektrooeerd in HepG2-cellen voor virusproductie(figuur 3 en figuur 4). Succesvolle elektroporatie wordt gecontroleerd door de immunofluorescentie kleuring van de transfectie controle (Figuur 9a). De transfectie-efficiëntie moet meer dan 40% bedragen (figuur 9b). Een replicatiedeficiënte mutant dient als een negatieve controle, om de specificiteit van de ORF2-kleuring te waarborgen, omdat er geen ORF2-expressie wordt verwacht(figuur 9c). Na 7 dagen incubatie worden de omhulde (extracellulaire) HEVcc geoogst door het verzamelen en filteren van de celcultuur supernatant. Niet-gehulde (intracellulaire) HEVcc wordt vrijgegeven uit de cellen door verschillende vries- en dooicycli. Om celpuin te verwijderen wordt de cellysaat met hoge snelheid getcentrifugeerd (figuur 5). Vervolgens worden beide HEVcc-soorten gebruikt om HepG2/C3A-cellen te infecteren door seriële verdunning(figuur 6 en figuur 9d). Volgens de bovenstaande vergelijkingen (zie stap 9) worden virale titers bepaald door FFU-berekening.
Representatieve resultaten zijn afgebeeld in figuur 9. De transfectiecontrole moet ongeveer 50% ORF2-positieve cellen omvatten om een efficiënte hoeveelheid virus te garanderen (figuur 9a,b). Hoe minder ORF2-positieve cellen hoe lager de titer zal zijn. Juist na de in het protocol genoemde stappen genereren titers die variëren tussen 105 en 3 x 106 FFU/mL voor het niet-gehulde (intracellulaire) HEVcc. Voor de omhulde (extracellulaire) HEVcc titers tussen 102 en 5 x10worden 4 FFU/mL verwacht (figuur 9e). Bovendien werden verhoogde FFU-tellingen waargenomen voor de G1634R-mutant. Bij het berekenen van de verhouding tussen genoomkopieën en besmettelijke virale deeltjes bleek het geproduceerde intracellulaire HEVcc voor zowel p6_WT als p6_G1634R lager te zijn in vergelijking met het extracellulaire HEVcc, wat wijst op een hogere specifieke infectiviteit van de niet-omhulde HEV-soort (figuur 9f).
Figuur 8: Generatie in vitro getranscribeerd RNA.
(A) Voorbeeld van een absorptiespectrum van geïsoleerd Plasmid-DNA. (B) Gel elektroforese van niet-verteerd en verteerd Plasmid-DNA. (C) Gel elektroforese van in vitro getranscribeerd RNA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Representatieve resultaten van de productie van hoge titer HEVcc.
(A) Transfectiecontrole van geëlektreerde HepG2-cellen. Getransfecteerde cellen werden bevlekt met anti-ORF2 antilichaam (groen, LS-Bio) en DAPI (blauw). (B) De transfectie-efficiëntie werd berekend door het aantal ORF2-positieve cellen genormaliseerd tot het aantal totale cellen. (C) Een replicatie-deficiënte mutant dient als een negatieve controle op immunofluorescentie vlekken, om ORF2 specificiteit te waarborgen. dD) Voor ffu-bepaling werden serieverdunningen van de geproduceerde virusvoorraden uitgevoerd. ORF2 positieve cellen worden in het wit afgebeeld. (E) Virale titers werden berekend door FFU tellen en (F) virale belastingen werden bepaald door qPCR en genormaliseerd naar FFU / mL. Bars tonen de gemiddelde en standaarddeviatie van respectievelijk 38 en 10 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Werkende oplossing | Concentratie | Volume |
| Collageen | 40 mL | Pbs |
| 40 μl | Azijnzuur | |
| 1 mL | Collageen R-oplossing 0,4% steriel | |
| Cytomix (Cytomix) | 120 mM | Kcl |
| 0,15 mM | CaCl2 | |
| 10 mM | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25 mM | HEPES | |
| 2 mM | EGTA | |
| DMEM compleet | 500 mL | DMEM (DMEM) |
| 5 mL | Pen/Strep | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamin | |
| 50 mL | Foetaal runderserum | |
| MEM compleet | 500 mL | Mem |
| 5 mL | Natrium Pyruvat | |
| 5 mL | Gentamycine Gentamycine | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamine | |
| 50 mL | ultralage IgG |
Tabel 1: Tabel met buffersamenstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beginnend met het plasmidepreparaat, zouden de opbrengsten van DNA meer dan 150 ng/μL moeten overschrijden om veelvoudige linearisatie van de zelfde plasmidvoorraad te kunnen uitvoeren, die het risico van bacteriën-geïnduceerde mutagenese van essentiële genoomopeenvolgingen minimaliseert. Verder is het belangrijk om de beperking te controleren voor de volledige plasmide linearisatie door gel elektroforese (Figuur 8b). Een gebrek aan gelinealiseerd plasmide DNA zou leiden tot rollende cirkel versterking waardoor de in vitro transcriptie minder efficiënt. Bovendien moet de RNA-integriteit worden bevestigd om de overvloed aan RNases in het monster te evalueren(figuur 8 quater). Alleen dan moet een elektroporatie van doelcellen worden overwogen. Van nota, alvorens met de voorbereiding van cellen HepG2 te beginnen, zorg ervoor dat alles bij de hand is en goed voorbereid het vermijden van lange wachttijden. Zorg vooral voor korte tijd opslag van de cellen en RNA in de Cytomix tot elektroporatie. Om het verwarmen van de cellen tijdens elektroporatie te omzeilen is het essentieel om de buffer op ijs vooraf te koelen. De duur van de puls mag niet hoger zijn dan 20-25 ms en 270 V. Na elektroporatie vereisen de cellen een snelle overdracht naar vers medium om de levensvatbaarheid van de cel te garanderen. Vóór infectie van doelcellen moet de TC worden gecontroleerd op het percentage ORF2-positieve cellen. In het geval dat de TC geen ORF2-positieve cellen vertoont, is het zeer waarschijnlijk dat de elektroporatie is mislukt of dat de kleuring niet werkte en moet het experiment worden herhaald.
Bij het oogsten van intracellulaire HEVcc moet speciale aandacht worden besteed aan de snelheid van de vries- en dooicycli. Virale titers kunnen worden verhoogd door het uitvoeren van de bevriezing van vloeibare stikstof in plaats van op -80 °C. Integendeel, het ontdooien moet op de langzaamste manier plaatsvinden, wat suggereert dat de opslag op ijs wordt voorgesteld totdat de celsuspensie volledig is geliquideerd. Niettemin is het ook mogelijk om de celsuspensie bij kamertemperatuur te ontdooien, in een couveuse of waterbad van 37 °C, hoe sneller het ontdooien zal worden uitgevoerd, hoe meer de titers zullen afnemen.
Afhankelijk van de volgende experimenten is het ook mogelijk om de vries- en dooicycli in MEM complete of 1x PBS te doen zonder dramatisch verlies van virale titers, maar men moet in gedachten houden dat dit ervoor zorgt dat de extracellulaire HEVcc zich in een ander medium bevindt dan het intracellulaire HEVcc.
Volgens deze cruciale stappen van het protocol variëren de verwachte titers tussen 105 en 3 x 106 FFU/mL voor het niet-gehulde (intracellulaire) HEVcc. Voor de omhulde (extracellulaire) HEVcc titers tussen 102 en 5 x 104 FFU/mL worden gewacht (Figuur 9e). Tot nu toe, studies in dienst HEV celkweek systemen monitor virale replicatie en voortplanting voornamelijk door qPCR. De beoordeling van RNA genoomkopieën geeft nog geen inzicht in de assemblage en het vrijkomen van infectieuze deeltjes.
Een eerdere studie58 met succes gepropageerd patiënt isolaten in celcultuur met maximale titers van 103 TCID50/mL. Zoals onlangs is aangetoond, is het ook mogelijk om HEVcc met succes te passeren in de celcultuur en ons protocol aan te passen aan andere stammen, zoals 47832c en 83-2 die geen invoeging in de hypervariabele regio56herbergen. Ook, of de patiënt afgeleide sequenties kunnen worden gekloond in de Bluescript vector backbone en nog steeds opbrengst hoge virale titers werd niet getest. Met de geïntroduceerde methode kunnen niet-gehulde en omhulde virale deeltjes worden geoogst en gebruikt om een verscheidenheid aan naïeve cellijnen zoals A549, Huh7.5, Jeg-3 en primaire menselijke en varkenshapatocyten te inenten, wat een voordeel biedt voor toekomstige toepassingen zoals het onderzoek naar HEV-tropisme, pathogenese, medicijnontwikkeling, virale en gastinteracties, inactivatiestudies, neutrale antilichamen en nog veel meer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn Suzanne Emerson dankbaar voor de hepatitis E virus p6 kloon. HEV-specifieke konijn hyperimmune serum werd vriendelijk geleverd door Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Instituut, Duitsland. Bovendien danken wij alle leden van de afdeling Moleculaire en Medische Virologie van de Ruhr-universiteit Bochum voor hun steun en discussie. Cijfers 1-7 werden gegenereerd met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
References
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
- Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
- Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
- Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
- Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
- Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
- Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
- Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, Pt 3 750-758 (2010).
- Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
- Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
- Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
- Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
- Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
- Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
- Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
- Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
- Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
- Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
- Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
- Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
- Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
- Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
- Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, Pt 3 912-917 (2007).
- Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
- Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
- Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
- Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany - results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
- Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
- Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
- Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
- Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
- Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
- Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
- Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
- Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
- Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
- Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
- Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
- Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
- Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
- Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
- van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
- Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
- Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
- Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
- Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
- Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
- Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
- Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
- Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
- Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
- Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
- Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
- Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).
