Summary
Hier wird eine wirksame Methode beschrieben, wie man hohe virale Titerbestände an Hepatitis-E-Viren (HEV) produziert, um Häpatomzellen effizient zu infizieren. Mit der vorgestellten Methode können sowohl nicht umhüllte als auch umhüllte Viruspartikel geerntet und zur Impfung verschiedener Zelllinien verwendet werden.
Abstract
Hepatitis E Virus ist die Hauptursache für Leberzirrhose und Leberversagen mit zunehmender Prävalenz weltweit. Das einsträngige RNA-Virus wird überwiegend durch Bluttransfusionen, unzureichende hygienische Bedingungen und kontaminierte Lebensmittel übertragen. Bis heute ist das off-Label-Medikament Ribavirin (RBV) für viele Patienten die Behandlung der Wahl. Dennoch muss noch eine spezifische HEV-Behandlung identifiziert werden. Bisher wurde das Wissen über den HEV-Lebenszyklus und die Pathogenese durch das Fehlen eines effizienten HEV-Zellkultursystems stark behindert. Ein robustes Zellkultursystem ist für die Untersuchung des viralen Lebenszyklus unerlässlich, der auch die virale Pathogenese umfasst. Mit der hier beschriebenen Methode kann man virale Titer von bis zu 3 x 106 Fokusbildeinheit/ml (FFU/ml) von nicht umhüllter HEV und bis zu 5 x 104 FFU/ml umhüllter HEV produzieren. Mit diesen Partikeln ist es möglich, eine Vielzahl von Zellen unterschiedlicher Herkunft zu infizieren, einschließlich Primärzellen und menschlichen, sowie tierischen Zelllinien. Die Produktion von infektiösen HEV-Partikeln aus Plasmiden stellt eine unendliche Quelle dar, die dieses Protokoll außerordentlich effizient macht.
Introduction
Hepatitis E ist eine ziemlich unterschätzte Krankheit mit zunehmender Verbreitung weltweit. Etwa 20 Millionen Infektionen führen zu mehr als 70.000 Todesfällen pro Jahr1. Das zugrunde liegende Mittel, das Hepatitis-E-Virus (HEV), wurde vor kurzem neu zugewiesen und ist nun in der Familie Hepeviridae einschließlich der Gattungen Orthohepevirus und Piscihepevirus klassifiziert. HEV verschiedener Herkunft werden innerhalb der Art Orthohepevirus A-D einschließlich Isolate n. Mensch, Schwein, Kaninchen, Ratten, Vögel und andere Säugetiere2eingestuft. Derzeit wurden acht verschiedene Genotypen (GT) des positiv-orientierten, einsträngigen RNA-Virus identifiziert2. Obwohl sie sich in ihrer Sequenzidentität, den Übertragungswegen und der geographischen Verteilung unterscheiden, ist ihre genomische Struktur stark konserviert. Genauer ist, dass das 7,2 kbp HEV Genom in 3 große offene Leserahmen (ORF1-3) unterteilt ist. Während ORF1 alle Enzyme kodiert, die für eine erfolgreiche Replikation innerhalb der Hostzelle benötigt werden, kodiert ORF2 das Capsid-Protein und das ORF3-Protein als funktioneller Ionenkanal, der für die Montage und Freisetzung von InfektiösePartikelnbenötigt wird 3 . Einmal in das Basal- oder apikales Lumen freigesetzt, existiert HEV sowohl bei quasi umhüllten als auch bei nicht umhüllten/nackten Arten, je nachdem, ob das Virus aus Blut oder Kot stammt bzw.4,5.
Während GT1 und GT2 hauptsächlich in Entwicklungsländern gefunden werden, die Menschen6 nur über den fäkal-oralen Weg infizieren, GT3, GT4 und GT7 kommen vorwiegend in entwickelten Ländern1,7 mit einer Vielzahl von Arten als Reservoirs dienen, z.B., Schweine8, Ratte9, Huhn10,11, Hirsch12, Mongoose13, Fledermaus14, Kaninchen15,16, Wildschwein17 und viele mehr 77,18,19, beweise Zoonose7,20,21,22. Neben unzureichenden sanitären Bedingungen23 und kontaminierte Lebensmittel12,24,25,26, Übertragung über Bluttransfusion und Organtransplantationen ist auch möglich27,28. HEV ist eine häufige Ursache für Leberzirrhose und Leberversagen29 vor allem bei Patienten mit bereits bestehenden Lebererkrankungen, immungeschwächten Personen (Genotyp 3, 4 und 7) und Schwangeren (Genotyp 1). Bemerkenswert ist, dass es auch extrahepatische Manifestationen wie hämatopoetische Erkrankungen30,31,32, neurologische Erkrankungen33 und Nierenverletzungen34.
Bis heute ist das off-Label-Medikament Ribavirin (RBV) die Behandlung der Wahl für viele infizierte Patienten35,36. Jedoch, Fälle von Behandlungsversagen und schlechte klinische langfristige Ergebnisse wurden berichtet. Behandlungsversagen wurde mit viraler Mutagenese und erhöhter viraler Heterogenität bei chronisch infizierten Patienten37,38,39zusammengebracht. Im Gegenteil, eine kürzlich durchgeführte europäische retrospektive multizentrische Studie war nicht in der Lage, Polymerase-Mutationen mit Einem Fehler bei der RBV-Behandlung40zu korrelieren. In klinischen Beobachtungen und In-vitro-Experimenten haben Interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, Zinksalze46 und Silvestrol47,48 ebenfalls antivirale Wirkungen gezeigt. Dennoch bleibt eine spezifische HEV-Behandlung zu finden, die durch das mangelnde Wissen über den HEV-Lebenszyklus und seine Pathogenese behindert wird. Daher ist ein robustes Zellkultursystem für virologische Studien und die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente dringend erforderlich49.
Leider ist HEV, wie andere Hepatitis-Viren, in konventionellen Zelllinien schwer zu vermehren und entwickelt sich in der Regel sehr langsam, was zu niedrigen Virusbelastungen führt. Dennoch waren einige Gruppen in der Lage, die Viruslast durch die Erzeugung von Zelllinien-Subklonen50 oder die Einstellung von Medienergänzungen51zu steigern. Kürzlich die Erzeugung von cDNA-Klone52 und die Anpassung von Primären-Patientenisolaten durch Passaging53,54 weiter verbesserte HEV-Vermehrung in der Zellkultur55. In diesem Protokoll verwendeten wir das Genom eines zellkulturangepassten Kernow-C1-Stamms (bezeichnet als p6_WT)54 und einen mutierten Stamm, der eine replikationsverstärkende Mutation (p6_G1634R)37. Kernow-C1 ist die am häufigsten verwendete Sorte in der HEV-Zellkultur und ist in der Lage, hohe Viruslasten zu produzieren. Durch die Bewertung viraler RNA-Kopierzahlen kann die HEV-Replikation in vitro überwacht werden. Diese Techniken erlauben jedoch keine Bewertung der Anzahl der erzeugten infektiösen Partikel. Daher haben wir eine Immunfluoreszenzfärbung zur Bestimmung von Fokusbildungseinheiten (FFU/ml) etabliert.
Die hier beschriebene Methode56 kann verwendet werden, um infektiöse Viruspartikel in voller Länge zu produzieren, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Zelltypen unterschiedlicher Herkunft zu infizieren, einschließlich Primärzellen und Säugetierzelllinien. Dies ist eine grundvoraussetzung, um wichtige Aspekte der HEV-Infektion und des Tropismus zu entschlüsseln. Es besteht keine Notwendigkeit für impfungen mit in der Regel begrenzten Patientenisolaten. Die Produktion von infektiösen HEV-Partikeln aus Plasmiden stellt eine unendliche Quelle dar, die dieses Protokoll vergleichsweise effizient macht. Darüber hinaus kann dieses System für die Reverse-Genetik verwendet werden, die die Untersuchung der in vivo identifizierten Genomveränderung und ihrer Auswirkungen auf die HEV-Replikation und -Fitness ermöglicht. Diese Technik überwindet viele Einschränkungen und kann den Weg für die Arzneimittelentwicklung, Mutagenesestudien und die Bewertung von Virus-Host-Wechselwirkungen wie Restriktions- oder Eintrittsfaktoren ebnen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Experimente werden unter BSL-2-Bedingung durchgeführt. Alle Materialien, die mit DerHepatitis E-Virus-RNA oder infektiösem Virus in Berührung kommen, müssen vor der Entsorgung mit 4% Kohrsolin FF aus einem Abfallbehälter in der Haube richtig gespült werden.
1. Plasmid-Vorbereitung
- Inokulatieren Sie 200 ml LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin mit transformiertem Escherichia coli JM109 mit einer Plasmid-Codierung für die Sequenz HEV gt3 Kernow-C1p6 in voller Länge (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 oder pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). 16 h bei 37 °C unter permanenter Rührung (170 U/min) inkubieren.
HINWEIS: Die Plasmidisolierung wurde mit einem Plasmidextraktionskit durchgeführt (siehe Materialtabelle). - Nach dem Herstellungsprotokoll 200 ml Übernachtungskultur bei 6.000 x g und 4 °C für 10 min nach unten drehen und den Überstand entsorgen. Das bakterielle Pellet kann bei -20 °C eingefroren und gelagert werden.
- Setzen Sie das bakterielle Pellet in 4 ml Resuspension-Puffer wieder auf, indem Sie mit einer 10 ml serologischen Pipette und einem Pipettenmann auf und ab pfeifen. Darüber hinaus Wirbel streng.
- 4 ml vorgewärmter Lysispuffer (30-40 °C) hinzufügen. Sanft für mehrere Male inumlegen und bei Raumtemperatur (RT) 5 min inkubieren.
- 4,8 ml Neutralisationspuffer hinzufügen, sanft invertieren und sicherstellen, dass das Lysat quantitativ neutralisiert wird (siehe Herstellerbeschreibung). Dann Zentrifuge bei 11.000 x g und 4 °C für 20 min.
- Ein 2 cm x 2 cm Mull-Stück in eine 1 ml Nichtfilterspitze legen, resuspendiert, lysiert und neutralisiert in 10 ml serologische Pipette laden, 1 ml Spitze mit Mull zur Spitze der serologischen Pipette geben und den Überstand in ein neues 50 ml Rohr filtern.
HINWEIS: Supernatant kann bei Bedarf bis zu 30 min bei 4 °C gelagert werden. - In mehreren Schritten 750 l des gefilterten Überstandes auf insgesamt 4 Filtersäulen (im Kit vorgesehen) und Zentrifuge bei 11.000 x g für 30 s auftragen. Verwerfen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie diese Sequenz, bis alle Überstande auf die Filtersäulen aufgebracht wird.
- Waschen Sie jede Filtersäule zweimal mit 500 l vorgewärmten (50 °C) Waschpuffer AW bei 11.000 x g für 30 s und entsorgen Sie den Durchfluss anschließend.
- Waschen Sie jede Filtersäule mit 600 l Waschpuffer A4 durch Zentrifugieren bei 11.000 x g für 30 s. Entsorgen Sie die Durchfluss- und Trocknung der Filtersäulen durch Zentrifugation bei 11.000 x g für 2 min.
- Elute die Plasmid-DNA aus jeder Filterspalte, indem 60 l Elutionspuffer auf die Mitte der Filtersäulen übertragen werden. 1 min bei RT und Zentrifuge bei 11.000 x g für 1 min inkubieren.
- Kombinieren Sie Eluate und messen Sie die Konzentration der extrahierten Plasmid-DNA mit einem Spektralphotometer.
2. Linearisierung und DNA-Reinigung
Abbildung 1: Schematische Versuchseinrichtung für die Plasmid-Linearisierung und DNA-Reinigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: Die Linearisierung erhöht die RNA-Ausbeute während der In-vitro-Transkription (Schritt 3)
- Um die Plasmid-DNA (Abbildung 1) zu linearisieren, mischen Sie 10 g der Schablonen-DNA (extrahiert in Schritt 1), 10 l des Puffers, 2 l MluI und passen Sie sich mit H2O auf ein Volumen von 100 l an.
- Inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C und bestätigen Sie die Linearisierung des Plasmids durch Agarose-Gelelektrophorese (z. B. Last nicht verdaut und verdaute Plasmid-DNA [je 1 L DER DNA] auf ein 1% Agarose-Gel und führen Elektrophorese bei 120 V Konstantstrom).
- Nach dem Herstellerprotokoll für die DNA-Extraktion (siehe Tabelle der Materialien, Abbildung 1), mischen Sie 500 l Bindungspuffer, im Kit vorgesehen, mit 100 l linearisierte DNA. Tragen Sie die Probe auf eine Filterspalte auf, und zentrifugieren Sie bei 17.800 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss und legen Sie die Filterspalten wieder in ein und demselben Rohr.
- Waschen Sie die Filtersäule, indem Sie 650 l Waschpuffer und Zentrifugierung bei 17.800 x g für 30 s hinzufügen. Entsorgen Sie den Durchfluss und legen Sie die Filtersäule wieder in das gleiche Rohr. Um den Restwaschpuffer zu entfernen, zentrifugieren Sie die Zentrifuge bei 17.800 x g für 60 s und legen Sie jede Filtersäule anschließend in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Elute DNA durch Übertragung von 60 l vorgewärmtenH2O (PCR-Grad, 70 °C) in die Mitte des Filters. 1 min bei 70 °C und Zentrifuge bei 18.000 x g 1 min. Messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer.
HINWEIS: Bewahren Sie die DNA bei -20 °C bis zur In-vitro-Transkription auf.
3. In-vitro-Transkription des HEV-Genotyps 3 p6 DNA und RNA-Reinigung
Abbildung 2: Schematische Versuchseinrichtung für die In-vitro-Transkription und RNA-Reinigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: Eine In-vitro-Transkription ist notwendig, um virale genomische RNA aus Plasmid-DNA zu produzieren.
- Für In-vitro-Transkriptionsmix 20 l 5x T7 Transkriptionspuffer, 10 mM DTT, 100 U Ribonuklease-Inhibitor, 25 mM ATP, CTP und UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 g linearisierte DNA-Schablonund und 80 U T7-RNA-Polymerase. Bis zu 100 l mit nukleasefreiH2O füllen, gut mischen und 2 h bei 37 °C brüten.
HINWEIS: Kurzfristige Lagerung bei -20 °C ist nach Schritt 3.1 bis 3.1.2 möglich.- Fügen Sie 2 L T7-RNA-Polymerase hinzu, gut mischen und für weitere 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Um die ursprüngliche DNA-Vorlage zu verdauen, fügen Sie 7,5 l DNase (RNase frei, 1 U/L) hinzu, mischen Sie sie gut und brüten bei 30 min bei 37 °C.
HINWEIS: Reinigen Sie alle Oberflächen und Pipetten mit Oberflächendekontamination für RNase, wenn Sie mit RNA arbeiten, um Einen Abbau zu vermeiden. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle Reaktionsrohre RNase-frei und steril sind. Verwenden Sie nur Spitzen mit Filtern und verdünnen Sie sie ausschließlich mit RNase-freiem und sterilem Wasser.
- Nach dem Herstellungsprotokoll für die RNA-Extraktion (siehe Tabelle der Materialien, Abbildung 2) bereiten Sie einen Vormix aus Lysispuffer und 100 % Ethanol vor, indem Sie 330 l Lysispuffer und 330 l 100 % Ethanol für jede In-vitro-Transkriptionsreaktion mischen. Fügen Sie 660 L Lysis-Puffer-Ethanol-Vormischung zu 110 L RNA und Wirbel hinzu. Belastungsprobe auf eine Filtersäule und Zentrifuge bei 8000 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss und legen Sie die Filtersäule wieder in das gleiche Rohr.
- Fügen Sie 600 l Waschpuffer und Zentrifuge bei 8000 x g für 30 s hinzu. Entsorgen Sie die Durchfluss- und Platzieren Sie die Filtersäule wieder in demselben Rohr. Fügen Sie 350 l Waschpuffer und Zentrifuge bei 8000 x g für 2 min hinzu, um den Restwaschpuffer zu entfernen. Legen Sie jede Filtersäule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Öffnen Sie den Deckel der Filtersäule und lassen Sie die Säule 3 min trocknen.
- Elute RNA, indem Sie 50 l RNase freiH2O in die Mitte der Filtersäule legen. 1 min bei RT inkubieren und anschließend bei 8.000 x g für 1 min zentrieren. Die RNA-Integrität überprüfen, indem Sie 1 l RNA auf ein Agarose-Gel laden und die Konzentration der extrahierten RNA mit einem Spektralphotometer messen.
HINWEIS: Speichern Sie RNA bei -80 °C bis zur Elektroporation und tauen Sie die RNA ausschließlich auf Eis, um einen Abbau zu vermeiden.
4. Herstellung von HepG2-Zellen für die Zellkultur-Produktion abgeleitete HEV-Produktion (HEVcc)
Abbildung 3: Schematische Versuchseinrichtung zur Herstellung von HepG2-Zellen für die heV-Produktion (HEVcc). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden die Herstellung von Zellen, Elektroporation, Infektion, Ernte und Zellfixierung unter sterilen Bedingungen in einer Anlage der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt. Inkubationsschritte bei 37 °C, die Zellen beinhalten, wurden in einem 5%CO2-Inkubator durchgeführt.
- Zur Vorbereitung von HepG2-Zellen für die HEVcc-Produktion (Abbildung 3) werden Samenzellen in vollständigem Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) (siehe Tabelle 1) auf eine 15 cm Kollagen (siehe Tabelle 1, steriler Filter PBS- Essigsäure-Mix durch 0,2 m Mesh vor Zugabe von Kollagen) beschichteter Kulturschale vorbereitet. Bei 37 °C inkubieren, bis die Zellen zu 90 % konfluent sind.
HINWEIS: Jede 15 cm große Schale, die 90 % konfluente Zellen enthält, erzeugt genügend Zellen für bis zu 4 Elektroporationen. - Entfernen Sie das Medium vorsichtig von der Platte und waschen Sie Zellen einmal mit 10 ml 1x PBS. Versuchen Sie Zellen, indem Sie 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA auf die Zellen eintragen und bei 37 °C brüten, bis die Zellen vollständig getrennt sind. Resuspend Zellen in 10 ml DMEM komplettes Medium und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml Rohr. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen.
- Da jede Elektroporation 5 x 106 Zellen erfordert, übertragen Sie das entsprechende Volumen in ein neues 50 ml-Rohr und füllen Sie bis zu mindestens 35 ml mit 1x PBS. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min und den Überstand sorgfältig entsorgen, ohne das Zellpellet zu stören.
- Waschen Sie Zellen noch einmal mit 35 ml 1x PBS bei 200 x g für 5 min. Legen Sie Zellen auf Eis und entfernen Sie noch nicht 1x PBS, um die Zellen in Suspension zu halten.
5. Elektroporation von HepG2-Zellen
Abbildung 4: Schematische Versuchseinrichtung für die Elektroporation von HepG2-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Für die Elektroporation von HepG2-Zellen (Abbildung 4) bereiten Sie 400 l Cytomix vollständig pro Elektroporation vor, indem Sie 384 l Cytomix (siehe Tabelle 1) mit 2 mM ATP und 5 mM Glutathion ergänzen. Bereiten Sie frisch vor dem Gebrauch und legen Sie direkt auf Eis.
HINWEIS: Eine korrekte, aber schnelle Ausführung der folgenden Schritte ist entscheidend. Stellen Sie daher sicher, dass alles richtig vorbereitet ist. - Entfernen Sie 1x PBS vorsichtig, ohne das Zellpellet aus Schritt 4.4 zu stören. 5 x 106 Zellen in 400 l Cytomix absetzen und 5 g RNA ab Schritt 3.2.2 hinzufügen. Übertragen Sie die Lösung einmal in eine 4 mm Küvette und pulsieren Sie mit 975 °F, 270 V für 20 ms mit einem Elektroporationssystem.
- Nach der Elektroporation übertragen sich die Zellen so schnell wie möglich mit einer Pasteurpipette in 11 ml DMEM komplett pro Elektroporation.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass RNA erfolgreich in HepG2-Zellen transfiziert wird, wird eine Transfektionskontrolle (TC) durchgeführt. Die erwarteten Transfektionsraten schwanken zwischen 40 und 60% der ORF2-positiven Zellen.
- Nach der Elektroporation übertragen sich die Zellen so schnell wie möglich mit einer Pasteurpipette in 11 ml DMEM komplett pro Elektroporation.
- 10 ml elektropoierte Zellen in eine 10 cm große Kulturschale, die mit Kollagen beschichtet ist, übertragen. Fügen Sie 1,3 x 105 elektroproierte Zellen (300 l) in einen Brunnen einer kollagenbeschichteten 24-Mikrotiter-Platte mit einem Deckbeleg (später als Transfektionskontrolle verwendet) hinzu. Zellen gleichmäßig verteilen und bei 37 °C inkubieren.
- Nach 24 h das Medium der 10 cm Schale wechseln und mit 10 ml frischem DMEM komplett ersetzen. Ändern Sie das Medium der Transfektionssteuerung nicht. Weitere 6 Tage bei 37 °C inkubieren.
- Stoppen Sie die Transfektionskontrolle in 24 Wellplatte 5-7 d post Elektroporation in Abhängigkeit von der Zelldichte, indem Sie mit dem Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll fortfahren (Schritt 8). Die Transfektionseffizienz wird berechnet, indem die Anzahl der ORF2-positiven Zellen auf die Gesamtzahl der Zellen normalisiert wird.
6. Ernte von intra- und extrazellulärem HEVcc
Abbildung 5: Schematische Versuchseinrichtung für die Ernte von intra- und extrazellulärem HEVcc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Um extrazelluläre HEVcc (Abbildung 5) zu ernten, filtern Sie den Überstand, der nach 6 Tagen aus der 10 cm Schale gewonnen wird (Schritt 5.3.1), durch ein 0,45 m Maschennetz, um Zellablagerungen zu entfernen. Geerntete extrazelluläre HEVcc bei 4 °C für den gleichen Tag Infektion lagern, sonst bei -80 °C lagern.
- Um intrazelluläre HEVcc zu ernten (Abbildung 5), waschen Zellen mit 1x PBS und trypsinize durch Zugabe von 1,5 ml von 0,05% Trypsin-EDTA. Bei 37 °C inkubieren, bis die Zellen vollständig abgetrennt sind. Fügen Sie 10 ml DMEM komplette, Bündigplatte hinzu, um Zellen zu lösen und Zellen Suspension in 50 ml Rohr zu übertragen. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1,6 ml DMEM vollständig pro Elektroporation wieder auf. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 2 ml Reaktionsrohr.
HINWEIS: Verwenden Sie keine größeren Volumina, da dieviruslasten drastisch verringert würden. - Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Tauen zellen. Wiederholen Sie diese Sequenz 3 Mal.
HINWEIS: Pooln Sie nicht mehr als eine Elektroporation (1,6 ml) für die 3 Gefrier- und Tauwetterzyklen, da die Lyseeffizienz beeinträchtigt würde. Wirbeln Sie die Zellsuspension zwischen den Zyklen nicht. Achten Sie darauf, die Zellsuspension langsam aufzutauen (z. B. Raumtemperatur oder auf Eis), um die Viruslast zu maximieren. - Hochgeschwindigkeitszentrifugieren Sie die lysierten Zellen für 10 min bei 10.000 x g, um Zellablagerungen zu trennen. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre. Nehmen Sie den Überstand für eine Infektion, sonst lagern bei -80 °C.
- Konzentrieren Sie optional den extra- und intrazellulären HEVcc mit einem Konzentrator, um die Viruslast zu erhöhen (gemäß Herstellerprotokoll).
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1,6 ml DMEM vollständig pro Elektroporation wieder auf. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 2 ml Reaktionsrohr.
7. Infektion von HepG2/C3A-Zellen mit intra- und extrazellulärer HEVcc
Abbildung 6: Schematische Versuchseinrichtung zur Infektion von HepG2/C3A-Zellen mit intra- und extrazellulärer HEVcc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: Die Infektion von HepG2/C3A-Zellen muss sicherstellen, dass infektiöse Partikel produziert werden. Zusätzlich wird die Titration des geernteten intrazellulären und extrazellulären HEVcc zur Berechnung der Virustitel in FFU/ml verwendet. Dies wird später als Infektionskontrolle (IC) bezeichnet.
- Zur Vorbereitung von HepG2/C3A-Zellen auf eine HEVcc-Infektion (Abbildung 6), Vorwarme Minimal Essential Medium (MEM) komplett (siehe Tabelle 1) bis 37 °C.
- Samen 2 x 104 Zellen/gut in 100 l auf die kollagenbeschichtete 96 well Mikrotiterplatte einen Tag vor Schritt 6. Achten Sie darauf, die äußersten Brunnen mit 1x PBS zu füllen, um eine Verdunstung des Mediums in den inneren 60 Brunnen zu verhindern. Bei 37 °C für 24 h inkubieren.
- Infizieren Sie mit extrazellulären HEVcc durch Zugabe von 50 l des Überstandes (ab Schritt 6.1) zu den HepG2/C3A-Zellen, die am Vortag gesät wurden. Mischen Sie gut durch Pipettieren nach oben und unten und seriell verdünnen sechs mal 1:3 durch Übertragung von 50 l in den nächsten Brunnen. Führen Sie Duplikate der seriellen Verdünnung für technische Replikationen durch.
- Infizieren Sie mit intrazellulären HEVcc durch Zugabe von 25 L Überstand (ab Schritt 6.2.3) zu den HepG2/C3A-Zellen, die am Vortag gesät wurden. Mischen Sie gut durch Pipettieren nach oben und unten und seriell verdünnen sechs mal 1:5 durch Übertragung von 25 l in den nächsten Brunnen. Führen Sie doppelte serielle Verdünnung für die technische Replikation durch.
- Nach 7 d bei 37 °C stoppen Sie die Infektion, indem Sie mit dem Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll (Schritt 8) fortfahren.
8. Immunfluoreszenzfärbung der Transfektions- und Infektionskontrolle
Abbildung 7: Schematische Versuchseinrichtung für die Immunfluoreszenzfärbung der Transfektion und Infektionskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Für Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 7), waschen Sie 3x mit 1x PBS und fixieren Sie Zellen, indem Sie 350 l (Transfektionskontrolle [TC]) oder 50 'L (Infektionskontrolle [IC]) von 4% Fixationslösung pro Brunnen dosieren. 15 min bei RT inkubieren und danach zweimal mit 1x PBS sorgfältig waschen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier für die Transfektionskontrolle angehalten werden, bis auch die Infektion von HepG2/C3A-Zellen gestoppt wird. Gutplatte bei 4 °C aufbewahren. Auch mit Parafilm versiegeln, um Verdunstung zu verhindern. - Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie bei RT 350 l (TC) oder 50 l (IC) von 0,2% Triton X-100 (in 1" PBS) hinzufügen. Dann zweimal mit 1x PBS waschen und mit 350 l (TC) oder 50 l (IC) von 5% Pferdeserum (in 1x PBS) für 1 h bei RT unter ständiger Rührung auf einem Orbitalshaker (30 U/min) blocken.
HINWEIS: Bereiten Sie kleine Kunststoffschale (30 mm) vor, indem Sie ein feuchtes Gewebe und eine Paraffinschicht darüber platzieren, wodurch eine feuchte Kammer entsteht. Dann den TC-Abdeckungsschlupf nach oben auf den Paraffinfilm übertragen. Die folgenden Schritte für den TC werden in der feuchten Kammer ausgeführt. - Fügen Sie 70 l (TC) oder 25 l (IC) des primären Antikörper-Anti-ORF2 8282 (HEV-spezifisches Kaninchen-Hyperimmunserum,1:5.000 in 5% Pferdeserum) pro Bohrloch hinzu und über Nacht bei 4 °C unter ständiger Erregung auf einem Orbitalshaker (30 U/min) inkubieren.
- Zweimal mit 1x PBS vorsichtig waschen und 70 l (TC) oder 25 l (IC) des Sekundärantikörpers Ziegenanti-Kaninchen 488 (1:1.000 in 5 % Pferdeserum) hinzufügen. 1 h unter ständiger Erregung auf einem Orbital-Shaker (30 U/min) im Dunkeln inkubieren. Wieder zweimal mit 1x PBS vorsichtig waschen
- Fügen Sie 70 l (TC) oder 25 l (IC) von DAPI (1:10.000 in H2O) hinzu und 1 min inkubieren. Zweimal mit H2O waschen. Nehmen Sie den Deckelschlupf aus der feuchten Kammer, montieren Sie den Deckelschlupf mit 6 l des Montagereagenzes auf einem Deckschlitten (nur für TC) und lassen Sie das Montagereagenz bei RT im Dunkeln 16 h trocknen. Ic in Wasser bis zur Bildgebung aufbewahren und die Platte mit Paraffinfolie versiegeln, um eine Trocknung durch Verdunstung zu vermeiden.
- Nehmen Sie Bilder, um erfolgreiche Transfektion und Infektion zu bestätigen.
ANMERKUNG: Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem handelsüblichen Anti-ORF2 1E6-Antikörper57 (1:200 in 5 % Pferdeserum) und einem Sekundärantikörper Esel-Antimaus (1:1.000 in 5 % Pferdeserum) erzielt.
9. FFU-Bestimmung
HINWEIS: Eine FFU ist definiert als eine oder mehrere ORF2-positive Zellen, die durch mindestens drei negative Zellen von einer anderen FFU getrennt sind.
- Für extrazelluläre HEVcc beginnen, alle ORF2-positiven Brennpunkte der beiden Brunnen in den beiden niedrigsten Verdünnungen zu zählen. Insgesamt sollten vier Brunnen gezählt werden. Die Fokusbildeinheiten (FFU) pro Milliliter können mit der folgenden Gleichung berechnet werden:
HINWEIS: Erwartete Titer variieren zwischen 102 und 5 x 104 FFU/ml. - Für intrazelluläre HEVcc beginnen, alle ORF2-positiven Brennpunkte in Brunnen zu zählen, in denen zwischen 50 und 100 Brennpunkte beobachtet werden. Zählen Sie außerdem die beiden Brunnen in der nächsthöheren Verdünnung. Insgesamt sollten vier Brunnen gezählt werden. Die Fokusbildeinheiten (FFU) pro Milliliter können mit der folgenden Gleichung berechnet werden:
HINWEIS: Erwartete Titer variieren zwischen 105 und 3 x 106 FFU/ml. Die Faktoren 20x und 40x werden verwendet, um die Anzahl der FFU pro 50 l und 25 l bis 1 ml zu extrapolieren und können entsprechend angepasst werden.
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Representative Results
In diesem Protokoll beschreiben wir die Produktion von Hochtiter-Infektier HEVcc. Der erste Schritt besteht darin, die Plasmid-DNA (pBluescript_SK_HEVp654 und pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Abbildung 8a) zu isolieren, die dann durch Restriktionsverdauung linearisiert und für die In-vitro-Transkription gereinigt wird (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Linearisierung kann durch den Vergleich der nicht verdauten Plasmid-DNA mit der verdauten Plasmid-DNA mittels Gelelektrophorese verifiziert werden. Zusätzlich zu einer Größenverschiebung sollte nur ein DNA-Band sichtbar sein, das die lineare Form darstellt. Die Linearisierung ist abgeschlossen, wenn die beiden anderen Bänder oberhalb und unterhalb der linearen Form, die den geknickten Kreis bzw. die übergewickelte Form darstellen, vollständig verringert werden (Abbildung 8b). Die Ausbeute der gereinigten DNA sollte 150 ng/l überschreiten. Nur wenn diese Eigenschaften wahr sind, sollte die linearisierte DNA für die In-vitro-Transkription verwendet werden. Die in vitro transkribierte RNA sollte ebenfalls mit Gelelektrophorese überprüft werden und bei niedriger RNase-Abundung sollte deutliche Bänder aufweisen und nicht einen verschwommenen Abstrich aufweisen (Abbildung 8c). Zusätzlich sollte die gereinigte RNA-Ausbeute 500 ng/l überschreiten Die in vitro transkribierte RNA (Abbildung 2) wird schließlich zur Virusproduktion in HepG2-Zellen elektropoiert (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die erfolgreiche Elektroporation wird durch die Immunfluoreszenzfärbung der Transfektionskontrolle überwacht (Abbildung 9a). Die Transfektionseffizienz sollte 40 % überschreiten (Abbildung 9b). Ein Replikationsmangel mutiert als Negativkontrolle, um die Spezifität der ORF2-Färbung zu gewährleisten, da kein ORF2-Ausdruck erwartet wird (Abbildung 9c). Nach 7 Tagen Inkubation wird der umhüllte (extrazelluläre) HEVcc durch Sammeln und Filtern des Zellkulturüberstandes geerntet. Nicht umhüllte (intrazelluläre) HEVcc wird durch mehrere Gefrier- und Tauzyklen aus den Zellen freigesetzt. Um Zellablagerungen zu entfernen, wird das Zelllysat mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert (Abbildung 5). Anschließend werden beide HEVcc-Arten genutzt, um HepG2/C3A-Zellen durch serielle Verdünnung zu infizieren (Abbildung 6 und Abbildung 9d). Nach den obigen Gleichungen (siehe Schritt 9) werden virale Titer durch FFU-Berechnung bestimmt.
Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 9dargestellt. Die Transfektionskontrolle sollte etwa 50% ORF2-positive Zellen umfassen, um eine effiziente Virusmenge zu gewährleisten (Abbildung 9a,b). Je weniger ORF2-positive Zellen, desto niedriger wird der Titer sein. Genau das Folgen der im Protokoll genannten Schritte erzeugt Titer, die zwischen 105 und 3 x 106 FFU/ml für den nicht umhüllten (intrazellulären) HEVcc variieren. Für die umhüllten (extrazellulären) HEVcc-Titer zwischen 102 und 5 x104 FFU/ml werden erwartet (Abbildung 9e). Zusätzlich wurden erhöhte FFU-Zahlen für die G1634R-Mutation beobachtet. Bei der Berechnung des Verhältnisses zwischen Genomkopien und infektiösen Viruspartikeln wurde festgestellt, dass die produzierten intrazellulären HEVcc sowohl für p6_WT als auch für p6_G1634R im Vergleich zum extrazellulären HEVcc niedriger waren, was auf eine höhere spezifische Infektiosität der nicht umhüllten HEV-Arten hindeutet (Abbildung 9f).
Abbildung 8: Erzeugung von in vitro transkribierter RNA.
(A) Beispiel für ein Absorptionsspektrum isolierter Plasmid-DNA. (B) Gelelektrophorese von nicht verdauter und verdauter Plasmid-DNA. (C) Gelelektrophorese von in vitro transkribierter RNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Repräsentative Ergebnisse der Hohentisproduktion HEVcc.
(A) Transfektionskontrolle von elektropoierten HepG2-Zellen. Transfizierte Zellen wurden mit Anti-ORF2-Antikörpern (grün, LS-Bio) und DAPI (blau) gefärbt. (B) Die Transfektionseffizienz wurde durch die Anzahl der ORF2-positiven Zellen berechnet, die auf die Anzahl der Gesamtzellen normalisiert wurden. (C) Ein Replikationsmangel-Mutant dient als Negativkontrolle für Die Immunfluoreszenzfärbung, um die Spezifität von ORF2 zu gewährleisten. (D) Zur FFU-Bestimmung wurden serielle Verdünnungen der produzierten Virusbestände durchgeführt. ORF2-Positive Zellen sind weiß dargestellt. (E) Virale Titer wurden durch FFU-Zählung berechnet und (F) Viruslasten wurden durch qPCR bestimmt und auf FFU/ml normalisiert. Balken zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung von 38 bzw. 10 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Arbeitslösung | Konzentration | Volumen |
| Kollagen | 40 ml | Pbs |
| 40 l | Essigsäure | |
| 1 ml | Kollagen-R-Lösung 0,4% steril | |
| Cytomix | 120 mM | Kcl |
| 0,15 mM | CaCl2 | |
| 10 mM | K2HPO4 (pH 7,4) | |
| 25 mM | HEPES | |
| 2 mM | EGTA | |
| DMEM komplett | 500 ml | DMEM |
| 5 mL | Stift/Strep | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamin | |
| 50 ml | Fetales Rinderserum | |
| MEM komplett | 500 ml | Mem |
| 5 mL | Natriumpyruvat | |
| 5 mL | Gentamycin | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamin | |
| 50 ml | ultra-niedriges IgG |
Tabelle 1: Tabelle der Pufferzusammensetzung.
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Discussion
Beginnend mit der Plasmidpräparation sollten die DNA-Erträge 150 ng/l überschreiten, um eine multiple Linearisierung aus demselben Plasmidbestand durchführen zu können, was das Risiko einer durch Bakterien induzierten Mutagenese wichtiger Genomsequenzen minimiert. Darüber hinaus ist es wichtig, den Restriktionsdigest für die vollständige Plasmid-Linearisierung durch Gelelektrophorese zu überprüfen (Abbildung 8b). Ein Mangel an linearisierter Plasmid-DNA würde eine Rollkreisverstärkung induzieren, wodurch die In-vitro-Transkription weniger effizient ist. Darüber hinaus sollte die RNA-Integrität bestätigt werden, um die Häufigkeit von RNasen innerhalb der Probe zu bewerten (Abbildung 8c). Erst dann sollte eine Elektroporation von Zielzellen in Betracht gezogen werden. Beachten Sie, bevor Sie mit der Vorbereitung von HepG2-Zellen beginnen, stellen Sie sicher, dass alles zur Hand ist und gut vorbereitet, um lange Wartezeiten zu vermeiden. Insbesondere die kurzzeitige Speicherung der Zellen und der RNA im Cytomix bis zur Elektroporation sicherstellen. Um das Erhitzen der Zellen während der Elektroporation zu umgehen, ist es wichtig, den Puffer auf Eis vorher zu kühlen. Die Dauer des Pulses sollte 20-25 ms und 270 V nicht überschreiten. Nach der Elektroporation benötigen die Zellen eine schnelle Übertragung in frisches Medium, um die Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten. Vor der Infektion von Zielzellen sollte der TC auf den Prozentsatz der ORF2-positiven Zellen überprüft werden. Falls der TC keine ORF2-positiven Zellen zeigt, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Elektroporation fehlgeschlagen ist oder die Färbung nicht funktioniert hat, und das Experiment sollte wiederholt werden.
Bei der Ernte intrazellulärER HEVcc sollte besonderes Augenmerk auf die Geschwindigkeit der Gefrier- und Tauzyklen verwendet werden. Virale Titer können durch das Einfrieren in flüssigem Stickstoff anstatt bei -80 °C erhöht werden. Im Gegenteil, das Auftauen sollte so langsam wie möglich erfolgen, was darauf hindeutet, dass die Lagerung auf Eis möglich ist, bis die Zellsuspension vollständig liquidiert ist. Dennoch ist es auch möglich, die Zellsuspension bei Raumtemperatur, in einem 37 °C Inkubator oder Wasserbad aufzutauen, aber je schneller das Auftauen ausgeführt wird, desto mehr werden die Titer abnehmen.
Abhängig von den folgenden Experimenten ist es auch möglich, die Gefrier- und Tauzyklen in MEM komplett oder 1x PBS ohne dramatischen Verlust von viralen Titfern durchzuführen, jedoch sollte man bedenken, dass dies dazu führt, dass sich der extrazelluläre HEVcc in einem anderen Medium als dem intrazellulären HEVcc befindet.
Nach diesen entscheidenden Schritten des Protokolls schwanken die erwarteten Titer zwischen 105 und 3 x 106 FFU/ml für den nicht umhüllten (intrazellulären) HEVcc. Für die umhüllten (extrazellulären) HEVcc-Titer zwischen 102 und 5 x 104 FFU/ml werden gewartet (Abbildung 9e). Bisher überwachen Studien mit HEV-Zellkultursystemen die Virusreplikation und -ausbreitung überwiegend durch qPCR. Die Bewertung von RNA-Genomkopien liefert jedoch keinen Einblick in die Montage und Freisetzung von infektiösen Partikeln.
Eine vorherige Studie58 verbreitete erfolgreich Patientenisolate in der Zellkultur mit einem maximalen Titters von 103 TCID50/ml. Wie kürzlich gezeigt, ist es auch möglich, HEVcc erfolgreich in der Zellkultur zu durchlaufen und unser Protokoll an andere Stämme wie 47832c und 83-2 anzupassen, die keine Einfügung in den hypervariablen Bereich56aufweisen. Auch, ob Patienten abgeleitete Sequenzen in das Bluescript Vektor-Backbone geklont werden können und dennoch hohe virale Titer ergeben, wurde nicht getestet. Mit der eingeführten Methode können nicht umhüllte sowie umhüllte Viruspartikel geerntet und verwendet werden, um eine Vielzahl von naiven Zelllinien wie A549, Huh7.5, Jeg-3 und primäre menschliche und schweine Hepatozyten zu impfen, was einen Vorteil für zukünftige Anwendungen wie die Untersuchung von HEV-Tropismus, Pathogenese, Arzneimittelentwicklung, virale und Wirtsinteraktionen, Inaktivierungsstudien, Neutralisierung von Antikörpern und vielemehr bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir sind Suzanne Emerson für den Klon des Hepatitis-E-Virus p6 dankbar. HEV-spezifisches Kaninchenhyperimmunserum wurde freundlicherweise von Rainer Ulrich, Friedrich-Loeffler-Institut, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern des Fachbereichs Molekulare und Medizinische Virologie der Ruhr-Universität Bochum für ihre Unterstützung und Diskussion. Die Zahlen 1-7 wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
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