Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटस में कुशल साइट-विशिष्ट म्यूटेनेसिस के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61375
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

Summary

यह प्रोटोकॉल क्यूलेक्स क्विंकेफासिटसिटस भ्रूण के लिए माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जिन्हें CRISPR/Cas9 जीन संपादन उपकरणों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जाता है । यह तकनीक कुशलतापूर्वक साइट-विशिष्ट, वंशानुबल, जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न कर सकती है जिसका उपयोग इस अंडरअड्डा रोग वेक्टर में आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों के निर्माण के लिए किया जा सकता है।

Abstract

क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटस एवियन मलेरिया, वेस्ट नील वायरस (डब्ल्यूएनवी), जापानी इंसेफेलाइटिस, पूर्वी घोड़े इंसेफेलाइटिस, लिम्फेटिक फाइलेरिया, और सेंट लुइस इंसेफेलाइटिस जैसे वेक्टर जनित रोगों की एक विविध श्रृंखला का वेक्टर है। विशेष रूप से, एवियन मलेरिया ने कई स्थानिक द्वीप पक्षी प्रजातियों के विलुप्त होने में एक प्रमुख भूमिका निभाई है, जबकि WNV संयुक्त राज्य अमेरिका में एक महत्वपूर्ण वेक्टर जनित रोग बन गया है । सी क्विंक्विफासियस जीव विज्ञान में और अधिक जानकारी हासिल करने और उनके आनुवंशिक नियंत्रण टूलबॉक्स का विस्तार करने के लिए, हमें इस प्रजाति में जीनोम इंजीनियरिंग के लिए और अधिक कुशल और किफायती तरीके विकसित करने की आवश्यकता है। हालांकि, क्यूलेक्स मच्छरों, विशेष रूप से उनके अंडे राफ्ट के लिए अद्वितीय कुछ जैविक लक्षणों ने जीनोम इंजीनियरिंग के लिए आवश्यक माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रियाओं को करना मुश्किल बना दिया है। इन चुनौतियों से निपटने के लिए, हमने एक अनुकूलित भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित किया है जो क्यूलेक्स मच्छरों की अनूठी विशेषताओं से जुड़ी तकनीकी बाधाओं को कम करने पर केंद्रित है। ये प्रक्रियाएं अंडे के संग्रह, अंडा बेड़ा जुदाई और सी क्विंक्विफासियस में सफल माइक्रोइंजेक्शन के लिए आवश्यक अन्य हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए अनुकूलित तरीकों को प्रदर्शित करती हैं। जब CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के साथ युग्मित, इन प्रक्रियाओं हमें साइट विशिष्ट, कुशल और वंशानुबल जर्मलाइन उत्परिवर्तन, जो उन्नत जीनोम इंजीनियरिंग प्रदर्शन और इस महत्वपूर्ण में आनुवंशिक नियंत्रण प्रौद्योगिकियों का विकास करने के लिए आवश्यक है प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन वर्तमान में अध्ययन, रोग वेक्टर ।

Introduction

सी क्विंक्विफासिटसिटस,जिसे आमतौर पर दक्षिणी घर मच्छर के रूप में जाना जाता है, पश्चिम नील वायरस (डब्ल्यूएनवी), जापानी इंसेफेलाइटिस, सेंट लुइस इंसेफेलाइटिस और पूर्वी घोड़े इंसेफेलाइटिस सहित कई रोगजनकों का एक सक्षम वेक्टर है। विशेष रूप से, चूंकि यह पहली बार 1999 में न्यूयॉर्क में पाया गया था, WNV महाद्वीपीय संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) भर में एक प्रमुख वेक्टर जनित रोग बन गया है 50,000 से अधिक मानव मामलों की सूचना दी 1999 और2018 1 के बीच लगभग 2,300 मौतों के साथ-साथ 4,500 से अधिक 2008-20192 के बीच ईक्वीन मामलों की सूचना दी. इसके अलावा, उत्तरी अमेरिका में पाई जाने वाली कम से कम 23 पक्षी प्रजातियों को डब्ल्यूएनवी3के परिणामस्वरूप अप्राप्य के रूप में वर्गीकृत कम से कम 12 प्रजातियों के साथ WNV संक्रमणों से प्रभावित किया गया है। मानव, घोड़े और एवियन आबादी पर WNV का प्रभाव इसके वैक्टर के अवसरवादी भोजन व्यवहार के कारण है। आमतौर पर, पक्षी WNV के लिए प्राथमिक मेजबान हैं, और मनुष्य और घोड़े आकस्मिक या मृत अंत मेजबान हैं। सी क्विंक्विफासिटसिटस द्वारा कुछ रोगजनक केवल एवियन मलेरिया परजीवी, प्लाज्मोडियम रेलिटमजैसे पक्षियों को संक्रमित करते हैं। हवाई में, सी क्विंक्विफासियस एवियन मलेरिया का एक प्रमुख वेक्टर है और इसने कई देशी पक्षी प्रजातियों के विलुप्त होने का कारण बना दिया है4,5।

सी क्विंक्विफासिटसिटसद्वारा प्रेषित रोगों को नियंत्रित करने के लिए, शोधकर्ताओं और वेक्टर नियंत्रण एजेंसियों ने कीटनाशक आवेदनजैसेआमतौर पर स्थापित मच्छर जनसंख्या नियंत्रण उपकरणों का उपयोग किया है, हालांकि, ये विधियां महंगी हैं, प्रजातियों-विशिष्ट नहीं हैं, और सीमित प्रभावशीलता है क्योंकि कीटनाशकों के प्रतिरोध में कई सी क्विंक्विफास्सिया आबादी 6,7,8,9में अधिक है। वुलबाचियाआधारित जनसंख्या नियंत्रण रणनीतियों जैसी अन्य नियंत्रण तकनीकों को हाल के वर्षों मेंविकसितकिया गयाहै,लेकिन वुलबाचिया संक्रमण से जुड़ी फिटनेस लागत इस वेक्टर12के लिए इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को सीमित करते हैं । अन्य मच्छरों की प्रजातियों जैसे एडीज एजिप्टी13,14, एनोफेल्स गाम्बियाई15 और एनोफेल्स स्टीफेंसी16 में जेनेटिक बेस्ड कंट्रोल विधियां भी विकसित की गई हैं, जिनमें रोगजनक प्रतिरोधी मच्छरोंका विकास17,18,19शामिल है, जो सी क्विंक्फासिया के लिए भी विकसित किए जा सकते हैं यदि जीनोम अपेक्षित इंजीनियरिंग उपकरण हैं इस प्रजाति के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, सी क्विंक्फासियस जीव विज्ञान अन्य एडीज और एनोफेल्स मच्छर वैक्टर से बहुत अलग है जिसने इस वेक्टर में समान आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों के विकास को मुश्किल बना दिया है। CRISPR आधारित जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों के आगमन के साथ, सटीक जीनोम इंजीनियरिंग तेजी से तुच्छ, सस्ती और अनुकूलनीय हो गया है और फलस्वरूप प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता में उपन्यास आनुवंशिक उपकरणों के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है ।

CRISPR आधारित प्रौद्योगिकियों के साथ उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए, Cas9 प्रोटीन और सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA), वांछित loci के पूरक का मिश्रण, पूर्व blastoderm चरण भ्रूण में microinjected है । चूंकि सी क्विंक्विफासिटस मादाएं एक फ्लोटिंग बेड़ा संरचना(चित्रा 1)में संलग्न समूहों में अपने अंडे डालती हैं, जैसा कि व्यक्तिगत अंडों को ओविपोसिटिंग करने के विपरीत, एडीज और एनोफेल्स मच्छरों की एक विशेषता, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन इस प्रजाति में तेजी से जटिल हैं। क्यूलेक्स लार्वा प्रत्येक अंडे के पूर्वकाल पक्ष से भी निकलता है, जो पानी की सतह(चित्रा 1)के संपर्क में है, इसलिए इस प्रजाति में अंडा अभिविन्यास पोस्ट हेरफेर महत्वपूर्ण है। यहां हम सी क्विंक्विफासिटस भ्रूण में Cas9 प्रोटीन और sgRNA के माइक्रोइंजेक्शन के लिए डिज़ाइन किए गए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ कदम है कि समय पर अंडा संग्रह और अंडे के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है के माध्यम से भ्रूण अस्तित्व और जीनोम उत्परिवर्तन दरों में सुधार करने के लिए Culex जीव विज्ञान के लिए अद्वितीय लक्षण को समायोजित करने के लिए डिजाइन किया गया है ।

Protocol

1. सी क्विंक्फासियस कॉलोनी पालन

  1. बग छात्रावास पिंजरों में सी क्विंक्विफासिटस वयस्कों की कई उपनिवेशों की स्थापना करें।
    नोट: कालोनियों कॉर्नेल विश्वविद्यालय20में डॉ लौरा हैरिंगटन द्वारा प्रदान की गई । क्यूलेक्स मच्छरों के पालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल अन्य साहित्य में पाया जा सकता है21.
    1. 12:12 घंटे दिन:रात चक्र के साथ 30% आर्द्रता पर 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर मच्छरों को बनाए रखें।
    2. पिंजरे में एक बाती के साथ एक चीनी समाधान कंटेनर शुरू करने या चीनी समाधान के साथ कपास गेंदों संतृप्त और पिंजरे के भीतर रखकर 20% चीनी समाधान विज्ञापन libitum प्रदान करें ।
  2. मच्छरों को रक्त आहार(चित्रा 2 ए)से कम से कम 3 दिन पहले रहने दें।

2. सी क्विंक्विफासिटस प्री-ब्लास्टोडर्म स्टेज भ्रूण का संग्रह

  1. 3-6 दिनों के बाद एक बंद करने के बाद, एक सिंथेटिक झिल्ली के माध्यम से एक citrated गोजातीय रक्त भोजन के 1-2 एमएल के साथ महिलाओं को प्रदान करते है और एक रक्त आहार प्रणाली(चित्रा 2B)में लगभग ४० डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म । वैकल्पिक रक्त आहार प्रोटोकॉल भी हैं जिनका उपयोग क्यूलेक्स मच्छरों के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, रेफरी21देखें)।
    नोट: सी क्विंक्विफासिटस को एवियन रक्त के लिए वरीयता के लिए जाना जाता है। कुछ प्रयोगशालाएं अपने रक्त भोजन के स्रोत 21 , 22,23के लिए एनेस्थेटाइज्ड जीवित पक्षियों या एवियन रक्त का उपयोग करती हैं । हालांकि, कालोनियों को प्रशिक्षित/गोजातीय रक्त या छोटे कृंतक पर खिलाने के लिए चयनित किया जा सकता है अगर इस सुविधा को कई पीढ़ियों से अधिक के लिए चुना जाता है ।
    1. माइक्रोइंजेक्शन प्रयोगों के लिए ओविपोजिशन को प्रेरित करने से पहले गर्भाशय और अंडे की परिपक्वता से गुजरने के लिए रक्त आहार के बाद महिलाओं को कम से कम 3 दिनों तक आराम करने की अनुमति दें।
  2. भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन के दिन, जैविक रूप से संचार ओविपोजिशन पानी के साथ एक ओविपोजिशन कप बनाएं। ओविपोजिशन पानी खरगोश मल (५० ग्राम/एल) को किण्वित करके, घास (४.५ ग्राम/एल) को विघटित करके, या मछली के भोजन (25 ग्राम/एल) को 5 या अधिक दिनों के दौरान पानी में24,25।
  3. ओविशनपोस कप को पिंजरे में रखें और पूरे पिंजरे को एक अंधेरे स्थान(चित्रा 2C)में रखें।
  4. हर 30 मिनट के बाद, अंडे राफ्ट के लिए कप की जांच करें।
    1. यदि अंडे के राफ्ट मौजूद हैं, तो राफ्ट को तूलिका के साथ स्कूप करके इकट्ठा करें और उन्हें गीले फिल्टर पेपर(चित्रा 2डी, ई)पर रखें।

3. सी क्विंक्विफासिटस प्री-ब्लास्टोडर्म स्टेज भ्रूण का संरेखण

  1. राफ्ट पर नीचे दबाकर और एक ठीक टिप तूलिका और संदंश(चित्रा 2E)का उपयोग कर व्यक्तिगत रूप से अंडे के अलावा चिढ़ा द्वारा राफ्ट से अंडे अलग ।
  2. एक ग्लास स्लाइड(चित्रा 2F)के शीर्ष पर रखे डबल-तरफा चिपचिपा टेप की एक पतली पट्टी पर व्यक्तिगत अंडे संरेखित करें।
  3. संरेखित करते समय, आसान पहुंच के लिए प्रत्येक अंडे के पूर्वकाल पक्ष को एक ही दिशा में इंगित करने का प्रयास करें।
    नोट: दो तरफा चिपचिपा टेप के बिना एक वैकल्पिक अंडा संरेखण विधि पहले से प्रकाशित नासोनिया vitripennis भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल26में पाया जा सकता है ।
  4. हेलोकार्बन तेल मिश्रण के साथ अंडे को कवर करें।
    नोट: हेलोकार्बन मिश्रण को धीरे-धीरे दो हेलोकार्बन रिएजेंट और पानी (9:1:20, हेलोकार्बन 700: हेलोकार्बन 27: अल्ट्रापुरे पानी) को मिलाकर समय से पहले तैयार किया जा सकता है और फिर प्रभामंडल के तेल के पानी संतृप्ति को सुविधाजनक बनाने के लिए 25οC पर रात भर मिश्रण को इनक्यूबेटिंग कर सकता है।

4. माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुई की तैयारी

  1. ग्लास माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके एल्यूमिनोसिलिकेट केशिका ग्लास सुई उत्पन्न करें।
    1. सुई खींचने वाले उपयोगकर्ता मैनुअल के निर्देशों के अनुसार, एक एल्यूमिनोसिकेट केशिका ग्लास को सुई खींचने वाले में रखें।
      नोट: क्वार्ट्ज और बोरोसिकेट केशिका सुइयों का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन इस प्रयोग के लिए, एल्यूमिनोसिलिएकेट को इसकी सापेक्ष सामर्थ्य और स्थायित्व के कारण पसंद किया जाता है।
    2. 516 के लिए गर्मी सेट, 100 के लिए वेग, 70 में देरी, 97 को खींचो, और सुई खींचने पर 500 के लिए दबाव।
    3. खींचने वाले के निर्देशों के अनुसार सुई खींचने वाले को सक्रिय करें और अतिरिक्त सुइयों के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएं।
      नोट: इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान, सुई अक्सर भरा हुआ या गलती से टूट जाता है, इसलिए, एक ही प्रयोग के लिए अतिरिक्त सुई खींचने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
  2. एक 50 डिग्री कोण पर लगभग 10 एस के लिए घूर्णन हीरे घर्षण प्लेट पर खींची गई सुई की नोक को धीरे-धीरे छूकर सुई टिप को दूर करें।
    नोट: सुई Beveling यह तरल पदार्थ के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए खोलता है, जबकि भी भ्रूण में आसान प्रवेश के लिए एक तेज टिप बनाने । एक उचित सुई का एक उदाहरण पिछले अनुच्छेद26में देखा जा सकता है ।
  3. स्टोर एक पेट्री डिश में मॉडलर की मिट्टी की लाइनों में एम्बेड करके खींच लिया और सुई beveled ।
    नोट: सुई युक्तियों के लिए सबसे अच्छी गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, सुई हौसले से खींचा जाना चाहिए और संभव के रूप में इंजेक्शन के समय के करीब के रूप में beveled ।

5. इंजेक्शन मिश्रण लोड

  1. जीनोम संशोधन रिएजेंट्स (जैसे, 200 एनजी/μL sgRNA और 200 एनजी/μL Cas9 मिश्रण), या पसंदीदा इंजेक्शन समाधान और बर्फ पर रखने से मिलकर इंजेक्शन मिश्रण तैयार करें।
    नोट: अंडे रखे जाने की प्रतीक्षा करते समय इस मिश्रण को तैयार किया जा सकता है। Cas9 और SgRNA उत्पादन और माइक्रोइंजेक्शन की तैयारी के बारे में अधिक जानकारी पिछले प्रकाशनों में पाया जा सकता है27,28, 29,30.
  2. माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके इंजेक्शन सुई में इंजेक्शन मिश्रण के 2 माइक्रोन लोड करें।

6. माइक्रोइंजेक्शन की स्थापना

  1. भरे हुए इंजेक्शन सुई को इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े माइक्रोमैनिपुलेटर में रखें।
  2. एक यौगिक माइक्रोस्कोप के चरण पर गठबंधन अंडे युक्त ग्लास स्लाइड रखें।
  3. माइक्रोमैनीपुलेटर और यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सुई को 25-35 डिग्री कोण पर भ्रूण के पीछे के छोर पर निशाना साधने के लिए संरेखित करें।

7. भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन(चित्रा 2G)

  1. ध्यान से भ्रूण में सुई डालें और अंडे के आकार के आधार पर भ्रूण (700-800 पीएल) की मात्रा के लगभग 10% की मात्रा में मिश्रण इंजेक्ट करें।
    नोट: इंजेक्शन देते समय, अंडा थोड़ा प्रफुल्लित होना चाहिए, हालांकि, यदि बहुत अधिक तरल पदार्थ इंजेक्ट किया जाता है, तो अंडे फट सकते हैं, या साइटोप्लाज्मिक तरल पदार्थ बाहर निकल सकता है।
  2. एक समय में लगभग 20 अंडे इंजेक्ट करें फिर भ्रूण वसूली प्रक्रियाओं को रोकें और प्रदर्शन करें।
    नोट: इंजेक्शन देते समय, या तो रोकना या तोड़ने के लिए सुइयों की एक उच्च संभावना है। यदि एक रोकना होता है, जो सुई के माध्यम से बहने वाले इंजेक्शन तरल पदार्थ की कमी से निर्धारित किया जा सकता है, तो या तो इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोइंजेक्टर पर स्वच्छ कार्य के साथ सुई को साफ करने की कोशिश करें या सुई को फिर से बेवेलिंग करने की कोशिश करें। यदि न तो कदम काम करता है, तो तैयार अंडे को गीला रहते हुए एक नई सुई में जल्दी से बदलें।

8. भ्रूण वसूली और हैचिंग

  1. अंडे को कम से कम 5 मिनट के लिए अव्यवस्थित छोड़ दें। 20 मिनट के बाद इंजेक्शन के भीतर, ध्यान से एक साफ तूलिका(चित्रा 2H)के साथ हल्के से ब्रश करके हेलोकार्बन तेल को हटा दें ।
  2. एक तूलिका का उपयोग कर धीरे अंडे लिफ्ट और उन्हें डबल आसुत पानी(चित्रा 2I)के एक कप में जगह है । अंडे को पानी की सतह पर रखने का ध्यान रखें।
  3. हैचिंग(चित्रा 2J)के लिए 7 दिनों के लिए दैनिक अंडे की जांच करें ।
  4. सामान्य लार्वा पालन प्रक्रियाओं का पालन करें21.

9. जीनोम संशोधन के लिए स्क्रीनिंग

  1. एक स्टीरियोस्कोप(चित्रा 2K)का उपयोग कर उत्परिवर्ती फेनोटाइप के लिए इंजेक्शन मच्छरों को स्क्रीन करें।
    1. उन उत्परिवर्तनों को सत्यापित करें जिनमें पीसीआर प्रवर्धन, टी 7 एंडोक्यूलीज आई परख और लक्ष्य क्षेत्र31के उप-समावेशन द्वारा आसानी से पहचानने योग्य फेनोटाइप नहीं है।
  2. जर्मलाइन के भीतर वंशानुबल उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इंजेक्शन व्यक्तियों के बीच अतिरिक्त क्रॉस सेट करें।

Representative Results

पहले प्रकाशित प्रयोगों में इस विधि का उपयोग अंधेरे आंखों के पिगमेंटेशन, सफेद (CPIJ005542)30 (तालिका 1)के विकास के लिए महत्वपूर्ण जीन के दैहिक और जर्मलाइन उत्परिवर्तन को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए किया गया था। CRISPR/Cas9 उत्पन्न दैहिक उत्परिवर्तन इंजेक्शन व्यक्तियों (जी0)के प्यूपल स्टेज आंखों में पिगमेंटेशन के नुकसान के लिए स्क्रीनिंग द्वारा बनाए गए थे । दैहिक उत्परिवर्तन आम तौर पर मोज़ेक फेनोटाइप के रूप में मौजूद थे जहां कुछ लेकिन सभी कोशिकाओं में उत्परिवर्ती फेनोटाइप नहीं होता है। उदाहरण के लिए, सफेद जीन के दैहिक उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप फेनोटाइप के साथ ओमाटिडिया का मिश्रण हुआ जिसमें पिगमेंटेशन की कमी है और वे एक जंगली प्रकार के पिगमेंटेड फेनोटाइप30के साथ हैं। लेकिन जब सफेद जीन का जर्मलाइन म्यूटेशन हुआ तो अगली पीढ़ी (जी1)को पूरी सफेद आंखों वाले फेनोटाइप विरासत में मिली । जर्मलाइन उत्परिवर्तन दरों का निर्धारण मोज़ेक जी 0 व्यक्तियों को इंटरक्रॉस करके और पूरीतरह से सफेद आंखों वाली संतानों (जी1)के लिए स्कोरिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। इन प्रयोगों के परिणामस्वरूप 64% से 82% भ्रूण जीवित रहने की दर, साथ ही 37% से 57% दैहिक म्यूटेनेसिस दर और >61% जर्मलाइन म्यूटेनेसिस दर(टेबल 1)हुई। एक ही जीन में मल्टीपल लोकी को लक्षित करने के लिए एसजीआरएनए को मल्टीप्लेक्स करके, दैहिक और जर्मलाइन म्यूटेनेसिस दरों में 86%(तालिका 1)तक वृद्धि हुई। इसके अलावा, कई पीढ़ियों के लिए, सफेद म्यूटेंट के व्यवहार्य होमोज़िगस स्टॉक को सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में रखा गया है।

Figure 1
चित्रा 1: सी क्विंक्विफासियस अंडे का बेड़ा और एकल अंडा आकृति विज्ञान।
सी क्विंक्विफासिटसियस एग राफ्ट्स के पृष्ठीय(ए),पार्श्व(बी),और वेंट्रल(सी)दृश्य। C. क्विंक्विफासिटसियाटस महिलाएं पानी की सतह को छूने वाले अधिक बल्बस पूर्वकाल पक्ष के साथ अपने अंडे डालती हैं, जबकि पानी की सतह(डी)से अधिक नुकीले पीछे की ओर होती हैं। ए-पूर्वकाल; पी-पीछे कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोइंजेक्शन द्वारा सी क्विंक्विफासियस म्यूटेंट बनाने के लिए टाइमलाइन।
माइक्रोइंजेक्शन(ए-डी)के लिए सी क्विंक्विफासियस कॉलोनी तैयार करने और भ्रूण संग्रह की टाइमलाइन । एकत्र किए गए अंडों को तब अलग किया जाता है(ई)एक ही अभिविन्यास में गठबंधन किया जाता है और हेलोकार्बन तेल(एफ)से ढका जाता है। अंडे तो इंजेक्शन(जी)और हेलोकार्बन तेल(एच)को हटाने से पहले 5 मिनट की एक ंयूनतम के लिए आराम करने की अनुमति दी जाती है । अंडे तो एक साफ पानी के स्रोत(मैं)हैचिंग(जे)के लिए स्थानांतरित कर रहे है और उत्परिवर्ती फेनोटाइप(कश्मीर)के लिए जांच की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अस्तित्व बचाना दैहिक मोज़ेकिज्म (जी0) जर्मलाइन म्यूटेनेसिस (जी1)
एसजीआरएनए #injected ♂ ♀ कुल (%) ♂ ♀ कुल (%) जी1 म्यूटेंट (%)
wsgRNA-1 50 15 20 35(70) 7(47) 13(65) 20(57) 128(69)
wsgRNA-2 50 9 32 41(82) 3(33) 12(38) 15(37) 51(61)
wsgRNA-3 50 17 15 32(64) 7(41) 8(53) 15(47) 157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-2 50 7 16 23(46) 5(71) 12(75) 17(74) 123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-3 50 13 9 22(44) 10(77) 6(67) 16(73) 72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-3 50 17 10 27(54) 13(76) 8(80) 21(78) 101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 50 11 10 21(42) 9(82) 9(90) 18(86) 149(86)

तालिका 1: सफेद को निशाना बनाते हुए एकल और मल्टीप्लेक्स वाले जीआरएन के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूणों की जीविता और उत्परिवर्तन दर। तालिका30 से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित है

Discussion

मच्छर वेक्टर नियंत्रण के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर उपकरण उत्पन्न करने के लिए हाल के प्रयासों के साथ, आम मच्छर रोग वैक्टर के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित करने की आवश्यकता है। हालांकि एडीज और एनोफेल्स मच्छरों के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, लेकिन विशेष रूप से क्यूलेक्स के लिए डिजाइन किए गए एक प्रोटोकॉल का न्यूनतम पता लगाया गया है। सामान्य मच्छर भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल में 3 सामान्य चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1) भ्रूण संग्रह और तैयारी, 2) भ्रूण इंजेक्शन, और 3) इंजेक्शन के बाद वसूली। म्यूटेंट को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए, लक्षित प्रजातियों के लिए सभी तीन चरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए यह संशोधित प्रोटोकॉल क्यूलेक्स मच्छरों के सफल जीनोम इंजीनियरिंग के लिए विशिष्ट है।

भ्रूण संग्रह को अधिकतम करना भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल में एक आम अड़चन है। थोड़े समय में एकत्र किए गए अंडों की संख्या बढ़ाने के लिए, मच्छरों को रक्त भोजन के बाद 2-3 दिनों के लिए एक अंडाशय सब्सट्रेट से प्रतिबंधित किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सी क्विंक्विफासियस स्तनधारी स्रोतों या स्तनधारी रक्त के साथ झिल्ली खिलाने के विपरीत एवियन रक्त स्रोतों को पसंद करते हैं। हालांकि, कई शोधकर्ताओं को रक्त आहार के लिए जीवित एवियन या एवियन रक्त का विश्वसनीय स्रोत प्राप्त करने में कठिनाई होती है, इसलिए प्रयोगशाला स्टॉक को अधिक सुलभ रक्त स्रोतों पर खिलाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ओविपोशन सब्सट्रेट के लिए पोषक तत्वों से भरपूर पानी का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सी क्विंक्विफासिटसिटस और अधिकांश अन्य क्यूलेक्स वैक्टर के लिए ओविपोजिशन संकेत प्रदान करता है। पोषक तत्वों से भरपूर पानी उत्पन्न करने के लिए कई तरीके हैं, जिन्हें प्रयोगशालाओं के बीच अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माइक्रोइंजेक्शन के लिए उचित संख्या में अंडे उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, जबकि यह विधि खरगोश मल के साथ सबसे सफल थी जो 5 या अधिक दिनों के लिए डिओनाइज्ड पानी में किण्वित थी, अन्य शोधकर्ताओं को पोषक तत्व स्रोत के रूप में घास या मछली के भोजन के साथ अधिक सफलता मिलती है और कुछ आसुत पानी के साथ भी21।

चूंकि क्यूलेक्स मच्छर राफ्ट में अंडे के समूह लगाते हैं, इसलिए अंडे इकट्ठा करना काफी सरल है। अंडे को बस एक तूलिका के साथ पूरे बेड़ा स्कूपिंग द्वारा एकत्र किया जा सकता है। अंडा जुदाई अधिक जटिल है, लेकिन सफल इंजेक्शन के लिए आवश्यक है। अंडे को तूलिका या संदंश के साथ अंडे के बीच कोमल नीचे दबाव लागू करके बेड़ा से सावधानीपूर्वक अलग किया जा सकता है। कुछ अभ्यास के साथ, कई उपयोगकर्ता अंडे राफ्ट से एकल अंडे को अलग करने में मज़बूती से सक्षम थे। प्रत्येक अंडे को अलग करने के बाद, अंडे को दो तरफा चिपचिपा टेप पर एक ही अभिविन्यास में गठबंधन किया जाता है, जो माइक्रोइंजेक्शन के दौरान अंडों को स्थिर करता है। अंडे पतला पीछे के अंत में इंजेक्शन कर रहे हैं और हेलोकार्बन तेल के अलावा हेरफेर के दौरान अंडे नम रहता है।

माइक्रोइंजेक्शन के दौरान भ्रूण क्षति को सीमित करने के लिए, इंजेक्शन सुइयों को उचित शक्ति की आवश्यकता होती है और उचित कोण पर beveled की आवश्यकता होती है। एल्यूमिनोसिलिकेट सुई एक 50 डिग्री कोण पर 10 सेकंड के लिए beveled सबसे अच्छा परिणाम था, लेकिन बोरोसिलिकेट और क्वार्ट्ज सुई भी काम कर सकते हैं, भले ही वे कम टिकाऊ और अधिक महंगा हो सकता है। इसके अलावा, उचित सुई beveling Cas9 और sgRNA मिश्रण के बेहतर प्रवाह की सुविधा और भ्रूण में आसान प्रवेश के लिए एक तेज बिंदु बनाता है । कई मामलों में, beveling भी एक कुशल तरीका है जल्दी से भरा सुई को ठीक करने के बजाय समय और भरा हुआ सुई की जगह प्रयास खर्च करने के लिए है ।

इंजेक्शन के बाद, अंडे को कम से कम 5 मिनट तक अव्यवस्थित रहना चाहिए, जिसमें हेलोकार्बन तेल को तुरंत बाद हटा दिया जाना चाहिए। हेलोकार्बन तेल को हटाने के बाद, इंजेक्शन अंडे को हैच करने के लिए पानी में रखा जा सकता है, जो आमतौर पर इंजेक्शन के बाद 3 दिनों के भीतर होता है। अभ्यास और पर्याप्त संख्या में अंडे के साथ, यह प्रोटोकॉल सी क्विंकेफासिटसिटसिटस में लगातार दैहिक और जर्मलाइन उत्परिवर्तन प्राप्त कर सकता है और बहुमुखी है कि यह अन्य क्यूलेक्स मच्छरों के लिए आसानी से अनुकूलनीय होना चाहिए।

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

इस काम को ओ.एस.ए. को निर्देशित UCSD स्टार्टअप फंड द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9 oz clear plastic pet cup Karat C-KC9 Insect Rearing and Egg Collection
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) Sutter Instruments BF100-58-10 Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate
Blood Colorado Serum Company 31025 The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.
Bugdorm Bugdorm 4F2222 Insect Rearing Cage
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01 Microinjection
Compound Microscope Olympus BX41 Microinjection, for embryo injection
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) Sutter Instruments 104E Microinjection, to be used with beveler
DNase/RNase-Free distilled Water Invitrogen 10977-015 Microinjection
Double-sided Tape Scotch B084NVQGXD Microinjection, embryo alignment
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector Eppendorf Microinjection
Femtotips Microloader tips Fisher Scientific E5242956003 Microinjection
Filter Paper Whatman 1001-090 Microinjection, embryo collection
Fine-tip paintbrush ZEM 2595 Microinjection, embryo alignment
Halocarbon oil 27 Sigma-Aldrich H8773 Microinjection, embryo alignment
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 Microinjection, embryo alignment
Hemotek Hemotek PS5 Line Maintenance
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV10 Microinjection, needle beveling
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 or P-2000 Microinjection, needle pulling
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-A3 Microinjection, embryo alignment
Non-Drying Modeling Clay Jovi B0025Z71IM Microinjection, needle storage
Stereo Microscope Olympus SZ51 Microinjection, for embryo alignment
Sugar Domino 20% sugar solution for adult sugar source.
T7 Endonuclease I NEB M0302 Preparation of microinjection materials
TOPO TA Cloning Kit ThermoFischer Scientific K451020 Preparation of microinjection materials
Ultra-fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-121 Microinjection, embryo alignment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
  2. APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
  3. Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
  4. van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
  5. Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
  6. Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
  7. Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
  8. Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
  9. Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
  10. Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
  11. Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
  12. Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
  13. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
  14. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
  15. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  16. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  17. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  18. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
  19. Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
  20. Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
  21. Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
  22. Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
  23. Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
  24. Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
  25. Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
  26. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
  27. Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
  28. Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  29. Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
  30. Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
  31. New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).

Tags

जेनेटिक्स अंक 159 क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटसिटस,CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन भ्रूण संरेखण भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन जीनोम संशोधन जर्मलाइन म्यूटेनेसिस
<em>क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटस</em> में कुशल साइट-विशिष्ट म्यूटेनेसिस के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu,… More

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus. J. Vis. Exp. (159), e61375, doi:10.3791/61375 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter