Summary
Denne protokol beskriver mikroinjection procedurer for Culex quinquefasciatus embryoner, der er optimeret til at arbejde med CRISPR/Cas9 genredigeringsværktøjer. Denne teknik kan effektivt generere stedsspecifikke, arvelige, kønsceller mutationer, der kan bruges til at opbygge genetiske teknologier i denne understudied sygdom vektor.
Abstract
Culex quinquefasciatus er en vektor for en bred vifte af vektorbårne sygdomme som aviær malaria, West Nile virus (WNV), japansk encephalitis, østlig hesteencephalitis, lymfefilariasis og Saint Louis encephalitis. Især har aviær malaria spillet en stor rolle i udryddelsen af talrige endemiske ø fuglearter, mens WNV er blevet en vigtig vektorbåren sygdom i USA. For at få yderligere indsigt i C. quinquefasciatus biologi og udvide deres genetiske kontrol værktøjskasse, er vi nødt til at udvikle mere effektive og overkommelige metoder til genomteknik i denne art. Men nogle biologiske træk unikke for Culex myg, især deres æg flåder, har gjort det vanskeligt at udføre mikroinjection procedurer, der kræves for genom engineering. For at løse disse udfordringer har vi udviklet en optimeret embryomikrojectionprotokol, der fokuserer på at afbøde de tekniske hindringer, der er forbundet med Culex myggenes unikke egenskaber. Disse procedurer demonstrere optimerede metoder til æg indsamling, æg tømmerflåde adskillelse og andre håndteringsprocedurer afgørende for en vellykket mikroinjection i C. quinquefasciatus. Når disse procedurer kombineres med CRISPR/Cas9-genomredigeringsteknologien, giver de os mulighed for at opnå stedsspecifikke, effektive og arvelige kønsceller mutationer, som er nødvendige for at udføre avanceret genomteknologi og udvikle genkontrolteknologier i denne vigtige, men i øjeblikket understudiede sygdomsvektor.
Introduction
C. quinquefasciatus, almindeligvis kendt som det sydlige hus myg, er en kompetent vektor af mange patogener, herunder West Nile virus (WNV), japansk encephalitis, Saint Louis encephalitis, og østlige heste encephalitis. Især siden det første gang blev opdaget i New York i 1999, er WNV blevet en stor vektorbåren sygdom i hele det kontinentale USA (USA) med over 50.000 rapporterede humane tilfælde, der resulterede i omkring 2.300 dødsfald mellem 1999 og 20181 samt over 4.500 rapporterede hestetilfælde mellem 2008-20192. Desuden er mindst 23 fuglearter, der findes i Nordamerika, blevet påvirket af WNV-infektioner med mindst 12 arter, der er klassificeret som uoprettelige som følge af WNV3. Virkningen af WNV på mennesker, heste og fuglepopulationer skyldes den opportunistiske fodringsadfærd hos sine vektorer. Fugle er typisk de primære værter for WNV, og mennesker og heste er tilfældige eller blindgyde værter. Nogle patogener vektoreret af C. quinquefasciatus inficerer kun fugle som fugle malariaparasit, Plasmodium relictum. I Hawaii, C. quinquefasciatus er en hovedvektor for fugle malaria og har forårsaget udryddelsen af mange indfødte fuglearter4,5.
For at bekæmpe sygdomme, der overføres af C. quinquefasciatus, forskere og vektorkontrolagenturer, har brugt almindeligt etablerede mygpopulationskontrolværktøjer som insekticidapplikation6, men disse metoder er dyre, ikke artsspecifikke og har begrænset effektivitet, da resistens over for insekticider er høj i mange C. quinquefasciatuspopulationer 6,7,8,9. Andre kontrolteknikker, såsom Wolbachia-baseredebefolkningskontrolstrategier, er blevet udviklet i de senere år10,11, men fitnessomkostningerne forbundet med Wolbachia-infektion begrænser gennemførligheden af denne tilgang til denne vektor12. Der er også genetisk baserede kontrolmetoder, der er udviklet i andre mygarter som Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 og Anopheles stephensi16, herunder udvikling af patogenresistente myg17,18,19, der også kunne udvikles til C. quinquefasciatus, hvis de nødvendige genomteknologiske værktøjer er udviklet til denne art. Men C. quinquefasciatus biologi adskiller sig meget fra andre Aedes og Anopheles myg vektorer, som har gjort udviklingen af lignende genetiske teknologier vanskeligt i denne vektor. Med fremkomsten af CRISPR-baserede genomteknologier er præcis genomteknik blevet stadig triviel, overkommelig og tilpasningsdygtige og har derfor ført til udvikling af nye genetiske værktøjer i en lang række arter.
For at generere mutationer med CRISPR-baserede teknologier, en blanding af Cas9 protein og syntetisk guide RNA (sgRNA), der supplerer den ønskede loci, er microinjected i præ-blastoderm fase embryoner. Da C. quinquefasciatus hunner lægger deres æg i grupper fastgjort i en flydende flådestruktur (figur 1), i modsætning til at ovipositing individuelle æg, er et træk ved Aedes og Anopheles myg, embryo mikroinjections stadig mere komplicerede i denne art. Culex larver kommer også ud af den forreste side af hvert æg, som er i kontakt med vandoverfladen (Figur 1), så ægorientering efter manipulation er vigtig i denne art. Her beskriver vi en detaljeret protokol designet til mikroinjection af Cas9 protein og sgRNA i C. quinquefasciatus embryoner. Denne protokol er designet til at rumme træk, der er unikke for Culex biologi for at forbedre embryoets overlevelse og genommutationshastigheder gennem visse trin, der er nøglen til rettidig ægopsamling og ægoverlevelse.
Protocol
1. C. quinquefasciatus koloni opdræt
- Opret flere kolonier af C. quinquefasciatus voksne i bug kollegieværelse bure.
BEMÆRK: Kolonierne blev leveret af Dr. Laura Harrington på Cornell University20. Detaljerede protokoller for opdræt af Culex myg findes i anden litteratur21.- Hold myggene ved 25 ± 1 °C ved 30% fugtighed med en 12:12 h dag:nat cyklus.
- Giv 20% sukkeropløsning ad libitum ved at introducere en sukkeropløsningsbeholder med en væge i buret eller ved at mætte bomuldskugler med sukkeropløsningen og placere den i buret.
- Lad myg parre sig i mindst 3 dage før blodfodring(figur 2A).
2. Indsamling af C. quinquefasciatus præ-blastoderm fase embryoner
- Efter 3-6 dage efter eklosionen skal hunnerne forsynes med 1-2 mL af et citratedt kvægblodmel gennem en syntetisk membran og opvarmes til ca. 40 °C i et blodfodringssystem (Figur 2B). Der er også alternative protokoller for blodfodring, der kan bruges til Culex-myg (f.eks. se ref21).
BEMÆRK: C. quinquefasciatus er kendt for en præference for aviær blod. Nogle laboratorier bruger bedøvede levende fugle eller fugleblod til deres blodmel kilde21,22,23. Kolonier kan dog trænes/udvælges til at fodre med kvægblod eller små gnavere, hvis denne funktion er valgt i over flere generationer.- Lad hunnerne hvile i mindst 3 dage efter, at blodfodringen har undergået oogenese og ægmodning, før de fremkalder oviposition til mikroinjectionforsøg.
- På dagen for embryonale mikroinjections skal du oprette en oviposition kop med organisk infunderet oviposition vand. Fårevand skal laves ved gærende kaninafføring (50 g/L), nedbrydende græs (4,5 g/l) eller fiskefoder (25 g/l) i vand i løbet af 5 eller flere dage24,25.
- Placer oviposition kop i buret og placere hele buret i en mørk placering(Figur 2C).
- Efter hver 30 minutter skal du kontrollere koppen for ægflåder.
- Hvis der er ægflåder til stede, skal du samle flåderne ved at skovle dem med en pensel og placere dem på et vådt filterpapir(Figur 2D, E).
3. Tilpasning af C. quinquefasciatus præ-blastoderm fase embryoner
- Adskil æggene fra flåderne ved at trykke ned på tømmerflåden og drille æggene individuelt ved hjælp af en fin spidsmaling og pincet(Figur 2E).
- Juster de enkelte æg på en tynd strimmel dobbeltsidet klæbebånd placeret over toppen af et glas dias(Figur 2F).
- Mens du justerer, skal du prøve at pege den forreste side af hvert æg i samme retning for lettere tilgængelighed.
BEMÆRK: En alternativ ægjusteringsmetode uden dobbeltsidet klæbebånd findes i en tidligere offentliggjort Nasonia vitripennis embryo microinjection protocol26. - Dæk æg med halocarbonolieblandingen.
BEMÆRK: Halocarbonblandingen kan fremstilles på forhånd ved forsigtigt at blande to halocarbonreagenser og vand (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : Ultrapure vand) og derefter inkubere blandingen natten over ved 25οC for at lette vandmætningen af halocarbonolien.
4. Nåleforberedelse til mikroinjections
- Generer aluminosilicate kapillær glas nåle ved hjælp af et glas micropipette puller.
- Placer et aluminosilicate kapillærglas i en nåleskøjte, i henhold til instruktionerne fra nåletrækkerens brugervejledning.
BEMÆRK: Kvarts- og borosilicate kapillærnåle kan også anvendes, men til dette eksperiment foretrækkes aluminosilicate på grund af dets relative overkommelighed og holdbarhed. - Indstil Heat til 516, Velocity til 100, Delay to 70, Pull to 97 og Pressure to 500 on the needle puller.
- Aktiver nåletrækeren i henhold til aftrækkerens anvisninger, og gentag efter behov for yderligere nåle.
BEMÆRK: Under injektionsprocessen bliver nåle ofte tilstoppede eller ved et uheld brudt, derfor anbefales det stærkt at trække ekstra nåle til et enkelt eksperiment.
- Placer et aluminosilicate kapillærglas i en nåleskøjte, i henhold til instruktionerne fra nåletrækkerens brugervejledning.
- Facet nålen spidsen ved forsigtigt at røre spidsen af den trukket nål på den roterende diamant slibeplade for omkring 10 s i en 50 ° vinkel.
BEMÆRK: Facettering af nålen åbner den for at lade væsken strømme igennem, samtidig med at der skabes en skarpere spids for lettere indtrængning i embryoet. Et eksempel på en ordentlig nål kan ses i en tidligere artikel26. - Opbevar trukket og facet nåle ved at indlejre dem i linjer af modeler's ler i en petriskål.
BEMÆRK: For at sikre den bedste kvalitet til nålespidser skal nåle trækkes frisk og facet så tæt på injektionstidspunktet som muligt.
5. Påfyldning af injektionsblandingen
- Indsprøjtningsblandingen består af reagenser til genommodifikation (f.eks. 200 ng/μL sgRNA og 200 ng/μL Cas9-blanding) eller foretrukne injektionsopløsninger, og hold den på is.
BEMÆRK: Denne blanding kan tilberedes, mens du venter på, at der lægges æg. Yderligere oplysninger om Produktion og forberedelse af Cas9 og sgRNA til mikroinjection findes i tidligere publikationer27,28,29,30. - 2 μL injektionsblandingen lægges i injektionsnålen ved hjælp af en mikrolæsserspids.
6. Mikroinjection oprettet
- Placer den fyldte injektionsnål i en mikromanipulator, der er forbundet med en elektronisk mikroinjektor.
- Placer glasrutschebanen med de justerede æg på scenen i et sammensat mikroskop.
- Brug mikromanipulatoren og det sammensatte mikroskop til at justere nålen for at sigte mod embryoets bageste ende i en vinkel på 25-35°.
7. Mikroinjektion af embryoner (figur 2G)
- Sæt forsigtigt nålen i embryoet og injicere blandingen i en mængde på ca. 10% af embryoets volumen (700-800 pL afhængigt af æggenes størrelse).
BEMÆRK: Ved injektion skal ægget dog svulme lidt op, hvis der injiceres for meget væske, kan æggene briste, eller der kan sive cytoplasmisk væske ud. - Injicere omkring 20 æg ad gangen derefter stoppe og udføre embryogendannelse procedurer.
BEMÆRK: Under injektion er der stor risiko for, at nåle enten tilstopper eller går i stykker. Hvis der opstår en tilstopning, som kan bestemmes af en mangel på injektionsvæske, der strømmer gennem nålen, kan du prøve enten at rense nålen med den rene funktion på den elektroniske mikroinjektor eller prøve at omslutte nålen. Hvis ingen af trinene virker, skal du hurtigt skifte til en ny nål og samtidig sikre, at de forberedte æg forbliver fugtede.
8. Bjærgning og udklækning af embryoner
- Lad æggene være uforstyrret i mindst 5 min. Inden for 20 minutter efter injektionen skal du forsigtigt fjerne halocarbonolien ved at børste let med en ren pensel (Figur 2H).
- Løft æggene forsigtigt ved hjælp af en pensel og læg dem i en kop dobbeltdestilleret vand (Figur 2I). Sørg for at holde æggene på vandets overflade.
- Kontroller æggene dagligt i 7 dage til udklækning(figur 2J).
- Følg de normale larveopdrætsprocedurer21.
9. Screening for genommodifikation
- Screen de injicerede myg for de mutante fænotyper ved hjælp af et stereoskop (Figur 2K).
- Kontroller mutationer, der ikke har en let genkendelig fænotype, ved PCR-forstærkning, T7 Endonuclease I-analyse og sekventering ved subklonering af målområdet31.
- Opret yderligere krydsninger mellem injicerede individer for at opdage arvelige mutationer inden for kønscellerne.
Representative Results
I tidligere offentliggjorte forsøg blev denne metode anvendt til med succes at generere somatiske og kønsceller mutationer af et gen, der er afgørende for udviklingen af pigmentering af mørke øjne, hvid (CPIJ005542)30 (Tabel 1). CRISPR/Cas9 genererede somatiske mutationer blev scoret ved screening for tab af pigmentering i pupal stage øjne injicerede individer (G0). Somatiske mutationer var generelt til stede som mosaik fænotyper, hvor nogle, men ikke alle cellerne har mutant fænotype. For eksempel resulterede somatiske mutationer af det hvide gen i en blanding af ommatidia med fænotyper, der mangler pigmentering og dem med en wildtype pigmenteret fænotype30. Da der var en kønsceller mutation af det hvide gen, dog den næste generation (G1)arvet den fulde hvide øjne fænotype. Kønsmutationshastigheder blev bestemt af intercrossing mosaik G0 individer og scoring for helt hvide øjne afkom (G1). Disse forsøg resulterede i en overlevelsesrate på 64-82% af embryoner samt en 37-57% somatisk mutageneserate og en >61% kimcelle mutageneserate (tabel 1). Ved at multiplumre sgRNA'er for at målrette flere loci i samme gen steg somatiske og kimiske mutagenesehastigheder opad til så meget som 86%(Tabel 1). Hertil kommer, at i mange generationer, levedygtige homozygous bestande af de hvide mutanter er blevet holdt i laboratoriet.
Figur 1: C. quinquefasciatus æg tømmerflåde og enkelt æg morfologi.
Dorsal (A), lateral (B) og ventral (C) visninger af C quinquefasciatus ægflåder. C. quinquefasciatus hunner lægge deres æg med de mere pæreformet forreste side rører overfladen af vandet, mens de mere spidse posterior væk fra vandets overflade (D). A- forreste; P-posterior Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tidslinje for oprettelse af C. quinquefasciatus mutanter ved mikroinjection.
Tidslinje for C. quinquefasciatus koloniforberedelse og embryonindsamling til mikroinjektion (A-D). Indsamlede æg adskilles derefter (E) justeret i samme retning og dækkes med halocarbonolie (F). Æggene injiceres derefter (G) og får lov til at hvile i mindst 5 minutter, før de fjerner halocarbonolien (H). Æggene overføres derefter til en ren vandkilde (I) til udklækning (J) og screenes for mutante fænotyper (K). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Overlevelse | Somatisk mosaikisme (G0) | Kimstof mutagenese (G1) | ||||||
| sgRNA | #injected | ♂ | ♀ | I alt (%) | ♂ | ♀ | I alt (%) | G1 mutanter (%) |
| wsgRNA-1 | 50 | 15 | 20 | 35(70) | 7(47) | 13(65) | 20(57) | 128(69) |
| wsgRNA-2 | 50 | 9 | 32 | 41(82) | 3(33) | 12(38) | 15(37) | 51(61) |
| wsgRNA-3 | 50 | 17 | 15 | 32(64) | 7(41) | 8(53) | 15(47) | 157(72) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2 | 50 | 7 | 16 | 23(46) | 5(71) | 12(75) | 17(74) | 123(79) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-3 | 50 | 13 | 9 | 22(44) | 10(77) | 6(67) | 16(73) | 72(81) |
| wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 17 | 10 | 27(54) | 13(76) | 8(80) | 21(78) | 101(85) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 11 | 10 | 21(42) | 9(82) | 9(90) | 18(86) | 149(86) |
Tabel 1: Overlevelses- og mutationsrater for embryoner, der injiceres med enkelt- og multiplekserede gRNA'er, der er rettet mod hvid. Tabellen udskrives igen med tilladelse fra30
Discussion
Med de seneste bestræbelser på at generere genetisk manipulerede værktøjer til myg vektor kontrol, er der behov for at udvikle og optimere embryo mikroinjection protokoller for fælles myg sygdom vektorer. Selvom der er udviklet metoder til Aedes og Anopheles myg, er en protokol designet specielt til Culex blevet minimalt udforsket. Generelt kan myggefostrindsprøjtningsprotokoller opdeles i 3 generelle trin: 1) embryonindsamling og -forberedelse, 2) embryoindsprøjtning og 3) genopretning efter injektion. For at kunne generere mutanter skal alle tre trin optimeres til målarten. Denne modificerede protokol for embryo mikroinjection er specifik for vellykket genom engineering af Culex myg.
Maksimering af embryonindsamling er en almindelig flaskehals i embryomikroinjectionprotokoller. For at øge antallet af æg indsamlet på kort tid blev myg begrænset fra et ovipositionssubstrat i 2-3 dage efter blodmåltidet. Det er vigtigt at bemærke, at C. quinquefasciatus tendens til at foretrække fugleblod kilder i modsætning til pattedyr kilder eller membran fodring med pattedyr blod. Men mange forskere har svært ved at erhverve en pålidelig kilde til levende fugle eller fugleblod til blodfodring, så laboratorielagre kan tilpasses til at fodre på mere tilgængelige blodkilder. Det er også vigtigt at bruge næringsrigt vand til oviposition substrat, da det giver oviposition stikord til C. quinquefasciatus og de fleste andre Culex vektorer. Der er mange metoder til at generere næringsrigt vand, som muligvis skal optimeres mellem laboratorier for at sikre, at et passende antal æg er tilgængelige for mikroinjection. For eksempel, mens denne metode var den mest succesfulde med kaninafføring fermenteret i deioniseret vand i 5 eller flere dage, har andre forskere mere succes med græs eller fiskefoder som næringsstofkilde og nogle endda med destilleret vand21.
Da Culex myg lægger grupper af æg i flåder, er indsamling af æg ret simpelt. Æg kan simpelthen indsamles ved at scooping hele flåden med en pensel. Ægadskillelse er mere kompliceret, men afgørende for en vellykket injektion. Æg kan omhyggeligt adskilles fra flåden ved at anvende blidt nedadgående tryk mellem æg med pensel eller pincet. Med en vis praksis var flere brugere pålideligt i stand til at adskille enkeltæg fra ægflåder. Efter adskillelse af hvert æg justeres æggene i samme retning på dobbeltsidet klæbebånd, som stabiliserer æggene under mikroinjektion. Æg injiceres i den koniske bageste ende, og tilsætningen af halocarbonolie holder æggene fugtige under manipulation.
For at begrænse skader på embryoner under mikroinjektion skal injektionsnåle være af passende styrke og facetteres i en passende vinkel. Aluminosilicate nåle facetteret i 10 sekunder i en 50 ° vinkel havde de bedste resultater, men borosilikat og kvarts nåle kan også arbejde, selv om de kan være billigere og dyrere. Derudover letter korrekt nålesvingning bedre strømning af Cas9- og sgRNA-blandingerne og skaber et skarpere punkt for lettere indtrængning i embryoet. I mange tilfælde er facet også en effektiv måde til hurtigt at fastsætte tilstoppede nåle i stedet for at bruge tid og kræfter på at erstatte tilstoppede nåle.
Efter injektionen skal æggene forblive uforstyrrede i mindst 5 minutter, mens halocarbonolien fjernes umiddelbart efter ved forsigtigt at børste den væk med en ren pensel. Efter fjernelse af halocarbonolien kan de injicerede æg placeres i vand for at klække, hvilket typisk sker inden for 3 dage efter injektionen. Med praksis og tilstrækkeligt antal æg kan denne protokol opnå konsekvente somatiske og kønsceller mutationer i C. quinquefasciatus og er alsidig nok til, at den let kan tilpasses andre Culex-myg.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af UCSD-startmidler rettet mod O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
References
- Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
- APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
- Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
- van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
- Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
- Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
- Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
- Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
- Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
- Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
- Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
- Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
- Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
- Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
- Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
- Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
- Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
- Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
- New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).
