Summary
このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus 胚のマイクロインジェクション手順について説明します。この技術は、この研究対象疾患ベクターの遺伝的技術を構築するために使用できる部位特異的、遺伝性、生殖細胞系列突然変異を効率的に生成することができる。
Abstract
キュレックス・キンケファシアトゥス は、鳥インフルエンザ、西ナイルウイルス(WNV)、日本脳炎、東方脳炎、リンパ系フィラリア症、セントルイス脳炎など、多様なベクター媒介性疾患のベクターです。特に、鳥類マラリアは多数の固有の島鳥類種の絶滅に大きな役割を果たし、WNVは米国で重要なベクター媒介性疾患となっています。 C.キンケファシアトゥス 生物学に関するさらなる洞察を得て、その遺伝的制御ツールボックスを拡大するためには、この種のゲノム工学のためのより効率的で手頃な価格の方法を開発する必要があります。しかし 、Culex 蚊、特に卵のいかだに特有の生物学的形質の中には、ゲノム工学に必要なマイクロインジェクション手順を実行することが困難になっています。これらの課題に対処するために 、Culex 蚊のユニークな特性に関連する技術的障害を軽減することに焦点を当てた最適化された胚マイクロインジェクションプロトコルを開発しました。これらの手順は 、C.quinquefasciatus でのマイクロインジェクションを成功させるために不可欠な卵の収集、卵いかだの分離、その他の取り扱い手順に最適化された方法を示しています。CRISPR/Cas9ゲノム編集技術と組み合わせることで、高度なゲノム工学を行い、現在研究されていない疾患ベクターで遺伝子制御技術を開発するために必要な、部位特異的で効率的で遺伝性の生殖細胞系列突然変異を達成することができます。
Introduction
C.キンケファシアトゥスは、一般に南部の家の蚊として知られており、西ナイルウイルス(WNV)、日本脳炎、セントルイス脳炎、および東方脳炎を含む多数の病原体の有能なベクターです。特に、1999年にニューヨークで初めて検出されて以来、WNVは米国大陸全体で主要なベクター媒介性疾患となり、1999年から2018年の間に約2,300人が死亡し、2008-201920092年の間に報告された馬の症例は4,500人を超えています。さらに、北米で見つかった少なくとも23種の鳥類は、WNV3の結果として回復不可能と分類される少なくとも12種のWNV感染の影響を受けている。WNVがヒト、馬、鳥類集団に及ぼす影響は、そのベクターの日和食摂食行動によるものです。通常、鳥はWNVの主要なホストであり、人間と馬は偶発的または行き止まりのホストです。C.キンケファシアトゥスによってベクター化されたいくつかの病原体は、鳥類マラリア原虫、マラリア原虫などの鳥類にのみ感染する。ハワイでは、C.キンケファシアトゥスは鳥類マラリアの主要なベクターであり、多くの在来鳥種4、5の絶滅を引き起こしている。
C.キンケファシアトゥスによって伝染する疾患を制御するために、研究者およびベクターコントロール機関は、殺虫剤用途6のような一般的に確立された蚊集団制御ツールを使用してきたが、これらの方法は、種特異的ではなく、高価であり、殺虫剤に対する耐性が多くのC.キンケファシアトの集団6、7、8、9で高いため、限られた有効性を有する。ウォルバキア系集団制御戦略などの他の制御技術は近年10,11に開発されているが、ウォルバキア感染に伴うフィットネスコストは、このベクター12に対するこのアプローチの実現可能性を制限している。また、Aedes aegypti13、14、アノフェレスガンビア15、アノフェレス・ステファシ16などの他の蚊種で開発された遺伝子ベースの制御方法もあり、病原性蚊17、18、19の開発を含む、 C.quinquefaiatusのために開発される可能性があります。 この種のために開発されました。しかし、C.キンケファシアトゥス生物学は、このベクターで同様の遺伝技術の開発を困難にしている他のAedesおよびアノフェレス蚊ベクターとは大きく異なります。CRISPRベースのゲノム工学技術の出現により、精密なゲノム工学はますます些細で手頃な価格で適応可能になり、その結果、多種多様な種で新しい遺伝子ツールの開発につながっています。
CRISPRベースの技術で変異を生成するために、Cas9タンパク質と合成ガイドRNA(sgRNA)の混合物を、所望の遺伝子座と相補し、プレブラスタードドミルム期胚にマイクロインジェクションする。C.キンケファシアトゥスメスは、個々の卵子をオビジケートするのとは対照的に、浮遊いかだ構造(図1)に付着したグループで卵を産むので、この種では胚の微小注射がますます複雑になっている。カレックス幼虫は、水面に接触している各卵の前側からも出てくる(図1)ので、卵の向き後操作がこの種では重要である。ここでは、C.キンケファシアトゥス胚へのCas9タンパク質およびsgRNAのマイクロインジェクション用に設計された詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、タイムリーな卵の収集と卵の生存のための重要な特定のステップを通じて胚の生存率とゲノム突然変異率を改善するために、Culex生物学に特有の形質を収容するように設計されています。
Protocol
1. C. クィケファシアトゥス コロニー飼育
- バグ寮ケージに C.キンケファシアトゥス 大人の複数のコロニーを設定します。
注:コロニーはコーネル大学20でローラ・ハリントン博士によって提供されました。 Culex 蚊を飼育するための詳細なプロトコルは、他の文献21で見つけることができます。- 12:12時間の昼/夜サイクルで湿度30%で25±1 °Cで蚊を維持します。
- 20%の砂糖溶液のアドリビタムを提供し、芯を入れた砂糖溶液容器をケージに入れるか、または綿ボールを砂糖溶液で飽和させ、ケージ内に入れます。
- 蚊が血液を摂食する前に少なくとも3日間交尾することを許可する(図2A)。
2. C.キンケファシアトゥス プレブラコデドム期胚の収集
- 3〜6日後のエローションの後、女性に、合成膜を通して1〜2mLのクビシ血液食を与え、血液供給システムで約40°Cに加熱した(図2B)。また、Culex蚊に使用できる代替の血液供給プロトコルもあります(例えば、ref21を参照してください)。
注:C.キンケファシアトゥスは、鳥の血液の好みで知られています。いくつかの研究室は、血液の食事源21、22、23のために麻酔を受けた生きた鳥や鳥の血液を使用しています。しかし、この機能が複数の世代にわたって選択されている場合、コロニーはウシの血液または小さなげっ歯類を食べるように訓練/選択することができます。- 女性は、マイクロインジェクション実験のための卵子を誘発する前に、卵の発生と卵の成熟を受けるために、血液の供給後に最低3日間休むことを可能にします。
- 胚性マイクロインジェクションの日に、有機的に注入された卵子水で卵子カップを作成します。卵子水は、ウサギの便(50 g/L)、草(4.5 g/L)、または魚の食べ物(25g/L)を5日以上の間に水に分解することによって作られるべきです。
- オビポジションカップをケージに入れ、ケージ全体を暗い場所に置きます(図2C)。
- 30分ごとに、カップに卵のいかだがないか確認してください。
- 卵のいかだが存在する場合は、ペイントブラシでそれらをすくっていかだを収集し、ウェットフィルター紙の上に置きます(図2D,E)。
3. C.クムケファシアトゥスプレブラスターデドム期胚のアライメント
- いかだを押し下げて、細かい先端のペイントブラシと鉗子を使って卵を個別に引き離して、いかだから卵を分離します(図2E)。
- ガラススライドの上部に置かれた両面付箋テープの薄いストリップに個々の卵を揃える(図2F)。
- 整列しながら、アクセシビリティを容易にするために、各卵の前側を同じ方向に向けてみてください。
注:両面付き粘着テープを使用しない代替卵アライメント方法は、以前に公開された ナソニアビトリペニス 胚マイクロインジェクションプロトコル26で見つけることができます。 - ハロカーボンオイルミックスで卵を覆います。
注:ハロカーボンミックスは、2つのハロカーボン試薬と水(9:1:20、ハロカーボン700:ハロカーボン27:超純水)を穏やかに混合し、25°Cで一晩インキュベートしてハロカーボンオイルの水飽和を容易にすることによって、事前に調製することができます。
4. マイクロインジェクション用の針の準備
- ガラスマイクロピペットプーラーを使用して、アルミノケイ酸キャピラリーガラス針を生成します。
- 針の引き手のユーザーマニュアルからの指示に従って、アルミノケイ酸キャピラリーガラスを針の引き手に入れます。
注:石英およびホウケイ酸毛細血管針も使用できますが、この実験では、アルミノケイ酸塩は相対的な手頃な価格と耐久性のために好まれます。 - [熱]を 516、速度を 100 に、[遅延] を 70 に、[97 にプル]、および [圧力] をニードル プーラーで 500 に設定します。
- 引き手の指示に従って針の引き手を作動させ、追加の針のために必要に応じて繰り返します。
注: 注射プロセス中に針が詰まったり、誤って壊れたりすることが多いため、1 回の実験で追加の針を引っ張ることを強くお勧めします。
- 針の引き手のユーザーマニュアルからの指示に従って、アルミノケイ酸キャピラリーガラスを針の引き手に入れます。
- 回転するダイヤモンドの研磨板の上で、50°の角度で約10sのプル針の先端にそっと触れることで、針先をベベルします。
注:針をベベルすると、液体が流れるように開き、胚への浸透を容易にするためにより鋭い先端を作成します。適切な針の例は、前の記事26で見ることができます。 - ペトリ皿のモデラーの粘土のラインに埋め込むことによって、針を引っ張ってベベリングした針を保管してください。
注:針の先端のための最高の品質を確保するために、針は、注射の時間にできるだけ近い、新鮮に引っ張られ、ベベにする必要があります。
5. 注入混合物のロード
- ゲノム修飾試薬(例えば、200 ng/μL sgRNAおよび200 ng/μL Cas9混合物)からなる注入混合物を準備するか、または好ましい注入溶液を氷の上に保つ。
注:このミックスは、卵が産まれるのを待っている間に準備することができます。Cas9 および sgRNA の生産とマイクロインジェクションの準備の詳細については、前の出版物27,28,29,30を参照してください。 - マイクロローダーチップを使用して注射針に2μLの注入混合物をロードします。
6. マイクロインジェクションのセットアップ
- 充填された注射針を、電子マイクロインジェクターにリンクされたマイクロマニピュレータセットに入れる。
- コンパウンド顕微鏡のステージ上に、整列した卵を含むガラススライドを置きます。
- マイクロマニピュレーターと複合顕微鏡を使用して、針を合わせて、25~35°の角度で胚の後端を目指します。
7. 胚マイクロインジェクション(図2G)
- 慎重に針を胚に挿入し、胚の体積の約10%の量(卵の大きさに応じて700〜800 pL)の混合物を注入する。
注:注入すると、卵はわずかに膨らむはずですが、あまりにも多くの液体を注入すると、卵が破裂したり、細胞質流体が漏れたりすることがあります。 - 一度に約20個の卵を注入し、停止して胚の回復手順を実行します。
注:注射中に、針が詰まったり壊れたりする可能性が高くなります。詰まりが発生した場合は、注射液が針を流れる不足によって判断される可能性があり、電子マイクロインジェクターのクリーン機能で針を掃除するか、針を再びベベリングしてみてください。どちらのステップもうまくいかない場合は、準備された卵が湿ったままであることを確認しながら、すぐに新しい針に変更します。
8. 胚の回復と孵化
- 卵を少なくとも5分間邪魔しません。20分以内に、きれいなペイントブラシで軽くブラッシングしてハロカーボンオイルを慎重に取り除きます(図2H)。
- 卵をペイントブラシでやさしく持ち上げ、二重蒸留水のカップに入れます(図2I)。水面に卵を保管するように注意してください。
- 卵が孵化するために毎日7日間チェックしてください(図2J)。
- 通常の幼虫飼育手順21に従ってください。
9. ゲノム改変のスクリーニング
- ステレオスコープを使用して、突然変異型のフェノタイプのために注入された蚊をスクリーニングする(図2K)。
- 容易に認識可能な表現型を有しない突然変異を検証し、PCR増幅により、T7エンドヌクレアーゼIアッセイ、および標的領域31のサブクローニングによるシーケンシングを行う。
- 生殖細胞系列内の遺伝性突然変異を検出するために注入された個人間の追加の十字架を設定します。.
Representative Results
以前に公開された実験では、この方法は、暗い目の色素沈着の発達に重要な遺伝子の体細胞性および生殖細胞系列突然変異を正常に生成するために使用された、白色(CPIJ005542)30(表1)。CRISPR/Cas9は、注入された個体のプパルステージ目における色素沈着の喪失をスクリーニングすることによって採点した(G0)。体細胞変異は一般に、一部の細胞が変異表現型を有するが、その一部が変異型であるモザイク表現型として存在していた。例えば、白色遺伝子の体細胞変異は、色素沈着を欠く表現型を有するオマチディアと、野生型色素性表現型30との混合物をもたらした。しかし、白い遺伝子の生殖系列変異があった場合、次の世代(G1)は完全な白目表現型を受け継いだ。生殖細胞系列突然変異率は、モザイクG0個体を交交し、完全に白い目の子孫に対して得点することによって決定した(G1)。これらの実験結果は、胚生存率が64%から82%、ならびに37%〜57%の体細胞性突然変異誘発率および>61%の生殖細胞系変異生成率をもたらした(表1)。同じ遺伝子内の複数の遺伝子を標的とするsgRNAを多重化することにより、体細胞および生殖細胞系列突然変異誘発率は86%まで上方に増加した(表1)。さらに、多くの世代のために、白い突然変異体の実行可能なホモ接合株は、実験室で正常に保持されています。
図 1:C.キンケファシアトゥス 卵いかだと単一卵形態
D.D.Cキンケファシアトゥス卵いかだのドーサル(A)、横(B)、腹側(C)の眺め。C.キンケファシアトゥスメスは、より球根の前側が水面から離れて指差された後方に水面に触れて卵を産む(D)。A-前者;P-後部この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロインジェクションによる C.クィクケファシアトゥス 変異体の作成用のタイムライン
C.キンケファシアトゥスコロニー調製と微小注射のための胚コレクションの年表(A-D)。次いで、採取した卵が分離され(E)同じ向きに整列し、ハロカーボン油(F)で覆われる。卵を注入し(G)、ハロカーボンオイル(H)を除去する前に最低5分間休ませる。卵は、孵化のためにきれいな水源(I)に移され、突然変異型(K)のスクリーニングを受ける。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 生存 | 体的モザイク (G0) | 生殖細胞系突然変異誘発(G1) | ||||||
| スグRNA | #injected | ♂ | ♀ | 合計 (%) | ♂ | ♀ | 合計 (%) | G1 変異体 (%) |
| wsgRNA-1 | 50 | 15 | 20 | 35(70) | 7(47) | 13(65) | 20(57) | 128(69) |
| wsgRNA-2 | 50 | 9 | 32 | 41(82) | 3(33) | 12(38) | 15(37) | 51(61) |
| wsgRNA-3 | 50 | 17 | 15 | 32(64) | 7(41) | 8(53) | 15(47) | 157(72) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2 | 50 | 7 | 16 | 23(46) | 5(71) | 12(75) | 17(74) | 123(79) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-3 | 50 | 13 | 9 | 22(44) | 10(77) | 6(67) | 16(73) | 72(81) |
| wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 17 | 10 | 27(54) | 13(76) | 8(80) | 21(78) | 101(85) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 11 | 10 | 21(42) | 9(82) | 9(90) | 18(86) | 149(86) |
表1:白を標的とする単一および多重化gRNAを注射した胚の生存率および突然変異率。テーブルは30からの許可を得て再印刷されます。
Discussion
最近、蚊ベクター制御のための遺伝子操作ツールを生成する取り組みでは、一般的な蚊病ベクターの胚マイクロインジェクションプロトコルを開発し、最適化する必要があります。 Aedes と Anopheles 蚊のための方法が開発されていますが 、Culex のために特別に設計されたプロトコルは最小限に探索されています。一般に、蚊の胚の注入プロトコルは、3つの一般的なステップに分けることができます:1)胚の採取と準備、2)胚注射、および3)注射後の回復。突然変異体を正常に生成するには、3つのステップすべてをターゲット種に最適化する必要があります。胚マイクロインジェクションのためのこの改変されたプロトコルは 、Culex 蚊のゲノム工学に成功した場合に特異的である。
胚の採取を最大化することは、胚微小注入プロトコルにおける一般的なボトルネックである。短時間で採取される卵の数を増やすために、蚊は血液食後2〜3日間、卵子基質から制限された。 C.キンケファシアトゥス は、哺乳類の源や哺乳類の血液を供給する膜とは対照的に、鳥類の血液源を好む傾向があることに注意することが重要です。しかし、多くの研究者は、血液供給のための生きている鳥類や鳥類の血液の信頼性の高い供給源を取得することが困難であるため、実験室の在庫は、よりアクセスしやすい血液源を供給するために適応することができます。また 、C.キンケファシアトゥス および他のほとんどの Culex ベクターにオビポジションキューを提供するため、オビポジション基質に栄養豊富な水を使用することも重要です。栄養豊富な水を生成する多くの方法があり、マイクロインジェクションに適切な数の卵が利用可能であることを確認するために、ラボ間で最適化する必要があります。例えば、この方法は5日以上の脱イオン水で発酵したウサギの便で最も成功したが、他の研究者は、栄養源として草や魚の食物でより多くの成功を収めているが、蒸留水21でもいくつかある。
Culex蚊はいかだに卵のグループを産むので、卵を集めるのはかなり簡単です。卵は、ペイントブラシでいかだ全体をすくうことによって単に収集することができます。卵の分離はより複雑ですが、正常な注射には不可欠です。卵は、ペイントブラシや鉗子で卵の間に穏やかな下降圧力をかけることで、いかだから慎重に分離することができます。いくつかの練習では、複数のユーザーが確実に卵のいかだから単一卵を分離することができました。各卵を分離した後、卵は両面付き粘着テープ上で同じ向きに整列し、マイクロインジェクション中に卵を安定させる。卵は先細りの後端に注入され、ハロカーボンオイルの添加は、操作中に卵を湿らせた保ちます。
マイクロインジェクション中の胚の損傷を制限するには、注射針が適切な強度を持ち、適切な角度でベベブする必要があります。50°の角度で10秒間ベベにされたアルミノケイ酸針は最良の結果を得ましたが、ボロシリケート針とクォーツ針も機能しますが、耐久性が低く、より高価である可能性があります。さらに、適切な針のベベルはCas9およびsgRNA混合物のよりよい流れを促進し、胚へのより容易な浸透のためのより鋭いポイントを作成する。多くの場合、ベベルは詰まった針を交換するのに時間と労力を費やすのではなく、詰まった針を素早く固定する効率的な方法でもあります。
注射後、卵は少なくとも5分間邪魔されず、ハロカーボンオイルはきれいな絵筆で軽くブラッシングしてすぐに取り除かれます。ハロカーボン油の除去後、注入された卵は、通常、注射後3日以内に発生する孵化するために水に入れることができます。練習と卵の十分な数で、このプロトコルは 、C.キンケファシアトゥス で一貫した体細胞および生殖細胞系列突然変異を達成することができ、他の Culex 蚊に容易に適応可能であるべきであるほど汎用性があります。
Disclosures
何一つ
Acknowledgments
この作業の一部は、O.S.Aに向けられたUCSDスタートアップファンドによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
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