Summary
Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.
Abstract
Culex quinquefasciatus é um vetor de uma variedade diversificada de doenças transmitidas por vetores, como malária aviária, vírus do Nilo Ocidental (WNV), encefalite japonesa, encefalite equina oriental, filariase linfática e encefalite de Saint Louis. Notavelmente, a malária aviária tem desempenhado um papel importante na extinção de numerosas espécies de aves insulares endêmicas, enquanto a WNV tornou-se uma importante doença transmitida por vetores nos Estados Unidos. Para obter mais informações sobre a biologia C. quinquefasciatus e expandir sua caixa de ferramentas de controle genético, precisamos desenvolver métodos mais eficientes e acessíveis para a engenharia de genomas nesta espécie. No entanto, alguns traços biológicos exclusivos dos mosquitos Culex, particularmente suas jangadas de ovos, têm dificultado a realização de procedimentos de microinjeção necessários para a engenharia do genoma. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um protocolo otimizado de microinjeção de embriões que se concentra em mitigar os obstáculos técnicos associados às características únicas dos mosquitos Culex. Esses procedimentos demonstram métodos otimizados para coleta de ovos, separação de jangadas de ovos e outros procedimentos de manuseio essenciais para a microinjeção bem sucedida em C. quinquefasciatus. Quando associados à tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9, esses procedimentos permitem alcançar mutações germinas específicas, eficientes e hereditárias, que são necessárias para realizar engenharia avançada do genoma e desenvolver tecnologias de controle genético neste importante, mas atualmente subestudado, vetor da doença.
Introduction
C. quinquefasciatus, comumente conhecido como mosquito da casa do sul, é um vetor competente de numerosos patógenos, incluindo o vírus do Nilo Ocidental (WNV), encefalite japonesa, encefalite de Saint Louis e encefalite equina oriental. Em particular, desde que foi detectada pela primeira vez em Nova York, em 1999, a WNV tornou-se uma importante doença transmitida por vetores em todo o continente dos Estados Unidos (EUA) com mais de 50.000 casos humanos relatados resultando em cerca de 2.300 mortes entre 1999 e 20181, bem como mais de 4.500 casos de equinos relatados entre 2008-2019. Além disso, pelo menos 23 espécies de aves encontradas na América do Norte foram impactadas por infecções por WNV com pelo menos 12 espécies classificadas como irrecuperáveis como resultado do WNV3. O impacto da WNV nas populações humanas, equinas e aviárias deve-se ao comportamento alimentar oportunista de seus vetores. Normalmente, os pássaros são os principais hospedeiros da WNV, e humanos e cavalos são hospedeiros incidentais ou sem saída. Alguns patógenos vetorcidos por C. quinquefasciatus só infectam aves como o parasita da malária aviária, o plasmodium relictum. No Havaí, C. quinquefasciatus é um dos principais vetores da malária aviária e causou a extinção de muitas espécies de aves nativas4,5.
Para controlar as doenças transmitidas por C. quinquefasciatus,pesquisadores e órgãos de controle de vetores têm usado ferramentas de controle populacional de mosquitos comumente estabelecidas, como a aplicação de inseticidas6,no entanto, esses métodos são caros, não específicos para espécies, e têm eficácia limitada, pois a resistência aos inseticidas é alta em muitas populações de C. quinquefasciatus 6,7,8,9. Outras técnicas de controle, como estratégias de controle populacional baseadas em Wolbachiaforam desenvolvidas nos últimos anos10,11, mas os custos de aptidão associados à infecção por Wolbachia limitam a viabilidade dessa abordagem para este vetor12. Existem também métodos de controle de base genética que foram desenvolvidos em outras espécies de mosquitos, como Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 e Anopheles stephensi16, incluindo o desenvolvimento de mosquitos resistentes ao patógeno17,18,19, que também poderiam ser desenvolvidos para C. quinquefasciatus se as ferramentas de engenharia do genoma necessários forem desenvolvido para esta espécie. No entanto, a biologia C. quinquefasciatus difere muito de outros vetores de mosquitos Aedes e Anopheles, o que dificultou o desenvolvimento de tecnologias genéticas semelhantes neste vetor. Com o advento das tecnologias de engenharia de genoma baseadas em CRISPR, a engenharia precisa do genoma tornou-se cada vez mais trivial, acessível e adaptável e, consequentemente, levou ao desenvolvimento de novas ferramentas genéticas em uma ampla variedade de espécies.
Para gerar mutações com tecnologias baseadas em CRISPR, uma mistura de proteína Cas9 e guia sintético RNA (sgRNA), complementar ao loci desejado, é microinjetada em embriões estágio pré-blastoderm. Uma vez que as fêmeas C. quinquefasciatus depositam seus ovos em grupos ligados a uma estrutura flutuante de jangada (Figura 1), em oposição à oviposição de ovos individuais, um traço dos mosquitos Aedes e Anopheles, as microinjeções de embriões são cada vez mais complicadas nesta espécie. As larvas culex também emergem do lado anterior de cada ovo, que está em contato com a superfície da água(Figura 1),por isso a orientação de ovos pós manipulação é importante nesta espécie. Aqui descrevemos um protocolo detalhado projetado para a microinjeção da proteína Cas9 e sgRNA em embriões C. quinquefasciatus. Este protocolo foi projetado para acomodar características exclusivas da biologia culex, a fim de melhorar as taxas de sobrevivência de embriões e mutação do genoma através de certas etapas que são fundamentais para a coleta oportuna de ovos e sobrevivência de ovos.
Protocol
1. Criação da colônia quinquefasciatus
- Montou várias colônias de adultos C. quinquefasciatus em gaiolas de dormitórios de insetos.
NOTA: As colônias foram fornecidas pela Dra. Protocolos detalhados para a criação de mosquitos Culex podem ser encontrados em outrasliteraturas 21.- Mantenha os mosquitos a 25 ± 1 °C a 30% de umidade com um ciclo de 12:12 h durante o dia:noturno.
- Forneça 20% de açúcar solução ad libitum introduzindo um recipiente de solução de açúcar com um pavio na gaiola ou saturando bolas de algodão com a solução de açúcar e colocando-o dentro da gaiola.
- Permitir que os mosquitos acasalem por pelo menos 3 dias antes da alimentação sanguínea(Figura 2A).
2. Coleção de embriões estágio pré-blastoderm de C. quinquefasciatus
- Após 3-6 dias após a eclosão, forneça às fêmeas 1-2 mL de uma farinha de sangue bovina citrated através de uma membrana sintética e aquecida a aproximadamente 40 °C em um sistema de alimentação sanguínea(Figura 2B). Existem também protocolos alternativos de alimentação sanguínea que podem ser usados para mosquitos Culex (por exemplo, ver ref21).
NOTA: C. quinquefasciatus é conhecido por uma preferência por sangue aviário. Alguns laboratórios usam aves vivas anestesiadas ou sangue aviário para sua fonte de farinha de sangue21,22,23. No entanto, as colônias podem ser treinadas/selecionadas para se alimentar em sangue bovino ou pequenos roedores se esse recurso for selecionado por várias gerações.- Permitir que as fêmeas descansem por um mínimo de 3 dias após a alimentação sanguínea para se submeterem à oogênese e à maturação dos óvulos antes de induzir a oviposição para experimentos de microinjeção.
- No dia das microinjeções embrionárias, crie um copo de oviposição com água de oviposição infundida organicamente. A água de oviposição deve ser feita fermentando fezes de coelho (50 g/L), grama em decomposição (4,5 g/L) ou alimentos para peixes (25 g/L) em água ao longo de 5 ou mais dias24,25.
- Coloque o copo de oviposição na gaiola e coloque toda a gaiola em um local escuro(Figura 2C).
- Depois de cada 30 minutos, verifique se há jangadas de ovos.
- Se as jangadas de ovos estiverem presentes, colete as jangadas recolhendo-as com um pincel e coloque-as em um papel filtro molhado(Figura 2D,E).
3. Alinhamento dos embriões do estágio pré-blastoderm de C. quinquefasciatus
- Separe os ovos das jangadas pressionando a jangada e provocando os ovos individualmente usando um pincel de ponta fina e fórceps(Figura 2E).
- Alinhe os ovos individuais em uma fina tira de fita adesiva de dois lados colocada na parte superior de uma lâmina de vidro(Figura 2F).
- Ao alinhar, tente apontar o lado anterior de cada ovo na mesma direção para facilitar a acessibilidade.
NOTA: Um método alternativo de alinhamento de ovos sem fita adesiva dupla face pode ser encontrado em um protocolo de microinjeção de embrião nasonia vitripennis publicado anteriormente26. - Cubra os ovos com a mistura de óleo de halocarboneto.
NOTA: A mistura de halocarboneto pode ser preparada com antecedência misturando suavemente dois reagentes de halocarbono e água (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : Água ultrapura) e, em seguida, incubando a mistura durante a noite a 25οC para facilitar a saturação da água do óleo halocarboneto.
4. Preparação da agulha para microinjeções
- Gere as agulhas de vidro capilar aluminossilicato usando um puxador de micropipette de vidro.
- Coloque um vidro capilar aluminossilicato em um puxador de agulha, de acordo com as instruções do manual do usuário do puxador de agulhas.
NOTA: Agulhas capilares de quartzo e borossilicato também podem ser usadas, mas para este experimento, aluminossilicato é preferido devido à sua relativa acessibilidade e durabilidade. - Defina o calor para 516, Velocidade para 100, Atraso para 70, Puxe para 97 e Pressão para 500 no puxador de agulha.
- Ative o puxador de agulha, de acordo com as instruções do puxador e repita conforme necessário para agulhas adicionais.
NOTA: Durante o processo de injeção, as agulhas muitas vezes ficam entupidas ou acidentalmente quebradas, portanto, puxar agulhas adicionais para um único experimento é altamente recomendado.
- Coloque um vidro capilar aluminossilicato em um puxador de agulha, de acordo com as instruções do manual do usuário do puxador de agulhas.
- Coloque a ponta da agulha tocando suavemente a ponta da agulha puxada na placa abrasiva de diamante rotativo por cerca de 10 s em um ângulo de 50°.
NOTA: Chanfrar a agulha abre-a para permitir que o fluido flua ao mesmo tempo criando uma ponta mais nítida para facilitar a penetração no embrião. Um exemplo de agulha adequada pode ser visto em um artigo anterior26. - Armazene agulhas puxadas e chanfradas incorporando-as em linhas de argila do modelador em uma placa de Petri.
NOTA: Para garantir a melhor qualidade para pontas de agulha, as agulhas devem ser recém-puxadas e chanfradas o mais perto possível do tempo de injeção.
5. Carregando a mistura de injeção
- Prepare a mistura de injeção composta por reagentes de modificação de genoma (por exemplo, 200 ng/μL sgRNA e 200 ng/μL Cas9), ou soluções de injeção preferidas e mantê-lo no gelo.
NOTA: Esta mistura pode ser preparada enquanto espera que os ovos sejam colocados. Mais detalhes sobre a produção e preparação do SGRNA para microinjeção podem ser encontrados em publicações anteriores27,28,29,30. - Carregue 2 μL de mistura de injeção na agulha de injeção usando uma ponta de microcarregador.
6. Microinjeção configurada
- Coloque a agulha de injeção preenchida em um micromanipulador configurado ligado a um microinjetor eletrônico.
- Coloque o slide de vidro contendo os ovos alinhados no estágio de um microscópio composto.
- Usando o microscópio micromanipulador e composto, alinhe a agulha para apontar para a extremidade posterior do embrião em um ângulo de 25-35°.
7. Microinjeção de embriões(Figura 2G)
- Insira cuidadosamente a agulha no embrião e injete a mistura em uma quantidade de cerca de 10% do volume do embrião (700-800 pL, dependendo do tamanho dos ovos).
NOTA: Ao injetar, o ovo deve inchar ligeiramente, no entanto, se muito fluido for injetado, os ovos podem estourar ou o fluido citoplasmado pode vazar. - Injete cerca de 20 ovos por vez e pare e realize procedimentos de recuperação de embriões.
NOTA: Durante a injeção, há uma grande chance de agulhas para entupir ou quebrar. Se ocorrer um entupimento, que pode ser determinado pela falta de fluido de injeção que flui através da agulha, tente limpar a agulha com a função limpa no microinjetor eletrônico ou tente reencorar a agulha. Se nenhum dos passos funcionar, mude rapidamente para uma nova agulha, garantindo que os ovos preparados permaneçam umedecidos.
8. Recuperação e eclosão de embriões
- Deixe os ovos imperturbáveis por pelo menos 5 minutos. Dentro de 20 minutos pós-injeção, remova cuidadosamente o óleo de halocarboneto escovando levemente com um pincel limpo(Figura 2H).
- Levante os ovos suavemente usando um pincel e coloque-os em uma xícara de água duplamente destilada(Figura 2I). Tome cuidado para manter os ovos na superfície da água.
- Verifique os ovos diariamente por 7 dias para eclosão(Figura 2J).
- Siga os procedimentos normais de criação de larvas21.
9. Triagem para modificação do genoma
- Triar os mosquitos injetados para os fenótipos mutantes usando um estereoscópio(Figura 2K).
- Verifique mutações que não tenham um fenótipo facilmente reconhecível, por amplificação pcr, ensaio T7 Endonuclease I e sequenciamento por subcloamento da regiãoalvo 31.
- Configure cruzamentos adicionais entre indivíduos injetados para detectar mutações hereiáveis dentro da linha germinal.
Representative Results
Em experimentos publicados anteriormente, este método foi utilizado para gerar mutações somáticas e germinas de um gene crítico para o desenvolvimento da pigmentação do olho escuro, branco (CPIJ005542)30 (Tabela 1). As mutações somáticas geradas pelo CRISPR/Cas9 foram pontuadas pela triagem para perda de pigmentação nos olhos do estágio pupal de indivíduos injetados (G0). Mutações somáticas estavam geralmente presentes como fenótipos de mosaico onde algumas, mas nem todas as células têm o fenótipo mutante. Por exemplo, mutações somáticas do gene branco resultaram em uma mistura de ommatidia com fenótipos que carecem de pigmentação e aqueles com fenótipo pigmentadoselvagem 30. Quando houve uma mutação germinal do gene branco, no entanto, a próxima geração (G1) herdou o fenótipo de olhos brancos completos. As taxas de mutação germinal foram determinadas por meio de indivíduos do mosaico G0 e pontuação para descendentes de olhos completamente brancos (G1). Esses experimentos resultaram em uma taxa de sobrevivência de 64% a 82% em embriões, bem como uma taxa de mutagênese somática de 37% a 57% e uma taxa de mutagênese germinada de >61%(Tabela 1). Ao multiplexar sgRNAs para atingir múltiplos loci no mesmo gene, as taxas de mutagênese somática e germinal aumentaram para cima para até 86%(Tabela 1). Além disso, por muitas gerações, estoques homozigos viáveis dos mutantes brancos foram mantidos com sucesso no laboratório.
Figura 1: Jangada de ovos C. quinquefasciatus e morfologia de ovo único.
Dorsal (A), lateral (B), e ventral (C) vistas de jangadas de ovos C quinquefasciatus. C. as fêmeas quinquefasciatus colocam seus ovos com o lado anterior mais bulboso tocando a superfície da água enquanto o posterior mais apontado para longe da superfície da água(D). A- anterior; P-posterior Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Linha do tempo para criar mutantes C. quinquefasciatus por microinjeção.
Linha do tempo de preparação da colônia C. quinquefasciatus e coleta de embriões para microinjeção(A-D). Os ovos coletados são então separados(E)alinhados na mesma orientação e cobertos com óleo de halocarbono(F). Os ovos são então injetados(G) e permitidos descansar por um mínimo de 5 minutos antes de remover o óleo de halocarboneto(H). Os ovos são então transferidos para uma fonte de água limpa(I) para eclosão(J) e rastreados para fenótipos mutantes(K). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sobrevivência | Mosaico somático (G0) | Mutagênese germinal (G1) | ||||||
| sgRNA | #injected | ♂ | ♀ | Total (%) | ♂ | ♀ | Total (%) | G1 mutantes (%) |
| wsgRNA-1 | 50 | 15 | 20 | 35(70) | 7(47) | 13(65) | 20(57) | 128(69) |
| wsgRNA-2 | 50 | 9 | 32 | 41(82) | 3(33) | 12(38) | 15(37) | 51(61) |
| wsgRNA-3 | 50 | 17 | 15 | 32(64) | 7(41) | 8(53) | 15(47) | 157(72) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2 | 50 | 7 | 16 | 23(46) | 5(71) | 12(75) | 17(74) | 123(79) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-3 | 50 | 13 | 9 | 22(44) | 10(77) | 6(67) | 16(73) | 72(81) |
| wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 17 | 10 | 27(54) | 13(76) | 8(80) | 21(78) | 101(85) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 11 | 10 | 21(42) | 9(82) | 9(90) | 18(86) | 149(86) |
Tabela 1: Taxas de sobrevivência e mutação de embriões injetados com gRNAs únicas e multiplexadas visando o branco. A tabela é reimpressa com permissão de30
Discussion
Com os recentes esforços para gerar ferramentas geneticamente modificadas para o controle de vetores de mosquitos, há a necessidade de desenvolver e otimizar protocolos de microinjeção de embriões para vetores comuns de doenças de mosquitos. Embora métodos tenham sido desenvolvidos para mosquitos Aedes e Anopheles, um protocolo projetado especificamente para Culex foi minimamente explorado. Em geral, os protocolos gerais de injeção de embriões de mosquitos podem ser divididos em 3 etapas gerais: 1) coleta e preparação de embriões, 2) injeção de embriões e 3) recuperação pós-injeção. Para gerar mutantes com sucesso, todas as três etapas devem ser otimizadas para as espécies-alvo. Este protocolo modificado para microinjeção de embriões é específico para a engenharia de genomas bem sucedidas de mosquitos Culex.
Maximizar a coleta de embriões é um gargalo comum nos protocolos de microinjeção de embriões. Para aumentar o número de ovos coletados em um curto período de tempo, os mosquitos foram restringidos de um substrato de oviposição por 2-3 dias após a refeição sanguínea. É importante notar que C. quinquefasciatus tendem a preferir fontes de sangue aviária em oposição a fontes de mamíferos ou membranas que se alimentam com sangue de mamíferos. No entanto, muitos pesquisadores têm dificuldade em adquirir uma fonte confiável de aviários vivos ou sangue aviário para alimentação sanguínea, de modo que os estoques de laboratório podem ser adaptados para se alimentar de fontes de sangue mais acessíveis. Também é crucial usar água rica em nutrientes para o substrato de oviposição, pois fornece pistas de oviposition para C. quinquefasciatus e a maioria dos outros vetores Culex. Existem muitos métodos para gerar água rica em nutrientes, que podem precisar ser otimizados entre laboratórios para garantir que um número adequado de ovos esteja disponível para microinjeção. Por exemplo, enquanto este método foi o mais bem sucedido com fezes de coelho fermentadas em água desionizada por 5 ou mais dias, outros pesquisadores têm mais sucesso com a grama ou alimentos de peixe como fonte de nutrientes e alguns até mesmo com água destilada21.
Uma vez que os mosquitos Culex colocam grupos de ovos em jangadas, coletar ovos é bastante simples. Os ovos podem simplesmente ser coletados recolhendo toda a jangada com um pincel. A separação do ovo é mais complicada, mas essencial para a injeção bem sucedida. Os ovos podem ser cuidadosamente separados da jangada aplicando uma pressão suave para baixo entre os ovos com pincel ou fórceps. Com alguma prática, vários usuários foram capazes de separar ovos únicos de jangadas de ovos. Após a separação de cada ovo, os ovos são alinhados na mesma orientação em fita adesiva de dois lados, que estabiliza os ovos durante a microinjeção. Os ovos são injetados na extremidade posterior afilada e a adição de óleo de halocarboneto mantém os ovos úmidos durante a manipulação.
Para limitar os danos embriões durante a microinjeção, as agulhas de injeção precisam ser de força adequada e chanfradas em um ângulo apropriado. Agulhas de aluminossilicato chanfradas por 10 segundos em um ângulo de 50° tiveram os melhores resultados, mas agulhas de borossilicato e quartzo também podem funcionar, mesmo que possam ser menos duráveis e mais caras. Além disso, o chanfrado adequado da agulha facilita o melhor fluxo das misturas Cas9 e sgRNA e cria um ponto mais acentuado para uma penetração mais fácil no embrião. Em muitos casos, o chanfrado também é uma maneira eficiente de corrigir rapidamente agulhas entupidas em vez de gastar o tempo e o esforço para substituir agulhas entupidas.
Após a injeção, os ovos devem permanecer imperturbáveis por pelo menos 5 minutos, com o óleo de halocarboneto sendo removido imediatamente depois, escovando-o suavemente com um pincel limpo. Após a remoção do óleo de halocarboneto, os ovos injetados podem ser colocados na água para eclodir, o que normalmente ocorre dentro de 3 dias após a injeção. Com a prática e o número suficiente de ovos, este protocolo pode alcançar mutações somáticas e germinas consistentes em C. quinquefasciatus e é versátil o suficiente para que ele seja facilmente adaptável a outros mosquitos Culex.
Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por fundos de startup da UCSD direcionados à O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
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