Summary
Denne live-bakterielle celleavbildningsprotokollen muliggjør visualisering av interaksjoner mellom flere bakterielle arter på encellenivå over tid. Time-lapse imaging gjør det mulig for observasjon av hver bakteriell art i monokultur eller kokultur for å avhøre interspecies interaksjoner i multispecies bakterielle samfunn, inkludert individuelle cellemotilitet og levedyktighet.
Abstract
Polymikrobielle samfunn er allestedsnærværende i naturen, men å studere deres interaksjoner på encellenivå er vanskelig. Dermed er en mikroskopibasert metode utviklet for å observere interspecies interaksjoner mellom to bakterielle patogener. Bruken av denne metoden for å avhøre interaksjoner mellom et motilt Gram-negativt patogen, Pseudomonas aeruginosa og et ikke-motilt Gram-positivt patogen, er Staphylococcus aureus demonstrert her. Denne protokollen består av å co-inokulere hver art mellom en coverslip og en agarose pad, som opprettholder cellene i et enkelt plan og tillater visualisering av bakteriell atferd i både rom og tid.
Videre er time-lapse mikroskopi demonstrert her ideell for å visualisere de tidlige interaksjonene som finner sted mellom to eller flere bakterielle arter, inkludert endringer i bakterielle arter motilitet i monokultur og i kokultur med andre arter. På grunn av arten av det begrensede utvalgsrommet i mikroskopioppsettet, er denne protokollen mindre gjeldende for å studere senere interaksjoner mellom bakterielle arter når cellepopulasjonene er for høye. Det finnes imidlertid flere forskjellige anvendelser av protokollen som inkluderer bruk av farging for avbildning av levende og døde bakterielle celler, kvantifisering av gen- eller proteinuttrykk gjennom fluorescerende journalister, og sporing av bakteriell cellebevegelse i både enkeltarter og multispecies eksperimenter.
Introduction
Polymikrobielle samfunn er vanlige i naturen, som strekker seg over en rekke miljømessige1,,2,,3 og menneskelige nisjer4,5. Noen av de mest beryktede polymikrobielle infeksjonene i menneskelig sykdom inkluderer tannbiofilmer6,kroniskesår 7,,8og luftveisinfeksjoner hos personer med kronisk obstruktiv lungesykdom9, ventilator-assosiert lungebetennelse10, og den genetiske sykdommen cystisk fibrose (CF)11,12. Disse infeksjonene består ofte av ulike mikrobielle arter; Imidlertid har et nylig fokus på samspillet mellom den Gram-positive bakterien Staphylococcus aureus og Gram-negative bakterien Pseudomonas aeruginosa dukket opp. Studier inkludert pasienter som er sammenfvelt med disse organismene og in vitro-analysene, viser både konkurransedyktige og samarbeidende interaksjoner som kan ha dype og uventede påvirkninger på sykdomsprogresjon, mikrobiell overlevelse, virulens, metabolisme og antibiotikafølsomhet (gjennomgått i detalj av Hotterbeekx et al. 201713 og Limoli og Hoffman 20193).
Den økende interessen for interspecies interaksjoner under infeksjon har gitt en rekke metoder for å studere polymikrobiell samfunnsatferd. Vanligvis har disse studiene benyttet plate- eller buljongbaserte analyser for å undersøke fenotypiske forskjeller mellom monokultur og kokultur. For eksempel har koculturing P. aeruginosa og S. aureus på faste overflater tillatt for visualisering av veksthemming eller endringer i kolonifenotype, pigment eller polysakkaridproduksjon14,,15,,16. Biofilmer av blandede arter, på biotiske eller abiotiske overflater, samt koculturing bakterielle arter i flytende kultur har også gjort det mulig å måle endringer i vekst, metabolisme, antibiotikatoleranse, konkurranse og levedyktighet, i tillegg til gen- og proteinuttrykk17,18. Mens disse bulk kultureksperimentene har avslørt innsikt i hvordan P. aeruginosa og S. aureus kan påvirke hverandre på samfunnsskalaen, kan de ikke svare på viktige spørsmål om interaksjonene som finner sted på encellenivå. Metoden som presenteres her legger til tilnærmingene for å studere interspecies interaksjoner ved å fokusere på endringene i bevegelse, celle levedyktighet, og genuttrykk av enkeltceller i et kokulturert samfunn over tid.
Encellede interaksjoner kan avvike fra interaksjonene som finner sted i et bulkfellesskap av celler. Gjennom encelleanalyse kan heterogenitet i et samfunn kvantifiseres for å studere hvordan romlig plassering av celler påvirker samfunnsdynamikken eller hvordan gen- og proteinuttrykksnivåer endres i individuelle medlemmer av en gruppe. Sporing av celler kan også gi innsikt i hvordan enkeltceller beveger seg og oppfører seg over tid, gjennom flere generasjoner. Ved å spore cellebevegelse og endringer i genuttrykk samtidig, kan det gjøres korrelasjoner mellom gensvingninger og tilsvarende fenotyper. Tidligere protokoller for å studere individuelle bakterielle arter på encellenivå er beskrevet. Disse studiene dra nytte av live-imaging celler over tid i et enkelt plan, og har vært nyttig for å observere fenotyper som celledeling og antibiotikamottakelighet 19,20. Ytterligere live-imaging mikroskopi har blitt benyttet til å overvåke vekst, motilitet, overflatekolonisering og biofilm dannelse av enkelt bakteriellearter 21,,22,,23. Men mens disse studiene har vært innsiktsfulle for å forstå fysiologien til bakterier i monokultur, er eksperimenter for å observere encellede atferd av flere bakterielle arter over tid i kokultur begrenset.
Her er tidligere protokoller som brukes for enkeltartsavbildning tilpasset studieinteraksjoner mellom P. aeruginosa og S. aureus. Disse organismene kan differensieres under fasekontrast basert på deres cellemorfologier (P. aeruginosa er bacilli og S. aureus er cocci). Utvikling av denne metoden nylig aktivert visualisering av tidligere ubeskrevet motilitet atferd av P. aeruginosa i nærvær av S. aureus24. P. aeruginosa ble funnet å være i stand til å føle S. aureus på avstand og reagere med økt og retningsbestemte encellebevegelser mot klynger av S. aureusceller. P. aeruginosa bevegelse mot S. aureus ble funnet å kreve typen IV pili (TFP), hårlignende projeksjoner hvis koordinert forlengelse og tilbaketrekking genererer en bevegelse kalt rykninger motilitet25.
Disse studiene viser nytten av denne metoden for avhør av tidligere interaksjoner mellom arter. Bildebehandling ved høycelletetthet ved senere interaksjonstidspunkter er imidlertid vanskelig gitt at enkeltlag med celler ikke lenger kan identifiseres, noe som for det meste utgjør problemer under analyse etter bildebehandling. Gitt denne begrensningen er metoden best egnet for tidligere interaksjoner som deretter kan følges opp med tradisjonelle makroskopiske analyser ved høyere celletettheter som er representative for senere interaksjoner. Ytterligere begrensninger av denne metoden inkluderer lav gjennomstrømmingsnatur, siden bare en prøve kan avbildes om gangen og kostnaden for mikroskopet, kameraet og miljøkammeret. Videre utgjør fluorescensmikroskopi risiko for bakteriecellene som fototoksisitet og fotobleaching, og begrenser derfor frekvensen som fluorescensbilder kan anskaffes. Til slutt er agarose pads som brukes i denne metoden svært utsatt for endringer i miljøet, noe som gjør det avgjørende for å kontrollere for forhold som temperatur og fuktighet, gitt at putene kan begynne å krympe eller utvide hvis forholdene ikke er riktige. Til slutt, mens denne metoden ikke etterligner vertsmiljøet, gir den ledetråder for hvordan forskjellige bakterielle arter reagerer på overflater, som kan følges opp i analyser designet for å etterligne miljø / vertsforhold.
Denne metoden er forskjellig fra tidligere studier som sporer encellede bevegelser, ved at cellene er inokulert mellom en coverslip og agarose pad, som begrenser celler til overflaten. Dette gjør det mulig for cellesporing over tid i ett enkelt plan; Begrenser imidlertid sykluser av forbigående overflateengasjement observert når celler er nedsenket i væske26. En ekstra fordel med å bilde bakterier under en agarose pad er at den etterligner makroskopisk platebaserte sub-overflate inokulasjonsanalyser klassisk brukes til å undersøke P. aeruginosa rykninger motilitet25. I denne analysen er bakterielle celler inokulert mellom bunnen av en petriskål og agaren, og holder cellene i et enkelt plan når de beveger seg over bunnen av parabolen utover fra inokulasjonspunktet, mye som denne mikroskopiprotokollen.
Time-lapse mikroskopi protokollen for visualisering av interspecies interaksjoner presentert her består av 1) forbereder bakteriell prøve og agarose pad, 2) velge mikroskop innstillinger for imaging oppkjøp og 3) etter bildebehandling analyse. Detaljert visualisering av cellebevegelse og sporing kan utføres ved oppkjøp av bilder med korte tidsintervaller etter fasekontrast. Fluorescensmikroskopi kan også brukes til å bestemme cellelevabilitet eller genuttrykk over tid. Her viser vi ett eksempel på tilpasning for fluorescensmikroskopi gjennom tilsetning av levedyktighetsfargestoffer til agarose pads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: En fullstendig beskrivelse og katalognumre for alle forsyninger i denne protokollen finnes i Materials tabell.
1. Tilberedning av M8T minimalt medium
- Forbered 1 L M8 minimal saltbase (5x) ved å oppløse 64 g Na2HPO4·7H2O, 15 g KH2PO4og 2,5 g NaCl i 800 ml ultrarent vann (UPW, resistivitet 18 MΩ/cm) i en 2 L flaske. pH til 7,6. Fullfør volumet til 1 L med UPW. Autoklav i 45 min.
- Forbered 500 ml glukoseoppløsning (20 % w/v) ved å oppløse 100 g glukose i 400 ml UPW i en 1 L flaske. Komplett løsning til 500 ml med UPW. Autoklav i 45 min.
- Forbered 500 ml tryptonløsning (20 % w/v) ved å oppløse 100 g trypton i 400 ml UPW. Fullfør til 500 ml med UPW. Autoklav i 45 min.
- Forbered 1 L M8 + 10% tryptone (M8T) minimalt medium ved å tilsette 200 ml 5x M8 minimalsalter (1x endelig), 10 ml 20% glukose (1x endelig), 10 ml 20% glukose (1x endelig), 10 ml 20% glukose (1x finale), 10 ml 20% glukose (1x finale), 10 ml 20% glukose (1x finale), 10 ml 20% glukose (1x finale), 10 ml 20% glukose (1x finale), 10 ml 20% glukose (1x finale), 10 ml 20% glukose ( 0,2 % endelig), 1 ml 1 M MgSO4 (1 mM-finale) og 50 ml med 20 % trypton (1 % endelig) til 600 ml UPW. Fullfør til 1 L med UPW. Filtrer gjennom et 0,2 μm sterilt filter i en steril 500 ml medieoppbevaringsflaske.
Dag 1:
2. Utarbeidelse av bakterielle overnattingskulturer
- Inokuler 5 ml M8T minimalt medium med en enkelt koloni P. aeruginosa eller S. aureus (inkludert antibiotika når det er hensiktsmessig) og inkuber over natten ved 37 °C med lufting i ikke mer enn 16 timer.
MERK: Bakteriepatogenene P. aeruginosa og S. aureus ble brukt til denne metoden, fordi de ofte er koisolert fra kroniske infeksjoner, og det er viktig å studere deres interaksjoner for å forstå hvordan de bidrar til pasientutfall under polymikrobielle infeksjoner. Andre bakterielle arter kan brukes avhengig av studiets fokus.
Dag 2:
3. Subkultur av bakterielle stammer
- Subkultur P. aeruginosa 1:500 og S. aureus 1:1000 i 5 ml frisk M8T (inkluderer antibiotika når det er hensiktsmessig). Inkuber med lufting ved 37 °C til kulturer når midtloggfasen (OD600 = ~0,3 - 0,5).
4. Utarbeidelse av materialer for pad former
- Forbered metallspateler ved å varme opp enden av en flat, avrundet laboratoriespatel med en Bunsen-brenner til halvparten av den flate enden kan bøyes til en 90° vinkel. Varm enden av en annen flat, avrundet laboratoriespatel og bøy de siste 10 mm til en 45 °C vinkel.
- Klipp av de fire hjørnene av silikonformene slik at formene passer inn i en 35 mm tallerken.
- Steriliser slikkepottene og et par pinsett ved å legge til 70% etanol og passere dem gjennom flammen til Bunsen-brenneren.
- Rengjør parabolen og silikonformene med 70 % etanol og tørk dem med lofrie kluter.
5. Fremstilling av agarose pads
MERK: Putene er utarbeidet med M8T minimalt media som næringskilde for bakteriene som brukes i denne protokollen. Næringsstoffene som brukes i pads kan imidlertid endres for forskjellige organismer.
- Smelt 2% lavsmeltede oppsto i 10 ml M8T i en ren 50 ml Erlenmeyer kolbe. Mikrobølgeovn i korte intervaller (2-5 s) til agarose er i oppløsning for å hindre at innholdet i kolben koker over. Når smeltet, la avkjøles i et 50 ° C vannbad i minst 15 min.
- Forbered formene ved å justere silikonutskjæringen med åpningen i 35 mm parabolen og trykk lett med slikkepott for å feste silikonen til parabolen, og for å fjerne alle luftbobler mellom formen og parabolen.
- Når den er avkjølt, ble pipetten 915 μL smeltet agarose inn i formen. La lokket stå på gløtt og la puten tørke ved romtemperatur i 30 min.
- Dekk fatet med lokket og la det stå ved romtemperatur i ytterligere 2 timer.
- Forbered fuktighetsservietter ved å rulle opp en lofri klut tett. Plasser den rullede tørken inne i en steril petriskål og tilsett jevnt 500 μL sterilt vann over tørkingen. Varm til 37 °C i 1 time.
- Varm puten og en steril 35 mm tallerken til 37 °C i 1 time.
6. Fremstilling av bakterielle celler og inokuserende pads
- Mål OD600 av hver subkultur og fortynne P. aeruginosa til en OD600 = 0,03 og S. aureus til en OD600 = 0,10 i M8T forutfor til 37 °C. Bland P. aeruginosa og S. aureus i et 1:1-forhold og virvel.
MERK: Hvis stammer krever antibiotika, kan antibiotika legges til overnatting og subkultur, men bør ikke legges til når du blander arter for avbildning hvis det påvirker de andre artene i kokulturen. Plasmid stabilitet og effekten av antibiotika på alle arter i kokulturen må bestemmes for hver organisme / plasmid som brukes. - Pipette 1 μL kokultur jevnt over bunnen av en forvarmet, steril 35 mm glassdekslersoppfat.
- Fjern silikonutskjæringen fra formen ved hjelp av sterile pinsett.
- Fjern puten fra fatet ved hjelp av sterile slikkepoler.
- Sett den litt bøyde slikkepotten under kanten av puten, mens du holder formen opp ned, for å slippe den ut på et sterilt Petri platelokk.
MERK: Vær forsiktig så du ikke tvinger puten ut, ellers den. Hold oversikt over hvilken side av puten som er bunnen.
- Sett den litt bøyde slikkepotten under kanten av puten, mens du holder formen opp ned, for å slippe den ut på et sterilt Petri platelokk.
- Overfør puten til fatet med bakteriecellene, nedenfra og ned, ved å skyve den 90° vinklede slikkepotten under puten og plassere den på toppen av den inokulerte dekkslippen. Bruk den 90° vinklede slikkepotten til å gjøre puten flush mot dekkslippen og trykk forsiktig ut eventuelle luftbobler.
- Fjern overflødig fuktighet fra fuktige kluter og plasser deretter rundt kanten av parabolen, og pass på at den ikke berører puten. Prøven er nå klar for bildebehandling.
7. Sette opp mikroskopet for levende bildebehandling
- Varmt miljøkammer til 37 °C minst 2 timer før eksperimentelt oppsett.
- Slå på alle komponenter, inkludert mikroskop, datamaskin og lyskilder for brightfield og fluorescens imaging.
- Åpne bildeprogramvaren, og kontroller at lyskildene er tilkoblet og i gang.
- Utfør Köhler-belysning27 for å justere alle bildeplan.
- Først må du fokusere merket dekkslip med et 20x mål ved hjelp av en "dummy" tallerken. Kontroller at kondensatortårnet er satt til "åpen" posisjon.
MERK: Köhler-belysning bør utføres for hvert unike mål/prøve for å justere bildeplanene på riktig måte. Fokus og justering med "dummy" parabolen på lavere forstørrelse fremskynder oppsett på levende prøver ved høyere forstørrelse for å begrense tiden mellom oppsett og eksperiment starttid. - Fokuser kondensatoren.
- Lukk feltmembranen.
MERK: En åttekantformet blenderåpning skal vises. Hvis kondensatoren er helt ute av fokus, vises hele synsfeltet (FOV) mørkt. - Drei kondensatorfokusknappene til oktogagonkantene er skarpe.
MERK: Lysintensiteten vil øke etter hvert som bildeplanene nærmer seg riktig justering.
- Lukk feltmembranen.
- Juster kondensatoren.
- Midtstill feltkondensatoren ved å justere justeringsknottene.
MERK: Octagonen skal være sentrert til midten av FOV. Justeringsknottene varierer avhengig av mikroskopet. For eksempel har noen mikroskopkondensatorer knotter, mens andre har skruer som krever en skrutrekker.
- Midtstill feltkondensatoren ved å justere justeringsknottene.
- Fokuser lampefilamentet og juster kondensatoråpningen.
- Plasser et faseteleskop eller Bertrand-objektiv i lysbanen for å observere målets midtfokalplan.
MERK: Det skal være to konsentriske sirkler. - Vri Bertrand-objektivfokusknappen til ringene ser skarpe ut.
- Fjern Bertrand-linsen fra lysbanen.
- Plasser et faseteleskop eller Bertrand-objektiv i lysbanen for å observere målets midtfokalplan.
- Åpne feltmembranen til octagon er like utenfor FOV.
- Bytt til 100x-målet og skyv den matchende faseringen på plass før du legger til en dråpe nedsenkingsolje, og plasser den tilberedte prøvefatet på toppen.
- Utfør Köhler-belysning på 100x-målet med bakterieprøven.
- Først må du fokusere merket dekkslip med et 20x mål ved hjelp av en "dummy" tallerken. Kontroller at kondensatortårnet er satt til "åpen" posisjon.
- Fokuser bare på bakteriene ved hjelp av finjustering. Når bakteriene i FOV er fokusert gjennom okularet, bytter du lysbanen til kameraet ved å trykke på kameraknappen på mikroskopet.
- Klikk alternativet Fase i bildebehandlingsprogramvaren.
- Juster prosentandelen av DIA LED-lys som sendes ut ved å velge lyskilden i programvaren og enten manuelt angi ønsket prosentandel av lys som skal brukes eller skyve linjen på lysprosentskalaen.
- Juster DIA LED-lyseksponeringstiden ved å klikke på lyskilden og enten angi ønsket eksponeringstid manuelt eller velge en eksponeringstid fra den medfølgende rullegardinmenyen.
MERK: Eksponeringstiden vil variere avhengig av kameraet som brukes. - Hvis du bruker fluorescens, justerer du kamerainnstillingene i hver tilsvarende kanal (det vil si TxRed, GFP), ved å klikke på den fluorescerende interessekanalen.
- Still inn prosentandelen av fluorescenslys som slippes ut, og juster deretter eksponeringstiden (som angitt i trinn 7.7 og 7.8 for DIA LED-lys).
- Du kan også endre bitdybden for å justere det dynamiske området ved å velge ett av de andre bitdybdealternativene i rullegardinmenyen visualiseringskontroll.
- Velg XY-posisjonene av interesse ved å klikke på XY-alternativet i menyen anskaffelseskontroll.
- Flytt sceneposisjonen med gledespinnen, eller ved å klikke og dra FOV på skjermen, og klikk på den tomme boksen for å lagre X- og Y-koordinatene til en bestemt posisjon.
MERK: Valg av ikke mer enn tre forskjellige XY-posisjoner, så tett sammen som mulig, anbefales for tidsforløp.
- Flytt sceneposisjonen med gledespinnen, eller ved å klikke og dra FOV på skjermen, og klikk på den tomme boksen for å lagre X- og Y-koordinatene til en bestemt posisjon.
- Slå på det perfekte fokussystemet (PFS) ved enten å klikke på PFS-boksen i kategorien XY på oppkjøpskontrollmenyen eller trykke på PFS-knappen på joy stick-kontrollpanelet.
- Roter de fine justeringsknottene for å fokusere på bakteriecellene.
- Klikk PFS-knappen for hver XY-posisjon, når cellene er i ønsket fokusplan.
MERK: PFS kompenserer for drift i Z-aksen under tidsforløpseksperimenter. Dette er nødvendig for å opprettholde fokus på bakterielle celler over tid. Ulike produsenter har forskjellige kompensasjonssystemer. - Velg bildeanskaffelsesforholdene, inkludert anskaffelsesintervall og frekvens for hver kanal (f.eks. fasekontrast og hver fluorofor) ved å velge fra alternativene i menyen for anskaffelseskontroll.
MERK: For eksperimentene som presenteres her, er fasekontrastbilder anskaffet med intervaller hver 5-10 s mens fluorescensbilder i GFP- og TxRed-kanalene anskaffes hvert 20. - Begynn å bilde av når mikroskopet og anskaffelsesinnstillingene er konfigurert.
8. Valgfritt: Modifikasjoner for levende / død bildebehandling
- Smelt 2% oppsto i 10 ml M8T og la avkjøles i 50 ° C vannbad i minst 15 min.
- Tilsett 1 mM propidiumjodid til smeltet agarose.
- Når den er avkjølt, pipette 915 μL av agarose i den tilberedte formen.
- La lokket stå på gløtt og la puten tørke ved romtemperatur i 30 min. Beskytt mot lys.
- Dekk fatet med lokket og la det stå ved romtemperatur i ytterligere 2 timer.
- Forbered fuktighetsservietter.
- Rull et lofritt papir godt.
- Legg tørken i en steril petriskål og tilsett 500 μL sterilt vann til tørkingen.
- Inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Inkuber puten og en steril 35 mm fat rett ved 37 °C i 1 time.
- Fortsett å inokulere parabolen som angitt i avsnitt 6: Tilberedning av bakterielle celler og inokuserende pads.
9. Dataanalyse
- Identifikasjon av celler
- Åpne bildefilen i bildebehandlingsprogramvaren og beskjær filen for å bare inkludere rammene som skal brukes til sporing, zoomet inn i cellene av interesse, og bare i fasekontrastkanalen.
MERK: Den beskårne filen kan lagres som en ny fil der sporingsdata kan lagres uten å forstyrre den opprinnelige filen. - Velg alternativet for å velge områder av interesse (ROI) i analysekontrollmenyen og definere ROIer ved å spore enten individuelle bakterielle celler eller klynger av celler i den første rammen som skal brukes til analyse.
MERK: ROIene kan enten defineres manuelt eller som binærfiler.- Definere avkastning manuelt
- Spor omkretsen av hver enkelt bakteriell celle eller klynger av celler for å definere ROIene manuelt.
MERK: I analyseprogramvaren kan P. aeruginosaeller andre stangformede celler spores manuelt ved å velge Ellipse ROI og tegne en ellipse justert til størrelsen på bakteriecellen. Alternativt kan alternativet Polygon ROI velges for å spore ikke-tradisjonelle-formede ROIer, for eksempel klynger av celler.
- Spor omkretsen av hver enkelt bakteriell celle eller klynger av celler for å definere ROIene manuelt.
- Identifisere binære ROM-er
- Klikk alternativet Binær til avkastning for å definere binære ROIer.
MERK: Objekter defineres i et binært lag basert på separasjon av de mørkere pikselerte bakteriecellene fra den lettere pikselerte bakgrunnen i fasekontrastkanalen. - Hvis du vil terskele cellene, velger du Terskel-alternativet i analysekontrollmenyen. Velg interessekanalen, og skyv stolpene i fluorescens histogrammet for å justere terskelintervallverdiene.
MERK: Binær objektidentifikasjon for ROIer kan også defineres i fluorescerende bilder ved å terskele bakteriecellene. Terskeling fastslår hvilke fluorescensintensiteter som anses som objekter og hvilke fluorescensintensiteter som utgjør bakgrunnen.
- Klikk alternativet Binær til avkastning for å definere binære ROIer.
- Definere avkastning manuelt
- Åpne bildefilen i bildebehandlingsprogramvaren og beskjær filen for å bare inkludere rammene som skal brukes til sporing, zoomet inn i cellene av interesse, og bare i fasekontrastkanalen.
- Cellesporing
- Hvis du vil spore ROIer manuelt, merker du neste bilderamme i bildesekvensen og justerer plasseringen av ROIene ved å klikke og dra hver avkastning for å justere etter den nye plasseringen til den opprinnelige bakteriecellen.
MERK: Hvis bakteriecellene ikke har endret posisjon, trenger ikke ROIene flyttes. - Gjenta i alle sekvensielle rammer som celler skal spores for.
- Når celler deler seg, definerer du dattercellene som nye ROIer, som beskrevet i trinn 9.1, og begynner å spore de nylig delte cellene.
MERK: Hvis celler identifiseres som binærfiler, bruker du funksjonen Spor binærfiler til å spore ROIer automatisk i valgte rammer. - Når celler er sporet gjennom alle valgte rammer, eksporterer du dataene som skal analyseres.
- Åpne dataregnearket og identifiser målene som kreves for analyse (det vil vil vil at objekthastighet, akselerasjon eller banelengde).
MERK: Når det gjelder målestyrthet, kreves banelengde- og linjelengdemålingene. Linjelengden er en måling av euklidisk avstand, eller den rette avstanden fra sporopprinnelsen til kanten av S. aureuskolonien. Banelengden er et mål på den akkumulerte avstanden, eller summen av sporsegmenter fra alle rammer. Directedness kan beregnes som et forhold mellom euklidisk avstand, D(E), (linjelengde), over den akkumulerte avstanden, D(A), (Banelengde).
- Hvis du vil spore ROIer manuelt, merker du neste bilderamme i bildesekvensen og justerer plasseringen av ROIene ved å klikke og dra hver avkastning for å justere etter den nye plasseringen til den opprinnelige bakteriecellen.
- Fluorescens kvantifisering
- Definer ROIer for fluorescerende bakterieceller som beskrevet i trinn 9.1.
- Gjenta sporing eller bevegelse av ROIer for bakterielle celler eller klynger i de gjenværende fluorescerende rammene.
- Eksporter den genererte tabellen til en regnearkfil for analyse av fluorescerende intensitet.
- I dataregnearket ser du etter kolonnen med "Gjennomsnittlig intensitet" som representerer den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten for den sporede bakteriecellen(e) avkastningen.
- Grafer gjennomsnittsintensitetsverdiene for å se på endringene i fluorescens over tid.
MERK: Endringene i fluorescens over tid representerer svingningene i genuttrykket for det fluorescerende merkede genet av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket bruk av den beskrevne metoden vil resultere i en rekke rammer som genererer en video der interspecies interaksjoner kan observeres over tid. Skjematisk i figur 1 gir et visualobjekt for å utheve de viktigste trinnene som er involvert i å forberede materialer for bildebehandling. Bruk av denne metoden har tillatt demonstrasjon av P. aeruginosa celler som viser forskjellig atferd i monokultur versus i kokultur med S. aureus. Sammenlignet med P. aeruginosa celler i monokultur som forblir gruppert i flåter, når i coculture med S. aureus, P. aeruginosa har økt encellede motilitet mot S. aureus kolonier (Figur 2A-2B). Fluorescerende merkede bakterielle stammer tillater også visualisering av blandede populasjoner av bakterielle arter. Ved hjelp av GFP-merket P. aeruginosa tillot observasjonen at etter P. aeruginosa enkeltceller øke i motilitet, vil de omgi og til slutt invadere S. aureus kolonier (Figur 2C). Utnyttelse av fluorescerende merkede celler tillater også visualisering av P. aeruginosa celleinvasjon i S. aureus kolonier for første gang (Figur 2C, bunn).
Selv om protokollen gir bilder av høy kvalitet for å observere interspecies interaksjoner, er det flere vanlige problemer som kan føre til rammesekvenser av dårlig kvalitet. Inkonsekvent fuktighet over hele eksperimentets varighet og feil tørkede pads er to vanlige problemer som fører til drift som følge av puten som skifter og drar cellene med den ut av FOV (figur 3A). Endringer i fuktighet påvirker tørrheten av agarose pads. Økt fuktighet gjør putene for våte, slik at fuktighet kan bosette seg mellom puten og bunnen av glassbunnsfatet. Fuktigheten etterlater et lag med væske tykk nok til at motile celler kan sverme eller svømme gjennom og holder ikke bakterielle celler i et enkelt plan. I mellomtiden tørker i fuktighet ut puten raskere, noe som fører til at cellene driver tidlig. En annen vanlig feil når du bruker denne metoden med fluorescens er å skaffe fluorescerende bilder for ofte eller utsette bakterielle celler for fluorescerende lys for lenge. Korte oppkjøpsintervaller for fluorescerende bilder opphisser gjentatte ganger fluoroforer med høyintensitetslys av en bestemt bølgelengde. Spente fluoroforer reagerer deretter med oksygen, noe som forårsaker nedbrytning av fluorofor. Den resulterende fotobleaching depletes fluorescens til mer av fluorofor kan uttrykkes og brettes, men skader ikke bakteriecellene selv (Figur 3B). Tap av fluorescens forstyrrer imidlertid målinger av gen/proteinuttrykk, slik at cellene er markørløse til fluoroforen kan syntetiseres og begeistres fullt ut igjen. Videre kan oksygenet som samhandler med spente fluoroforer danne reaktive oksygenarter (ROS). Disse ROS radikaler deretter skade bakterielle celler, til slutt blir giftig og resulterer i celledød i noen få celledelinger (Figur 3C). Prosessene med fotobleking og fototoksisitet kan lett ses som celler vil først miste sin fluorescens helt, og i etterfølgende rammer vil cellene slutte å dele og kan til slutt dø (Figur 3B-3C). Et siste vanlig problem når du konfigurerer eksperimentet starter med for mange celler per FOV eller med celler for nær hverandre, som vanligvis er mindre enn 20 μm fra hverandre. Overfylte celler i den første rammen vil gi klynger av å dele celler som bare fusjonerer inn i hverandre etter hvert som de vokser i stedet for å samhandle. I tillegg kan celler som begynner for nær i nærheten ikke ha tilstrekkelig tid til å etablere en gradient av utskillede signaler som de andre artene kan reagere på (figur 3D), mens fjerne bakterielle celler kanskje ikke har mulighet til å møte hverandre i løpet av eksperimentet.
Figur 4 viser et eksempel på hvordan bakteriell celle levedyktighet kan visualiseres med denne protokollen ved å legge propidiumjodid til agarose pads. Propidiumjodid er ugjennomtrengelig for levende celler, men kan komme inn i celler med skadede membraner og binde seg til nukleinsyrer. Her midtlogg GFP-merket WT S. aureus ble behandlet med media alene eller med cellefri supernatant avledet fra P. aeruginosa og avbildet umiddelbart etter behandling. Tre forskjellige kanaler ble avbildet: Fase, TxRed og GFP. Lyse grønne celler indikerer levende celler som aktivt uttrykker GFP som sett for S. aureus behandlet bare med media (figur 4A), og røde celler indikerer døde propidiumjodidfarget S. aureusceller, etter å ha blitt behandlet med P. aeruginosa supernatant (figur 4B). Selv om bare ett tidspunkt vises, kan denne metoden tilpasses for å bestemme cellelevabilitet under tidsforløp live imaging.
Flere analyser etter bildebehandling kan utføres for å kvantifisere aspekter ved interspecies interaksjoner. For eksempel kan cellesporing gi målinger for rettethet av P. aeruginosa enkeltcellebevegelser mot en klynge av S. aureus. Bevegelsene til individuelle P. aeruginosa-celler spores fra rammen en celle forlater flåten gjennom rammen der cellen når S. aureusklyngen (Figur 5A). Avstanden mellom P. aeruginosa flåten og S. aureus klyngen gir euklidian avstand, D(E), mens den totale sporlengder gir akkumulert avstand, D(A) (Figur 5B). Rettethet for hver celle beregnes som et forhold mellom D(E)/D(A). I coculture eksperimenter, WT P. aeruginosa beveget seg mot WT S. aureus med betydelig høyere rettethet enn mot S. aureus ΔagrBDCA, en mutant mangler Agr-regulerte utskilles faktorer, tidligere fastslått å være nødvendig for retningsmotilitet mot S. aureus24 (Figur 5C).
Figur 1: Skjematisk for bildeoppsettprotokollen.
Oversikt over kritiske trinn for fremstilling av bakteriekulturer og agarose pads. Opprettet med BioRender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Time-lapse, live-imaging mikroskopi viser forskjeller i P. aeruginosa atferd når cocultured med S. aureus.
Representative snap shots av P. aeruginosa (bacilli, grønn) i monokultur (A) og i coculture med S. aureus (cocci, umerket) (B). (C) Fluorescent merket bakterier tillate visualisering av P. aeruginosa enkeltceller invaderende S. aureus klynger. Fasekontrast og GFP-kanaloverlegg (øverst) og GFP-kanal alene (nederst). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative snap shots av vanlige bildeproblemer som fører til dårlig bildeoppkjøp.
(A)Feil tørkede pads og inkonsekvent fuktighet fører til drift av celler over FOV over hele bildetiden. Plasseringen av grunnleggercellen er merket i hver ramme (grønn stang). (B) Fotobleaching fra eksponering for lys for lenge vil tømme påviselige nivåer av fluorescens for en periode, men dreper ikke cellene. (C) Fototoksisitet som følge av hyppig eksponering for lys fører til celledød. De første tegn på fototoksisitet ses når cellene slutter å fluorisere og ikke klarer å dele seg. (D)Høy innledende inoculum folkemengder celler i FOV og forhindrer observasjon av interspecies interaksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av levende versus døde S. aureusceller.
Representative snap shots for GFP-merket WT S. aureus behandlet med enten middels alene (A) eller cellefri P. aeruginosa supernatant (B). Cellene ble umiddelbart avbildet etter behandling. Levende celler (grønn) uttrykker aktivt GFP og utelukker propidiumjodid, mens døde celler (rød) mister GFP fluorescens og membranpermeabilisering gjør at propidiumjodid kan komme inn i cellene og binde nukleinsyrer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Cellesporingsanalyse av P. aeruginosa i kokultur med S. aureus.
Tidligere ble denne metoden brukt metode for å utføre cellesporing av WT P. aeruginosa i kokultur med enten WT eller ΔagrBDCA S. aureus. (A)Representasjon av P. aeruginosa encellede spor i en coculture med S. aureus ΔagrBDCA. (B) Skjematisk for euklidiske avstand (D(E)) og akkumulert avstand (D(A)) målinger som brukes til å bestemme directedness ((D(E)/D(A)). (C)Rettethet målinger av enkelt WT P. aeruginosa celler i kokultur med WT og ΔagrBDCA S. aureus. Dette tallet er endret fra Limoli et al. 201924. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som presenteres her beskriver en protokoll for levende-celle avbildning av bakterielle arter interaksjoner på encellenivå med modifikasjoner for andre applikasjoner, inkludert cellesporing og overvåking av cellelevebilitet. Denne metoden åpner nye veier for å studere encellede atferd av mikroorganismer i kokultur med andre arter over tid. Spesielt viser protokollen nytten av denne kokulturmetoden for å observere bakteriell overflateatferd, spesielt når man studerer organismer som har både overflate- og væskerelaterte vedlegg for motilitet. For eksempel, ved å begrense bakteriell bevegelse til en overflate i et enkelt plan med fokus, kan den økte og retningsbestemte pili-medierte motiliteten til P. aeruginosa som svar på S. aureus visualiseres.
Som tidligere nevnt krever det å oppnå optimale resultater med denne bildemetoden vurdering av flere forhold, inkludert temperatur og fuktighet i prøve- og bildeinstrumentene (det vil vil vil at mål og stadium). Hvis du vil ha flere tips og feilsøking, kan du se tilleggsfilen 1. Et kritisk skritt i vellykket bruk av protokollen er utarbeidelse av agarose pads, som utilstrekkelig tørking pads er en av de vanligste problemene. Som vist i figur 3A, hvis putene ikke tørkes lenge nok, vises drift i begynnelsen av tidsforløpsbildet, mens pads som tørkes for lenge begynner å krympe og cellene driver ut av FOV noen timer inn i bildet. Å sikre at alle materialer er forvarmet og vedlikeholdt ved jevn temperatur og fuktighet i løpet av eksperimentet, gjennom bruk av en scene-top inkubator og fuktige lofrie kluter, vil bidra til å redusere drift. Det anbefales også at en backup pad alltid er laget i tilfelle den første puten ikke tørkes riktig eller tårer under overføring fra formen til prøven parabolen. I tillegg er det viktig å bruke et lav-autofluorescence medium, både for voksende bakterielle kulturer og for å lage pads for å minimere bakgrunnen fluorescens fra mediet når man avbilde cellene. Det anbefales å bruke minimalt med media for mikroskopi, siden rike medier ofte har høy autofluorescence. Starter med en lav tetthet inokuleum og selv romlig fordeling av celler i FOV er også viktige faktorer i denne metoden. Spesielt i tidligere studier som evaluerte P. aeruginosa og S. aureus interaksjoner, tillot dette bakteriene å generere en tilstrekkelig gradient av utskillede faktorer som deretter kan oppdages av de andre artene som finnes (figur 2B).
Til tross for fordelene med denne metoden, er det også begrensninger, inkludert pris, lav gjennomstrømning natur, fluorescens restriksjoner, og høy avhengighet av å kontrollere miljøforhold. Figur 3B-3C viser de viktigste begrensningene ved bruk av fluorescensmikroskopi. Som diskutert i resultatdelen, hvis de fluorescerende bildene er tatt i korte intervaller, kan fotobleaching og fototoksisitet forekomme. For å unngå disse to utfallene, bør fluorescerende bildeintervaller tas langt nok fra hverandre og med så lav fluorescerende lyseksponeringstid som mulig for å fortsatt tilstrekkelig visualisere fluoroforen. I tillegg, når du bestemmer intervallet for fluorescensavbildning, er det viktig å vurdere modningstiden for hver fluorofor. Fluoroforene som brukes i P. aeruginosa og S. aureusstammer vist i figur 2, figur 3 og figur 4,har for eksempel en modningstid på ca. 20 minutter og kan derfor være begeistret hvert 20. I mellomtiden er en annen ulempe med denne metoden at den ikke tillater observasjoner av sene interspecies interaksjoner når cellene når en høy celletetthet. For å visualisere individuelle bakterielle celler, må de forbli i et enkelt fokusplan. Men når befolkningen når en høy celletetthet, begynner cellene å vokse i mer enn ett plan.
Denne metoden kan endres for å studere ulike fenotyper som celle levedyktighet (figur 4) og uttrykk for gener av interesse (data ikke vist). Figur 4 viser et eksempel på hvordan metoden er tilpasset for å visualisere bakteriell levedyktighet ved å legge propidiumjodid til agarose pads. En annen anvendelse av denne metoden er å måle bakteriell gen/ proteinuttrykk i kokultur med en annen organisme gjennom fluorescerende journalister. For eksempel kan flere fluoroforer innlemmes i en plasmidvektor eller bakteriekromosomet for samtidig å studere uttrykket av forskjellige gener eller proteiner. Her er det viktig å velge fluoroforer som ikke har overlappende eksitasjon og utslippsspektra. Til slutt gjør bruk av bakteriell cellesporing i analyse etter bildebehandling retningsbestemthet (figur 5), hastighet og akselerasjon, blant andre målinger, som skal beregnes, samt24.
Samlet sett forbedrer denne kokulturavbildningsmetoden tilpasset fra tidligere beskrevne monokulturprotokoller evnen til å visualisere atferden til flere bakterielle arter i kokultur. Denne metoden gir mulighet til å studere mikrober fra et blandet kulturperspektiv, noe som vil øke forståelsen av hvordan hver art endrer sin atferd på encellet måte, og gir til slutt ny innsikt i hvordan bakterielle arter samhandler i polymikrobielle miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), og NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Vi takker Jeffrey Meisner, Minsu Kim og Ethan Garner for å dele innledende protokoller og råd for bildebehandling og lage pads.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
