Summary
Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.
Abstract
Le comunità polimicrobiche sono onnipresenti in natura, ma studiare le loro interazioni a livello di una singola cellula è difficile. Pertanto, è stato sviluppato un metodo basato sulla microscopia per osservare le interazioni tra le specie tra due patogeni batterici. L'uso di questo metodo per interrogare le interazioni tra un patogeno motile Gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa e un patogeno Gram-positivo non motile, Staphylococcus aureus è dimostrato qui. Questo protocollo consiste nel co-inoculare ogni specie tra un coverslip e un pad di agarose, che mantiene le cellule in un unico piano e consente la visualizzazione dei comportamenti batterici sia nello spazio che nel tempo.
Inoltre, la microscopia time-lapse qui dimostrata è ideale per visualizzare le prime interazioni che si svolgono tra due o più specie batteriche, compresi i cambiamenti nella motilità delle specie batteriche nella monocultura e nella coculazione con altre specie. A causa della natura dello spazio campione limitato nella configurazione della microscopia, questo protocollo è meno applicabile per studiare le interazioni successive tra le specie batteriche una volta che le popolazioni cellulari sono troppo alte. Tuttavia, ci sono diverse applicazioni del protocollo che includono l'uso della colorazione per l'imaging di cellule batteriche vive e morte, la quantificazione dell'espressione genica o proteica attraverso giornalisti fluorescenti e il monitoraggio del movimento delle cellule batteriche sia nelle singole specie che negli esperimenti multispecie.
Introduction
Le comunità polimicrobiche sono comuni in natura, che abbracciano una varietà dinicchie ambientali 1,2,3 e umane4,5. Alcune delle infezioni polimicrobiche più note nella malattia umana includono biofilm dentali6, ferite croniche7,8e infezioni respiratorie in individui con malattia polmonare ostruttivacronica 9, polmonite associata al ventilatore10e la fibrosi cistica della malattia genetica (CF)11,12. Queste infezioni sono spesso composte da diverse specie microbiche; tuttavia, è emerso un recente focus sulle interazioni tra il batterio Gram-positivo Staphylococcus aureus e il batterio Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa. Studi che includono pazienti coinfettati con questi organismi e analisi in vitro rivelano interazioni competitive e cooperative che possono avere influenze profonde e inaspettate sulla progressione della malattia, la sopravvivenza microbica, la virulenza, il metabolismo e la suscettibilità agli antibiotici (esaminate in dettaglio da Hotterbeekx et al. 201713 e Limoli Hoffman 20193).
Il crescente interesse per le interazioni interspecie durante l'infezione ha prodotto una varietà di metodi per studiare i comportamenti della comunità polimicrobica. Tipicamente, questi studi hanno utilizzato saggi a base di piatti o brodo per studiare le differenze fenotipici tra monocultura e cocoltura. Ad esempio, la cocultura di P. aeruginosa e S. aureus su superfici solide ha permesso la visualizzazione dell'inibizione della crescita o dei cambiamenti nella produzione di fenotipo, pigmento o polisaccharidedella colonia 14,15,16. I biofilm di specie miste, su superfici biotiche o abiotiche, nonché le specie batteriche coculturing nella coltura liquida hanno anche permesso di misurazione dei cambiamenti nella crescita, nel metabolismo, nella tolleranza agli antibiotici, nella concorrenza e nella vitalità, oltre all'espressione genica e proteica17,18. Mentre questi esperimenti di coltura di massa hanno rivelato una visione di come P. aeruginosa e S. aureus potrebbero influenzarsi a vicenda su scala comunitaria, non sono in grado di rispondere a domande importanti sulle interazioni che si svolgono a livello di singola cellula. Il metodo qui presentato si aggiunge agli approcci per studiare le interazioni traspecie concentrandosi sui cambiamenti nel movimento, la vitalità cellulare e l'espressione genica di singole cellule all'interno di una comunità coculuta nel tempo.
Le interazioni a cella singola possono differire ampiamente dalle interazioni che si svolgono in una comunità di celle di massa. Attraverso l'analisi a una singola cellula, l'eterogeneità all'interno di una comunità può essere quantificata per studiare come il posizionamento spaziale delle cellule influenza le dinamiche della comunità o come i livelli di espressione genica e proteica cambiano all'interno dei singoli membri di un gruppo. Le celle di monitoraggio possono anche fornire informazioni su come le singole celle si muovono e si comportano nel tempo, attraverso più generazioni. Monitorando contemporaneamente il movimento cellulare e i cambiamenti nell'espressione genica, è possibile fare correlazioni tra le fluttuazioni geniche e i fenotipi corrispondenti. Sono stati descritti protocolli precedenti per lo studio di singole specie batteriche a livello di singola cellula. Questi studi sfruttano le cellule di imaging dal vivo nel tempo in un unico piano, e sono stati utili per osservare fenotipi come la divisione cellulare e la suscettibilità agli antibiotici19,20. Ulteriore microscopia a imaging vivo è stata utilizzata per monitorare la crescita, la motilità, la colonizzazione superficiale e la formazione di biofilm di singole speciebatteriche 21,22,23. Tuttavia, mentre questi studi sono stati perspicenti per comprendere la fisiologia dei batteri nella monocultura, gli esperimenti per osservare il comportamento di più cellule di più specie batteriche nel tempo nella coculazione sono limitati.
Qui, i protocolli precedenti utilizzati per l'imaging di singole specie sono stati adattati per studiare le interazioni tra P. aeruginosa e S. aureus. Questi organismi possono essere differenziati in fase di contrasto in base alle loro morfologie cellulari (P. aeruginosa sono bacilli e S. aureus sono cocci). Lo sviluppo di questo metodo ha recentemente permesso la visualizzazione dei comportamenti di motilità precedentemente non descritto di P. aeruginosa in presenza di S. aureus24. P. aeruginosa è stato trovato in grado di percepire S. aureus da lontano e rispondere con movimenti uni cellulali aumentati e direzionali verso cluster di cellule S. aureus. P. aeruginosa movimento verso S. aureus è stato trovato per richiedere il tipo IV pili (TFP), proiezioni capelli-come la cui estensione coordinata e retrazione generano un movimento chiamato motilità contrazione25.
Questi studi dimostrano l'utilità di questo metodo per interrogare le interazioni precedenti tra le specie. Tuttavia, l'imaging ad alte densità cellulari nei punti di tempo di interazione successivi è difficile dato che non è più possibile identificare singoli strati di cellule, il che pone principalmente problemi durante l'analisi post-imaging. Data questa limitazione, il metodo è più adatto per le interazioni precedenti che potrebbero quindi essere seguite con saggi macroscopici tradizionali a densità cellulari più elevate rappresentative delle interazioni successive. Ulteriori limitazioni di questo metodo includono la natura a bassa velocità effettiva, poiché è possibile eseguire l'immagine di un solo campione alla volta e il costo del microscopio, della fotocamera e della camera ambientale. Inoltre, la microscopia a fluorescenza pone rischi per le cellule batteriche come la fototossicità e la fotobleaching, limitando così la frequenza con cui le immagini di fluorescenza possono essere acquisite. Infine, i cuscinetti di agarose utilizzati in questo metodo sono altamente suscettibili ai cambiamenti nell'ambiente, il che lo rende fondamentale per il controllo per condizioni come la temperatura e l'umidità, dato che i cuscinetti possono iniziare a ridursi o espandersi se le condizioni non sono corrette. Infine, mentre questo metodo non imita l'ambiente ospite, fornisce indizi su come le diverse specie batteriche rispondono sulle superfici, che possono essere seguite in saggi progettati per imitare le condizioni ambientali/host.
Questo metodo differisce dagli studi precedenti che tracciano il movimento di una singola cellula, in che le cellule sono inoculate tra un cosale e un cuscinetto di agarose, limitando le cellule alla superficie. Ciò consente il tracciamento delle cellule nel tempo in un singolo piano; tuttavia, limita i cicli di coinvolgimento della superficie transitoria osservati quando le cellule sono sommerse nel liquido26. Un ulteriore vantaggio dell'imaging batteri sotto un cuscinetto di agarose è che imita macroscopici saggi di inoculazione sotto-superficie a base di piastra classicamente utilizzati per esaminare P. aeruginosa twitching motility25. In questo saggio, le cellule batteriche sono inoculate tra il fondo di un piatto di Petri e l'agar, mantenendo le cellule in un unico piano mentre si muovono attraverso il fondo del piatto verso l'esterno dal punto di inoculazione, proprio come questo protocollo di microscopia.
Il protocollo di microscopia time-lapse per la visualizzazione delle interazioni interspecie qui presentato consiste di 1) preparare il campione batterico e il tampone di agarose, 2) selezionando le impostazioni del microscopio per l'acquisizione dell'imaging e 3) l'analisi post-imaging. La visualizzazione dettagliata del movimento e del tracciamento delle cellule può essere eseguita mediante l'acquisizione di immagini a brevi intervalli di tempo in base al contrasto di fase. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata anche per determinare la vitalità cellulare o l'espressione genica nel tempo. Qui, mostriamo un esempio di adattamento per la microscopia a fluorescenza attraverso l'aggiunta di coloranti di vitalità ai cuscinetti di agarose.
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Protocol
NOTA: una descrizione completa e i numeri di catalogo per tutti i materiali in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione del supporto minimo M8T
- Preparare 1 L di M8 minima sali base (5x) sciogliendo 64 g di Na2HPO47H2O, 15 g di KH2PO4e 2,5 g NaCl in 800 mL di acqua ultrapura (UPW, resistenza 18 MΩ/cm) in una bottiglia da 2 L. pH a 7,6. Volume completo a 1 L con UPW. Autoclave per 45 min.
- Preparare 500 mL di una soluzione di glucosio (20% w/v) sciogliendo 100 g di glucosio in 400 mL di UPW in una bottiglia da 1 L. Soluzione completa a 500 mL con UPW. Autoclave per 45 min.
- Preparare 500 mL di una soluzione tryptone (20% w/v) sciogliendo 100 g di tryptone in 400 mL di UPW. Completo a 500 mL con UPW. Autoclave per 45 min.
- Preparare 1 L di M8 - 10% tryptone (M8T) media minimi aggiungendo 200 mL di 5x M8 sali minimi (1x finale), 10 mL del 20% di glucosio (0 2%finale), 1 mL di 1 M MgSO4 (1 mM finale) e 50 mL del 20% di tryptone (1% finale) a 600 mL di UPW. Completare a 1 L con UPW. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m in una bottiglia sterile di memoria multimediale da 500 mL.
Giorno 1:
2. Preparazione di colture batteriche durante la notte
- Inoculare 5 mL di media minimi M8T con una singola colonia di P. aeruginosa o S. aureus (compresi gli antibiotici quando appropriato) e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi con aerazione per non più di 16 h.
NOTA: I patogeni batterici P. aeruginosa e S. aureus sono stati utilizzati per questo metodo, perché sono comunemente coisolati da infezioni croniche, e studiare le loro interazioni è importante capire come contribuiscono agli esiti dei pazienti durante le infezioni polimicrobiche. Altre specie batteriche potrebbero essere utilizzate a seconda del focus dello studio.
Giorno 2:
3. Sottocultura dei ceppi batterici
- Sottocultura P. aeruginosa 1:500 e S. aureus 1:1000 in 5 mL di M8T fresco (includere antibiotici quando appropriato). Incubare con aerazione a 37 gradi centigradi fino a quando le colture raggiungono la fase di log medio (OD600 - 0,3 - 0,5).
4. Preparazione dei materiali per gli stampi pad
- Preparare le spatole metalliche riscaldando l'estremità di una spatola di laboratorio piatta e arrotondata con un bruciatore Bunsen fino a quando metà dell'estremità piatta può essere piegata ad un angolo di 90 gradi. Riscaldare l'estremità di un'altra spatola di laboratorio piatta e arrotondata e piegare leggermente gli ultimi 10 mm ad un angolo di 45 gradi centigradi.
- Tagliare i quattro angoli degli stampi in silicone in modo che gli stampi si inserisano all'interno di un piatto da 35 mm.
- Sterilizzare le spatole e un paio di pinzette aggiungendo il 70% di etanolo e passandole attraverso la fiamma del bruciatore Bunsen.
- Pulire il piatto e gli stampi in silicone con il 70% di etanolo e asciugarli con salviette senza lanugine.
5. Preparazione di cuscinetti di agarose
NOTA: I cuscinetti sono preparati con il supporto minimo M8T come fonte nutritiva per i batteri utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, i nutrienti utilizzati nelle pastiglie possono essere modificati per diversi organismi.
- Sciogliere il 2% di agarose a basso fusione in 10 mL di M8T in una fiaschetta pulita di 50 mL Erlenmeyer. Microonde a brevi intervalli (2-5 s) fino a quando l'agarose è in soluzione al fine di evitare che il contenuto del pallone di bollire sopra. Una volta sciolti, lasciate raffreddare in un bagno d'acqua di 50 gradi per almeno 15 minuti.
- Preparare gli stampi allineando il ritaglio in silicone con l'apertura nel piatto da 35 mm e toccare leggermente con la spatola per fissare il silicone al piatto e rimuovere tutte le bolle d'aria tra lo stampo e il piatto.
- Una volta raffreddato, pipetta 915 L di agarose fuso nello stampo. Lasciare il coperchio socchiuso e lasciare asciugare il pad a temperatura ambiente per 30 min.
- Coprire il piatto con il coperchio e lasciare a temperatura ambiente per un ulteriore 2 h.
- Preparare le salviette di umidità arrotolando saldamente una salvietta senza lanugine. Posizionare la salvietta arrotolata all'interno di un piatto Petri sterile e aggiungere uniformemente 500 L di acqua sterile attraverso la salvietta. Caldo a 37 gradi centigradi per 1 h.
- Scaldare il pad e un piatto sterile da 35 mm a 37 gradi centigradi per 1 h.
6. Preparazione di cellule batteriche e pastiglie inoculanti
- Misurare l'OD600 di ogni sottocultura e diluire P. aeruginosa in un OD600 x 0,03 e S. aureus a un OD600 x 0,10 in M8T preriwarmed a 37 gradi centigradi. Mescolare P. aeruginosa e S. aureus in un rapporto 1:1 e vortice.
NOTA: Se i ceppi richiedono antibiotici, gli antibiotici possono essere aggiunti alla notte e alla sottocultura, ma non devono essere aggiunti quando si mescolano specie per l'imaging se colpiscono le altre specie nella cocoltura. La stabilità plasmida e gli effetti degli antibiotici su tutte le specie nella cocultura dovranno essere determinati per ogni organismo/plasmide utilizzato. - Pipette 1 L di cocoltura uniformemente sul fondo di un piatto di coperture in vetro pre-riscaldato e sterile da 35 mm.
- Rimuovere il ritaglio di silicone dallo stampo utilizzando una pinzetta sterile.
- Togliere il pad dal piatto con spatole sterili.
- Scivolare la spatola leggermente piegata sotto il bordo del pad, tenendo lo stampo a testa in giù, per rilasciarlo su un coperchio sterile della piastra Petri.
NOTA: Fare attenzione a non forzare il pad fuori o si strappa. Tenere traccia di quale lato del pad è il fondo.
- Scivolare la spatola leggermente piegata sotto il bordo del pad, tenendo lo stampo a testa in giù, per rilasciarlo su un coperchio sterile della piastra Petri.
- Trasferire il pad sul piatto con le cellule batteriche, in basso a lato, facendo scorrere la spatola angolata di 90 gradi sotto il pad e posizionandolo sopra il inoculato. Utilizzare la spatola angolata a 90 gradi per rendere il pad a filo contro il coverslip e premere delicatamente eventuali bolle d'aria.
- Rimuovere l'umidità in eccesso dalle salviette umiditàe, quindi posizionate intorno al bordo del piatto, assicurandosi che non tocchi il pad. Il campione è ora pronto per l'imaging.
7. Impostazione del microscopio per l'imaging dal vivo
- Camera ambientale calda a 37 gradi centigradi almeno 2 h prima dell'allevarsi in fase sperimentale.
- Accendere tutti i componenti, tra cui microscopio, computer e sorgenti luminose per l'imaging a campo luminoso e a fluorescenza.
- Aprire il software di imaging e assicurarsi che le sorgenti di luce siano connesse e in esecuzione.
- Eseguire l'illuminazione di K'hder27 per allineare tutti i piani dell'immagine.
- In primo luogo, portare a fuoco le coverslip contrassegnate con un obiettivo 20x utilizzando un piatto "fittizio". Assicurarsi che la torretta del condensatore sia impostata sulla posizione "aperta".
NOTA: per ogni obiettivo/campione unico deve essere eseguita l'illuminazione di K'hder per allineare correttamente i piani dell'immagine. Tuttavia, la messa a fuoco e l'allineamento con la piatto "fittizio" sull'ingrandimento inferiore accelera la configurazione su campioni vivi a un ingrandimento più elevato per limitare il tempo tra l'impostazione e l'ora di inizio dell'esperimento. - Mettere a fuoco il condensatore.
- Chiudere il diaframma del campo.
NOTA: dovrebbe apparire un'apertura a forma di ottagono. Se il condensatore è completamente fuori fuoco, l'intero campo di vista (FOV) apparirà scuro. - Ruotare le manopole di messa a fuoco del condensatore fino a quando i bordi dell'ottagono non saranno nitidi.
NOTA: l'intensità della luce aumenterà man mano che i piani dell'immagine si avvicinano all'allineamento corretto.
- Chiudere il diaframma del campo.
- Allineare il condensatore.
- Centrare il condensatore di campo regolando le manopole di allineamento.
NOTA: l'ottagono deve essere centrato al centro del FOV. Le manopole di allineamento variano a seconda del microscopio. Ad esempio, alcuni condensatori al microscopio hanno manopole, mentre altri hanno viti che richiedono un driver a vite.
- Centrare il condensatore di campo regolando le manopole di allineamento.
- Mettere a fuoco il filamento della lampada e regolare l'apertura del condensatore.
- Posizionare un telescopio di fase o una lente Bertrand nel percorso di luce per osservare il piano focale posteriore dell'obiettivo.
NOTA: Ci dovrebbero essere due cerchi concentrici. - Ruotare la manopola di messa a fuoco dell'obiettivo Bertrand fino a quando gli anelli sembrano nitidi.
- Rimuovere l'obiettivo Bertrand dal percorso della luce.
- Posizionare un telescopio di fase o una lente Bertrand nel percorso di luce per osservare il piano focale posteriore dell'obiettivo.
- Aprire il diaframma del campo fino a quando l'ottagono è appena fuori dal FOV.
- Passare all'obiettivo 100x e far scorrere l'anello di fase di corrispondenza in posizione prima di aggiungere una goccia di olio di immersione, e posizionare il piatto campione preparato sulla parte superiore.
- Eseguire l'illuminazione di Kohler sull'obiettivo 100x con il piatto campione batterico.
- In primo luogo, portare a fuoco le coverslip contrassegnate con un obiettivo 20x utilizzando un piatto "fittizio". Assicurarsi che la torretta del condensatore sia impostata sulla posizione "aperta".
- Concentrarsi sui batteri utilizzando solo la regolazione fine. Una volta che i batteri nel FOV sono concentrati attraverso l'oculare, cambiare il percorso di luce alla fotocamera premendo il pulsante della fotocamera al microscopio.
- Fare clic sull'opzione Fase nel software di imaging.
- Regolare la percentuale di luce LED DIA emessa selezionando la sorgente luminosa nel software e inserendo manualmente la percentuale di luce desiderata da utilizzare o facendo scorrere la barra sulla scala percentuale della luce.
- Regolare il tempo di esposizione della luce LED DIA facendo clic sulla sorgente luminosa e inserendo manualmente il tempo di esposizione desiderato o selezionando un tempo di esposizione dal menu a discesa fornito.
NOTA: il tempo di esposizione varia a seconda della fotocamera utilizzata. - Se si utilizza la fluorescenza, regolare le impostazioni della fotocamera in ogni canale corrispondente (ad esempio, TxRed, GFP), facendo clic sul canale fluorescente di interesse.
- Impostare la percentuale di luce fluorescenza emessa, quindi regolare il tempo di esposizione (come eseguito nei punti 7.7 e 7.8 per la luce LED DIA).
- In alternativa, modificare la profondità di bit per regolare l'intervallo dinamico selezionando una delle altre opzioni di profondità di bit nel menu a discesa dei controlli di visualizzazione.
- Scegliere le posizioni XY di interesse facendo clic sull'opzione XY nel menu dei controlli di acquisizione.
- Spostare la posizione dello stage con il joy stick o facendo clic e trascinando il FOV sullo schermo e fare clic sulla casella vuota per salvare le coordinate X e Y di una posizione specifica.
NOTA: per l'acquisizione in time-lapse è consigliata la selezione di non più di tre diverse posizioni XY, il più vicino possibile.
- Spostare la posizione dello stage con il joy stick o facendo clic e trascinando il FOV sullo schermo e fare clic sulla casella vuota per salvare le coordinate X e Y di una posizione specifica.
- Accendere il sistema di messa a fuoco perfetto (PFS) facendo clic sulla casella PFS nella scheda XY del menu di controllo di acquisizione o premendo il pulsante PFS sul pannello di controllo joy stick.
- Ruotare le manopole di regolazione fine per mettere a fuoco le cellule batteriche.
- Fare clic sul pulsante PFS per ogni posizione XY, una volta che le celle si trovano nel piano di messa a fuoco desiderato.
NOTA: PFS compensa la deriva nell'asse z durante gli esperimenti time-lapse. Questo è necessario per mantenere la messa a fuoco delle cellule batteriche nel tempo. Diversi produttori hanno diversi sistemi di compensazione. - Scegli le condizioni di acquisizione dell'immagine, tra cui l'intervallo di acquisizione e la frequenza per ogni canale (ad esempio, contrasto di fase e ogni fluoroforo) selezionandole dalle opzioni nel menu dei controlli di acquisizione.
NOTA: Per gli esperimenti qui presentati, le immagini a contrasto di fase vengono acquisite a intervalli ogni 5-10 s, mentre le immagini di fluorescenza nei canali GFP e TxRed vengono acquisite ogni 20 minuti. - Iniziare l'imaging una volta che le impostazioni del microscopio e dell'acquisizione sono impostate.
8. Facoltativo: modifiche per l'imaging in tempo reale/morto
- Sciogliere il 2% di agarose in 10 mL di M8T e lasciare raffreddare in bagno d'acqua di 50 gradi centigradi per almeno 15 min.
- Aggiungere 1 mM di iodide di propidio all'agarose fuso.
- Una volta raffreddata, pipetta 915 L di agarose nello stampo preparato.
- Lasciare il coperchio socchiuso e lasciare asciugare il tampone a temperatura ambiente per 30 min. Proteggere dalla luce.
- Coprire il piatto con il coperchio e lasciare a temperatura ambiente per un ulteriore 2 h.
- Preparare salviette di umidità.
- Rotolare una carta senza lanugine pulire saldamente.
- Mettere la salvietta in un piatto Petri sterile e aggiungere 500 L di acqua sterile alla salvietta.
- Incubate a 37 gradi centigradi per 1 h.
- Incubare il pad e un piatto sterile da 35 mm a 37 gradi centigradi per 1 h.
- Procedere per inoculare il piatto come indicato nella sezione 6: Preparazione delle cellule batteriche e tamponi inoculanti.
9. Analisi dei dati
- Identificazione delle cellule
- Aprire il file di immagine nel software di imaging e ritagliare il file per includere solo i fotogrammi da utilizzare per il tracciamento, ingrandito le celle di interesse e solo nel canale di contrasto di fase.
NOTA: il file ritagliato può essere salvato come nuovo file in cui i dati di rilevamento possono essere memorizzati senza interferire con il file originale. - Selezionare l'opzione per scegliere le regioni di interesse (ROI) nel menu dei controlli di analisi e definire i RO tracciando singole cellule batteriche o cluster di celle nel primo fotogramma da utilizzare per l'analisi.
NOTA: i ROI possono essere definiti manualmente o come file binari.- Definire manualmente il ROI
- Traccia il perimetro di ogni singola cellula batterica o cluster di cellule per definire manualmente i ROI.
NOTA: Nel software di analisi, P. aeruginosa, o altre cellule a forma di asta, possono essere tracciate manualmente selezionando il ROI dell'ellisse e disegnando un'ellisse adattata alle dimensioni della cellula batterica. Ellipse In alternativa, è possibile selezionare l'opzione ROI poligono per tracciare ROI non tradizionali, ad esempio gruppi di celle.
- Traccia il perimetro di ogni singola cellula batterica o cluster di cellule per definire manualmente i ROI.
- Identificare i ROI binari
- Fare clic sull'opzione Binario al ROI per definire i ROI binari.
NOTA: gli oggetti vengono definiti in un livello binario in base alla separazione delle cellule batteriche pixelate più scure dallo sfondo pixelato più chiaro nel canale di contrasto di fase. - Per sogliare le celle, selezionare l'opzione Soglia nel menu dei controlli di analisi. Selezionare il canale di interesse e far scorrere le barre nell'istogramma di fluorescenza per regolare i valori dell'intervallo di soglia.
NOTA: l'identificazione di oggetti binari per i ROI può anche essere definita nelle immagini fluorescenti sogliando le cellule batteriche. La soglia stabilisce quali intensità di fluorescenza sono considerate oggetti e quali intensità di fluorescenza costituiscono lo sfondo.
- Fare clic sull'opzione Binario al ROI per definire i ROI binari.
- Definire manualmente il ROI
- Aprire il file di immagine nel software di imaging e ritagliare il file per includere solo i fotogrammi da utilizzare per il tracciamento, ingrandito le celle di interesse e solo nel canale di contrasto di fase.
- Tracciamento delle celle
- Per tracciare manualmente i ROI, selezionare il fotogramma successivo nella sequenza di imaging e regolare la posizione dei ROI facendo clic e trascinando ogni ROI per allinearlo alla nuova posizione della cella batterica originale.
NOTA: Se le cellule batteriche non hanno cambiato posizione, i ROI non devono essere spostati. - Ripetere in tutti i fotogrammi sequenziali per i quali devono essere rilevate le celle.
- Quando le celle si dividono, definire le celle figlia come nuovi ROI, come descritto nel passaggio 9.1, e iniziare a tenere traccia delle celle appena divise.
NOTA: se le celle vengono identificate come binari, utilizzare la funzione Binari traccia per tenere traccia automaticamente dei ROI nei fotogrammi selezionati. - Una volta che le celle sono state tracciate attraverso tutti i fotogrammi selezionati, esportare i dati da analizzare.
- Aprire il foglio di calcolo dei dati e identificare le misure necessarie per l'analisi (ad esempio, velocità dell'oggetto, accelerazione o lunghezza del percorso).
NOTA: nel caso della misura diretta, sono necessarie le misure Lunghezza percorso e Lunghezza linea. La lunghezza della linea è una misura della distanza euclidica, o la distanza retta dall'origine della pista al bordo della colonia di S. aureus. La lunghezza del tracciato è una misura della distanza accumulata o della somma dei segmenti di traccia di tutti i fotogrammi. La direzione può essere calcolata come rapporto tra la distanza euclidiana, D(E), (Lunghezza linea), sulla distanza accumulata, D(A), (Lunghezza percorso).
- Per tracciare manualmente i ROI, selezionare il fotogramma successivo nella sequenza di imaging e regolare la posizione dei ROI facendo clic e trascinando ogni ROI per allinearlo alla nuova posizione della cella batterica originale.
- Quantificazione della fluorescenza
- Definire i ROI per le cellule batteriche fluorescenti come descritto al punto 9.1.
- Ripetere il tracciamento o il movimento dei ROI per cellule batteriche o cluster nei fotogrammi fluorescenti rimanenti.
- Esportare la tabella generata in un file di foglio di calcolo per l'analisi dell'intensità fluorescente.
- Nel foglio di calcolo dei dati, cercare la colonna con "Intensità media" che rappresenta l'intensità media della fluorescenza per il ROI delle cellule batteriche tracciate.
- Grafico dei valori intensità media per esaminare i cambiamenti nella fluorescenza nel tempo.
NOTA: I cambiamenti nella fluorescenza nel tempo rappresentano la fluttuazione dell'espressione genica per il gene di interesse fluorescente.
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Representative Results
Un uso corretto del metodo descritto comporterà una serie di fotogrammi che generano un video in cui le interazioni traspecie possono essere osservate nel tempo. Lo schema in Figura 1 fornisce un oggetto visivo per evidenziare i passaggi chiave coinvolti nella preparazione dei materiali per l'imaging. L'uso di questo metodo ha permesso la dimostrazione di cellule P. aeruginosa che presentano comportamenti diversi in monocultura rispetto alla cocultura con S. aureus. Rispetto alle cellule P. aeruginosa in monocultura che rimangono raggruppate in zattere, quando in cocoltura con S. aureus, P. aeruginosa ha aumentato la motilità a singola cellula verso le colonie di Aureo (Figura 2A-2B). I ceppi batterici fluorescenti consentono anche di visualizzare popolazioni miste di specie batteriche. Utilizzando GFP-etichettato P. aeruginosa ha permesso l'osservazione che dopo P. aeruginosa singole cellule aumentano di motilità, essi circonderanno e alla fine invadere colonie S. aureus (Figura 2C). L'utilizzo di cellule marcate fluorescente consente inoltre la visualizzazione dell'invasione delle cellule P. aeruginosa nelle colonie di S. aureus per la prima volta (Figura 2C, in basso).
Mentre il protocollo produce immagini di alta qualità per osservare le interazioni traspecie, ci sono diversi problemi comuni che possono portare a sequenze di fotogrammi di scarsa qualità. Umidità incoerente per tutta la durata dell'esperimento e pastiglie non correttamente essiccate sono due problemi comuni che portano alla deriva risultante dal pad spostamento e trascinando le cellule con esso fuori dal FOV (Figura 3A). I cambiamenti di umidità influenzano la secchezza dei cuscinetti agarose. L'aumento dell'umidità rende le pastiglie troppo umide, permettendo all'umidità di stabilirsi tra il pad e il fondo del piatto di fondo di vetro. L'umidità lascia uno strato di liquido abbastanza spesso per le cellule motile a sciamare o nuotare attraverso e non mantiene le cellule batteriche in un singolo piano. Nel frattempo, le diminuzioni di umidità asciugano il pad più velocemente, che causano le cellule alla deriva presto. Un altro errore comune quando si utilizza questo metodo con fluorescenza è l'acquisizione di immagini fluorescenti troppo frequentemente o l'esposizione di cellule batteriche alla luce fluorescente per troppo tempo. Brevi intervalli di acquisizione per immagini fluorescenti eccitano ripetutamente fluorofori con luce ad alta intensità di una specifica lunghezza d'onda. I fluorofori eccitati reagiscono quindi con l'ossigeno, causando la degradazione del fluoroforo. La fotobleaching risultante esaurisce la fluorescenza fino a quando non si può esprimere e piegare più del fluorofroforo, ma non danneggia le cellule batteriche stesse (Figura 3B). La perdita di fluorescenza, tuttavia, interferisce con le misurazioni dell'espressione genica/proteina, lasciando le cellule senza marcatori fino a quando il fluoroforo può essere completamente sintetizzato ed eccitato di nuovo. Inoltre, l'ossigeno che interagisce con fluorofori eccitati può formare specie reattive di ossigeno (ROS). Questi radicali ROS danneggiano quindi le cellule batteriche, diventando in ultima analisi tossiche e con conseguente morte cellulare all'interno di alcune divisioni cellulari (Figura 3C). I processi di fotostossicità e fototossicità possono essere facilmente visti come le cellule perderanno prima completamente la loro fluorescenza, e nei fotogrammi successivi, le cellule smetterà di dividersi e alla fine potrebbero morire (Figura 3B-3C). Un ultimo problema comune durante la configurazione dell'esperimento è l'inizio con troppe cellule per FOV o con cellule troppo vicine l'una all'altra, che è generalmente inferiore a 20 m di distanza. Le celle affollate nel primo fotogramma produrranno gruppi di celle divisorie che si uniscono semplicemente l'una all'altra man mano che crescono piuttosto che interagire. Inoltre, le cellule che iniziano troppo vicino potrebbero non avere abbastanza tempo per stabilire un gradiente di segnali secreti a cui le altre specie possono rispondere(Figura 3D), mentre le cellule batteriche distanti potrebbero non avere la possibilità di incontrarsi entro la durata dell'esperimento.
Figura 4 mostra un esempio di come la vitalità delle cellule batteriche può essere visualizzata con questo protocollo aggiungendo propidium iodide ai pastiglie di agarose. Lo iodide propidio è impermeabile alle cellule vive, ma può entrare in cellule con membrane danneggiate e legarsi agli acidi nucleici. Qui il GFP etichettato GFP Aureus sono stati trattati con i soli mezzi di comunicazione o con supernante senza cellule derivato da P. aeruginosa e immagini immediatamente dopo il trattamento. Sono stati 2003 i diversi canali: Phase, TxRed e GFP. Le cellule verdi brillanti indicano cellule vive che esprimono attivamente GFP come visto per il S. aureus trattato solo con i supporti (Figura 4A), e le cellule rosse indicano cellule S. aureus macchiate di propidio morto, dopo essere state trattate con P. aeruginosa supernatant (Figura 4B). Sebbene venga mostrato un solo punto di tempo, questo metodo può essere adattato per determinare la vitalità delle cellule durante l'imaging dal vivo time-lapse.
È possibile eseguire diverse analisi post-imaging per quantificare gli aspetti delle interazioni traspecie. Ad esempio, il tracciamento cellulare può fornire misure per la direzione dei movimenti di una singola cellula P. aeruginosa verso un gruppo di S. aureus. I movimenti delle singole cellule P. aeruginosa vengono tracciati dal telaio in cui una cella lascia la zattera attraverso il telaio in cui la cella raggiunge il cluster S. aureus (Figura 5A). La distanza tra la zattera P. aeruginosa e il cluster S. aureus fornisce la distanza euclidica, D(E),mentre le lunghezze totali della pista forniscono la distanza accumulata, D(A) (Figura 5B). La fedeltà di ogni cella viene calcolata come rapporto tra D(E)/D(A). Negli esperimenti di cocoltura, WT P. aeruginosa si è spostato verso il WT S. aureus con una direzione significativamente più alta rispetto a S. aureus agrBDCA, un mutante privo di fattori secretati regolati da Agr, precedentemente determinati per essere necessari per la motilità direzionale verso S. aureus24 (Figura 5C).
Figura 1: Schema del protocollo di impostazione dell'immagine.
Panoramica dei passaggi critici per la preparazione di colture batteriche e pastiglie di agarose. Creato con BioRender.com. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La microscopia a immagini dal vivo mostra le differenze nel comportamento di P. aeruginosa quando cocultured con S. aureus.
Foto di P. aeruginosa (bacilli, verde) in monocultura (A) e in cocoltura con S. aureus (cocci, non marcato) (B). (C) I batteri con etichetta fluorescente consentono la visualizzazione di singole cellule P. aeruginosa che invadono gli ammassi S. aureus. Contrasto di fase e sovrapposizione dei canali GFP (in alto) e canale GFP da solo (in basso). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Scatti rappresentativi di problemi di imaging comuni che portano a un'acquisizione di immagini scadente.
(A) I cuscinetti essiccati in modo improprio e l'umidità incoerente portano alla deriva delle cellule attraverso il FOV per tutta la durata dell'imaging. La posizione della cella di fondazione è contrassegnata in ogni fotogramma (asta verde). (B) Il fototracceggio dall'esposizione alla luce per troppo tempo esaurirà i livelli rilevabili di fluorescenza per un certo periodo di tempo, ma non uccide le cellule. (C) La fototossicità a seguito della frequente esposizione alla luce porta alla morte cellulare. I primi segni di fototossicità si vedono quando le cellule smettono di fluoresciare e non riescono a dividersi. (D) Alta inoculo iniziale affolla le cellule nel FOV e impedisce l'osservazione delle interazioni interspecie. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto tra cellule S. aureus vive e morte.
Scatti rappresentativi per WT S. aureus etichettati GFP trattati con mezzo dasolo( A ) o P. aeruginosa supernatant senza cellule (B). Le cellule sono state immediatamente immagini dopo il trattamento. Le cellule vive (verdi) esprimono attivamente GFP ed escludono lo iodide propidio, mentre le cellule morte (rosse) perdono la fluorescenza GFP e la permeabilizzazione della membrana consente al propidium iodide di entrare nelle cellule e legare gli acidi nucleici. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi del tracciamento cellulare di P. aeruginosa in cocultura con S. aureus.
In precedenza, questo metodo è stato utilizzato metodo per eseguire il tracciamento cellulare di WT P. aeruginosa in coculture con WT oagrBDCA S. aureus. (A) Rappresentazione di P. aeruginosa tracce a cella singola in una cocultura con S. aureus agrBDCA. (B) Schematico per le misure Distanza Euclidica(D)) e Distanza accumulata (D(A)) utilizzate per determinare la directedness ((D(E)/D(A)). (C) Misure di regia di singole cellule WT P. aeruginosa in cocoltura con WT eagrBDCA S. aureus. Questa cifra è stata modificata da Limoli et al. 201924. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi qui presentati descrivono un protocollo per l'imaging a cellule vive delle interazioni delle specie batteriche a livello di singola cellula con modifiche per altre applicazioni, tra cui il monitoraggio delle cellule e il monitoraggio della vitalità cellulare. Questo metodo apre nuove strade per studiare i comportamenti unicelle dei microrganismi in cocoltura con altre specie nel tempo. In particolare, il protocollo dimostra l'utilità di questo metodo di cocultura nell'osservare i comportamenti della superficie batterica, in particolare quando si studiano organismi che hanno sia appendici di superficie che di liquido per la motilità. Ad esempio, limitando il movimento batterico a una superficie in un singolo piano di messa a fuoco, è possibile visualizzare la motilità mediata dal pilo aumentata e direzionale di P. aeruginosa in risposta a S. aureus.
Come accennato in precedenza, il raggiungimento di risultati ottimali con questo metodo di imaging richiede la considerazione di diverse condizioni, tra cui la temperatura e l'umidità del campione e gli strumenti di imaging (cioè obiettivi e stadio). Per ulteriori suggerimenti e risoluzione dei problemi, vedere il file supplementare 1. Un passo fondamentale per un uso efficace del protocollo è la preparazione dei cuscinetti di agarose, in quanto l'asciugatura inadeguata delle pastiglie è uno dei problemi più comuni. Come mostrato nella Figura 3A, se i cuscinetti non vengono asciugati abbastanza a lungo, la deriva appare all'inizio dell'imaging time-lapse, mentre i cuscinetti che vengono asciugati per troppo tempo iniziano a ridursi e le cellule si allontanano dal FOV poche ore nell'imaging. Garantire che tutti i materiali siano pre-riscaldati e mantenuti a temperatura e umidità uniformi per tutta la durata dell'esperimento, attraverso l'uso di un'incubatrice stage-top e di salviette senza lanugine, contribuirà a ridurre la deriva. Si consiglia inoltre di fare sempre un tampone di riserva nel caso in cui il primo pad non sia asciugato correttamente o che le lacrime si asci dalla muffa al piatto campione. Inoltre, è importante utilizzare un mezzo di bassa autofluorescenza, sia per la coltivazione di colture batteriche che per la realizzazione dei cuscinetti al fine di ridurre al minimo la fluorescenza di fondo dal mezzo durante l'imaging delle cellule. Si consiglia di utilizzare supporti minimi per la microscopia, poiché i rich media hanno spesso un'elevata autofluorescenza. A partire da un inoculum a bassa densità e anche la distribuzione spaziale delle cellule nel FOV sono anche fattori chiave in questo metodo. In particolare, in studi precedenti che valutano le interazioni P. aeruginosa e S. aureus, ciò ha permesso ai batteri di generare un gradiente sufficiente di fattori secreti che possono poi essere rilevati dalle altre specie presenti (Figura 2B).
Nonostante i vantaggi di questo metodo, ci sono anche limitazioni tra cui il suo prezzo, la natura a basso rendimento, le restrizioni di fluorescenza e l'elevata dipendenza dal controllo delle condizioni ambientali. La figura 3B-3C mostra le principali limitazioni dell'uso della microscopia a fluorescenza. Come discusso nella sezione dei risultati, se le immagini fluorescenti vengono acquisite in brevi intervalli, possono verificarsi fotosvolacca e fototossicità. Al fine di evitare questi due esiti, gli intervalli di immagini fluorescenti dovrebbero essere smontati abbastanza distanti e con il più basso tempo di esposizione alla luce fluorescente possibile per visualizzare ancora adeguatamente il fluoroforo. Inoltre, quando si determina l'intervallo per l'imaging a fluorescenza, è importante considerare il tempo di maturazione di ogni fluoroforo. I fluorofori utilizzati nei ceppi P. aeruginosa e S. aureus illustrati nella Figura 2, Figura 3 e Figura 4, ad esempio, hanno un tempo di maturazione di circa 20 minuti e possono quindi essere eccitati ogni 20 minuti senza preoccuparsi di potenziali effetti di fotobleaching. Nel frattempo, un altro svantaggio di questo metodo è che non consente osservazioni di interazioni interspecie tardivo una volta che le cellule raggiungono un'alta densità cellulare. Al fine di visualizzare le singole cellule batteriche, devono rimanere in un unico piano di messa a fuoco. Tuttavia, una volta che la popolazione raggiunge un'alta densità cellulare, le cellule iniziano a crescere in più di un piano.
Questo metodo può essere modificato per studiare diversi fenotipi come la vitalità cellulare (Figura 4) e l'espressione di geni di interesse (dati non mostrati). Figura 4 mostra un esempio di come il metodo è stato adattato per visualizzare la vitalità batterica con l'aggiunta di iodide propidio ai pastiglie di agarose. Un'altra applicazione di questo metodo è misurare l'espressione batterica genica/proteina nella cocoltura con un altro organismo attraverso giornalisti fluorescenti. Ad esempio, i fluorofori multipli possono essere incorporati in un vettore plasmide o nel cromosoma batterico per studiare contemporaneamente l'espressione di diversi geni o proteine. Qui è importante selezionare fluorofori che non hanno spettri di eccitazione e di emissione sovrapposti. Infine, l'uso del tracciamento delle cellule batteriche nell'analisi post-imaging consente di calcolare la direzionalità (Figura 5), la velocità e l'accelerazione, tra le altre misurazioni,nonché 24.
Nel complesso, questo metodo di imaging della cocoltura adattato da protocolli di monocoltura descritti in precedenza migliora la capacità di visualizzare i comportamenti di più specie batteriche nella cocoltura. Questo metodo offre l'opportunità di studiare i microbi da una prospettiva di coltura mista, che aumenterà la comprensione di come ogni specie altera i suoi comportamenti in modo uni cellula, fornendo infine nuove informazioni su come le specie batteriche interagiscono in ambienti polimicrobici.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento del Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) e NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Ringraziamo Jeffrey Meisner, Minsu Kim ed Ethan Garner per aver condiviso protocolli e consigli iniziali per l'imaging e la realizzazione di pastiglie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
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