Summary
Denne levende bakterielle cellebilleddannelse protokol giver mulighed for visualisering af interaktioner mellem flere bakteriearter på encellet niveau over tid. Time-lapse imaging giver mulighed for observation af hver bakterieart i monokultur eller coculture at afhøre interspecies interaktioner i multispecies bakterielle samfund, herunder individuelle celle motilitet og levedygtighed.
Abstract
Polymikrobielle samfund er allestedsnærværende i naturen, men at studere deres interaktioner på encellet niveau er vanskelig. Der er således udviklet en mikroskopibaseret metode til observation af interspecies-interaktioner mellem to bakteriepatogener. Brugen af denne metode til at afhøre interaktioner mellem en motile Gram-negative patogen, Pseudomonas aeruginosa og en ikke-motile Gram-positive patogen, Staphylococcus aureus er påvist her. Denne protokol består af co-inoculating hver art mellem en coverslip og en agarose pad, som fastholder cellerne i et enkelt plan og giver mulighed for visualisering af bakteriel adfærd i både rum og tid.
Desuden er den time-lapse mikroskopi demonstreret her ideel til at visualisere de tidlige interaktioner, der finder sted mellem to eller flere bakteriearter, herunder ændringer i bakteriearter motilitet i monokultur og i coculture med andre arter. På grund af karakteren af den begrænsede prøveplads i mikroskopiopsætningen er denne protokol mindre anvendelig til at studere senere interaktioner mellem bakteriearter, når cellepopulationerne er for høje. Men der er flere forskellige anvendelser af protokollen, som omfatter brugen af farvning til billeddannelse levende og døde bakterieceller, kvantificering af gen- eller proteinudtryk gennem fluorescerende journalister, og sporing bakteriel cellebevægelse i både enkelt art og multispecies eksperimenter.
Introduction
Polymikrobielle samfund er almindelige i naturen, der spænder over en rækkemiljømæssige 1,2,3 og menneskelige nicher4,5. Nogle af de mest berygtede polymikrobielle infektioner i sygdomme hos mennesker omfatter dental biofilm6, kroniskesår 7,8, og luftvejsinfektioner hos personer med kronisk obstruktiv lungesygdom9, ventilator-associeret lungebetændelse10, og den genetiske sygdom cystisk fibrose (CF)11,12. Disse infektioner er ofte sammensat af forskellige mikrobielle arter; men, en nylig fokus på samspillet mellem Gram-positive bakterien Staphylococcus aureus og Gram-negative bakterien Pseudomonas aeruginosa er opstået. Undersøgelser, der omfatter patienter, der er inficeret med disse organismer og in vitro-analyser, afslører både konkurrencedygtige og kooperative interaktioner, der kan have dybtgående og uventede påvirkninger af sygdomsprogression, mikrobiel overlevelse, virulens, stofskifte og antibiotikamodtagelighed (gennemgået i detaljer af Hotterbeekx et al. 201713 og Limoli og Hoffman 20193).
Den stigende interesse for interspecies interaktioner under infektion har givet en række metoder til at studere polymikrobielle samfund adfærd. Typisk har disse undersøgelser udnyttet plade eller bouillon-baserede analyser til at undersøge fæotypiske forskelle mellem monokultur og coculture. For eksempel har coculturing P. aeruginosa og S. aureus på faste overflader gjort det muligt at visualisere væksthæmning eller ændringer i kolonifætype, pigment eller polysaccharidproduktion14,15,16. Biofilm af blandede arter, på biotiske eller abiotiske overflader samt coculturing bakteriearter i flydende kultur har også gjort det muligt at måle ændringer i vækst, stofskifte, antibiotikatolerance, konkurrence og levedygtighed, ud over gene og protein udtryk17,18. Mens disse bulk kultur eksperimenter har afsløret indsigt i, hvordan P. aeruginosa og S. aureus kan påvirke hinanden på community-skalaen, de er ude af stand til at besvare vigtige spørgsmål om de interaktioner, der finder sted på encellet niveau. Den metode, der præsenteres her, bidrager til tilgangene til at studere interspecies interaktioner ved at fokusere på ændringer i bevægelse, celle levedygtighed, og genekspression af enkelte celler i en cocultured samfund over tid.
Single-celle interaktioner kan i vid udstrækning afvige fra de interaktioner, der finder sted i en bulk samfund af celler. Gennem encelleanalyse kan heterogenitet i et samfund kvantificeres for at undersøge, hvordan rumlig placering af celler påvirker samfundets dynamik, eller hvordan gen- og proteinudfoldelsesniveauer ændrer sig hos de enkelte medlemmer af en gruppe. Sporing af celler kan også give indsigt i, hvordan enkelte celler bevæger sig og opfører sig over tid gennem flere generationer. Ved at spore cellebevægelser og ændringer i genekspression samtidig kan der foretages korrelationer mellem genudsving og tilsvarende fænotyper. Tidligere protokoller for undersøgelse af individuelle bakteriearter på encelleniveau er blevet beskrevet. Disse undersøgelser drage fordel af live-imaging celler over tid i et enkelt plan, og har været nyttige til at observere fænotyper som celledeling og antibiotika modtagelighed19,20. Yderligere levende-imaging mikroskopi er blevet udnyttet til at overvåge vækst, motilitet, overflade kolonisering og biofilm dannelse af enkelt bakteriearter21,,22,23. Men mens disse undersøgelser har været indsigtsfulde for at forstå fysiologi af bakterier i monokultur, eksperimenter for at observere encellede adfærd af flere bakteriearter over tid i coculture er begrænset.
Her er tidligere protokoller, der anvendes til billeddannelse af en enkelt art, blevet tilpasset til at undersøge interaktioner mellem P. aeruginosa og S. aureus. Disse organismer kan differentieres under fasekontrast baseret på deres cellemorfologi (P. aeruginosa er bacilli og S. aureus er cocci). Udvikling af denne metode for nylig aktiveret visualisering af tidligere ubeskrevet motilitet adfærd P. aeruginosa i overværelse af S. aureus24. P. aeruginosa viste sig at være i stand til at føle S. aureus på afstand og reagere med øgede og retningsbestemte encellede bevægelser mod klynger af S. aureus celler. P. aeruginosa bevægelse mod S. aureus blev anset for at kræve den type IV pili (TFP), hår-lignende fremskrivninger, hvis koordinerede udvidelse og tilbagetrækning generere en bevægelse kaldet trækninger motilitet25.
Disse undersøgelser viser nytten af denne metode til afhøring af tidligere interaktioner mellem arter. Billeddannelse ved høje celletætheder ved senere interaktionspunkter er imidlertid vanskelig, da enkelte lag af celler ikke længere kan identificeres, hvilket for det meste giver problemer under analyse efter billeddannelse. I betragtning af denne begrænsning, metoden er bedst egnet til tidligere interaktioner, som derefter kunne følges op med traditionelle makroskopiske analyser ved højere celletætheder repræsentativ for senere interaktioner. Yderligere begrænsninger af denne metode omfatter lav-throughput karakter, da kun én prøve kan afbildes ad gangen, og omkostningerne ved mikroskop, kamera og miljøkammer. Desuden fluorescensmikroskopi udgør en risiko for bakterieceller som fototoksicitet og fotobleaching, hvilket begrænser hyppigheden af fluorescensbilleder kan erhverves. Endelig er de agarosepuder, der anvendes i denne metode, meget modtagelige for ændringer i miljøet, hvilket gør det afgørende at kontrollere for forhold som temperatur og fugtighed, da puderne kan begynde at skrumpe eller udvide, hvis betingelserne ikke er korrekte. Endelig, mens denne metode ikke efterligner værtsmiljøet, det giver fingerpeg om, hvordan forskellige bakteriearter reagere på overflader, som kan følges op i analyser designet til at efterligne miljø / vært betingelser.
Denne metode adskiller sig fra tidligere undersøgelser sporing enkeltcellebevægelse, i, at celler er podet mellem en coverslip og agarose pad, begrænse celler til overfladen. Dette muliggør cellesporing over tid i et enkelt plan. begrænser dog cyklusser af forbigående overfladeengagement observeret, når cellerne nedsænkes i væske26. En yderligere fordel ved billeddannelse bakterier under en agarose pad er, at det efterligner makroskopisk plade-baserede sub-overflade vaccination assays klassisk anvendes til at undersøge P. aeruginosa trækninger motilitet25. I denne analyse podes bakterieceller mellem bunden af en petriskål og agaren, hvilket holder cellerne i et enkelt plan, når de bevæger sig hen over bunden af skålen udad fra vaccinationspunktet, ligesom denne mikroskopiprotokol.
Den tidsforskænde mikroskopiprotokol til visualisering af interartinteraktioner, der præsenteres her, består af 1) forberedelse af bakterieprøven og agarosepuden, 2) valg af mikroskopindstillinger for billeddannelse og 3) post-imaging analyse. Detaljeret visualisering af cellebevægelse og -sporing kan udføres ved erhvervelse af billeder med korte tidsintervaller efter fasekontrast. Fluorescensmikroskopi kan også anvendes til at bestemme celle levedygtighed eller genekspression over tid. Her viser vi et eksempel på tilpasning til fluorescensmikroskopi ved tilsætning af levedygtighedsfarvestoffer til agarosepuderne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: En komplet beskrivelse og katalognumre for alle forbrugsstoffer i denne protokol findes i materialetabellen.
1. Udarbejdelse af M8T minimale medier
- Der tilberedes 1 L M8 minimal saltbase (5x) ved at opløse 64 g Na2HPO4·7H2O, 15 g KH2PO4og 2,5 g NaCl i 800 ml ultrarent vand (UPW, resistivitet 18 MΩ/cm) i en 2 L-flaske. pH til 7,6. Komplet volumen til 1 L med UPW. Autoklave i 45 min.
- Der klargør 500 ml glukoseopløsning (20 % w/v) ved at opløse 100 g glukose i 400 ml UPW i en 1 L-flaske. Komplet løsning til 500 ml med UPW. Autoklave i 45 min.
- Der klargør 500 ml prøveptoneopløsning (20 % w/v) ved at opløse 100 g trypton i 400 ml UPW. Komplet til 500 ml med UPW. Autoklave i 45 min.
- Der tilberedes 1 L M8 + 10 % tryptone (M8T) minimalt medie ved at tilsætte 200 ml 5x M8 minimale salte (1x endelig), 10 ml 20 % glukose (20 % glukose(20% 0,2 % endelig), 1 ml 1 M MgSO4 (1 mM endelig) og 50 ml 20 % prøveptone (1% endelig) til 600 ml UPW. Komplet til 1 L med UPW. Gennemse et 0,2 μm sterilt filter i en steril 500 ml medieopbevaringsflaske.
Dag 1:
2. Forberedelse af bakterielle natten kulturer
- Inokuler 5 ml M8T minimale medier med en enkelt koloni P. aeruginosa eller S. aureus (herunder antibiotika, når det er relevant) og inkuberes natten over ved 37 °C med befrugtning i højst 16 timer.
BEMÆRK: De bakterielle patogener P. aeruginosa og S. aureus blev brugt til denne metode, fordi de er almindeligt coisolated fra kroniske infektioner, og studere deres interaktioner er vigtigt at forstå, hvordan de bidrager til patientens resultater under polymikrobielle infektioner. Andre bakteriearter kan anvendes afhængigt af undersøgelsens fokus.
Dag 2:
3. Subkultur af bakteriestammer
- Subkultur P. aeruginosa 1:500 og S. aureus 1:1000 i 5 ml frisk M8T (omfatter antibiotika, når det er relevant). Inkuberes med belægning ved 37 °C, indtil kulturerne når midten af logfasen (OD600 = ~0,3 - 0,5).
4. Fremstilling af materialer til pad forme
- Forbered metalspande ved opvarmning af enden af en flad, afrundet laboratoriespatel med en Bunsen-brænder, indtil halvdelen af den flade ende kan bøjes til en vinkel på 90°. Slutningen af en anden flad, afrundet laboratoriespatel opvarmes, og de sidste 10 mm bøjes en smule til en vinkel på 45 °C.
- Skær de fire hjørner af silikone forme, så formene passer ind i en 35 mm skål.
- Steriliser spatler og et par pincet ved at tilføje 70% ethanol og passerer dem gennem flammen af Bunsen brænderen.
- Rengør skålen og silikoneforme med 70% ethanol og tør dem med fnugfri klude.
5. Forberedelse af agarosepuder
BEMÆRK: Puderne fremstilles med M8T-minimale medier som næringsstofkilde for de bakterier, der anvendes i denne protokol. Men de næringsstoffer, der anvendes i puder kan ændres for forskellige organismer.
- Smelt 2% lavsmelt agarose i 10 ml M8T i en ren 50 ml Erlenmeyerkolbe. Mikrobølgeovn med korte mellemrum (2-5 s), indtil agarose er i opløsning for at forhindre indholdet af kolben i at koge over. Når det er smeltet, skal det køle af i et 50 °C vandbad i mindst 15 min.
- Forbered forme ved at tilpasse silikone udskæringen med åbningen i 35 mm parabol og tryk let med spatel for at sikre silikone til fadet, og for at fjerne alle luftbobler mellem formen og fadet.
- Når cool, pipette 915 μL af smeltet agarose i formen. Lad låget stå på klem og lad puden tørre ved stuetemperatur i 30 min.
- Dæk skålen med låget og lad ved stuetemperatur i yderligere 2 timer.
- Forbered fugtighedsservietter ved stramt at rulle op en fnug-fri tørre. Placer den valsede tørre i en steril petriskål og tilsættes jævnt 500 μL sterilt vand over tørret. Varm til 37 °C i 1 time.
- Puden opvarmes og en steril 35 mm skål til 37 °C i 1 time.
6. Fremstilling af bakterieceller og podningspuder
- OD600 for hver subkultur måles, og P. aeruginosa fortyndes til en OD600 = 0,03 og S. aureus til en OD600 = 0,10 i M8T på forankret til 37 °C. Bland P. aeruginosa og S. aureus i et 1:1 forhold og vortex.
BEMÆRK: Hvis stammer kræver antibiotika, kan antibiotika tilsættes til natten og subkultur, men bør ikke tilsættes, når blanding arter til billeddannelse, hvis det påvirker de andre arter i coculture. Plasmid stabilitet og virkningerne af antibiotika på alle arter i coculture skal bestemmes for hver organisme / plasmid anvendes. - Pipette 1 μL coculture jævnt over bunden af en forvarmet, steril 35 mm glas coverslip fad.
- Fjern silikone udskæring fra formen ved hjælp af sterile pincet.
- Fjern puden fra skålen med sterile spatler.
- Slip den let bøjede spatel under kanten af puden, mens du holder formen på hovedet, at droppe det ud på en steril Petri plade låg.
BEMÆRK: Pas på ikke at tvinge puden ud, ellers flår den. Hold styr på, hvilken side af puden der er nederst.
- Slip den let bøjede spatel under kanten af puden, mens du holder formen på hovedet, at droppe det ud på en steril Petri plade låg.
- Overfør puden til skålen med bakteriecellerne nederst på siden af hinanden ved at skubbe den 90° vinklede spatel under puden og placere den oven på den podede dækslæb. Brug den 90° vinklede spatel til at få puden til at flugte mod dækslæden og forsigtigt presse eventuelle luftbobler ud.
- Fjern overskydende fugt fra fugtige klude derefter placere omkring kanten af skålen, og sørg for at det ikke rører puden. Prøven er nu klar til billedbehandling.
7. Opsætning af mikroskopet til levende billeddannelse
- Varme miljøkammeret til 37 °C mindst 2 timer før forsøgsopsætter.
- Tænd for alle komponenter, herunder mikroskop, computer og lyskilder til brightfield og fluorescens-billedbehandling.
- Åbn billedbehandlingssoftwaren, og sørg for, at lyskilderne er tilsluttet og kører.
- Udfør Köhler belysning27 for at justere alle billedplaner.
- Først bringe markeret coverslip i fokus med en 20x mål ved hjælp af en "dummy" parabol. Sørg for, at kondensatortårnet er indstillet til den "åbne" position.
BEMÆRK: Der skal udføres Köhler-belysning for hver enkelt mål/prøve for at justere billedplaner korrekt. Men fokus og tilpasning med "dummy" parabol på lavere forstørrelse fremskynder set-up på levende prøver ved højere forstørrelse for at begrænse tiden mellem set-up og eksperiment starttid. - Fokuser kondensatoren.
- Luk markmembranen.
BEMÆRK: Der skal vises en ottekantet blænde. Hvis kondensatoren er helt ude af fokus, vises hele synsfeltet (FOV) mørkt. - Drej kondensatoren fokusering knapper, indtil ottekanter er sprøde.
BEMÆRK: Lysintensiteten øges, når billedflyene nærmer sig den korrekte justering.
- Luk markmembranen.
- Juster kondensatoren.
- Centrer feltkondensatoren ved at justere justeringsknapperne.
BEMÆRK: Ottekanten skal være centreret til midten af FOV. Justeringsknapperne varierer afhængigt af mikroskopet. For eksempel har nogle mikroskop kondensatorer knapper, mens andre har skruer, der kræver en skruetrækker.
- Centrer feltkondensatoren ved at justere justeringsknapperne.
- Fokuser lampetråden, og juster kondensatoråbningen.
- Placer et faseteleskop eller Bertrand-objektiv i lysvejen for at observere målets bagkaldeplan.
BEMÆRK: Der skal være to koncentriske cirkler. - Drej Bertrand linse fokus knappen, indtil ringene ser sprød.
- Fjern Bertrand-objektivet fra lysvejen.
- Placer et faseteleskop eller Bertrand-objektiv i lysvejen for at observere målets bagkaldeplan.
- Åbn feltmembranen, indtil ottekanten er lige uden for FOV.
- Skift til 100x objektivet, og skub den matchende fasering på plads, før du tilføjer en dråbe nedsænkningsolie, og placer den forberedte prøveskål ovenpå.
- Udfør Köhler belysning på 100x mål med bakteriel prøve parabol.
- Først bringe markeret coverslip i fokus med en 20x mål ved hjælp af en "dummy" parabol. Sørg for, at kondensatortårnet er indstillet til den "åbne" position.
- Fokuser kun på bakterierne ved hjælp af finjusteringen. Når bakterierne i FOV er fokuseret gennem okularet, skal du skifte lysvejen til kameraet ved at trykke på kameraknappen på mikroskopet.
- Klik på indstillingen Fase i billedsoftwaren.
- Juster procentdelen af DIA LED-lys, der udsendes, ved at vælge lyskilden i softwaren og enten manuelt indtaste den ønskede procentdel af lys, der skal bruges, eller ved at skubbe baren på lysprocentskalaen.
- Juster DIA LED-lyseksponeringstiden ved at klikke på lyskilden og enten manuelt indtaste den ønskede eksponeringstid eller vælge en eksponeringstid fra den medfølgende rullemenu.
BEMÆRK: Eksponeringstiden varierer afhængigt af det anvendte kamera. - Hvis du bruger fluorescens, skal du justere kameraindstillingerne i hver tilsvarende kanal (dvs.
- Indstil den procentdel af fluorescenslys, der udsendes, og juster derefter eksponeringstiden (som udført i trin 7.7 og 7.8 for DIA LED-lys).
- Du kan også ændre bitdybden for at justere det dynamiske område ved at vælge en af de andre bitdybdeindstillinger i rullemenuen visualiseringskontrolelementer.
- Vælg de XY-interessepositioner ved at klikke på XY-indstillingen i menuen anskaffelseskontrolelementer.
- Flyt scenen position med glæde stick, eller ved at klikke og trække FOV på skærmen, og klik på den tomme boks for at gemme X og Y koordinater for en bestemt position.
BEMÆRK: Valg af højst tre forskellige XY-positioner, der ligger så tæt på hinanden som muligt, anbefales til time-lapse-anskaffelse.
- Flyt scenen position med glæde stick, eller ved at klikke og trække FOV på skærmen, og klik på den tomme boks for at gemme X og Y koordinater for en bestemt position.
- Tænd for det perfekte fokussystem (PFS) ved enten at klikke på PFS-boksen under XY-fanen i kontrolmenuen for anskaffelse eller trykke på PFS-knappen på joystick-kontrolpanelet.
- Drej de fine justeringsknapper for at fokusere på bakteriecellerne.
- Klik på PFS-knappen for hver XY-position, når cellerne er i det ønskede fokusplan.
BEMÆRK: PFS kompenserer for afdrift i Z-aksen under time-lapse-eksperimenter. Dette er nødvendigt for at opretholde fokus på bakterieceller over tid. Forskellige producenter har forskellige kompensationssystemer. - Vælg betingelserne for anskaffelse af billeder, herunder anskaffelsesinterval og frekvens for hver kanal (f.eks. fasekontrast og hver fluorfil) ved at vælge mellem indstillingerne i anskaffelseskontrolmenuen.
BEMÆRK: For de eksperimenter, der præsenteres her, fase kontrast billeder er erhvervet med mellemrum hver 5-10 s, mens fluorescens billeder i GFP og TxRed kanaler er erhvervet hver 20 min. - Begynd billeddannelse, når mikroskopet og anskaffelsesindstillingerne er konfigureret.
8. Valgfri: Ændringer for levende/døde billeddannelser
- Smelt 2% agarose i 10 ml M8T og lad afkøle i 50 °C vandbad i mindst 15 min.
- Tilsæt 1 mM propidiumdodid til det smeltede agarose.
- Når afkølet, pipette 915 μL agarose i den forberedte skimmel.
- Lad låget stå på klem og lad puden tørre ved stuetemperatur i 30 min. Beskyt mod lys.
- Dæk skålen med låget og lad ved stuetemperatur i yderligere 2 timer.
- Tilbered fugtighedsservietter.
- Rul en fnugfri papir tørre op stramt.
- Tørd i en steril petriskål og tilsæt 500 μL sterilt vand til tørret.
- Inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Padden og en steril 35 mm skål kl.
- Skålen podes som angivet i afsnit 6: Fremstilling af bakterieceller og podningspuder.
9. Dataanalyse
- Identifikation af celler
- Åbn billedfilen i billedbehandlingssoftwaren, og beskær filen, så den kun omfatter de rammer, der skal bruges til sporing, zoomet ind på de celler, der er af interesse, og kun i fasekontrastkanalen.
BEMÆRK: Den beskårne fil kan gemmes som en ny fil, hvor sporingsdata kan gemmes uden at forstyrre den oprindelige fil. - Vælg indstillingen for at vælge interesseområder i menuen analysekontrolelementer, og definer ROI'er ved at spore enten individuelle bakterieceller eller klynger af celler i den første ramme, der skal bruges til analyse.
BEMÆRK: ROI'erne kan enten defineres manuelt eller som binære filer.- Definere investeringsafkast manuelt
- Spor omkredsen af hver enkelt bakteriecelle eller klynger af celler for manuelt at definere ROI'erne.
BEMÆRK: I analysesoftwaren kan P. aeruginosaeller andre stangformede celler spores manuelt ved at vælge ellipse-roi og tegne en ellipse, der er justeret til bakteriecellens størrelse. Alternativt kan indstillingen Polygon ROI vælges for at spore ikke-traditionelle,formede ROI'er, f.eks.
- Spor omkredsen af hver enkelt bakteriecelle eller klynger af celler for manuelt at definere ROI'erne.
- Identificer binære INVESTERINGSAFKAST
- Klik på indstillingen Binær til roi for at definere binære ROI'er.
BEMÆRK: Objekter defineres i et binært lag baseret på adskillelse af de mørkere pixelerede bakterieceller fra den lysere pixelerede baggrund i fasekontrastkanalen. - Hvis du vil begrænse cellerne, skal du vælge indstillingen Tærskel i menuen analysekontrolelementer. Vælg den kanal, der er interesseret, og skub søjlerne i fluorescens histogrammet for at justere tærskelintervalværdierne.
BEMÆRK: Binær objektidentifikation for ROI'er kan også defineres i lysstofrør ved at begrænse bakteriecellerne. Ved tærskelværdier fastsættes det, hvilke fluorescensintensiteter der betragtes som objekter, og hvilke fluorescensintensiteter udgør baggrunden.
- Klik på indstillingen Binær til roi for at definere binære ROI'er.
- Definere investeringsafkast manuelt
- Åbn billedfilen i billedbehandlingssoftwaren, og beskær filen, så den kun omfatter de rammer, der skal bruges til sporing, zoomet ind på de celler, der er af interesse, og kun i fasekontrastkanalen.
- Sporing af celler
- Hvis du manuelt vil spore investeringsafkast, skal du markere den næste ramme i billedsekvensen og justere placeringen af investeringsafkastet ved at klikke og trække på hvert investeringsafkast for at tilpasse det nye position for den oprindelige bakteriecelle.
BEMÆRK: Hvis bakteriecellerne ikke har ændret position, behøver ROI'erne ikke at blive flyttet. - Gentag i alle sekventielle rammer, som celler skal spores for.
- Når celler deler sig, skal du definere dattercellerne som nye ROI'er, som beskrevet i trin 9.1, og begynde at spore de nyligt opdelte celler.
BEMÆRK: Hvis celler identificeres som binære filer, skal du bruge funktionen Spor binære filer til automatisk at spore ROI'er i udvalgte rammer. - Når cellerne er blevet sporet gennem alle markerede rammer, skal du eksportere de data, der skal analyseres.
- Åbn dataregnearket, og identificer de målinger, der kræves til analyse (dvs. objekthastighed, acceleration eller kurvelængde).
BEMÆRK: I tilfælde af måling af anvisthed kræves målingerne Banelængde og Linjelængde. Linjen Længde er en måling af den euclidiske afstand, eller den lige afstand fra sporet oprindelse til kanten af S. aureus koloni. Stilængden er en måling af den akkumulerede afstand eller summen af sporsegmenter fra alle rammer. An dirigerethed kan beregnes som et forhold mellem den euklimatiske afstand, D(E), (Linjelængde) over den akkumulerede afstand, D(A), (Stilængde).
- Hvis du manuelt vil spore investeringsafkast, skal du markere den næste ramme i billedsekvensen og justere placeringen af investeringsafkastet ved at klikke og trække på hvert investeringsafkast for at tilpasse det nye position for den oprindelige bakteriecelle.
- Kvantificering af fluorescens
- Definer ROI'er for fluorescerende bakterieceller som beskrevet i trin 9.1.
- Gentag sporing eller bevægelse af ROI'er for bakterieceller eller klynger i de resterende lysstofrør.
- Eksporter den genererede tabel til en regnearksfil til analyse af lysstofrør.
- I dataregnearket skal du kigge efter kolonnen med "Middelintensitet", som repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet for den (de sporede bakterieceller) investeringsafkast.
- Grafer værdierne middelintensitet for at se på ændringerne i fluorescens over tid.
BEMÆRK: Ændringerne i fluorescens over tid repræsenterer udsving i genekspression for fluorescerende mærket gen af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket brug af den beskrevne metode vil resultere i en række billeder, der genererer en video, hvor interspecies interaktioner kan observeres over tid. Skemaet i figur 1 giver en visuel for at fremhæve de vigtigste trin, der er involveret i forberedelsen af materialer til billedbehandling. Brug af denne metode har gjort det muligt at demonstrere P. aeruginosa celler udviser forskellige adfærd i monokultur versus i coculture med S. aureus. Sammenlignet med P. aeruginosa celler i monokultur, der forbliver grupperet i flåder, når i coculture med S. aureus, P. aeruginosa har øget encellet motilitet mod S. aureus kolonier (Figur 2A-2B). Fluorescerende mærket bakteriestammer giver også mulighed for at visualisere blandede populationer af bakteriearter. Ved hjælp af GFP-mærket P. aeruginosa tilladt observation, at efter P. aeruginosa enkelte celler stigning i motilitet, vil de omgive og i sidste ende invadere S. aureus kolonier (Figur 2C). Udnyttelse af fluorescerende markerede celler giver også mulighed for visualisering af P. aeruginosa celle invasion i S. aureus kolonier for første gang(Figur 2C,bund).
Mens protokollen giver billeder af høj kvalitet til observation af interspecies interaktioner, er der flere almindelige problemer, der kan føre til rammesekvenser af dårlig kvalitet. Inkonsekvent fugtighed over varigheden af forsøget og forkert tørrede puder er to almindelige problemer, der fører til drift som følge af puden skiftende og trække cellerne med det ud af FOV (Figur 3A). Ændringer i fugtighed påvirker tørheden af agarosepuderne. Øget luftfugtighed gør puderne for våde, så fugten kan falde til mellem puden og bunden af glasbundet. Fugten efterlader et lag af væske tyk nok til motile celler til at sværme eller svømme igennem og ikke holde bakterieceller i et enkelt plan. I mellemtiden, fald i luftfugtigheden tørre ud puden hurtigere, hvilket forårsager celler til at glide tidligt. En anden almindelig fejl, når du bruger denne metode med fluorescens er at erhverve fluorescerende billeder for ofte eller udsætte bakterieceller til fluorescerende lys for længe. Korte anskaffelsesintervaller for fluorescerende billeder ophidser gentagne gange fluorofob med høj intensitetslys af en bestemt bølgelængde. Ophidset fluorophores derefter reagere med ilt, forårsager nedbrydning af fluorophore. Den resulterende fotobleaching nedbryder fluorescens, indtil mere af fluorophore kan udtrykkes og foldes, men ikke skader bakteriecellerne selv (Figur 3B). Tab af fluorescens, dog, forstyrrer målinger af gen / protein udtryk, forlader cellerne markørløs, indtil fluorophore kan være fuldt syntetiseret og ophidset igen. Desuden kan ilt interagere med ophidset fluorophores danne reaktive ilt arter (ROS). Disse ROS radikaler derefter skade bakterieceller, i sidste ende bliver giftige og resulterer i celledød inden for et par celledelinger (Figur 3C). Processerne for fotobleaching og fototoksicitet kan let ses som celler vil først miste deres fluorescens helt, og i efterfølgende rammer, vil cellerne stoppe dividere og kan i sidste ende dø (Figur 3B-3C). Et sidste fælles problem ved opstillingen af eksperimentet er at starte med for mange celler pr. FOV eller med celler for tæt på hinanden, hvilket generelt er mindre end 20 μm fra hinanden. Overfyldte celler i den første ramme vil give klynger af dividere celler, der blot fusionere ind i hinanden, som de vokser i stedet interagere. Desuden kan celler, der begynder for tæt på i nærheden, ikke have tilstrækkelig tid til at etablere en gradient af udskillede signaler, som de andre arter kan reagere på (Figur 3D),mens fjerne bakterieceller måske ikke har mulighed for at møde hinanden inden for forsøgets varighed.
Figur 4 viser et eksempel på, hvordan bakteriecellens levedygtighed kan visualiseres med denne protokol ved at tilføje propidiumidodid til agarosepuderne. Propidium iodid er uigennemtrængelig for levende celler, men kan komme ind i celler med beskadigede membraner og binde sig til nukleinsyrer. Her blev mid-log GFP-mærket WT S. aureus behandlet med medier alene eller med cellefri supernatant afledt af P. aeruginosa og afbildet umiddelbart efter behandlingen. Tre forskellige kanaler blev afbildet: Fase, TxRed og GFP. Lyse grønne celler indikerer levende celler, der aktivt udtrykker GFP som set for S. aureus behandlet kun med medier (Figur 4A), og røde blodlegemer indikerer døde propidiumidodid-farvede S. aureus celler, efter at være blevet behandlet med P. aeruginosa supernatant (Figur 4B). Mens der kun vises ét tidspunkt, kan denne metode tilpasses for at bestemme cellernes levedygtighed under time-lapse live imaging.
Der kan udføres flere postbilledanalyser for at kvantificere aspekter af samspillet mellem arter. For eksempel kan cellesporing give målinger for rettethed af P. aeruginosa enkelt celle bevægelser mod en klynge af S. aureus. Bevægelserne af de enkelte P. aeruginosa celler spores fra rammen en celle forlader flåden gennem rammen, hvor cellen når S. aureus klynge (Figur 5A). Afstanden mellem P. aeruginosa-flåden og S. aureus-klyngen giver den euklimatiske afstand, D(E),mens de samlede sporlængder giver den akkumulerede afstand, D(A) (Figur 5B). Hver celles anvisthed beregnes som et forhold mellem D(E)/D(A). I coculture-forsøgene bevægede WT P. aeruginosa sig mod WT S. aureus med betydeligt højere rettethed end mod S. aureus ΔagrBDCA, en mutant, der manglede Agr-regulerede udskillede faktorer, som tidligere var fast besluttet på at være nødvendig for retningsbestemt motilitet mod S. aureus24 (Figur 5C).
Figur 1: Skematisk af billedopsætningsprotokollen.
Oversigt over kritiske trin til fremstilling af bakteriekulturer og agarosepuder. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Time-lapse, live-imaging mikroskopi viser forskelle i P. aeruginosa adfærd, når cocultured med S. aureus.
Repræsentative snap shots af P. aeruginosa (bacilli, grøn) i monokultur (A) og i coculture med S. aureus (cocci, umærket) (B). (C) Fluorescerende mærkede bakterier giver mulighed for visualisering af P. aeruginosa enkeltceller invaderende S. aureus klynger. Fasekontrast og GFP-kanaloverlejring (øverst) og GFP-kanal alene (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative snapbilleder af almindelige billedbehandlingsproblemer, der fører til dårlig billedoptagelse.
(A)Forkert tørrede puder og inkonsekvent fugtighed føre til drivende af celler på tværs af FOV i løbet af varigheden af billeddannelse. Placeringen af den stiftende celle er markeret i hver ramme (grøn stang). (B)Photobleaching fra udsættelse for lys for længe vil nedbryder påviselige niveauer af fluorescens i en periode, men ikke dræbe cellerne. c) Fototoksicitet som følge af hyppig udsættelse for lys fører til celledød. De første tegn på fototoksicitet ses, når cellerne holder op med at fluorescere og undlader at dele. D)Høj indledende inoculum skarer celler i FOV og forhindrer observation af interspecies interaktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af levende versus døde S. aureus celler.
Repræsentative snap shots for GFP-mærket WT S. aureus behandlet med enten medium alene (A) eller celle-fri P. aeruginosa supernatant (B). Cellerne blev straks afbildet efter behandlingen. Levende celler (grøn) aktivt udtrykke GFP og udelukke propidium iodid, mens døde celler (rød) mister GFP fluorescens og membran permeabilization tillader propidium iodid at komme ind i cellerne og binde nukleinsyrer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Cellesporingsanalyse af P. aeruginosa i cokultur med S. aureus.
Tidligere blev denne metode anvendt metode til at udføre cellesporing af WT P. aeruginosa i coculture med enten WT eller ΔagrBDCA S. aureus. aA) Repræsentation af P. aeruginosa encellede spor i en coculture med S. aureus ΔagrBDCA. bB) Skematisk for de euklimatiske afstande (D(E)) og de akkumulerede afstandsmålinger (D(A),der anvendes til at bestemme rettethed ((D(E)/D(A)). cC) Målinger af an dirigerethed af enkelte WT P. aeruginosa-celler i coculture med WT og ΔagrBDCA S. aureus. Dette tal er ændret fra Limoli et al. 201924. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der præsenteres her, beskriver en protokol for livecellebilleddannelse af bakteriearters interaktioner på encelleniveau med modifikationer til andre anvendelser, herunder cellesporing og overvågning af cellernes levedygtighed. Denne metode åbner nye muligheder for at studere encellede adfærd mikroorganismer i coculture med andre arter over tid. Specifikt, protokollen viser nytten af denne coculture metode til at observere bakteriel overflade adfærd, især når man studerer organismer, der har både overflade og flydende-associerede vedhæng for motilitet. For eksempel, ved at begrænse bakteriel bevægelse til en overflade i et enkelt plan af fokus, den øgede og retningsbestemt pili-medieret motilitet af P. aeruginosa som reaktion på S. aureus kan visualiseres.
Som tidligere nævnt kræver det at opnå optimale resultater med denne billeddannelsesmetode, at der tages hensyn til flere forhold, herunder temperatur og fugtighed i prøven og billedinstrumenter (dvs. mål og fase). Yderligere tip og fejlfinding finder du i Supplerende fil 1. Et kritisk skridt i en vellykket brug af protokollen er forberedelse af agarose puder, som utilstrækkeligt tørring puder er et af de mest almindelige problemer. Som vist i figur 3A, hvis puderne ikke tørres længe nok, glider der i begyndelsen af time-lapse-billeddannelsen, mens puder, der tørres for længe, begynder at skrumpe ind, og cellerne glider ud af FOV et par timer i billeddannelse. Sikring af, at alle materialer er forvarplet og vedligeholdt ved ensartet temperatur og fugtighed i løbet af forsøgets varighed, ved hjælp af en fase-top inkubator og fugtig fnugfri klude, vil bidrage til at reducere afdrift. Det tilrådes også, at en backup pad altid er lavet i tilfælde af den første pad ikke tørres ordentligt eller tårer under overførsel fra formen til prøven parabol. Derudover er det vigtigt at bruge en lav-autofluorescens medium, både for voksende bakteriekulturer og for at gøre puder for at minimere baggrunden fluorescens fra mediet, når imaging cellerne. Det anbefales at bruge minimale medier til mikroskopi, da rige medier ofte har høj autofluorescens. Begyndende med en lav densitet inoculum og endda rumlig fordeling af celler i FOV er også vigtige faktorer i denne metode. Specifikt, i tidligere undersøgelser evaluere P. aeruginosa og S. aureus interaktioner, dette gjorde det muligt for bakterierne at generere en tilstrækkelig gradient af udskillede faktorer, som derefter kan påvises af de andre arter til stede (Figur 2B).
På trods af fordelene ved denne metode, er der også begrænsninger, herunder dens pris, lav-throughput karakter, fluorescens restriktioner, og høj afhængighed af at kontrollere miljøforhold. Figur 3B-3C viser de vigtigste begrænsninger ved brug af fluorescensmikroskopi. Som beskrevet i resultatafsnittet kan der forekomme fotobleachs og fototoksicitet, hvis lysstofrørdebillederne fanges med korte intervaller. For at undgå disse to resultater, fluorescerende billede intervaller bør tages langt nok fra hinanden og med så lavt fluorescerende lys eksponeringstid som muligt til stadig tilstrækkeligt visualisere fluorophore. Ved bestemmelse af intervallet for fluorescensbilleddannelse er det desuden vigtigt at overveje modningstiden for hver fluorophore. De fluorophores, der anvendes i P. aeruginosa- og S. aureus-stammerne, vist i figur 2, figur 3 og figur 4,har f.eks. I mellemtiden er en anden ulempe ved denne metode, at den ikke giver mulighed for observationer af sene interspecies interaktioner, når cellerne når en høj celletæthed. For at visualisere individuelle bakterieceller, skal de forblive i et enkelt plan af fokus. Men når befolkningen når en høj celletæthed, cellerne begynder at vokse i mere end ét plan.
Denne metode kan ændres for at undersøge forskellige fænotyper såsom celle levedygtighed (Figur 4) og udtryk for gener af interesse (data ikke vist). Figur 4 viser et eksempel på, hvordan metoden er blevet tilpasset til at visualisere bakteriel levedygtighed ved at tilføje propidium iodid til agarose puder. En anden anvendelse af denne metode er måling bakteriel gen / protein udtryk i coculture med en anden organisme gennem fluorescerende journalister. For eksempel kan flere fluorophores indarbejdes i en plasmid vektor eller bakterielt kromosom til samtidig at studere udtryk for forskellige gener eller proteiner. Her er det vigtigt at vælge fluorophores, der ikke har overlappende excitation og emission spektre. Endelig gør brugen af sporing af bakterieceller i post-imaging analyse det muligt at beregne retningsaliteten (figur 5), hastighed og acceleration, blandt andre målinger, samt24.
Samlet set denne coculture billeddannelse metode tilpasset fra tidligere beskrevne monokultur protokoller øger evnen til at visualisere adfærd flere bakteriearter i coculture. Denne metode giver mulighed for at studere mikrober fra en blandet kultur perspektiv, som vil øge forståelsen af, hvordan hver art ændrer sin adfærd i en enkelt-celle måde, i sidste ende giver ny indsigt i, hvordan bakteriearter interagerer i polymikrobielle miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Cystisk Fibrose Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystisk Fibrose Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), og NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Vi takker Jeffrey Meisner, Minsu Kim og Ethan Garner for at dele indledende protokoller og råd til billedbehandling og gøre puder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
