Summary
Detta live-bakteriell cell imaging protokoll möjliggör visualisering av interaktioner mellan flera bakteriearter på encellsnivå över tiden. Time-lapse imaging möjliggör observation av varje bakterieart i monokultur eller kokultur att förhöra interspecies interaktioner i multispecies bakteriella samhällen, inklusive enskilda cell motilitet och livskraft.
Abstract
Polymikrobiella samhällen är allestädes närvarande i naturen, men att studera deras interaktioner på encellig nivå är svårt. Således har en mikroskopibaserad metod utvecklats för att observera interspecies interaktioner mellan två bakteriella patogener. Användningen av denna metod för att förhöra interaktioner mellan en motil Gram-negativa patogen, Pseudomonas aeruginosa och en icke-motila Gram-positiva patogen, Staphylococcus aureus påvisas här. Detta protokoll består av co-inoculating varje art mellan en coverslip och en agaros pad, som upprätthåller cellerna i ett enda plan och möjliggör visualisering av bakteriella beteenden i både tid och rum.
Dessutom är den timelapskopia som demonstreras här idealisk för att visualisera de tidiga interaktioner som sker mellan två eller flera bakteriearter, inklusive förändringar i bakteriearters motilitet i monokultur och i kokultur med andra arter. På grund av arten av det begränsade provutrymmet i mikroskopiupplägget är detta protokoll mindre tillämpligt för att studera senare interaktioner mellan bakteriearter när cellpopulationerna är för höga. Det finns dock flera olika tillämpningar av protokollet som inkluderar användning av färgning för avbildning levande och döda bakterieceller, kvantifiering av gen eller protein uttryck genom fluorescerande reportrar, och spåra bakteriell cellrörelse i både enstaka arter och multiarter experiment.
Introduction
Polymikrobiella samhällen är vanliga i naturen, som spänner över en mängdolika miljömässiga 1,2,3 och mänskliga nischer4,5. Några av de mest ökända polymikrobiella infektioner i mänskliga sjukdomar inkluderar dentala biofilmer6, kroniska sår7,8, och luftvägsinfektioner hos individer med kronisk obstruktiv lungsjukdom9, ventilator-associeradelunginflammation 10, och den genetiska sjukdomen cystisk fibros (CF)11,12. Dessa infektioner är ofta består av olika mikrobiella arter; men en nyligen inriktad på samspelet mellan den Grampositiva bakterien Staphylococcus aureus och den Gramnegativa bakterien Pseudomonas aeruginosa har uppstått. Studier som inkluderar patienter som är myntade med dessa organismer och in vitro-analyser avslöjar både konkurrensmässiga och kooperativa interaktioner som kan ha djupgående och oväntade påverkan på sjukdomsprogression, mikrobiell överlevnad, virulens, metabolism, och antibiotikas mottaglighet (granskas i detalj av Hotterbeekx et al. 201713 och Limoli och Hoffman 20193).
Det växande intresset för interspecies interaktioner under infektion har gett en mängd olika metoder för att studera polymikrobiella samhället beteenden. Typiskt, dessa studier har utnyttjat platta eller buljong-baserade analyser för att undersöka de fenotypiska skillnaderna mellan monokultur och kokultur. Till exempel, kokulturering P. aeruginosa och S. aureus på fasta ytor har möjligit för visualisering av tillväxthämning eller förändringar i koloni fenotyp, pigment, eller polysackarid produktion14,15,16. Blandade arter biofilmer, på biotiska eller abiotiska ytor, samt koculturing bakteriearter i flytande kultur har också möjliggjort mätning av förändringar i tillväxt, metabolism, antibiotisk tolerans, konkurrens och livskraft, förutom gen och protein uttryck17,18. Medan dessa bulkkultur experiment har avslöjat insikt i hur P. aeruginosa och S. aureus kan påverka varandra på samhällsskala, de kan inte svara på viktiga frågor om de interaktioner som sker på encellig nivå. Den metod som presenteras här bidrar till de metoder för att studera interspecies interaktioner genom att fokusera på förändringar i rörelse, cell livskraft, och genuttryck av enstaka celler inom en cocultured gemenskap över tiden.
Encelliga interaktioner kan i stor utsträckning skilja sig från de interaktioner som sker i en bulk gemenskap av celler. Genom encellig analys kan heterogeniteten inom en gemenskap kvantifieras för att studera hur rumslig placering av celler påverkar samhällsdynamiken eller hur gen- och proteinuttrycksnivåer förändras inom enskilda medlemmar i en grupp. Spårningsceller kan också ge insikt i hur enstaka celler rör sig och beter sig över tiden, genom flera generationer. Genom att spåra cellrörelse och förändringar i genuttryck samtidigt kan korrelationer göras mellan genfluktuationer och motsvarande fenotyper. Tidigare protokoll för att studera enskilda bakteriearter på encellsnivå har beskrivits. Dessa studier dra nytta av live-imaging celler över tiden i ett enda plan, och har varit användbara för att observera fenotyper som celldelning och antibiotika mottaglighet19,20. Ytterligare live-imaging mikroskopi har utnyttjats för att övervaka tillväxt, motilitet, ytkolonisering och biofilm bildning av enda bakteriearter21,22,23. Men medan dessa studier har varit insiktsfulla för att förstå fysiologi bakterier i monokultur, experiment för att observera encelliga beteende av flera bakteriearter över tiden i kokultur är begränsade.
Här har tidigare protokoll som används för avbildning av en art anpassats till att studera interaktioner mellan P. aeruginosa och S. aureus. Dessa organismer kan differentieras under faskontrast baserat på deras cellmorfologier (P. aeruginosa är bacilli och S. aureus är cocci). Utveckling av denna metod nyligen möjliggjort visualisering av tidigare obeskriven motility beteenden av P. aeruginosa i närvaro av S. aureus24. P. aeruginosa konstaterades vara kapabel att känna av S. aureus från ett avstånd och svara med ökad och riktad single-cell rörelser mot kluster av S. aureus celler. P. aeruginosa rörelse mot S. aureus befanns kräva typ IV pili (TFP), hår-liknande projektioner vars samordnade förlängning och upprullning generera en rörelse som kallas ryckningar motility25.
Dessa studier visar nyttan av denna metod för att förhöra tidigare interaktioner mellan arter. Bildbehandling vid höga celltätheter vid senare interaktionstidspunkter är dock svårt med tanke på att enstaka lager av celler inte längre kan identifieras, vilket oftast innebär problem under post-imaging analys. Med tanke på denna begränsning är metoden bäst lämpad för tidigare interaktioner som sedan kunde följas upp med traditionella makroskopiska analyser vid högre celltätheter som är representativa för senare interaktioner. Ytterligare begränsningar av denna metod inkluderar låg genomströmning karaktär, eftersom endast ett prov kan avbildas i taget och kostnaden för mikroskop, kamera och miljökammare. Dessutom innebär fluorescensmikroskopi risker för bakteriecellerna som fototoxicitet och fotobleaching, vilket begränsar frekvensen som fluorescensbilder kan förvärvas. Slutligen, de agaros kuddar som används i denna metod är mycket mottagliga för förändringar i miljön, vilket gör det viktigt att kontrollera för förhållanden som temperatur och luftfuktighet, med tanke på att kuddar kan börja krympa eller expandera om villkoren inte är korrekta. Slutligen, medan denna metod inte efterliknar värdmiljön, ger det ledtrådar för hur olika bakteriearter svarar på ytor, som kan följas upp i analyser som utformats för att efterlikna miljö / värd förhållanden.
Denna metod skiljer sig från tidigare studier spåra encellig rörelse, i att celler är inokulerade mellan en täckplatta och agarose pad, begränsa celler till ytan. Detta möjliggör cellspårning över tid i ett enda plan; begränsar dock cykler av övergående ytangagemang som observerats när celler är nedsänkta i vätska26. En ytterligare fördel av bildframställning bakterier under en agaros pad är att den härmar makroskopisk platta-baserade sub-ytan inokulering assays klassiskt används för att undersöka P. aeruginosa ryckningar motility25. I denna analys, bakterieceller inokuleras mellan botten av en Petri skålen och agar, hålla cellerna i ett enda plan som de rör sig över botten av skålen utåt från punkten för inokulering, ungefär som denna mikroskopi protokoll.
Protokollet för mikroskopi för tidsfördröjning för visualisering av interaktioner mellan arter som presenteras här består av 1) förbereda bakterieprovet och agarospaden, 2) välja mikroskopinställningar för bildframställning förvärv och 3) post-imaging analys. Detaljerad visualisering av cellrörelse och spårning kan utföras genom förvärv av bilder med korta tidsintervaller efter faskontrast. Fluorescensmikroskopi kan också utnyttjas för att bestämma cellernas livskraft eller genuttryck över tiden. Här visar vi ett exempel på anpassning för fluorescensmikroskopi genom tillsats av livsdugliga färgämnen till agaroskuddarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: En fullständig beskrivning och katalognummer för alla leveranser i detta protokoll finns i tabellen över material.
1. Beredning av M8T minimal media
- Förbered 1 L av M8 minimala salter bas (5x) genom att lösa upp 64 g Na2HPO4·7H2O, 15 g KH2PO4, och 2,5 g NaCl i 800 mL ultrarent vatten (UPW, resistivitet 18 MΩ/cm) i en 2 L flaska. pH till 7,6. Komplett volym till 1 L med UPW. Autoklav i 45 min.
- Förbered 500 mL av en glukoslösning (20 % w/v) genom att lösa upp 100 g glukos i 400 mL UPW i en 1 L-flaska. Komplett lösning till 500 mL med UPW. Autoklav i 45 min.
- Förbered 500 mL av en tryptonelösning (20 % w/v) genom att lösa upp 100 g tryptone i 400 mL UPW. Komplett till 500 mL med UPW. Autoklav i 45 min.
- Förbered 1 L av M8 + 10% tryptone (M8T) minimal media genom att lägga till 200 mL av 5x M8 minimala salter (1x slutlig), 10 mL av 20% glukos (2 0,2 % slutlig), 1 mL av 1 M MgSO4 (1 mM slutlig), och 50 mL på 20% tryptone (1% slutlig) till 600 mL UPW. Komplett till 1 L med UPW. Filtrera genom ett 0,2 μm sterilt filter till en steril 500 mL media lagringsflaska.
Dag 1:
2. Beredning av bakteriekulturer över natten
- Inokulera 5 mL ML mL M8T minimal media med en enda koloni av P. aeruginosa eller S. aureus (inklusive antibiotika när så är lämpligt) och inkubera över natten vid 37 °C med avsättning under högst 16 h.
OBS: De bakteriella patogenerna P. aeruginosa och S. aureus användes för denna metod, eftersom de är vanligen coisolated från kroniska infektioner, och studera deras interaktioner är viktigt att förstå hur de bidrar till patientens resultat under polymikrobiella infektioner. Andra bakteriearter kan användas beroende på studiens fokus.
Dag 2:
3. Subkultur av bakteriestammar
- Subkultur P. aeruginosa 1:500 och S. aureus 1:1000 i 5 mL färsk M8T (inkludera antibiotika när det är lämpligt). Inkubera med luftning vid 37 °C tills kulturer når mitt i logfasen (OD600 = ~0,3 - 0,5).
4. Beredning av material för pad formar
- Förbered metallspatlar genom att värma upp änden på en platt, rundad laboratoriespatel med en Bunsenbrännare tills hälften av den platta änden kan böjas till 90° vinkel. Värm änden av en annan platt, rundad laboratorium spatel och något böja de sista 10 mm till en 45 °C vinkel.
- Klipp av de fyra hörnen av silikonformarna så att formar passar inuti en 35 mm skål.
- Sterilisera spatlar och ett par pincett genom att lägga till 70% etanol och passerar dem genom lågan av Bunsen brännaren.
- Rengör skålen och silikonformar med 70% etanol och torka dem med luddfria våtservetter.
5. Beredning av agaroskuddar
OBS: Dynorna bereds med M8T minimal media som näringskälla för de bakterier som används i detta protokoll. De näringsämnen som används i kuddarna kan dock modifieras för olika organismer.
- Smält 2% lågsmälta agaros i 10 mL M8T i en ren 50 mL Erlenmeyerkolv. Mikrovågsugn i korta intervaller (2-5 s) tills agaros är i lösning för att förhindra att innehållet i kolven kokar över. När smält, låt svalna i en 50 °C vattenbad i minst 15 min.
- Förbered formar genom att anpassa silikon utskärningen med öppningen i 35 mm skålen och knacka lätt med spatel för att säkra silikon till skålen, och för att ta bort alla luftbubblor mellan mögel och skålen.
- När svalna, pipetter 915 μL smält agarose i formen. Låt locket på glänt och låt dynan torka i rumstemperatur i 30 min.
- Täck skålen med locket och låt bli rumstemperatur i ytterligare 2 h.
- Förbered fuktighetsservetter genom att tätt rulla upp en luddfri torka. Placera den rullade torka inuti en steril Petriskål och jämnt tillsätt 500 μL sterilt vatten över torka. Varmt till 37 °C i 1 h.
- Värm pad och en steril 35 mm skålen till 37 °C i 1 h.
6. Beredning av bakterieceller och inokulat dynor
- Mät OD600 av varje subkultur och späd P. aeruginosa till en OD600 = 0,03 och S. aureus till en OD600 = 0,10 i M8T förvärmd till 37 °C. Blanda P. aeruginosa och S. aureus i en 1:1 förhållande och virvel.
OBS: Om stammar kräver antibiotika kan antibiotikan tillsättas i över natten och subkulturen, men bör inte tillsättas vid blandning av arter för avbildning om den påverkar de andra arterna i kokulturen. Plasmidstabilitet och antibiotikans effekter på alla arter i kokulturen kommer att behöva fastställas för varje organism/plasmid som används. - Pipett 1 μL kokultur jämnt över botten av en förvättad, steril 35 mm glasklämningsfat.
- Ta bort silikon utskärning från formen med hjälp av steril pincett.
- Ta bort dynan från skålen med hjälp av sterila spatlar.
- Slip den något böjda spatel under kanten av dynan, medan du håller formen upp och ner, för att släppa ut den på en steril Petri platta lock.
OBS: Var försiktig så att inte tvinga pad ut eller det kommer att rippa. Håll koll på vilken sida av dynan som är botten.
- Slip den något böjda spatel under kanten av dynan, medan du håller formen upp och ner, för att släppa ut den på en steril Petri platta lock.
- Överför dynan till skålen med bakteriecellerna, nedifrån och ner, genom att skjuta den 90° vinklade spatel under dynan och placera den ovanpå den inokulerade täckplattan. Använd den 90° vinklade spatel för att få dynan att spola mot täcket och tryck försiktigt ut eventuella luftbubblor.
- Ta bort överflödig fukt från fuktiga våtservetter sedan placera runt kanten av skålen, se till att den inte rör pad. Provet är nu klart för avbildning.
7. Ställa in mikroskopet för live-avbildning
- Varm miljökammare till 37 °C minst 2 h före experimentell upp-
- Slå på alla komponenter inklusive mikroskop, dator och ljuskällor för brightfield och fluorescens avbildning.
- Öppna bildhanteringsprogrammet och se till att ljuskällor är anslutna och körs.
- Utför Köhler illumination27 för att justera alla bildplan.
- Först, ta markerade coverslip i fokus med en 20x mål med hjälp av en "dummy" skålen. Se till att kondensortornet är inställt på "öppet" läge.
OBS: Köhler belysning bör utföras för varje unikt mål / prov för att korrekt justera bildplan. Men fokus och anpassning med "dummy" skålen på lägre förstoring påskyndar set-up på levande prover med högre förstoring för att begränsa tiden mellan set-up och experiment starttid. - Fokusera kondensorn.
- Stäng fältmembranet.
OBS: En oktagonformad bländare ska visas. Om kondensorn är helt ur fokus kommer hela synfältet (FOV) att visas mörkt. - Rotera kondensorns fokuseringsrattar tills oktagonkanterna är skarpa.
OBS: Ljusintensiteten kommer att öka när bildplanen närmar sig rätt inriktning.
- Stäng fältmembranet.
- Rikta kondensorn.
- Centrera fältkondensorn genom att justera de linjerande rattarna.
OBS: Oktagonen bör centreras till mitten av FOV. De uppriktningsrattarna skiljer sig åt beroende på mikroskopet. Till exempel, vissa mikroskop kondensorer har rattar, medan andra har skruvar som kräver en skruv drivrutin.
- Centrera fältkondensorn genom att justera de linjerande rattarna.
- Fokusera lampglödtråden och justera kondensorbländaren.
- Placera ett fasteleskop eller Bertrand-lins i ljusvägen för att observera målets bakre fokalplan.
OBS: Det bör finnas två koncentriska cirklar. - Vrid Bertrand lins fokus ratten tills ringarna ser skarpa.
- Ta bort Bertrand-linsen från ljusbanan.
- Placera ett fasteleskop eller Bertrand-lins i ljusvägen för att observera målets bakre fokalplan.
- Öppna fältmembranet tills oktagonen ligger strax utanför FOV.
- Byt till 100x-målet och skjut den matchande fasringen på plats innan du lägger till en droppe nedsänkningsolja och placera den förberedda provskålen ovanpå.
- Utför Köhler belysning på 100x målet med bakterieprov skålen.
- Först, ta markerade coverslip i fokus med en 20x mål med hjälp av en "dummy" skålen. Se till att kondensortornet är inställt på "öppet" läge.
- Fokusera på bakterierna med hjälp av finjusteringen bara. När bakterierna i FOV är fokuserade genom okularet, växla ljusvägen till kameran genom att trycka på kameraknappen på mikroskopet.
- Klicka på alternativet Fas i bildhanteringsprogrammet.
- Justera andelen DIA LED-ljus som avges genom att välja ljuskälla i programvaran och antingen manuellt ange önskad procentandel av ljus som ska användas eller skjuta strecket på ljusprocentskalan.
- Justera exponeringstiden för DIA LED-ljus genom att klicka på ljuskällan och antingen manuellt ange önskad exponeringstid eller välja en exponeringstid från den medföljande rullgardinsmenyn.
OBS: Exponeringstiden kommer att variera beroende på vilken kamera som används. - Om du använder fluorescens, justera kamerainställningarna i varje motsvarande kanal (dvs. TxRed, GFP), genom att klicka på den fluorescerande kanal av intresse.
- Ställ in andelen av lysdiodljus som avges, justera sedan exponeringstiden (enligt vad som utförs i steg 7,7 och 7,8 för DIA LED-ljus).
- Alternativt ändrar du bitdjupet för att justera det dynamiska omfånget genom att välja något av de andra bitdjupsalternativen i den nedrullningsbara menyn för visualiseringskontroller.
- Välj XY-positioner av intresse genom att klicka på XY-alternativet i menyn för förvärvskontroller.
- Flytta scenen position med glädje pinne, eller genom att klicka och dra på FOV på skärmen, och klicka på den tomma rutan för att spara X och Y koordinater för en viss position.
OBS: Val av högst tre olika XY-positioner, så nära varandra som möjligt, rekommenderas för förvärv av timelapse.
- Flytta scenen position med glädje pinne, eller genom att klicka och dra på FOV på skärmen, och klicka på den tomma rutan för att spara X och Y koordinater för en viss position.
- Slå på det perfekta fokussystemet (PFS) genom att antingen klicka på PFS-rutan på XY-fliken i förvärvskontrollmenyn eller trycka på PFS-knappen på joy stick-kontrollpanelen.
- Rotera finjusteringsrattarna för att fokusera på bakteriecellerna.
- Klicka på PFS-knappen för varje XY-position, när celler är i önskat plan av fokus.
OBS: PFS kompenserar för avdrift i Z-axeln under timelapseexperiment. Detta är nödvändigt för att upprätthålla fokus av bakterieceller över tiden. Olika tillverkningar har olika kompensationssystem. - Välj bildförvärvsförhållanden inklusive förvärvsintervall och frekvens för varje kanal (t.ex. faskontrast och varje fluorofor) genom att välja från alternativen i menyn för förvärvskontroller.
OBS: För de experiment som presenteras här förvärvas faskontrastbilder med intervaller var 5-10:e s medan fluorescensbilder i GFP- och TxRed-kanalerna förvärvas var 20:e minut. - Börja bildbehandling när mikroskop och förvärv inställningar har inrättats.
8. Tillval: Ändringar för live/död bildbehandling
- Smält 2% agaros i 10 mL M8T och låt svalna i 50 °C vattenbad i minst 15 min.
- Tillsätt 1 mM propidium-iodid till den smälta agarosen.
- När den har svalnat, pipetteras 915 μL agaros i den preparerade formen.
- Låt locket på glänt och låt pad torka i rumstemperatur i 30 min. Skydda mot ljus.
- Täck skålen med locket och låt bli rumstemperatur i ytterligare 2 h.
- Förbered fuktighetsservetter.
- Rulla en luddfri papperstorka ordentligt.
- Placera torka i en steril Petriskål och tillsätt 500 μL sterilt vatten till torka.
- Inkubera vid 37 °C i 1 h.
- Inkubera dynan och en steril 35 mm skål vid 37 °C i 1 h.
- Fortsätt att inokulera skålen som anges i avsnitt 6: Beredning av bakterieceller och inokulerande kuddar.
9. Dataanalys
- Identifiering av celler
- Öppna bildfil i bildhanteringsprogrammet och beskär filen så att den bara inkluderar de ramar som ska användas för spårning, zoomas in på de celler som är av intresse och endast i faskontrastkanalen.
OBS: Den beskurna filen kan sparas som en ny fil där spårningsdata kan lagras utan att störa den ursprungliga filen. - Markera alternativet för att välja områden av intresse (ROI) i menyn för analyskontroller och definiera ROIs genom att spåra antingen enskilda bakterieceller eller kluster av celler i den första bildrutan som ska användas för analys.
OBS: ROIs kan antingen definieras manuellt eller som binärer.- Definiera ROI manuellt
- Spåra omkretsen för varje enskild bakteriecell eller kluster av celler för att manuellt definiera ROIs.
OBS: I analysmjukvaran kan P. aeruginosa, eller andra stavformade celler, spåras manuellt genom att välja Ellipse ROI och rita en ellips som justeras till bakteriecellens storlek. Alternativt kan alternativet Polygon ROI väljas för att spåra icke-traditionella-formade ROIs, till exempel kluster av celler.
- Spåra omkretsen för varje enskild bakteriecell eller kluster av celler för att manuellt definiera ROIs.
- Identifiera binära ROIs
- Klicka på alternativet Binär till ROI för att definiera binära ROIs.
OBS: Objekt definieras i ett binärt lager baserat på separation av de mörkare-pixelated bakterieceller från den ljusare-pixelated bakgrunden i faskontrastkanalen. - Om du vill tröskelvärde för cellerna markerar du alternativet Tröskelvärde i menyn för analyskontroller. Välj kanal av intresse och skjut staplarna i fluorescens histogrammet för att justera tröskelvärdet intervallvärden.
OBS: Binär objektidentifiering för ROIs kan också definieras i fluorescerande bilder genom att tröskeln de bakteriella cellerna. Genom att tröskelvärde fastställs vilka fluorescensintensiteter som anses vara objekt och vilka fluorescensintensiteter som utgör bakgrunden.
- Klicka på alternativet Binär till ROI för att definiera binära ROIs.
- Definiera ROI manuellt
- Öppna bildfil i bildhanteringsprogrammet och beskär filen så att den bara inkluderar de ramar som ska användas för spårning, zoomas in på de celler som är av intresse och endast i faskontrastkanalen.
- Spårning av celler
- Om du vill spåra ROIs manuellt markerar du nästa bildruta i bildsekvensen och justerar rois placering genom att klicka och dra varje ROI för att justera med den ursprungliga bakteriecellens nya position.
OBS: Om bakteriecellerna inte har bytt position behöver ROIs inte flyttas. - Upprepa i alla sekventiella ramar för vilka celler som ska spåras.
- När celler delar sig definierar du dottercellerna som nya ROIs, som beskrivs i steg 9.1, och börjar spåra de nyligen uppdelade cellerna.
OBS: Om celler identifieras som binärfiler, använd funktionen Spåra binärer för att automatiskt spåra ROIs i valda ramar. - När celler har spårats genom alla markerade ramar exporterar du de data som ska analyseras.
- Öppna data-kalkylbladet och identifiera de mätningar som krävs för analys (dvs. objekthastighet, acceleration eller banlängd).
OBS: Vid mätning av directedness krävs mätningarna Banlängd och Linjelängd. Linjelängden är ett mått på det euklidesiska avståndet, eller det raka avståndet från spårets ursprung till kanten av S. aureuskolonin. Sökvägslängden är ett mått på det ackumulerade avståndet, eller summan av spårsegment från alla bildrutor. Directedness kan beräknas som ett förhållande av det Euklidesiska avståndet, D(E), (Linjelängd), över det ackumulerade avståndet, D(A), (Path Length).
- Om du vill spåra ROIs manuellt markerar du nästa bildruta i bildsekvensen och justerar rois placering genom att klicka och dra varje ROI för att justera med den ursprungliga bakteriecellens nya position.
- Fluorescenskvantifiering
- Definiera ROIs för fluorescerande bakterieceller enligt beskrivningen i steg 9.1.
- Upprepa spårning eller förflyttning av ROIs för bakterieceller eller kluster i de återstående fluorescerande bildrutorna.
- Exportera tabellen som genereras till en kalkylbladsfil för analys av fluorescerande intensitet.
- I data kalkylbladet, leta efter kolumnen med "Mean Intensity" som representerar den genomsnittliga fluorescens intensitet för den spårade bakteriecell (s) ROI.
- Graf medelvärdenna för medelintensiteten för att titta på förändringarna i fluorescens över tiden.
NOTERA: Ändringarna i fluorescens över tid föreställer växlingen av genuttryck för den fluorescently märkt genen av intresserar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik användning av den beskrivna metoden kommer att resultera i en serie bildrutor som genererar en video där interaktionerna mellan arter kan observeras över tid. Schemat i figur 1 ger ett visuellt objekt för att markera de viktigaste stegen som är involverade i att förbereda material för bildtagning. Användning av denna metod har gjort det möjligt demonstration av P. aeruginosa celler uppvisar olika beteenden i monokultur kontra i kokultur med S. aureus. Jämfört med de P. aeruginosa celler i monokultur som förblir grupperade i flottar, när det i kokultur med S. aureus, P. aeruginosa har ökat encellig motilitet mot S. aureus kolonier (Figur 2A-2B). Fluorescently märkt bakteriestammar möjliggör också visualisera blandade populationer av bakteriearter. Använda GFP-märkta P. aeruginosa tillåts observationen att efter P. aeruginosa enda celler ökning av motility, de kommer att omge och så småningom invadera S. aureus kolonier (Figur 2C). Utnyttjande av fluorescerande-märkta celler möjliggör också för visualisering av P. aeruginosa cell invasionen i S. aureus kolonierna för första gången (Figur 2C, botten).
Medan protokollet ger bilder av hög kvalitet för att observera interspecies interaktioner, det finns flera vanliga problem som kan leda till dålig kvalitet ram sekvenser. Inkonsekvent fuktighet under hela experimentets varaktighet och felaktigt torkade dynor är två vanliga problem som leder till drift som följer av att dynan skiftar och drar cellerna med den ut ur FOV (Bild 3A). Förändringar i luftfuktigheten påverkar agarosdynornas torrhet. Ökad luftfuktighet gör kuddarna för våta, vilket gör att fukten kan lägga sig mellan dynan och botten av glasbottniska skålen. Fukten lämnar ett lager vätska tjock nog för motil celler att svärma eller simma igenom och inte hålla bakterieceller i ett enda plan. Samtidigt minskar luftfuktigheten torka ut dynan snabbare, vilket orsakar celler att driva tidigt. Ett annat vanligt misstag när du använder denna metod med fluorescens är att förvärva fluorescerande bilder alltför ofta eller utsätta bakterieceller för fluorescerande ljus för länge. Korta förvärvsintervall för fluorescerande bilder upphetsa gång på gång fluoroforer med högintensivt ljus av en specifik våglängd. Upphetsade fluoroforer reagerar sedan med syre, vilket orsakar nedbrytning av fluorofor. Den resulterande fotobleaching utarmar fluorescens tills mer av fluorofore kan uttryckas och vikas, men skadar inte bakteriecellerna själva (Figur 3B). Förlust av fluorescens stör dock mätningar av gen / protein uttryck, lämnar cellerna markerless tills fluorofore kan vara helt syntetiseras och upphetsad igen. Dessutom kan syret interagera med upphetsade fluoroforer bilda reaktiva syrearter (ROS). Dessa ROS-radikaler skadar sedan bakterieceller, blir slutligen giftiga och resulterar i celldöd inom några få celldelningar (Figur 3C). Processerna för fotobleaching och fototoxicitet kan lätt ses som celler först kommer att förlora sin fluorescens helt, och i efterföljande ramar, cellerna kommer att sluta dela och kan så småningom dö (Figur 3B-3C). En sista vanlig fråga när experimentet ställer in är att man börjar med för många celler per FOV eller med celler för nära varandra, vilket i allmänhet är mindre än 20 μm från varandra. Trånga celler i den första bildrutan kommer att ge kluster av dela celler som helt enkelt slås samman i varandra när de växer snarare än interagerar. Dessutom kan celler som börjar för nära i närheten inte har tillräckligt med tid för att fastställa en gradient av utsöndrerade signaler som de andra arterna kan svara på (Figur 3D) medan avlägsna bakterieceller kanske inte har chansen att möta varandra inom experimentets varaktighet.
Figur 4 visar ett exempel på hur bakteriecellens viabilitet kan visualiseras med detta protokoll genom att propidium-iodiden läggs till i agaroskuddarna. Propidium-iodid är ogenomträngligt för levande celler, men kan komma in i celler med skadade membran och binda till nukleinsyror. Här mid-log GFP-märkt WT S. aureus behandlades med media ensam eller med cell-free supernatant härrör från P. aeruginosa och avbildas omedelbart efter behandling. Tre olika kanaler avbildades: Phase, TxRed och GFP. Ljusa gröna celler indikerar levande celler som aktivt uttrycker GFP som sett för S. aureus behandlas endast med media (Figur 4A), och röda celler indikerar döda propidium iodide-färgade S. aureus celler, efter att ha behandlats med P. aeruginosa supernatant (Figur 4B). Medan endast en tidpunkt visas, kan denna metod anpassas för att bestämma cellernas livskraft under time-lapse live imaging.
Flera analyser efter bildframställning kan utföras för att kvantifiera aspekter av interaktioner mellan arter. Till exempel kan cellspårning ge mätningar för riktadehet av P. aeruginosa enda cell rörelser mot ett kluster av S. aureus. Rörelserna för enskilda P. aeruginosa celler spåras från ramen en cell lämnar flotten genom ramen där cellen når S. aureus kluster (Figur 5A). Avståndet mellan P. aeruginosa flotten och S. aureus-klustret ger euklidesavståndet, D(E), medan de totala spårlängderna ger det ackumulerade avståndet, D(A) (Figur 5B). Directedness av varje cell beräknas som ett förhållande av D(E)/D(A). I kokultur experimenten, WT P. aeruginosa flyttade mot WT S. aureus med betydligt högre riktadhet än mot S. aureus ΔagrBDCA, en mutant saknar Agr-reglerade utsöndade faktorer, tidigare fast besluten att vara nödvändigt för riktningsmotilitet mot S. aureus24 (Figur 5C).
Bild 1: Schematisk för inställningsprotokollet för avbildning.
Översikt över kritiska steg för beredning av bakteriekulturer och agaroskuddar. Skapad med BioRender.com. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Time-lapse, live-imaging mikroskopi visar skillnader i P. aeruginosa beteende när cocultured med S. aureus.
Representativa snap skott av P. aeruginosa (bacilli, grön) i monokultur (A) och i kokultur med S. aureus (cocci, omärkta) (B). (C) Fluorescently-märkta bakterier möjliggör visualisering av P. aeruginosa enda celler invaderar S. aureus kluster. Faskontrast och GFP-kanalöverlagring (överst) och GFP-kanal ensam (nederst). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Representativa snap-bilder av vanliga bildhanteringsproblem som leder till dålig bildinhämtning.
(A) Felaktigt torkade kuddar och inkonsekvent fuktighet leda till drivande av celler över FOV under varaktigheten av bildbehandling. Den grundande cellens placering är markerad i varje ram (grön stång). (B) Fotoblekning från exponering för ljus för länge kommer att tömma påvisbara nivåer av fluorescens under en tid, men dödar inte cellerna. (C) Fototoxicitet till följd av frekvent exponering för ljus leder till celldöd. De första tecknen på fototoxicitet ses när celler slutar fluorescera och misslyckas med att dela. (D) Hög initial inokulat folkmassor celler i FOV och förhindrar observation av interspecies interaktioner. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Jämförelse av levande kontra döda S. aureusceller.
Representativa snapskott för GFP-märkta WT S. aureus som behandlats med antingen enbart medium (A) eller cellfri P. aeruginosa supernatant (B). Celler var omedelbart avbildas efter behandling. Levande celler (grön) aktivt uttrycka GFP och utesluta propidium iodid, medan döda celler (röda) förlorar GFP fluorescens och membran permeabilization tillåter propidium iodide att komma in i cellerna och binda nukleinsyror. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Cellspårningsanalys av P. aeruginosa i kokultur med S. aureus.
Tidigare var denna metod som används metod för att utföra cellspårning av WT P. aeruginosa i kokultur med antingen WT eller ΔagrBDCA S. aureus. (A) Representation av P. aeruginosa encelliga spår i en kokultur med S. aureus ΔagrBDCA. (B) Schematiska för euklidesavståndet (D(E)) och ackumulerade avstånd (D(A)) mätningar som används för att bestämma directedness ((D(E)/D(A)). (C) Directedness mätningar av enstaka WT P. aeruginosa celler i kokultur med WT och ΔagrBDCA S. aureus. Denna siffra har modifierats från Limoli et al. 201924. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Fil. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som presenteras här beskriver ett protokoll för live-cell imaging av bakteriella arter interaktioner på encellsnivå med ändringar för andra tillämpningar inklusive cell spårning och övervakning cell livskraft. Denna metod öppnar nya vägar för att studera encelliga beteenden av mikroorganismer i kokultur med andra arter över tiden. Specifikt visar protokollet nyttan av denna kokultur metod för att observera bakteriella ytbeteenden, särskilt när man studerar organismer som har både yta och vätskerelaterade bihang för motilitet. Till exempel genom att begränsa bakterierörelsen till en yta i ett enda plan av fokus, kan den ökade och riktade pili-medierad motility av P. aeruginosa som svar på S. aureus visualiseras.
Som tidigare nämnts kräver uppnåendet av optimala resultat med denna bildbehandlingsmetod övervägande av flera förhållanden, inklusive temperatur och fuktighet hos prov- och bildbildsinstrumenten (dvs. mål och stadium). Fler tips och felsökning finns i den kompletterande filen 1. Ett kritiskt steg i framgångsrik användning av protokollet är beredning av agaros kuddar, som otillräckligt torkning kuddar är en av de vanligaste problemen. Som visas i figur 3A, om kuddarna inte torkas tillräckligt länge, visas drift i början av time-lapse imaging, medan kuddar som torkas för länge börjar krympa och cellerna driver ut ur FOV några timmar in i avbildning. Se till att alla material är förvarvade och underhålls vid enhetlig temperatur och luftfuktighet under hela experimentet, genom användning av en steg-top inkubator och fuktig luddfri våtservetter, kommer att bidra till att minska drift. Det rekommenderas också att en backup pad alltid görs i fall den första dynan inte torkas ordentligt eller tårar under överföring från mögel till provet skålen. Dessutom är det viktigt att använda ett låg-autofluorescens medium, både för växande bakteriekulturer och för att göra kuddar för att minimera bakgrunden fluorescens från mediet när imaging cellerna. Det rekommenderas att använda minimala medier för mikroskopi, eftersom rika medier ofta har hög autofluorescens. Börjar med en låg densitet inokulat och även rumsliga fördelningen av celler i FOV är också viktiga faktorer i denna metod. Specifikt, i tidigare studier utvärdera P. aeruginosa och S. aureus interaktioner, detta gjorde det möjligt för bakterierna att generera en tillräcklig gradient av utsöndring faktorer som sedan kan upptäckas av de andra arter som finns (Figur 2B).
Trots fördelarna med denna metod finns det också begränsningar, inklusive dess pris, låg genomströmningskaraktär, fluorescensrestriktioner och stort beroende av att kontrollera miljöförhållandena. Bild 3B-3C visar de stora begränsningarna med att använda fluorescensmikroskopi. Som diskuteras i resultatavsnittet, om de fluorescerande bilderna fångas i korta intervaller, kan fotobleaching och fototoxicitet uppstå. För att undvika dessa två resultat, fluorescerande bild intervall bör tas tillräckligt långt ifrån varandra och med så lågt fluorescerande ljus exponeringstid som möjligt att fortfarande tillräckligt visualisera fluorophore. Dessutom, när man bestämmer intervallet för fluorescens avbildning, är det viktigt att överväga mognadstiden för varje fluorophore. De fluoroforer som används i stammarna P. aeruginosa och S. aureus som visas i figur 2, figur 3 och figur 4, till exempel, har en mognadstid på ca 20 minuter och kan därför vara upphetsad var 20:e minut utan att behöva behöva oroas av potentiella fotoblekningseffekter. Samtidigt är en annan nackdel med denna metod att det inte tillåter observationer av sena interspecies interaktioner när cellerna når en hög celltäthet. För att kunna visualisera enskilda bakterieceller måste de förbli i ett enda plan av fokus. Men när befolkningen når en hög celltäthet, cellerna börjar växa i mer än ett plan.
Denna metod kan modifieras för att studera olika fenotyper såsom cellens livskraft (Figur 4) och uttryck för gener av intresse (data visas inte). Figur 4 visar ett exempel på hur metoden har anpassats för att visualisera bakteriell viabilitet genom att tillföra propidium-iodid till agaroskuddarna. En annan tillämpning av denna metod är att mäta bakteriell gen / protein uttryck i kokultur med en annan organism genom fluorescerande reportrar. Till exempel kan flera fluoroforer införlivas i en plasmidvektor eller bakteriekromosomen för att samtidigt studera uttrycket av olika gener eller proteiner. Här är det viktigt att välja fluoroforer som inte har överlappande excitation och emission spektra. Slutligen möjliggör användningen av bakteriell cellspårning i analys efter avbildning av riktningen (Figur 5), hastighet och acceleration, bland andra mätningar, att beräknas samt24.
Sammantaget förbättrar denna coculture imaging metod som anpassats från tidigare beskrivna monokultur protokoll förmågan att visualisera beteenden av flera bakteriearter i kokultur. Denna metod ger möjlighet att studera mikrober ur ett blandkulturperspektiv, vilket kommer att öka förståelsen för hur varje art förändrar sitt beteende på ett encelligt sätt, vilket i slutändan ger ny insikt i hur bakteriearter interagerar i polymikrobiella miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från Cystisk Fibros Stiftelsen Postdoc-till-fakulteten Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystisk Fibros Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), och NIH T32 Utbildning Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Vi tackar Jeffrey Meisner, Minsu Kim och Ethan Garner för att dela inledande protokoll och råd för bildbehandling och göra kuddar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
