Summary
이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.
Abstract
급성 해마 슬라이스는 신경 과학자의 세대를 활성화하여 시냅스, 뉴런 및 회로 특성을 자세히 탐구하고 충실도가 높습니다. LTP 및 LTD 메커니즘, 단일 신경 수지상 계산 및 회로의 경험에 의존하는 변화의 탐구는 이 고전적인 준비 없이는 불가능했을 것입니다. 그러나, 몇 가지 예외를 제외하고, 급성 해마 슬라이스를 사용하여 대부분의 기본적인 연구는 상대적으로 젊은 연령의 설치류에서 조각을 사용하여 수행되었습니다, ~ P20-P40, 시냅스 및 본질적 흥분 성 메커니즘은 P60 과거에 도달하는 긴 개발 꼬리를 가지고 있지만. 젊은 해마 슬라이스를 사용 하 여의 주요 매력은 저 산소 손상에 높은 내성에 의해 도움이 신경 건강의 보존. 그러나, 노화 뇌 준비를 필요로 하는 신경 퇴행성 질환의 다양한 동물 모델의 개발에 의해 더욱 강조되는 발달의 더 성숙한 단계에서 신경 기능을 이해할 필요가 있다. 여기서 우리는 안정적으로 성인과 노화 마우스 해마에서 건강한 조각을 제공하는 급성 해마 슬라이스 준비에 대한 수정을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 간 근사 관류와 얼음 차가운 나트륨이 없는 NMDG-aSCF로 절단하는 것입니다. 함께, 이러한 단계는 참수 시 ATP에 저산소증 유발 하 강 하 뿐만 아니라 수동 나트륨 플럭스로 인한 세포 독성 부종을 감쇠. 우리는 진동 마이크로 토메를 사용하여 해마 플러스 피질의 트랜스 버들 조각을 잘라하는 방법을 보여줍니다. 이러한 방식으로 얻은 급성 해마 슬라이스는 여러 시간 동안 안정적으로 건강하며 형광으로 표시된 뉴런을 대상으로 하는 필드 레코딩 및 표적 패치 클램프 레코딩 모두에 적합합니다.
Introduction
포유류 급성 뇌 슬라이스 제제의 출현은 이전에 는 Aplysia1과같은 무척추 동물 제제에서만 가능했던 세포 및 시냅스 수준에서 실험을 촉진하였다. 급성 해마 슬라이스의 개발은 작업 기억과 문맥 형성을 담당하는 구조이기 때문에 특히 의미가 있었고, 생리학적 조작이 용이한 전문 삼중 시냅스 회로를 가지고 있다. 그러나, 급성 뇌 슬라이스의 대부분은 건강한 뉴런과 회로를 보존하는 것이 더 쉽기 때문에 상대적으로 젊은 마우스와 쥐로부터 여전히 준비되고, 슬라이스는 시간2,,3,,4의긴 기간 동안 실행 가능한 남아있다. 여기에서는 성인 및 노화 마우스에서 급성 해마 슬라이스의 생존 가능성이 증가하는 표준 슬라이스 프로토콜에 대한 수정을 소개합니다.
포유류 뇌 의 장기 전 생체 생존가능성에 대한 주요 장애물은 뇌로의 혈류가 중단되면 급속히 발생하는 초기 저산소 손상입니다. 산소의 손실은 인 크레아틴 (P-크레아틴)의 손실과 함께 뇌의 주요 에너지 자원의 빠른 신진 대사 소비의 결과 가장 빠른 되고, 포도당, 아데노신 삼호산염 (ATP), 및 글리코겐4다음. ATP의 보존은 NA-K ATPase를 통해 멤브레인 잠재력을 유지하기 위해 ATP가 필요하므로 뇌 슬라이스의 장기적인 건강에 특히 중요하며, 결과적으로 신경 활동5,,6. 성인 설치류 뇌의 ATP 수준은 ~2.5mM이며, 20초 이내에 급격히 떨어뜨려 약 1분 후 참수4,,7,,8에서기저 정상 상태(~0.5mMM)에 도달한다. 젊은 동물에서 ATP (~2분)에서 동일한 하락을 관찰하는 데 시간이 더 오래 걸립니다. 페노바르비탈 마취로 4분4로더 느려집니다. 이러한 고려 사항은 ATP 및 기타 에너지 자원의 손실을 방지하는 것은 뇌에 저산소 손상을 방지하고 차례로 오랜 기간 동안 뇌 슬라이스의 건강을 유지하기 위해 필요한 전략임을 보여줍니다, 특히 성인 동물.
낮은 온도는 신진 대사를 느리게. 따라서, 겸손한 저체온증이 뇌 에너지 매장량을 보호한다는 것이 입증되었습니다: 젊은 동물의 경우 체온을 6도 낮추고 37°C에서 31°C로, ATP 수준을 대조저 저산소증9의4시간 이상 정상 수준의 약 80%로 보존한다. P-크레아틴 수준은 유사하게 보존되고, 또한 전반적인 인산화전위도 9. 이것은 ATP의 거의 정상 수준이 슬라이스 절단 및 슬라이스 복구 기간을 통해 유지 될 수 있기 때문에 참수 전에 체온을 낮추는 것은 신경 보호일 수 있음을 시사합니다.
ATP 낙하가 참수 시 완전히 예방할 수 없는 정도까지, Na-K ATPase의 부분적으로 손상된 기능이 예상되며, 이어서 수동 나트륨 유입을 통한 탈극화가 뒤따릅니다. 수동 나트륨 유입은 세포로 물 입력에 선행되기 때문에, 그것은 세포 독성 부종과 결국 pyknosis를 일으키는 원인이 됩니다. 성인 쥐에서, 슬라이스 절단 솔루션에서 자당으로 Na + 이온을 교체하는 것은 세포 독성 부종의 부담을 완화하는 성공적인 전략이었다10,,11. 최근에는 나트륨 채널 투과성을 감소시키는 메틸화된 유기 양이온(12)은 특히 성인 마우스의 슬라이스에서 자당보다 더 효과적인 보호를 제공하는 것으로 나타났으며, N-메틸-D-글루카민(NMDG)은12 13,14,,15,,16에걸쳐 가장 광범위하게 적용되고 있다.,
수많은 뇌 슬라이스 프로토콜은 슬라이스 절단 단계에서만 차가운 온도를 사용하는 것을 포함하며 때로는 Na+ 이온 교체 전략16,,17과함께 합니다. 젊은 동물에서, 이러한 프로토콜은 두개골이 여전히 얇고 제거하기 쉽기 때문에 참수 후 신속하게 추출 할 수 있기 때문에 충분한 신경 보호를 제공하는 것으로 보인다3. 그러나,이 전략은 성인 동물에서 건강한 조각을 생산하지 않습니다. 시간이 지남에 따라, 성인 설치류를 연구하는 실험실의 숫자는 동물의 체온을 감소시키기 위해 얼음 차가운 솔루션과 경전 관혈을 도입했다, 따라서 뇌에 저산소 손상, 참수하기 전에. 이 절차는 소뇌 슬라이스18,중뇌 슬라이스19,신피성 슬라이스11,,20,과리라인 피질21,쥐 해마10,,22,,23,후각 전구24,복부 줄기 줄기25,시각 피질26을성공적으로 적용했다.
쥐와 쥐의 일부 뇌 영역에서 슬라이스를 준비하는 동안 경내 관류및 Na+ 이온 교체에 의해 제공되는 장점에도 불구하고, 마우스 해마는 저산소증으로부터 보호하기 위해 가장 어려운 영역 중 하나 남아13,,20. 현재까지, 신경 변성의 노화 마우스와 마우스 모델에서 해마를 슬라이스하는 가장 일반적인 접근 중 하나는 고립 된 해마(27)의고전적인 빠른 슬라이스를 포함한다. 여기에 설명된 프로토콜에서, 우리는 얼음 감기 Na+-무료 NMDG 기지를 둔 인공 뇌척수액 (NMDG-aCSF)로 동물을 경감하여 반갑게 침범하기 전에 저체온증을 도입하여 성인 뇌의 ATP의 손실을 최소화합니다. 슬라이스는 얼음 차가운 Na+-무료 NMDG-aCSF로 절단됩니다. 이 향상된 프로토콜로 우리는 슬라이스 후 최대 10 시간 동안 건강하고 장기 현장 기록 및 패치 클램프 연구에 적합한 성인 및 노화 마우스에서 급성 해마 조각을 얻습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 국립 보건원의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되며 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 방법은 또한 신경 과학 연구에서 동물과 인간의 사용에 신경 과학 에 대 한 사회의 정책에 따라.
참고: 모든 마우스는 병원균이 없는 환경에서 유지되었습니다. 혼합 C57Bl/ 6 x SV/ 129J 유전 적 배경에 야생 형 마우스는 달리 언급하지 않는 한 여기에 사용되었다.
1. 설정
- 1x aCSF(mM)의 1L을 준비: 125 NaCl, 26 NaHCO3,2.3 KCl, 1.26 KH2PO4,1.3 Mg2SO4·7H2O, 2.5 CaCl2,25 포도당(표 1). 복구 챔버 및 후속 레코딩에 이 솔루션을 사용합니다.
참고: ACSF를 NaCl, NaHCO3,KCl 및 KH2PO4를포함하는 10배 스톡 솔루션으로 저장합니다. Mg2SO4·7H2O 및 CaCl2를 1M 스톡 솔루션으로 저장합니다. 위의 스톡 솔루션에서 실험 당일 작업 용액을 준비하고 18MΩ 물로 최종 부피를 조정하기 전에 포도당을 추가합니다.
참고: 뇌 영역 또는 마우스 변형에 따라 차가운 aCSF는성공 11,,15,,26으로경동맥 관류에도 사용할 수 있다. - NMDG-aCSF의 300mL 준비 (mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4,1.5 MgCl2,0.5 CaCl2,20 콜린 중탄산염, 10 포도당(표 1). NMDG-aCSF의 이 부피는 경외 관류 및 절단 단계 모두에 충분합니다.
참고: NMDG-aCSF를 4°C의 3배 재고 솔루션으로 저장합니다. 실험 당일 작업 솔루션을 준비합니다. 18MΩ 물로 최종 부피를 조정하기 전에 콜린 중탄산염과 포도당을 추가합니다. 95%O 2/5%CO2로2 용액을 거품으로 버퍼링하고 산소로 포화시다.2
참고: NMDG 재고는 고알칼리성으로 시작하여 pH를 ~7.4로 조정하기 위해 농축염산(HCl)이 필요합니다. 염산의 첨가는 pH 8 보다 한 번 느려야 하며, 과도한 HCl을 사용하여 ~pH 3에 용액을 산산화하기 쉽기 때문에 느려야 한다. 이 조정은 이산 양이온을 추가하기 전에 수행해야합니다. 이 NMDG-aCSF 레시피는 나트륨이 없습니다. 이전에 발표된 NMDG 레시피는 완충을 위해 30mM NaHCO3을 사용하며, 이는 NMDG-aCSF13,,20에 존재하는 30mMM나트륨을 초래한다. - 진동 마이크로토메 절단 트레이및 장착 디스크를 -20°C로 설정합니다.
- 복구 챔버를 준비합니다.
- 복구 챔버를 슬라이스 홀딩 메시 바로 위에 채우고 실온에서 벤치에 보관하고 거품을 낸다.
참고 : 여기에 사용되는 슬라이스 복구 챔버는 에드워즈와 코너스3에의해 이전에 설명 된 고전적인 챔버와 매우 유사하다. aCSF는 하단에 붙어 검은 나일론 메쉬와 둥근 아크릴 프레임을 보유 유리 비커 (400 mL)에 보관된다. 아크릴 프레임은 비커 의 가장자리에 휴식 아크릴 후크를 통해 비커의 중간에 일시 중단됩니다. 유리 버블러는 바닥까지 삽입됩니다. 이 설계를 통해 양쪽의 슬라이스를 산소화할 수 있습니다. 버블링은 또한 복구 챔버에서 aCSF의 일정한 혼합을 제공합니다. 블랙 메쉬는 오프 화이트 슬라이스와 대비가 높은 것을 제공하므로 쉽게 볼 수 있습니다.
- 복구 챔버를 슬라이스 홀딩 메시 바로 위에 채우고 실온에서 벤치에 보관하고 거품을 낸다.
- 경내 관류 및 절단 용액을 준비합니다.
- 얼음 결정이 표면과 병의 벽에 형성되기 시작할 때까지 냉동고에서 NMDG-aCSF의 전체 300 mL을 냉각합니다. 과도하게 동결하지 마십시오!
- 차가운 NMDG-aCSF를 얼음과 거품에 넣습니다. 용액은 0\u20122 °C 사이여야 합니다.
참고 : 슬러시 NMDG- aCSF는 액체로 용액의 대부분을 갖는 것을 의미, 현재 슬러시 얼음의 작은 분수는 관류 및 절단 에 걸쳐 0 °C 근처 용액을 유지합니다. 절단 하는 동안 뇌에서 얼음 결정을 멀리 유지 하기 위해 주의 해야 한다.
- 티슈 장착 디스크를 준비합니다.
- 디스크를 냉동고에서 꺼내 필요한 경우 닦아냅니다.
- 이전에 준비된 한천 접시에서 5% 한천 블록을 잘라내고, 시아노아크라일트 접착제의 얇은 층을 사용하여 디스크 중앙에 접착제를 붙입니다. 한천 조각은 마우스 뇌의 크기에 관한 것이어야 합니다. 디스크에 붙어 있는 한천을 얼음 위에 놓고, 사용할 준비가 될 때까지 종이 타월로 덮습니다.
- 5% 한천 접시의 경우, 18MΩ 수의 100mL에 5 g의 천을 마이크로웨이브하여 녹여 깨끗한 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 유지하십시오.
- 절단 트레이를 냉동고에서 꺼내 마이크로톤에 넣고 얼음으로 둘러싸고 블레이드를 적재합니다.
2. 경내 관류 및 뇌 추출
- 마취 칵테일의 관면 주사를 통해 과다 복용 마우스. 통증 반사 (발가락 핀치)를 확인하여 마취 깊이를 확인하십시오. 마우스가 깊은 마취에 도달하면 반사를 나타내지 않아야합니다.
참고: 설치류 마취 칵테일 레시피: 케타민 HCl (66 mg/mL), 자일라진 HCl (6.6 mg/mL), 아세프로마진 말레테 (0.1 mg/mL), 18 MΩ 물 최종 볼륨. 복용량: 0.4 mg/g 체중, 0.04 mg/g 체중, 6 x10-4 케타민에 대 한 mg/g 체중, 자일라진, 그리고 아세프로마진, 각각. - 경전 관류용 연동 펌프를 설정합니다. 아이스 NMDG-aCSF를 통해 펌프 튜브의 한쪽을 병에 삽입합니다. 좌심실로 삽입될 27 G 바늘로 튜브의 반대편에 맞춥시다.
- 펌프 속도를 약 3.5mL/분으로 설정합니다. 이 속도로 NMDG-aCSF의 유출은 연속 흐름이 아닌 빠른 드립입니다.
참고: 중력에 의한 관류는 동일한 대략적인 유류속도를 달성할 수 있는 한 연동 펌프 관류를 대체할 수 있습니다. 높은 유량의 관류는 뇌의 파열 된 혈관을 초래할 것입니다. 지나치게 빠른 관류와 혈관의 증가 된 압력의 흔적은 동물의 코에서 나오는 솔루션입니다. - 관류
- 제대로 마취된 마우스를 기저귀 에 등에 놓습니다. 종이 테이프를 사용하여 앞다리와 뒷다리를 테이프로 테이프로 테이프로 사용하여 가슴과 복부가 노출되도록 합니다.
- 흉골 아래에서 목구멍까지 가슴 꼭대기에 있는 피부의 큰 패치를 잘라냅니다. 이것은 큰 작업 영역을 제공해야합니다. 흉골에 집게를 잡고 부드럽게 들어 올리고 가슴 구멍이 노출 될 때까지 양쪽의 갈비뼈 케이지를 절단하십시오.
- 흉부 구멍을 노출하기 위해 다이어프램을 잘라냅니다. 갈비뼈 의 플랩근육의 얇은 조각을 통해 부착 남아 있어야합니다. 노출된 가슴 구멍에 다시 떨어지지 않고 측면에 설정할 수 있어야 합니다. 심장이 여전히 뛰고 있는지 확인하십시오. 간의 대부분이 볼 수 있는지 확인합니다.
- 좌심실에 27G 바늘을 삽입; 마우스의 왼쪽 심실은 오른쪽보다 밝은 색상으로 보입니다. 어두운 붉은 색 오른쪽 아트리움을 찾습니다. 작은 가위로 오른쪽 아트리움을 잘라; 피가 흘러나오기 시작해야 합니다.
- 올바른 유동 속도로 미리 설정된 펌프를 시작합니다. 모든 것이 올바르게 수행된 경우, 간은 관류가 시작된 직후 빨간색에서 갈색으로 색상을 변경하기 시작해야 합니다. 관류의 길이를 결정하기 위해 간 색상을 모니터링; 간은 옅은 갈색으로 바뀌어야 합니다.
- 펌프를 몇 분 더 실행합니다. 직장 온도계를 사용하는 경우 체온은 28\u201229 °C로 떨어지며 동물의 코는 터치에 차가워야합니다.
- 뇌 추출.
참고 :이 단계에 대한, 다음과 같은 해부 도구를 준비 : 참수 가위, 직선 또는 각진 블레이드, 메스와 #10 블레이드, 단일 가장자리 블레이드, #3 집게, 90 °로 구부러진 한쪽 주걱, 주걱, "그림1A,B),및 작은 부드러운 브러시.- 큰 참수 가위로 마우스를 참수. #10 블레이드가 달린 메스를 사용하여 두개골 위에 피부를 열어 두습니다. 작은 각진 가위로, 미드라인에서 두개골을 잘라. 다음으로, #3 집게를 사용하여 두개골의 오른쪽과 왼쪽 절반을 멀리 캐리, 그것으로 멀리 두라를 가지고 조심. 뇌는 지금 노출되어야 합니다.
참고 : 두라가 두개골에서 분리되면 뇌를 통해 유지되며 별도로 제거해야합니다. 나머지 두라의 가장자리는 뇌를 통해 깊숙이 조여지고 슬라이스할 수 있으며 잠재적으로 관심 있는 뇌 영역을 손상시킬 수 있습니다. - 작은 주걱으로 뇌를 제거합니다. 얼음 위에 별도의 작은 비커에 배치 NMDG-aCSF 솔루션에 뇌를 드롭. 최대 1분 동안 그대로 둡니다.
참고 : 저체온증 외에도 얼음 차가운 식염수에 노출되면 뇌를 증가시며 절단에도 필요합니다. 참수에서 뇌 추출에 이르는 전체 절차는 30세 미만이어야 합니다.
- 큰 참수 가위로 마우스를 참수. #10 블레이드가 달린 메스를 사용하여 두개골 위에 피부를 열어 두습니다. 작은 각진 가위로, 미드라인에서 두개골을 잘라. 다음으로, #3 집게를 사용하여 두개골의 오른쪽과 왼쪽 절반을 멀리 캐리, 그것으로 멀리 두라를 가지고 조심. 뇌는 지금 노출되어야 합니다.
3. 슬라이스
- NMDG-aCSF에서 뇌를 꺼내 필터 용지에 놓습니다.
- 중간선을 중심으로 한 "60°" 도구를 사용하여 전뇌의 로스트랄 끝에서 60° 웨지를 잘라 제거합니다. 절단 표면은 아래 설명과 같이 횡단 해마 슬라이스에 대한 적절한 각도를 달성하기 위해 장착에 사용됩니다(그림 1A, B).
참고: 홈메이드 홀더를 통해 함께 유지되는 두 개의 단날 블레이드가 60°절단(그림 1A)을만들기 위한 사용하기 쉬운 도구를 만듭니다. - 메스와 중간선 아래로 반구를 분리합니다.
- 다음과 같이 반구를 장착 디스크에 붙입니다. 지금까지 얼음 위에 있었던 마운팅 디스크를 가져 가라. 필요한 경우 다시 말리십시오. 한천 블록 앞에 각 반구를 붙이면 측면을 줄입니다.
- 각 반구의 복부 면이 한천 블록을 만지고 있는지 확인합니다. 한천 블록은 절단 중에 추가 적인 지원을 제공하며 조각에도 필수적입니다. 각 반구의 등쪽 측면은 블레이드를 향해야 합니다. 절단 측에 접착하면, 각 반구는 그(것)에서 등쪽 해마의 횡방향 조각을 초래하는 방식으로 블레이드를 기준으로 지향된다(도1B).
- 반구와 디스크를 얼음 차가운 발보성 NMDG-aCSF를 포함하는 절단 챔버로 잠급하십시오.
- 400 μm 섹션을 잘라. 절단은 10 분 이내에 수행해야합니다. 다른 마이크로 토메는이 시간을 달성하기 위해 다른 설정이 필요합니다. 등쪽 해마 지역에서 총 8\u201210 슬라이스가 얻어질 것이다.
4. 복구
- 컷오프팁(그림 1C)이있는 일회용 이송 파이펫을 사용하여 실온에서 발보화 aCSF를 함유한 회수실로 슬라이스를 옮길 수 있습니다.
참고: 5mM Na-ascorbate 및 3mM Na-pyruvate로 복구 챔버-aSCF를 강화할 것을 적극 권장합니다. Pyruvate는 슬라이스28에서ATP의 생산을 향상시키는 것으로 나타난 에너지 기판이며, Na-ascorbate는 자유 라디칼 쿨시(29)입니다. - 기록하기 전에 약 2 시간 동안 실온 (22\u201224 °C)에서 배양하십시오 (최대 4 시간).
참고: 실온에서 더 긴 배양은 30분 동안 37°C의 표준 인큐베이션에 비해 더 오랜 시간 동안 더 건강한 슬라이스를 생성하고 실온 배양을 초래합니다. 37°C에서 재집기하면 세포독성부종(13)을도입할 수 있다.
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Representative Results
우리는 CamKIIa-Cre +에서 해마 조각을 생성하기 위해 위의 프로토콜을 적용; 혼합 유전 배경 C57Bl / 6 x SV / 129J, P > 120에 WT 마우스. CA1 분야에서 많은 수의 피라미드세포(도 2A)및수분(도 2B)은슬라이스 제제에서 건강한 세포의 특징인 적외선 차분 콘트라스트 현미경 검사법(IR-DIC)에서 관찰될 때 낮은 콘트라스트로 나타납니다. 이 준비와 함께 기가옴 씰의 높은 비율 (>90%) 표면 아래 약 20\u201250 미크론을 대상으로 할 때 일상적으로 달성된다. 이러한 성공률을 위해, 이 깊이에서 피라미드 세포의 적절한 시각화를 달성하기 위해 60배 물 침수 목표와 같은 IR-DIC에 대한 높은 NA 목표를 사용하는 것이중요하다(도 2A,B).
단일 뉴런의 패치 클램프 레코딩은 6개월 이상의 생쥐에서도 이 해마 슬라이스 제제를 사용하여 쉽게 달성할 수 있습니다. 도 2C는 CA1 뉴런으로부터의 소형 흥분절기 전류(mEPSC) 레코딩을 이용한 예제 실험을 나타낸다. 3분 동안 20 μM NMDA의 목욕 적용을 통해 화학 NMDA-LTD의 유도는 60분 후 NMDA 처리를 평가할 때 CA1 세포에서 mEPSC 주파수를 낮춥춥다. 이 발견은 NMDA-LTD가 오래된 마우스에서 CA1에 있는 시냅스의 활동 의존적인 가지치기를 일으키는 원인이 된다는 것을 건의합니다 (Durisic 외15에서적응한 결과). mEPSC 진폭의 변화는 검출되지 않았다. mEPSC 기록 중, CA1 세포는 또한 생생물시틴으로 채워졌다. 도 2D는 바이오시틴이 채워진 CA1 피라미드 뉴런의 수지상 식소와 건강한 세포 습관을 드러낸다. 세포 전체에 형광염의 강력한 분포는 다른 실험 조건하에서 수지상 척추 특성의 일상적인 평가를 허용합니다.
현장 기록을 사용하여 성인 마우스의 슬라이스에서 CA3-CA1 시냅스의 ~170%의 장기 전위(LTP)가 쉽게 관찰되었으며, 이는 LTP(그림2E,F)에필요한 신호 캐스케이드의 유지를 시사한다. 강력한 필드 흥분 성 포스트 냅스 전위(fEPSP) 신호에 필요한 네트워크 연결도 보존됩니다(그림2E). 성인 또는 노화 마우스에서 해 마 조각에 시 냅 스 가소성을 평가 하는 능력은 특히 그들의 특징 시 냅 스 기능 장애 생활에서 나중에 개발 으로 신경 퇴행 성 질환의 마우스 모델에 대 한 관련.
함께, 우리의 결과는 성인과 노화 마우스에서 급성 해마 준비가 정기적으로 단일 세포와 세포의 인구 모두에서 시냅스 기능의 평가를 허용한다는 것을 보여줍니다, 경내 관류및 얼음 차가운 NMDG 기반 솔루션이 저산소 손상을 최소화하기 위해 사용되는 한.
그림 1: 성인 및 노화 마우스에서 트랜스버라셀 해마 슬라이스의 절단 방법 및 회수. (A)중간선을 중심으로 뇌의 로스트랄 끝에서 60° 웨지를 제거하는 데 사용되는 "60°" 도구입니다. (B)반구의 대지 슬라이스 절단을 위한 포지셔닝. 왼쪽 및 오른쪽 상단 패널에 60° 절단 그림이 표시됩니다. 오른쪽 아래 패널에 표시된 방식으로 접착제로 표면에 두 반구를 배치하면 블레이드에 비해 등쪽 해마의 수직 방향을 보장합니다. 이 방향은 해마의 횡단 슬라이스를 초래합니다. 노란색 구조는 설치류 뇌 (회색) 내에서 해마의 3D 렌더링입니다. 이 그림은 SynapseWeb30에서적용됩니다. 모든 전망은 뇌의 등쪽 측면입니다. (C)회수실에서 4개월 된 마우스에서 잘라낸 횡단 해마 슬라이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: P120\u2012180에서 마우스에서 해마 슬라이스의 패치 클램프 및 시냅스 가소성 측정. (A)CA1 영역의 예IR-DIC 현미경 그래프. (B)수체의 예IR-DIC 현미경. A와 B 모두에서 60배의 수분 침수 목표를 가진 절단 후 이미지가 3h로 촬영됩니다. 교정 바는 10 μm.(C)P120\u2012180 마우스에서 CA1 뉴런의 mEPSC에 대한 화학적 NMDA-LTD의 효과이다. 상부 패널은 기준선 및 NMDA-LTD 펄스 후에 기록된 mEPSC의 예 추적입니다. 왼쪽 아래 패널: NMDA-LTD는 mEPSC 주파수를 낮췄습니다. 오른쪽 아래 패널: NMDA-LTD가 검출되지 않은 후 mEPSC 진폭 변경. N = 기준선에서 17개의 세포 및 n= NMDA-LTD, 6 마우스에 대한 15개의 세포. P = 0.004, t-테스트. 이 수치는 주리식 외15에서수정되었습니다. (D)생생물세포가 채워진 CA1 피라미드 세포의 예. (E)샤퍼 담보 자극 후 CA1 층 라디에움으로부터fEPSP 신호의 예. 회색 흔적은 기준선 기록 중에 얻어지며, 검은 색 흔적은 파상풍 자극 후 20분 후에 관찰된다. 각 추적은 평균 30개의 연속 추적입니다. (F)100Hz 유도의 4열차 후 CA3-CA1 시냅스의 장기 전위수의 누적 평균; n = 약 P90에서 8 WT 마우스에서 23 슬라이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 인공 뇌척수액 (aCSF) | ||||
| 재료 | Mw | 최종 conc. (mM) | g/2 리터 (10X) | g/리터 (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| 나코3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| KCl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1M 스톡 1.3 ml |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 1M 스톡 2.5 ml |
| 포도당*H2O | 180.2 | 25 | - | 4.5 g |
| a) 1M 주식에서 Mg2SO4*7H2O 및 CaCl2*2H2O 추가 | ||||
| b) aCSF 10X @RT 유지 | ||||
| c) aCSF 1X @4°C 용 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| 재료 | Mw | 최종 conc. (mM) | g/2 리터 (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| hCl을 곁들인 pH=7.4 | ||||
| KCl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| 콜린 중탄산염 | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| 포도당*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) 4°C에서 3X 스톡 솔루션을 필터링하고 저장 | ||||
표 1: 미디어 제형.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 성인 및 노화 마우스에게서 얻은 해마 조각이 절단 후에 많은 시간 동안 건강하고 실행 가능한 남아 있다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 슬라이스는 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 CA1 영역에서 오래 지속되는 필드 레코딩에 적합합니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 단계는 얼음 차가운 용액을 가진 경근 관류 단계입니다. 혈액의 빠른 간격은 간 색깔의 급속한 변경에 의해 신호됩니다. 추출 된 뇌는 색상에서 오프 화이트해야 한다. 뇌가 분홍색으로 남아 있다면 전신 혈액이 감기 NMDG-aCSF로 대체되지 않았으며 체온의 하락이 달성되지 않았다는 것을 의미합니다. 이것은 심장에 바늘의 부적절하게 배치에 의해 발생할 수 있습니다, 또는 심장을 통해 천공되었기 때문에. 제대로 perfused 마우스에서 뇌는 슬라이스에 사용되어서는 안된다. 두 번째 중요한 단계는 NMDG를 나트륨 이온 대체품으로 사용하는 것입니다. 쥐 뇌10에서Na+ 대체로 자당을 성공적으로 사용하는 프로토콜의 잘 알려진 이전변형,31은 마우스에서 충분히 건강한 해마 슬라이스를 생성하지 않습니다 (또한 참조 팅외. 13). 나트륨 이온 대체품으로 NMDG를 사용하는 것은 마우스 해마 슬라이스에 매우 중요합니다.
건강한 해마 슬라이스는 설명된 프로토콜을 사용하여 안정적으로 얻을 수 있지만 성인 및 노화 동물의 해마 준비는 여전히 도전적입니다. 그것의 어려움은 또한 다른 마우스 선 및 유전 배경으로 변경됩니다. 고려해야 할 잠재적 수정은 NMDG-aCSF 및 타우린, D-세린 또는 N-아세틸시스테인(NAC)과 같은 복구-aCSF 솔루션에 첨가제이며, 이는 신경 및 시냅스기능(13,29)을보강할 수 있고, 산소화를 증가시킬 수있다., Cl-이온의 대체는 또한 관류 및 절단 동안 고려되어야 한다32. 인터페이스 복구 챔버의 사용은 증가 된 산소를 유지하는 또 다른 방법입니다, 이는 장기 가소성 필드 녹음에 특히 관련이있다. 기재된 회수챔버(도1C)는그 목적을 위해 수정할 수 있다(예를 들어, aSCF에 의해 아래에서 촉촉하게 되는 배양 삽입 접시, 침수된 메쉬를 대체할 수 있음). 강철 블레이드를 사파이어 또는 세라믹 블레이드로 교체하면 해마 주변의 백색 물질의 무거운 골수화로 인해 조직 압축이 악화될 수 있습니다. 이것은 차례로 더 슬라이스 표면 근처 뉴런의 품질을 향상시킬 수 있습니다. 수직 진동을 최소화하도록 설계된 마이크로토메(예: 라이카 VT1200S의 제로-z)를 사용하는 또 다른 수정 가능한 단계입니다.
다른 뇌 영역은 절단 각도에 적절한 수정과 함께, 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 슬라이스 할 수있다. 또한, 다른 뇌 영역이 저산소증에 다른 정도에 민감하기 때문에 슬라이스 제제의 영역성을 조정할 수 있다. NMDG-aSCF를 사용하는 프로토콜은 성인 마우스 신피질 및 줄무늬 슬라이스 제제13,,20에대해 보고되었다. 30mM NaHCO3(즉, 나+무료가 아님)20을포함하는 NMDG-aCSF를 사용하며, 경우에 따라 실온13에서NMDG-aCSF를 사용하는 경우도 있다. 그러나, 해마로 저산소증에 취약 한 지역에 대 한, Na+무료 NMDG-aCSF와 얼음 차가운 경화 관류를 사용 하 여 중요 한 차이 만들 수 있습니다.
이 프로토콜은 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 광범위한 형질 전환 마우스 라인에 적용됩니다. 더욱이, 프로토콜은 그밖 포유류 모형 종에서 두뇌 조각에 추가 로 수정될 수 있었습니다, 또한. 함께, 이 프로토콜은 노화 동물에서 급성 해마 조각을 위한 표준화된 준비를 위한 기초가 될 수 있고, 따라서 질병 기계장치의 맥락에서 연구 전반에 걸쳐 비교를 촉진할 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
카를라 J. 샤츠 박사에게 조언과 지원을 해주신 것에 대해 감사드리며, 바바라 K. 브로트 박사와 미셸 K. 드루스 박사가 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 NIH EY02858과 MATHers 자선 재단이 CJS에 보조금을 지급함으로써 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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