Summary
这是一个急性切片制备从成人和老化的小鼠海马，利用转心灌注和切片切割与冰冷的NMDG-aCSF，以减少对组织的低氧损伤。生成的切片在几个小时内保持健康，并适用于长期的贴片夹和现场记录。
Abstract
急性海马切片使几代神经科学家能够详细探索突触、神经元和电路特性，并具有高保真度。没有这种经典的准备，不可能探索LTP和LTC机制、单神经元树突计算以及电路中依赖于经验的变化。然而，除了少数例外，大多数使用急性海马切片的基础研究都是使用相对年轻的啮齿动物的切片进行，+P20-P40，即使突触和内在兴奋机制有一个长长的发育尾巴，达到过去的P60。使用年轻的海马切片的主要吸引力是维持神经元健康，辅之以对低氧损伤的耐受性。然而，有必要了解神经功能在更成熟的发展阶段，进一步突出了各种动物模型的神经退行性疾病，需要老化的大脑准备。在这里，我们描述了对急性海马切片制剂的修改，该制剂可靠地从成年和老化的小鼠海马中提供健康的切片。该协议的关键步骤是转心灌注和切割与无冰钠无NMDG-aSCF。总之，这些步骤一起减轻脱毛时 ATP 中缺氧引起的下降，以及被动钠通量引起的细胞毒性水肿。我们演示如何使用振动微原子切割海马体和皮层的横切片。用这种方式获得的急性海马切片在数小时的录音中可靠健康，适用于现场记录和靶向贴片记录，包括荧光标记神经元的目标。
Introduction
哺乳动物急性脑切片制剂的出现促进了细胞和突触水平的实验，这些实验以前只能在无脊椎动物制剂（如Aplysia1）中实现。急性海马切片的发展具有特殊意义，因为它是一种负责工作记忆和上下文形成的结构，并且具有一种专门的三突触电路，易于生理操作。然而，绝大多数急性脑片仍然由相对年轻的小鼠和大鼠组成，因为它更容易保存健康的神经元和回路，而且这些切片在较长时间2、3、43期间仍然存活。2在这里，我们引入对标准切片协议的修改，提高成年和老化小鼠急性海马切片的生存能力。
哺乳动物大脑白症的长期外生力的主要障碍是，一旦血液在斩首后停止流向大脑，就迅速发生最初的缺氧损伤。缺氧导致大脑中主要能量资源的快速代谢消耗，磷肌酸（P-肌酸）损失速度最快，其次是葡萄糖、三磷酸腺苷（ATP）和糖原4。保存ATP对于大脑切片的长期健康特别重要，因为ATP需要通过Na-K ATPase保持膜电位，从而维持神经活动5，6。,6成年啮齿动物大脑中的ATP水平为±2.5 mM，在斩首后约1分钟、7、8时，在斩首后20秒内急剧下降，达到基底稳定状态（±0.5 mM）。4,7,8在幼年动物中，观察ATP相同下降需要更长的时间（±2分钟）;与苯巴比他麻醉，它进一步放缓到4分钟4。这些考虑表明，防止ATP和其他能量资源的丧失是防止大脑缺氧损伤的必要策略，反过来又可以长期维持大脑切片的健康，特别是在成年动物中。
低温减慢新陈代谢。因此，已经证明适度的体温过低可以保护大脑能量储备：在幼年动物中，将体温从37°C降低6度至31°C，将ATP水平控制在4小时以上的控制缺氧9中，将ATP水平控制在正常水平的80%左右。P-肌酸水平同样保留，以及整体磷酸化电位9。这表明，在斩首前降低体温可能是神经保护，因为ATP的接近正常水平可以通过切片切割和切片恢复期保持。
由于在斩首时无法完全防止ATP下降，预计Na-K ATPase的功能会部分受损，然后通过被动钠流入去极化。由于被动钠的涌入后，水进入细胞，它导致细胞毒性水肿，并最终皮刀病。在成年大鼠中，用蔗糖代替蔗糖是减轻细胞毒性水肿10、11,负担的成功策略。最近，减少钠通道渗透性12的甲基化有机化合物已经证明比蔗糖提供更有效的保护，特别是在成年小鼠的切片中，N-甲基-D-葡萄糖,胺（NMDG）在不同年龄和大脑区域,13、14、15、16中13,14应用得最广泛。15
许多大脑切片方案涉及仅在切片切割步骤期间使用低温，有时与 Na+离子替换策略16，,17 相结合。在幼年动物中，这些协议似乎提供了足够的神经保护，因为大脑可以在斩首后迅速提取，因为头骨仍然薄，易于切除3。然而，这种策略并不能从成年动物身上产生健康的切片。随着时间的推移，一些研究成年啮齿动物的实验室已经引进了转心灌注与冰冷的溶液，以降低动物的体温，因此在斩首之前对大脑的缺氧损伤。该程序被成功地应用于产生小脑片18，中脑切片19，新皮质切片11，20，腹皮层11,2021，大鼠海马体10，22，23，嗅球24，腹状盘,22,23状体25，视觉皮层26。
尽管跨心灌注和Na+离子替代在准备大鼠切片和小鼠某些大脑区域提供了优势，但小鼠海马仍然是保护13，20,缺氧的最具挑战性的区域之一。迄今为止，从老化的小鼠和神经退化的小鼠模型中切分海马体的最常见方法之一涉及分离的海马27的经典快速切片。在此描述的协议中，我们通过将脱毛前引入体温过低，通过用冰冷的 Na+- 基于 NMDG 的免费人工脑脊髓液 （NMDG） 来将动物转行，从而最大限度地减少成人大脑中 ATP 的损失。然后切成冰片在冰冷的 Na+ 无Nmdg - acsf。通过这种增强的协议，我们从成年和老化的小鼠获得急性海马切片，切片后健康长达10小时，适合长期现场记录和贴片夹研究。
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Protocol
该协议是根据国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南执行的，并经斯坦福大学机构动物护理和使用委员会批准。方法也符合神经科学学会关于在神经科学研究中使用动物和人类的政策。
注：所有小鼠都保持在无病原体的环境中。除非另有说明，否则此处使用混合C57Bl/6 x SV/129J遗传背景的野生小鼠。
1. 设置
- 准备 1 L 的 1x aCSF （以 mM）： 125 NaCl， 26 NaHCO3，2.3 KCl， 1.26 KH2PO4，1.3 毫克2SO4+7H2O， 2.5 CaCl2，25 葡萄糖 （表 1）.使用此解决方案进行恢复室和后续录制。
注：将 aCSF 存储为包含 NaCl、NaHCO3、KCl和 KH 2 PO4的 10 倍库存解决方案。将 Mg2SO4+7H2O 和 CaCl2 存储为 1 M 库存解决方案。在实验当天从上述库存溶液中准备工作溶液，并在用 18 MΩ 水调整最终体积之前添加葡萄糖。
注：根据大脑区域或小鼠应变，冷冻ACSF也可用于转心灌注成功11，15，26。11,15,26 - 准备 300 mL 的 NMDG-aCSF（以 mM）： 135 NMDG， 1 KCl， 1.2 KH2PO4，1.5 MgCl2，0.5 CaCl2， 20 胆碱碳酸氢盐， 10 葡萄糖 （表 1）.NMDG-aCSF 的体积足以用于转心灌注和切割步骤。
注：将 NMDG-aCSF 作为 3 倍库存溶液在 4 °C 下存储。 在实验当天准备工作解决方案;加入胆碱碳酸氢盐和葡萄糖，然后用18 MΩ水调节最终体积。用 95%O2/5%CO2 将溶液泡上溶液，以缓冲溶液，并用氧气饱和。
注：NMDG库存开始时为高碱性，需要浓缩盐酸（HCl）将pH值调整为+7.4。盐酸的添加应缓慢一次低于pH 8，因为它很容易酸化溶液到+pH3与多余的HCl。应在添加二分性 cations 之前进行此调整。此 NMDG-aCSF 配方不含钠。以前发布的NMDG配方使用30mM NaHCO3进行缓冲，这导致在NMDG-aCSF13，20中存在30mM钠。 - 将振动微切板和安装盘设置为 -20 °C。
- 准备恢复室。
- 将回收室填充到切片保持网格的上方，在室温下将回收室放在长凳上，然后冒泡。
注：这里使用的切片回收室与爱德华兹和康纳斯3号描述的古典室非常相似。aCSF 保存在玻璃烧杯 （400 mL） 中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃烧杯中，玻璃杯架中，玻璃烧杯中，丙烯酸框架通过一个丙烯酸钩悬浮在烧杯中间，放在烧杯的边缘。玻璃气泡器一直插入到底部。该设计允许切片两侧氧合。气泡还可以在回收室中持续混合 aCSF。黑色网格与白色切片具有高对比度，因此更容易看到。
- 将回收室填充到切片保持网格的上方，在室温下将回收室放在长凳上，然后冒泡。
- 准备转心灌注和切割溶液。
- 在冰柜中冷却整个 300 mL 的 NMDG-aCSF，直到冰晶开始在瓶子的表面和墙壁上形成。不要过度冻结！
- 将带冷藏 NMDG-aCSF 的瓶子放在冰和气泡上。溶液应介于 0°u20122 °C 之间。
注：Slushy NMDG- aCSF 意味着大部分溶液是液体，而一小部分泥冰在灌注和切割过程中将使溶液接近 0 °C。在切割过程中，应注意远离大脑的冰晶。
- 准备组织安装盘。
- 将磁盘从冰柜中取出，如果需要，请擦干。
- 从先前准备的阿加盘中切出一块 5% 的阿加，并使用薄薄的氰酸酸酯胶将糖粘在盘中央。阿加片应该和老鼠大脑一样大。将盘上粘着的阿加放在冰上，用纸巾盖住，直到准备好使用。
- 对于 5% 的阿加板，通过微摇将 5 g 的 agar 溶解在 100 mL 的 18 MΩ 水中，然后倒入干净的培养皿中。保持4°C。
- 将切割托盘从冰柜中取出，放入显微原子中，用冰包围，然后装载刀片。
2. 转心输注和脑抽
- 过量小鼠通过麻醉鸡尾酒的内皮内注射。通过检查疼痛反射（手趾捏）检查麻醉深度;老鼠到达深麻醉后不应表现出反射。
注：罗登特麻醉鸡尾酒配方：氯胺酮HCl（66毫克/mL），西拉辛HCl（6.6毫克/mL），乙丙胺醇酸酯（0.1毫克/mL），18 MΩ水到最终体积。剂量：0.4毫克/克体重，0.04毫克/克体重，6 x10-4 毫克/克体重，分别用于氯胺酮、Xylazine和丙丙胺。 - 设置用于转心灌注的心生泵。用冰的 NMDG-aCSF 将泵管的一侧插入瓶子中。用 27 G 针将插入左心室，将管子的另一侧安装。
- 将泵速设置为约 3.5 mL/min。以这个速度，NMDG-aCSF的流出是快速滴管，而不是连续流动。
注：重力灌注是内向泵灌注的一个很好的替代品，只要可以达到相同的近似流速。高流速的灌注会导致大脑血管破裂。过度快速灌注和血管压力增加的一个明显迹象是动物鼻子中的溶液。 - 灌注
- 将正确麻醉的鼠标放在尿布的背上。使用纸胶带，胶带下其前腿和后腿，使胸部和腹部暴露。
- 切出胸部顶部的一大片皮肤，从胸骨下方到喉咙;这应该提供一个大的工作区。用钳子抓住胸骨，轻轻抬起，开始切开两侧的肋骨笼，直到胸腔暴露。
- 切开隔膜，露出胸腔。肋骨笼的皮瓣应通过一块薄薄的肌肉保持连接。应该可以设置在一边，而不让它回落到暴露的胸腔上。检查心脏是否仍在跳动。确保大部分肝脏是可见的。
- 将 27 G 针插入左心室;鼠标的左心室颜色看起来比右心室轻。找到深红色右中庭。用小剪刀切穿右中庭;血液应该开始流出
- 启动已预设的泵，以正确的流量速度。如果一切做对了，肝脏应该开始改变颜色从红色到棕色后不久开始灌注。监测肝脏颜色以确定灌注的长度;肝脏应该变成淡棕色。
- 运行泵几分钟。如果使用直肠温度计，体温应下降至28°u201229°C，动物的鼻子应冷到触摸。
- 大脑提取。
注：对于此步骤，准备好以下解剖工具：斩首剪刀、带直或角刀片的小剪刀、手术刀和 #10 刀片、单刃刀片、#3 钳子、一侧弯曲到 90° 的铲子、铲子、"60°"工具（图1A、B）和一个小软刷。- 用大斩首剪刀斩首鼠标。使用带#10刀的手术刀，切开头骨顶部的皮肤。用小角度剪刀，在中线切头骨。接下来，用#3钳子，撬开头骨的左右半部分，小心地用它带走杜拉。现在大脑应该暴露了。
注：如果杜拉从头骨中分离出来，它会停留在大脑上，必须分开切除。剩余的杜拉的边缘可以收紧和切片深通过大脑，潜在的损害大脑区域的兴趣。 - 用一个小铲子挖出大脑，取出大脑。将大脑放入放置在冰上单独小烧杯中的 NMDG-aCSF 溶液中。留在那里长达一分钟。
注：除了体温过低，暴露在冰冷的盐水公司的大脑，这是必要的，甚至削减。从斩首到大脑提取的整个过程应该在30岁以下。
- 用大斩首剪刀斩首鼠标。使用带#10刀的手术刀，切开头骨顶部的皮肤。用小角度剪刀，在中线切头骨。接下来，用#3钳子，撬开头骨的左右半部分，小心地用它带走杜拉。现在大脑应该暴露了。
3. 切片
- 将大脑从 NMDG-aCSF 中拿出来，放在一张滤纸上。
- 使用以中线为中心的"60°"工具，从前脑的旋转端切割并移除 60° 楔子。切割表面将用于安装，以达到横向海马切片的正确角度，如下所述（图1A，B）。
注：通过一个自制造支架将两个单刃刀片放在一起，使 60° 切割成为易于使用的工具（图 1A）。 - 用手术刀将半球沿着中线向下。
- 将半球粘附到安装盘上，如下所示。拿一直冰上的安装盘到现在。如果需要，请再次擦干。将每个半球粘在阿加块前面，切边向下。
- 确保每个半球的腹侧接触阿加块。在切割过程中，agar 块提供额外的支撑，对于均匀切片至关重要。每个半球的侧侧应朝向刀片。当粘在切割侧时，每个半球相对于叶片的方向，导致在原位出现越轨海马片（图1B）。
- 将圆盘与半球一起淹没在含有冰冷碳化 NMDG-aCSF 的切割室中。
- 切割 400 μm 部分。切割应在 10 分钟内完成。不同的显微需要不同的设置来实现这一次。总共从后海马区获得8\u201210片。
4. 恢复
- 使用带切断尖端的一次性转移移液器，在室温下将切片转移到含有碳化 aCSF 的回收室（图 1C）。
注：强烈建议使用 5 mM Na-ascorbate 和 3 mM Na-pyruvate 来强化恢复室-aSCF。丙光酸是一种能量基质，用于促进28片中ATP的生产，而Na-ascorbate是一种自由基淬火剂29。 - 在室温下孵育（22°u201224 °C），在记录前孵育约2小时（最多4小时）。
注：在室温下孵育时间较长，与37°C的标准孵育时间相比，在37°C下孵育30分钟，然后是室温孵育。在37°C下重新温化可以引入细胞毒性水肿13。
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Representative Results
我们应用上述协议，从CamKIIa-Cre+生成海马切片;混合遗传背景的WT小鼠C57Bl/ 6 x SV/ 129J，在P> 120。在CA1场（图2A）和亚分细胞（图2B）中，当在红外差分对比度显微镜（IR-DIC）下观察到时，会出现低对比度，这是切片制备中健康细胞的标志。通过这种制备，可高千兆欧姆密封件（>90%）当目标为表面以下约 20 微米的最健康细胞时，通常实现。对于此成功率，对于 IR-DIC 使用高 NA 目标（如 60 倍水浸目标）非常重要，以便在此深度实现金字塔细胞的充分可视化（图 2A，B）。
使用这种海马切片制剂，从单个神经元的贴片记录很容易实现，即使在6个月大的小鼠中。 图 2C 显示了一个示例实验，使用来自 CA1 神经元的微型兴奋后突触电流 （mEPSC） 记录。在评估60分钟NMDA后处理时，将具有20μM NMDA的沐浴应用的化学NMDA-LTD诱导3分钟，可降低CA1细胞中的mEPSC频率。这一发现表明，NMDA-LTD导致老年小鼠CA1中突触的活动依赖性修剪（结果改编自Djurisic等人15）。未检测到 mEPSC 振幅的变化。在mEPSC记录期间，CA1细胞也充满了生物细胞素。 图2D 揭示了一个完整的树突状和生物细胞填充CA1金字塔神经元的健康细胞习惯。荧光染料在整个细胞中的强劲分布允许对不同实验条件下的树突脊柱特性进行常规评估。
使用现场记录，在成人小鼠切片中对 ±170% 的 CA3-CA1 突触进行长期电位化 （LTP）， 表明可以维持 LTP 所需的信号级联 （图 2E，F）。稳健的场兴奋后突触后电位（fEPSP）信号所需的网络连接也得到保留（图2E）。评估成年或老化小鼠海马切片的突触可塑性的能力与神经退行性疾病的小鼠模型特别相关，因为他们标志性的突触功能障碍在晚年发展。
我们的结果表明，成人和衰老小鼠的急性海马制剂允许评估单细胞和细胞群水平的突触功能，只要使用跨心灌注和基于冰冷的NMDG溶液，以尽量减少低氧损伤。
图1：从成年和老化小鼠身上切割方法和恢复横横海马切片。（A） 一种"60°"工具，用于从大脑的左体端去除60°楔子，以中线为中心。（B） 定位半球以切割横向切片。左侧和右上角的面板上显示了 60° 切口的图示;以右下面板所示的方式将两个半球定位在表面上，确保相对于叶片的侧海马体具有垂直方向。这种方向导致海马体的横向切片。黄色结构是啮齿动物大脑（灰色）内海马的3D渲染。此图改编自 SynapseWeb30。所有的观点都是大脑的后侧。（C） 从一只4个月大的老鼠在恢复室中切开的横向海马切片。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：P120\u2012180小鼠海马切片的贴片夹和突触可塑性测量。（A） CA1区域的红外-DIC显微图示例。（B） 子基拉姆的红外-DIC显微图示例。在 A 和 B 中，图像在以 60 倍水浸目标切割后 3 小时拍摄。校准杆为10μm.（ C ）化学NMDA-LTD对P120μu2012180小鼠CA1神经元中的MEPSC的影响。上面板是在基线和 NMDA-LTD 脉冲之后记录的 mEPSC 的示例痕迹。左下角面板：NMDA-LTD 导致 mEPSC 频率降低。右下面板：未检测到 NMDA-LTD 后，mEPSC 振幅变化。N = 基线的 17 个细胞和 N = 15 个细胞，用于 NMDA-LTD，6 只小鼠。P = 0.004，t 检验。这个数字已经修改了从朱里西奇等人15。（D） 生物细胞填充CA1金字塔细胞的例子。（E） 沙弗附带刺激后来自CA1层半径的fEPSP信号示例。在基线记录过程中获得灰色轨迹，在泰塔尼奇刺激后20分钟观察到黑色轨迹。每个跟踪平均为 30 个连续跟踪。（F） 4次100赫兹感应列车后，CA3-CA1突触长期强电的累计平均值;n = 8 WT 小鼠在大约 P90 的 23 片。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 人造脑脊液（aCSF） | ||||
| 成分 | M w | 最终会议 （mm） | g/2 升 （10 倍） | g/升 （1X） |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| 纳赫科3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| 氯化钾 | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| Kh2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1.3 毫升 1M 库存 |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2.5 ml 1M 库存 |
| 葡萄糖*H2O | 180.2 | 25 | - | 4.5 克 |
| a） 从 100 万股中添加 Mg2SO4*7H2O 和 CaCl2*2H2O | ||||
| b） acsF 10 倍保持@RT | ||||
| c） aCSF 1X @4°C，24 小时 | ||||
| Nmdg - acsf | ||||
| 成分 | M w | 最终会议 （mm） | g/2 升 （3X） | g/300 毫升（1X） |
| Nmdg | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7.4 带 HCl | ||||
| 氯化钾 | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| Kh2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| 胆碱碳酸酯 | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| 葡萄糖*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a） 在 4°C 下过滤和存储 3X 库存溶液 | ||||
表1：介质配方。
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Discussion
此处描述的协议表明，从成年和老化的小鼠获得的海马切片在切割后可以保持健康和存活数小时。使用此协议准备的切片适用于修补夹录制以及 CA1 区域中的持久现场录制。
此协议中有两个关键步骤。第一步是使用冰冷的溶液的跨心灌注步骤。快速清除血液是由肝脏颜色的快速变化发出的信号。提取的大脑应该是非白色的颜色。如果大脑保持粉红色，这意味着全身血液没有被冷的NMDG-aCSF所取代，而且体温的下降也未实现。这可能是由于针头正确放入心脏，或因为心脏被刺穿造成的。不应用不多的老鼠的大脑进行切片。第二个关键步骤是使用NMDG作为钠离子替代品。早著名的协议变体，成功地使用蔗糖代替Na+在大鼠大脑10，31没有产生10,31足够健康的海马切片在小鼠（也见Ting等人13）。使用NMDG作为钠离子替代品对小鼠海马切片至关重要。
虽然健康的海马切片是可靠地获得使用描述的协议，海马制剂从成年和老化的动物仍然是具有挑战性的。它的难度也随着不同的小鼠线和遗传背景而变化。考虑的可能是对NMDG-aCSF和回收-aCSF解决方案的添加剂，如牛磺酸，D-丝氨酸，或N-乙酰半胱氨酸（NAC），可以增强神经元和突触功能13，29，29增加氧13合29。 在灌注和切割32期间，还应考虑对Cl-离子的替换。使用接口回收室是维持增氧的另一种方式，这对于长期可塑性现场记录特别相关。所述恢复室（图1C）可为此目的进行修改（例如，由 aSCF 从下面润湿的培养插入盘可以替代水下网格）。用蓝宝石或陶瓷刀片取代钢叶片可以减少组织压缩，而海马周围白物质的重压会加剧;这反过来又可以进一步改善切片表面附近的神经元质量。使用旨在最小化垂直振动的微子（例如，Leica VT1200S 中的零 z）是另一个可修改的步骤。
其他大脑区域可以使用此处描述的协议进行切片，并适当修改切割角度。此外，切片准备的细致性可以调整，因为不同的大脑区域对缺氧程度不同敏感。据报道，一种使用NMDG-aSCF的协议用于成年小鼠新皮质和纹状切片制剂13，20;13,它使用包含 30 mM NaHCO3 （即它不是 Na+- free）20的 NMDG-aCSF，在某些情况下，在室温13时，转心灌注与 NMDG-aCSF 一起。然而，对于一个像海马体一样易缺氧的地区来说，使用无Na+ - - - - - - aCSF 和冰冷的转心灌注可以产生关键的影响。
该协议适用于大量模拟神经退行性疾病的转基因小鼠线。此外，该协议也可以进一步修改为来自其他哺乳动物模型物种的大脑切片。该协议可以一起作为对老化动物的急性海马切片进行标准化准备的基础，从而促进疾病机制背景下研究的比较。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我感谢卡拉·沙茨博士的建议和支持，感谢芭芭拉·布罗特博士和米歇尔·德鲁斯博士认真阅读手稿。这项工作得到了NIH EY02858和马瑟斯慈善基金会对CJS的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
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