Summary
هذا هو بروتوكول لإعداد شريحة حادة من الكبار والشيخوخة فرس النهر الماوس الذي يستفيد من الضخ عبر القلب وقطع شريحة مع الجليد البارد NMDG-aCSF للحد من الضرر نقص الأكسجة في الأنسجة. تبقى الشرائح الناتجة في صحة جيدة على مدار ساعات عديدة ، وهي مناسبة لـ Patch-clamp على المدى الطويل والتسجيلات الميدانية.
Abstract
وقد مكنت شرائح فرس النهر الحادة أجيال من علماء الأعصاب لاستكشاف خصائص متشابك، العصبية، والدوائر بالتفصيل وبدقة عالية. استكشاف LTP و LTD آليات، واحدة حساب تسخين الخلايا العصبية، والتغيرات التي تعتمد على الخبرة في الدوائر، لم يكن ممكنا بدون هذا الإعداد الكلاسيكي. ومع ذلك، مع بعض الاستثناءات القليلة، تم إجراء معظم البحوث الأساسية باستخدام شرائح فرس النهر الحادة باستخدام شرائح من القوارض من أعمار مبكرة نسبيا، ~ P20-P40، على الرغم من أن آليات الإثارة متشابك ومتأصلة لها ذيل التنموية الطويلة التي تصل إلى P60 الماضي. النداء الرئيسي لاستخدام شرائح فرس النهر الشباب هو الحفاظ على صحة الخلايا العصبية بمساعدة ارتفاع التسامح للأضرار نقص الأكسجة. ومع ذلك، هناك حاجة لفهم وظيفة الخلايا العصبية في مراحل أكثر نضجا من التنمية، وزيادة من خلال تطوير نماذج حيوانية مختلفة من الأمراض العصبية التي تتطلب إعداد الدماغ الشيخوخة. هنا وصفنا تعديلا لإعداد شريحة قرن آمون الحاد الذي يسلم بشكل موثوق شرائح صحية من فرس النهر الماوس الكبار والشيخوخة. الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي الضخ عبر القلب والقطع مع الجليد الباردة خالية من الصوديوم NMDG-aSCF. معا، هذه الخطوات تخفيف انخفاض نقص الأكسجة الناجم عن ATP عند قطع الرأس، فضلا عن وذمة السامة للخلايا الناجمة عن تدفقات الصوديوم السلبية. نُوضِّفُ كيفية قصّ شرائح مُنَعَرِفِ مِنْ قرن آمون بالإضافة إلى قشرةِ قَدَسْةِ تَعْزِزِيْ بِنْفِرِةِ. شرائح فرس النهر الحادة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة صحية بشكل موثوق على مدى ساعات عديدة من التسجيل ، وهي مناسبة لكل من التسجيلات الميدانية والتسجيلات المستهدفة باللصقبص ، بما في ذلك استهداف الخلايا العصبية ذات التسمية الفلورية.
Introduction
وقد سهل ظهور الثدييات الاستعدادات شريحة الدماغ الحادة التجارب على المستوى الخلوية والتشابكية التي كانت ممكنة سابقا إلا في الاستعدادات اللافقارية مثل Aplysia1. وكان تطوير شرائح فرس النهر الحادة ذات أهمية خاصة، حيث أنها هيكل مسؤول عن تكوين الذاكرة والعمل والسياق، ولها دوائر ثلاثية متشابك متخصصة قابلة للتلاعب الفسيولوجي السهل. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من شرائح الدماغ الحادة لا تزال مستعدة من الفئران والجرذان الصغيرة نسبيا ، حيث أنه من الأسهل الحفاظ على الخلايا العصبية والدوائر الصحية ، وتبقى الشرائح قابلة للحياة لفترات أطول من الزمن2،3،4. هنا، نقدم تعديلات على بروتوكولات التقطيع القياسية التي تؤدي إلى زيادة جدوى شرائح قرن آمون الحادة من الفئران البالغة والشيخوخة.
العائق الرئيسي أمام قدرة الجسم الحي السابق على البقاء على المدى الطويل من الثديات الدماغ parenchyma هو الضرر hypoxic الأولية التي تحدث بسرعة بمجرد تدفق الدم إلى الدماغ يتوقف بعد قطع الرأس. فقدان الأكسجين النتائج في الاستهلاك الأيضي السريع من موارد الطاقة الرئيسية في الدماغ مع فقدان فوسفو الكرياتين (ف- الكرياتين) كونها أسرع، تليها الجلوكوز، الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، والجليكوجين4. الحفاظ على ATP له أهمية خاصة لصحة طويلة الأجل لشرائح الدماغ، كما هو مطلوب ATP للحفاظ على إمكانات الغشاء عبر ATPase نا-K، وبالتالي النشاط العصبي5،,6. مستوى ATP في الدماغ القوارض الكبار هو ~ 2.5 mM، ويسقط بشكل حاد داخل 20 ق من قطع الرأس للوصول إلى حالة ثابتة القاعدية (~ 0.5 mM) في حوالي 1 دقيقة بعد قطع الرأس4،7،8. في الحيوانات الصغيرة، يستغرق وقتا أطول لمراقبة نفس الانخفاض في ATP (~ 2 دقيقة)؛ مع التخدير الفينوباربيالي هو مزيد من تباطؤ إلى 4 دقيقة4. وتبين هذه الاعتبارات أن منع فقدان ATP وغيرها من موارد الطاقة هو استراتيجية ضرورية لمنع تلف نقص الأكسجة في الدماغ، وبدوره للحفاظ على صحة شرائح الدماغ على مدى فترات أطول من الزمن، وخاصة في الحيوانات البالغة.
انخفاض درجات الحرارة تبطئ عملية التمثيل الغذائي. وبالتالي، فقد ثبت أن انخفاض حرارة الجسم متواضعة يحمي احتياطيات الطاقة في الدماغ: في الحيوانات الصغيرة، وخفض درجة حرارة الجسم بمقدار ست درجات، من 37 درجة مئوية إلى 31 درجة مئوية، يحافظ على مستويات ATP إلى حوالي 80٪ من المستويات العادية على مدى 4 ساعة من نقص الأكسجة الخاضعة للرقابة9. كما يتم الحفاظ على مستويات P-الكرياتين، وكذلك احتمالية الفسفور الشامل9. وهذا يشير إلى أن خفض درجة حرارة الجسم قبل قطع الرأس يمكن أن يكون عصبيا، حيث يمكن الحفاظ على مستويات شبه طبيعية من ATP من خلال قطع شريحة وشريحة فترات الانتعاش.
إلى درجة أن قطرة ATP لا يمكن منعها تماما عند قطع الرأس، ومن المتوقع وظيفة ضعف جزئي من ATPase نا- K، تليها إزالة التلوث عن طريق تدفق الصوديوم السلبي. كما يتبع تدفق الصوديوم السلبي من خلال دخول المياه إلى الخلايا، فإنه يسبب وذمة السامة للخلايا وفي نهاية المطاف pyknosis. في الفئران البالغة، استبدال نا + الأيونات مع السكروز في حلول قطع شريحة كانت استراتيجية ناجحة لتخفيف عبء الوذمة السامة للخلايا10،11. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الكاتيونات العضوية الميثيلية التي تقلل نفاذية قناة الصوديوم12 لتقديم حماية أكثر فعالية من السكروز، وخاصة في شرائح من الفئران الكبار، مع N-الميثيل-D-جلوكوامين (NMDG) يجري الأكثر انطباقا على نطاق واسع عبر مختلف الأعمار ومناطق الدماغ13،14،15،16.
العديد من بروتوكولات تشريح الدماغ تنطوي على استخدام درجات الحرارة الباردة فقط خلال خطوة قطع شريحة، وأحيانا في تركيبة مع نا+ استراتيجية استبدال الأيونات16،17. في الحيوانات الصغيرة ، يبدو أن هذه البروتوكولات توفر الحماية العصبية الكافية حيث يمكن استخراج الأدمغة بسرعة بعد قطع الرأس لأن الجمجمة لا تزال رقيقة وسهلة لإزالة3. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية لا تنتج شرائح صحية من الحيوانات البالغة. مع مرور الوقت، أدخلت عدد من المختبرات التي تدرس القوارض البالغة الضخ عبر القلب مع محلول الجليد البارد لخفض درجة حرارة جسم الحيوان، وبالتالي تلف نقص الأكسجة في الدماغ، قبل قطع الرأس. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح لإنتاج شرائح cerebellar18، شرائح midbrain19، شرائح القشرة الجديدة11،20، القشرة الرحاين21، قرن آمون الفئران10،22،23، لمبة الشم24، المخطط البطيني25، القشرة البصرية26.
على الرغم من المزايا التي يوفرها الضخ عبر القلب وNa+ استبدال الأيونات في إعداد شرائح من الفئران وفي بعض مناطق الدماغ في الفئران، يبقى قرن الماوس قرن آمين واحدة من أكثر المناطق تحديا للحماية من نقص الأكسجة13،20. حتى الآن، واحدة من النهج الأكثر شيوعا لشرائح قرن آمون من الفئران الشيخوخة ونماذج الماوس من الانعزال العصبي ينطوي على تشريح سريع الكلاسيكية من فرس النهر المعزول27. في البروتوكول الموصوف هنا ، نحن نقلل من فقدان ATP في الدماغ البالغ من خلال إدخال انخفاض حرارة الجسم قبل قطع الرأس عن طريق ضخ الحيوان عبر القلب مع الثلج البارد Na+- السائل النخاعي الاصطناعي المجاني NMDG القائم على NMDG (NMDG-aCSF). ثم يتم قطع شرائح في الجليد الباردة نا+-خالية NMDG-aCSF. مع هذا البروتوكول المعزز نحصل على شرائح قرن آمون حادة من الفئران البالغة والشيخوخة التي هي صحية لمدة تصل إلى 10 ساعة بعد التقطيع ومناسبة لتسجيلات ميدانية طويلة الأجل ودراسات التصحيح المشبك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقاً لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة، وهو دليل أقرته لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة ستانفورد. كما تتوافق الطرق مع سياسات جمعية علم الأعصاب بشأن استخدام الحيوانات والبشر في أبحاث علم الأعصاب.
ملاحظة: تم الحفاظ على جميع الفئران في بيئة خالية من مسببات الأمراض. واستخدمت الفئران من النوع البري على مختلطة C57Bl / 6 س س / 129J الخلفية الوراثية استخدمت هنا، ما لم يذكر خلاف ذلك.
1. الإعداد
- إعداد 1 لتر من 1X aCSF (في mM): 125 NaCl، 26 NaHCO3،2.3 KCl، 1.26 KH2PO4، 1.3 Mg2SO4·7H2O، 2.5 CaCl2، 25 glucose (الجدول 1). استخدم هذا الحل لغرفة الاسترداد والتسجيلات اللاحقة.
ملاحظة: تخزين aCSF كحل الأسهم 10x التي تحتوي على NaCl، NaHCO3،KCl، وخ2PO4. مخزن ملغ2SO4· 7H2O وCaCl2 كحلول الأسهم 1 M. إعداد حل العمل في يوم التجربة من حلول الأسهم المذكورة أعلاه، وإضافة الجلوكوز قبل تعديل حجم النهائي مع 18 MΩ المياه.
ملاحظة: اعتمادا على منطقة الدماغ أو سلالة الماوس، يمكن أيضا أن تستخدم aCSF المبردة ل perfusion عبر القلب مع النجاح11،15،26. - إعداد 300 مل من NMDG-aCSF (في mM): 135 NMDG، 1 KCl، 1.2 KH2PO4، 1.5 MgCl2، 0.5 CaCl2، 20 بيكربونات الكولين، 10 الجلوكوز(الجدول 1). هذا الحجم من NMDG-aCSF كافية لكل من التسريب عبر القلب وخطوات القطع.
ملاحظة: تخزين NMDG-aCSF كحل الأسهم 3x في 4 درجة مئوية. إعداد حل العمل في يوم التجربة؛ إضافة بيكربونات الكولين والجلوكوز قبل ضبط حجم النهائي مع 18 MΩ الماء. فقاعة الحل مع 95٪ O2/5٪ CO2 لمخزنها ، وتشبع مع الأكسجين.
ملاحظة: يبدأ مخزون NMDG ككلوية عالية، ويتطلب حمض الهيدروكلوريك المركز (HCl) لضبط الأس هيدروكلوريك إلى 7.4~ إضافة حمض الهيدروكلوريك ينبغي أن تكون بطيئة مرة واحدة تحت 8 pH، كما أنه من السهل أن تحمض الحل إلى ~ pH 3 مع حمض الهيدروكلوريك الزائدة. وينبغي أن يتم هذا التعديل قبل إضافة الكاتيونات divalent. هذه الوصفة NMDG-aCSF خالية من الصوديوم. نشرت سابقا وصفات NMDG استخدام 30 mM NaHCO3 للتخزين المؤقت، مما يؤدي إلى 30 mM الصوديوم موجودة في NMDG-aCSF13،20. - تعيين علبة قطع microtome تهتز والقرص تصاعد إلى -20 درجة مئوية.
- تحضير غرفة الاسترداد.
- ملء غرفة الانتعاش إلى ما فوق شبكة شريحة عقد، والحفاظ على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة، وفقاعات.
ملاحظة: غرفة استرداد شريحة المستخدمة هنا هي مشابهة جدا للغرف الكلاسيكية التي سبق وصفها من قبل ادواردز وكونريث3. يتم الاحتفاظ aCSF في كوب زجاجي (400 مل) الذي يحمل إطار الاكريليك جولة مع شبكة النايلون السوداء لصقها على القاع. يتم تعليق إطار الاكريليك في منتصف الكأس عن طريق خطاف الاكريليك يستريح على حافة الكأس. يتم إدخال فقاعة الزجاج على طول الطريق إلى أسفل. تصميم يسمح للأكسجين من كلا الجانبين من شرائح. كما يوفر محتدما خلط مستمر من aCSF في غرفة الانتعاش. توفر الشبكة السوداء تباينًا عاليًا ضد الشرائح البيضاء ، والتي يسهل رؤيتها.
- ملء غرفة الانتعاش إلى ما فوق شبكة شريحة عقد، والحفاظ على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة، وفقاعات.
- إعداد محلول التسريب والقطع عبر القلب.
- هدئ كامل 300 مل من NMDG-aCSF في الثلاجة، حتى بلورات الجليد تبدأ في التشكل على السطح وجدران الزجاجة. لا الإفراط في تجميد!
- ضع الزجاجة مع NMDG-aCSF المبردة على الجليد والفقاعات. يجب أن يكون الحل بين 0\u20122 درجة مئوية.
ملاحظة: SLushy NMDG- aCSF يعني وجود معظم الحل كسائل، في حين أن جزءا صغيرا من الجليد slushy الحالي سوف تبقي الحل بالقرب من 0 درجة مئوية في جميع أنحاء perfusion والقطع. وينبغي توخي الحذر لإبعاد بلورات الثلج عن الدماغ أثناء القطع.
- إعداد القرص الأنسجة المتصاعدة.
- أخرج القرص من الفريزر، وامسحه جافاً إذا لزم الأمر.
- قطع كتلة من 5٪ أجار من لوحة أجار أعدت سابقا، والغراء في وسط القرص باستخدام طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلا. قطعة أجار يجب أن تكون بحجم دماغ فأر. وضع القرص مع أجار لصقها على الجليد، وتغطية مع المناشف الورقية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
- ل5٪ agar لوحة، تذوب 5 غرام من أجار في 100 مل من 18 MΩ المياه عن طريق microwaving، وتصب في طبق بيتري نظيفة. يحفظ عند 4 درجة مئوية.
- أخرجي صينية القطع من الفريزر، وضعها في الميكراتوم، أحاطه بالثلج، وحمّل النصل.
2. الضخ عبر القلب واستخراج الدماغ
- جرّاء فئران الجرعة الزائدة عن طريق حقن داخل الصفاق من كوكتيل مخدر. التحقق من عمق التخدير عن طريق التحقق من انعكاس الألم (إصبع القدم قرصة); يجب أن لا يحمل الماوس رد الفعل بمجرد أن يصل إلى التخدير العميق.
ملاحظة: وصفة كوكتيل تخدير القوارض: الكيتامين HCl (66 ملغ /مل), زيلازين HCl (6.6 ملغ / مل), ماليات الأسبرومازين (0.1 ملغ / مل), 18 MΩ المياه إلى الحجم النهائي. الجرعة: 0.4 ملغ/ز وزن الجسم, 0.04 ملغ / ز وزن الجسم, 6 × 10-4 ملغ / ز وزن الجسم للكيتامين, xylazine, و acepromazine, على التوالي. - إعداد مضخة ال peristaltic ل perfusion عبر القلب. أدخل جانبًا واحدًا من أنابيب المضخة في الزجاجة باستخدام NMDG-aCSF المثلج. تناسب الجانب الآخر من أنابيب مع إبرة 27 G التي سيتم إدراجها في البطين الأيسر.
- تعيين سرعة المضخة في حوالي 3.5 مل / دقيقة. في هذه السرعة، وتدفق NMDG-aCSF هو بالتنقيط السريع، وليس تدفق مستمر.
ملاحظة: الضخ بالجاذبية هو بديل جيد للضخ ال peristaltic الضخ، طالما يمكن تحقيق نفس معدل التدفق التقريبي. و perfusion في ارتفاع معدل تدفق يؤدي إلى انفجار الأوعية الدموية في الدماغ. علامة تنبئ من ضخ سريع بشكل مفرط وزيادة الضغط في الأوعية الدموية هو حل يخرج من أنف الحيوان. - الضخ
- ضع الماوس المُهدّد بشكل صحيح على ظهره على حفاضة. باستخدام شريط ورقي، الشريط أسفل ساقيه الأمامية والذرية بحيث يتم كشف الصدر والبطن.
- قطع رقعة كبيرة من الجلد فوق الصدر, الانتقال من تحت القص إلى الحلق; هذا ينبغي أن توفر منطقة عمل كبيرة. الاستيلاء على القص مع ملقط، ورفع بلطف، والبدء في قطع من خلال القفص الصدري على كلا الجانبين حتى يتم الكشف عن تجويف الصدر.
- قطع من خلال الحجاب الحاجز من أجل فضح تجويف الصدر. يجب ترك رفرف القفص الصدري مرفقًا عن طريق قطعة رقيقة من العضلات. وينبغي أن يكون من الممكن لتعيينه على جانب دون أن يكون لها تقع مرة أخرى على تجويف الصدر المكشوفة. تأكد من أن القلب لا يزال ينبض. تأكد من أن معظم الكبد مرئي.
- أدخل إبرة 27 G في البطين الأيسر؛ البطين الأيسر الماوس تبدو أخف وزنا في اللون من اليمين. حدد مكان الأذين الأيمن الداكن ذو اللون الأحمر. قطع من خلال الأذين الأيمن مع مقص صغير; يجب أن يبدأ الدم في التدفق.
- بدء المضخة التي تم مسبقاً إلى سرعة التدفق الصحيح. إذا كان كل شيء قد تم بشكل صحيح، يجب أن تبدأ الكبد لتغيير اللون من الأحمر إلى البني بعد فترة وجيزة من بدء perfusion. مراقبة لون الكبد لتحديد طول الضخ; الكبد يجب أن تتحول البني شاحب.
- تشغيل المضخة لبضع دقائق أخرى. إذا كان استخدام ميزان الحرارة المستقيم، ينبغي أن تنخفض درجة حرارة الجسم إلى 28\u201229 درجة مئوية، وأنف الحيوان يجب أن يكون باردا لمسة.
- إستخراج الدماغ.
ملاحظة: لهذه الخطوة، لديها أدوات تشريح التالية جاهزة: مقص قطع الرأس، مقص صغير مع شفرة مستقيمة أو زاوية، مشرط #10 شفرة، شفرة حافة واحدة، #3 ملقط، ملعقة مع جانب واحد عازمة على 90 درجة، ملعقة، أداة "60 درجة"(الشكل 1A، B)،وفرشاة ناعمة صغيرة.- قطع رأس الماوس مع مقص قطع الرأس كبيرة. باستخدام مشرط مع شفرة #10، وقطع فتح الجلد على رأس الجمجمة. مع مقص صغير الزاوية، وقطع الجمجمة في خط الوسط. بعد ذلك ، باستخدام ملقط #3 ، نقب الأنصاف اليمنى واليسرى للجمجمة ، مع الحرص على أخذ الجافية معها. يجب أن يتعرض الدماغ الآن.
ملاحظة: إذا كانت الجافة تنفصل عن الجمجمة، فإنها ستبقى فوق الدماغ ويجب إزالتها بشكل منفصل. يمكن لحافات الجافا المتبقية تشديد وشريحة عميقة من خلال الدماغ، مما قد يضر منطقة الدماغ من الفائدة. - إزالة الدماغ عن طريق يغرف بها مع ملعقة صغيرة. إسقاط الدماغ في حل NMDG-aCSF وضعت في منقار صغير منفصل على الجليد. اتركه هناك لمدة تصل إلى دقيقة.
ملاحظة: بالإضافة إلى انخفاض حرارة الجسم، والتعرض لشركات الملحية الجليد الباردة حتى الدماغ، وهو أمر ضروري حتى لقطع. وينبغي أن يكون الإجراء بأكمله من قطع الرأس إلى استخراج الدماغ تحت 30 ق.
- قطع رأس الماوس مع مقص قطع الرأس كبيرة. باستخدام مشرط مع شفرة #10، وقطع فتح الجلد على رأس الجمجمة. مع مقص صغير الزاوية، وقطع الجمجمة في خط الوسط. بعد ذلك ، باستخدام ملقط #3 ، نقب الأنصاف اليمنى واليسرى للجمجمة ، مع الحرص على أخذ الجافية معها. يجب أن يتعرض الدماغ الآن.
3. تقطيع
- أخرج الدماغ من NMDG-aCSF وضعه على قطعة من ورق التصفية.
- قص وإزالة إسفين 60 درجة من نهاية الرسترالية من forebrain باستخدام أداة "60 درجة" تركزت في خط الوسط. سيتم استخدام الأسطح القطعية للتركيب لتحقيق الزاوية المناسبة لشرائح فرس النهر على النحو المبين أدناه (الشكل 1A, B).
ملاحظة: اثنين من ريش ذات حدين واحد عقد معا عن طريق حامل من صنع المنزل جعل أداة سهلة الاستخدام لجعل قطع 60 درجة (الشكل 1A). - نصفي الكرة الأرضية منفصلة أسفل خط الوسط مع مشرط.
- الغراء نصفي الكرة الأرضية على القرص المتصاعد على النحو التالي. خذ القرص المتصاعد الذي كان على الجليد حتى الآن. إذا لزم الأمر، امسحها مرة أخرى. الغراء كل نصف الكرة أمام كتلة أجار، وقطع الجانب إلى أسفل.
- تأكد من أن الجانب البطني من كل نصف الكرة الأرضية يلمس كتلة أجار. كتلة أجار يوفر دعما إضافيا أثناء القطع وضرورية لشرائح حتى. يجب أن تواجه الجوانب الظهرية لكل نصف الكرة الأرضية النصل. عندما لصقها على الجانب قطع، كل نصف الكرة الأرضية هو الموجهة بالنسبة إلى شفرة بطريقة تؤدي إلى شرائح عرضية من الحصين الظهرية في الموقع (الشكل 1B).
- غمر القرص مع نصفي الكرة الأرضية في غرفة القطع التي تحتوي على الجليد الباردة carbdG-aCSF.
- قطع 400 ميكرومتر المقاطع. وينبغي أن يتم قطع في أقل من 10 دقيقة. سوف تتطلب ميكروتومات مختلفة إعدادات مختلفة لتحقيق هذا الوقت. وسيتم الحصول على ما مجموعه 8\u201210 شرائح من منطقة الحصين الظهري.
4- التعافي
- نقل شرائح إلى غرفة الانتعاش التي تحتوي على aCSF carbogenated في درجة حرارة الغرفة باستخدام ماصات نقل المتاح مع نصائح قطع(الشكل 1C).
ملاحظة: ينصح بشدة لتحصين غرفة الإنعاش-aSCF مع 5 mM Na-ascorbate و 3 mM Na-pyruvate. بيروفات هو الركيزة الطاقة أظهرت لتعزيز إنتاج ATP في شرائح28، في حين نا أسكوربات هو quencher الجذور الحرة29. - احتضان في درجة حرارة الغرفة (22\u201224 درجة مئوية) لحوالي 2 ساعة قبل التسجيل (تصل إلى 4 ساعات).
ملاحظة: يؤدي الاحتضان الأطول في درجة حرارة الغرفة إلى شرائح أكثر صحة لفترات زمنية أطول، مقارنة بحضانة الاحتضان القياسية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة متبوعة باحتضان درجة حرارة الغرفة. يمكن إعادة توارنج في 37 درجة مئوية إدخال الوذمة السامة للخلايا13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طبقنا البروتوكول أعلاه لتوليد شرائح قرن آمون من CamKIIa-Cre+; WT الفئران على خلفية وراثية مختلطة C57Bl / 6 × SV / 129J، في P > 120. تظهر أعداد كبيرة من الخلايا الهرمية في حقل CA1(الشكل 2A)و subiculum(الشكل 2B)في تباين منخفض عندما لوحظ تحت المجهر التفاضلي للتباين تحت الحمراء (IR-DIC)، وهي علامة مميزة للخلايا السليمة في إعداد الشريحة. مع هذا الإعداد، وارتفاع معدل الأختام جيجا أوم (> 90٪) يتم تحقيق روتينية عند استهداف الخلايا أصح تقريبا 20\u201250 ميكرون تحت السطح. من أجل هذا معدل النجاح، من المهم استخدام هدف عالية NA للأشعة تحت الحمراء-DIC، مثل هدف 60x المياه الغمر، من أجل تحقيق التصور الكافي للخلايا الهرمية في هذا العمق(الشكل 2A، B).
التسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية واحدة يمكن تحقيقها بسهولة باستخدام هذا إعداد شريحة قرن آمون حتى في الفئران أكثر من ستة أشهر من العمر. يظهر الشكل 2C تجربة مثال باستخدام تسجيلات ما بعد الإثارة المصغرة (mEPSCs) من الخلايا العصبية CA1. التعريفي للمواد الكيميائية NMDA-LTD مع تطبيق حمام من 20 μM NMDA لمدة 3 دقائق يخفض mEPSC تردد في خلايا CA1 عند تقييم 60 دقيقة بعد العلاج NMDA. هذه النتيجة تشير إلى أن NMDA-LTD يسبب تقليم النشاط تعتمد على نقاط الاشتباك العصبي في CA1 في الفئران القديمة (النتائج مقتبسة من Djurisicوآخرون. 15). لم يتم الكشف عن التغيير في السعة mEPSC. خلال تسجيلات mEPSC ، تمتلئ خلايا CA1 أيضًا بالcycytin الحيوي. الشكل 2D يكشف عن arbor dendritic سليمة وعادة الخلايا الصحية من الخلايا العصبية الهرمية CA1 المملوءة بالسيولوجى. يتيح التوزيع القوي لصبغة الفلورسنت في جميع أنحاء الخلية التقييم الروتيني لخصائص العمود الفقري المتجرف في ظل ظروف تجريبية مختلفة.
باستخدام التسجيلات الميدانية ، تم ملاحظة التقوية طويلة الأجل (LTP) من ~ 170 ٪ من نقاط الاشتباك العصبي CA3 -CA1 في شرائح من الفئران البالغة بسهولة ، مما يشير إلى الحفاظ على الشلالات الإشارات اللازمة لLTP(الشكل 2E ، F). كما يتم الحفاظ على اتصال الشبكة اللازمة لإمكانية اجتثارية حقل قوية (fEPSP) إشارة(الشكل 2E). القدرة على تقييم اللدونة متشابك في شرائح فرس النهر من الكبار أو الفئران الشيخوخة ذات الصلة خاصة لنماذج الماوس من الأمراض العصبية كما يتطور الخلل متشابك السمة الخاصة بهم في وقت لاحق في الحياة.
معا، نتائجنا تثبت أن إعداد قرن آمون حاد من الفئران الكبار والشيخوخة يسمح بتقييم وظيفة متشابك على مستوى كل من الخلايا الفردية والسكان من الخلايا بشكل روتيني، طالما يتم استخدام الضخ عبر القلب والجليد الباردة NMDG الحلول القائمة على تقليل الضرر نقص الأكسجة.
الشكل 1: طريقة القطع واستعادة شرائح فرس النهر من الفئران البالغة والشيخوخة. (أ) أداة "60 درجة" تستخدم لإزالة إسفين 60 درجة من نهاية الدماغ الرسترالية ، وتركزت على خط الوسط. (B) تحديد المواقع في نصفي الكرة لقطع شرائح عرضية. يظهر رسم توضيحي لقطع 60 درجة على اليسار والألواح اليمنى العليا؛ تحديد موضع نصفي الكرة الأرضية على السطح مع الغراء بالطريقة الموضحة في اللوحة السفلية اليمنى يضمن توجه عمودي من الحصين الظهري نسبة إلى النصل. هذا الاتجاه يؤدي إلى شرائح عرضية من قرن آمون. الهياكل الصفراء هي تقديم 3D من فرس النهر داخل الدماغ القوارض (رمادي). تم تكييف هذا الرسم التوضيحي من SynapseWeb30. جميع وجهات النظر هي من الجانب الظهري من الدماغ. (C)شرائح فرس النهر مقطّع من فأر عمره 4 أشهر في غرفة الإنعاش. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياسات اللدونة المشبكة والمتشابكة في شرائح فرس النهر من الفئران في P120\u2012180. (A) مثال على الأشعة تحت الحمراء 1 من المنطقة. (B) مثال الأشعة تحت الحمراء DIC micrographs من subiculum. في كل من A و B، يتم التقاط الصور 3 ساعة بعد قطع مع هدف غمر الماء 60x. شريط المعايرة هو 10 ميكرومتر (C) تأثير الكيميائية NMDA-LTD على mEPSCs في الخلايا العصبية CA1 من الفئران P120\u2012180. اللوحة العلوية هي أمثلة على آثار mEPSCs المسجلة في خط الأساس وبعد نبض NMDA-LTD. اللوحة السفلية اليسرى: نتج عن NMDA-LTD تردد mEPSC أقل. اللوحة اليمنى السفلى: لم يتم الكشف عن تغيير السعة mEPSC بعد NMDA-LTD. N = 17 خلية عند خط الأساس و n = 15 خلية لـ NMDA-LTD، 6 فئران. P = 0.004، t-test. وقد تم تعديل هذا الرقم من Djurisic وآخرون15. (D) مثال على الخلايا الهرمية CA1 المملوءة بالسيتتين الحيوي. (E) مثال على إشارة fEPSP من CA1 stratum radiatum بعد التحفيز الضمان شيفر. يتم الحصول على أثر الرمادي أثناء تسجيل خط الأساس، ويتم ملاحظة التتبع الأسود 20 دقيقة بعد التحفيز tetanic. كل أثر هو في المتوسط 30 آثار متتالية. (F) المتوسط التراكمي للتقوية طويلة الأجل من CA3 -CA1 نقاط الاشتباك العصبي بعد 4 قطارات من 100 هرتز التعريفي؛ ن = 23 شرائح من 8 WT الفئران في ما يقرب من P90. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) | ||||
| المكونات | ميغاواط | الفقعر النهائي( mM) | ز / 2 لتر (10X) | ز / لتر (1X) |
| NaCl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| KCl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4 * 7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1.3 مل من مخزون 1M |
| CaCl2 * 2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2.5 مل من 1M الأسهم |
| الجلوكوز * H2O | 180.2 | 25 | - | 4.5 غرام |
| أ) إضافة Mg2SO4 * 7H2O وCaCl2 * 2H2O من الأسهم 1M | ||||
| ب) aCSF 10X الحفاظ على @RT | ||||
| ج) aCSF 1X @ 4 درجة مئوية ل24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| المكونات | ميغاواط | الفقعر النهائي( mM) | ز / 2 لتر (3X) | ز/300 مل (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH = 7.4 مع HCl | ||||
| KCl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2 * 6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2 * 2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| الكولين بيكربونات | 80% | 20 | - | 1238 ميكرولتر |
| الجلوكوز * H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| أ) تصفية وتخزين 3X حل الأسهم في 4 درجة مئوية | ||||
الجدول 1: صيغ وسائط الإعلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويوضح البروتوكول الموصوف هنا أن شرائح فرس النهر التي تم الحصول عليها من الفئران البالغة والشيخوخة يمكن أن تظل صحية وقابلة للحياة لساعات عديدة بعد القطع. الشرائح المعدة باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لتسجيلات اللصق، وكذلك التسجيلات الميدانية طويلة الأمد في مناطق CA1.
هناك خطوتان هامتان في هذا البروتوكول. الخطوة الأولى هي خطوة التسريب عبر القلب مع محلول الجليد البارد. يتم الإشارة إلى إزالة الدم بسرعة من خلال التغير السريع في لون الكبد. يجب أن يكون الدماغ المستخرج من اللون الأبيض. إذا كان الدماغ لا يزال وردي، فهذا يعني أن الدم الجهازي لم يتم استبداله مع NMDG-aCSF الباردة، ولم يتحقق انخفاض في درجة حرارة الجسم. قد يكون سبب ذلك وضع غير سليم للإبرة في القلب، أو لأن القلب كان مثقوباً. لا ينبغي استخدام الأدمغة من الفئران الرديئة بشكل سيئ في التقطيع. الخطوة الحاسمة الثانية هي استخدام NMDG كبديل أيون الصوديوم. وهناك اختلاف معروف في وقت سابق من البروتوكول الذي يستخدم بنجاح السكروز كبديل لNa+ في أدمغة الفئران10،31 لا تنتج شرائح فرس النهر صحية بما فيه الكفاية في الفئران (انظر أيضا تينغ وآخرون13). استخدام NMDG كبديل أيون الصوديوم أمر بالغ الأهمية لشرائح فرس النهر الماوس.
في حين يتم الحصول على شرائح فرس النهر صحية موثوق بها باستخدام البروتوكول الموصوف، وإعداد قرن آمون من الحيوانات الكبار والشيخوخة لا يزال تحديا. كما تتغير صعوبتها مع خطوط الماوس المختلفة والخلفيات الجينية. التعديلات المحتملة للنظر هي إضافات إلى NMDG-aCSF والحلول الانتعاش-aCSF مثل التورين, D-سيرين, أو N-أسيتيل (NAC), التي يمكن أن تزيد وظيفة الخلايا العصبية والتشابك13,29, زيادة الأوكسجين29. وينبغي أيضا استبدال كل أيونات النظر أثناء التسريب والقطع32. استخدام غرفة استرداد واجهة هو وسيلة أخرى للحفاظ على زيادة الأوكسجين، والتي هي ذات الصلة خاصة بالنسبة للدونة طويلة الأجل التسجيلات الميدانية. غرفة الاسترداد الموصوفة(الشكل 1C)قابلة للتعديل لهذا الغرض (على سبيل المثال، طبق إدراج الثقافة التي يتم ترطيبها من الأسفل بواسطة aSCF، يمكن أن تحل محل شبكة المغمورة). استبدال شفرات الصلب مع شفرات الياقوت أو السيراميك يمكن أن تقلل من ضغط الأنسجة التي تفاقمت بسبب المياة الثقيلة من المادة البيضاء حول قرن آمون; هذا بدوره يمكن أن تزيد من تحسين نوعية الخلايا العصبية بالقرب من سطح شريحة. استخدام microtomes مصممة لتقليل الاهتزاز العمودي (على سبيل المثال، صفر-z في لايكا VT1200S)، هو خطوة أخرى قابلة للتعديل.
مناطق الدماغ الأخرى يمكن أن تكون شرائح باستخدام البروتوكول الموصوف هنا، مع التعديلات المناسبة في زوايا القطع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل صرامة إعداد شريحة، ومناطق الدماغ المختلفة حساسة لنقص الأكسجة بدرجات مختلفة.. بروتوكول يستخدم NMDG-aSCF وقد تم الإبلاغ عن الماوس الكبار neocortex وsstriatum تحضيرات شريحة13,20; ويستخدم NMDG-aCSF التي تحتوي على30 mM NaHCO 3 (أي أنها ليست Na+- خالية)20، وفي بعض الحالات transcardial القذف مع NMDG-aCSF في درجة حرارة الغرفة13. ومع ذلك، بالنسبة لمنطقة عرضة لنقص الأكسجة مثل قرن آمون، فإن استخدام Na+-free NMDG-aCSF والتكرار عبر القلب البارد الجليد يمكن أن يحدث فرقًا حاسمًا.
هذا البروتوكول ينطبق على مجموعة واسعة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا نمض الأمراض العصبية. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل البروتوكول إلى شرائح الدماغ من أنواع نموذجية الثدييات الأخرى، كذلك. ويمكن أن يكون هذا البروتوكول معاً أساساً لإعداد موحد لشرائح فرس النهر الحادة من الحيوانات المسنة، وبالتالي تيسير المقارنات عبر الدراسات في سياق آليات المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.
Acknowledgments
أشكر الدكتورة كارلا ج. شاتز على المشورة والدعم، والدكتورة باربرا ك. بروت وميشيل ك. دريس على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. ويدعم العمل المعهد الوطني للصحة EY02858 ومنح مؤسسة ماذرز الخيرية إلى المركز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
