Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

Published: July 2, 2020 doi: 10.3791/61377

Summary

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

Abstract

פרוסות היפוקמפוס אקוטי אפשרו דורות של מדעני מוח לחקור תכונות סינפטיות, עצביות, ומעגל בפירוט ובנאמנות גבוהה. חקירה של מנגנוני LTP ו-LTD, חישוב דנדריטי נוירון יחיד, ושינויים תלויי ניסיון במעגלים, לא היו אפשריים ללא הכנה קלאסית זו. עם זאת, עם כמה יוצאים מן הכלל, המחקר הבסיסי ביותר באמצעות פרוסות היפוקמפוס חריפה בוצע באמצעות פרוסות מכרסמים של גילים צעירים יחסית, ~ P20-P40, למרות מנגנוני עירור סינפטיים פנימיים יש זנב התפתחותי ארוך שמגיע מעבר P60. הערעור העיקרי של שימוש בפרוסות היפוקמפוס צעירות הוא שימור של בריאות עצבית בסיוע סובלנות גבוהה יותר לנזק היפוקסי. עם זאת, יש צורך להבין את התפקוד העצבי בשלבים בוגרים יותר של התפתחות, מודגש עוד יותר על ידי התפתחות מודלים שונים של בעלי חיים של מחלות ניווניות הדורשות הכנה מוחית מזדקנת. כאן אנו מתארים שינוי בהכנת פרוסת היפוקמפוס חריפה המספקת באופן אמין פרוסות בריאות מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם זיעה וחיתוך בין-לב וחיתוך עם NMDG-aSCF ללא נתרן קר כקרח. יחד, שלבים אלה להחית את הירידה המושרה היפוקסיה ATP על עריפת ראש, כמו גם בצקת ציטוקוקסית הנגרמת על ידי שטף נתרן פסיבי. אנו מדגימים כיצד לחתוך פרוסות טרנסוורס של היפוקמפוס בתוספת קליפת המוח באמצעות מיקרוטומיה רוטטת. פרוסות היפוקמפוס אקוטיות שהושגו בדרך זו הן בריאות באופן מהימנים במשך שעות רבות של הקלטה, והן מתאימות הן להקלטות שדה והן להקלטות ממוקדות של מהדק טלאי, כולל מיקוד של נוירונים המסומנים בפלורסנט.

Introduction

הופעתם של ההכנות לחתיכה מוחית חריפה של היונקים הקלה על ניסויים ברמה התאית והסינופטית שהיו אפשריים בעבר רק בהכנות חסרי חוליות כמו Aplysia1. פיתוח פרוסות היפוקמפוס אקוטיות היה בעל משמעות מיוחדת, כפי שהוא מבנה אחראי על זיכרון עבודה היווצרות הקשר, ויש לו מעגלים תלת-סינפטיים מיוחדים כי הוא נוח מניפולציה פיזיולוגית קלה. עם זאת, הרוב המכריע של פרוסות מוח אקוטיות עדיין מוכנים מעכברים וחולדות צעירים יחסית, כפי שקל יותר לשמר נוירונים ומעגלים בריאים, ואת הפרוסות להישאר קיימא לפרקיזמן ארוכים יותר 2,,3,,4. כאן, אנו מציגים שינויים בפרוטוקולי חיתוך סטנדרטיים התוצאתם כדאיות מוגברת של פרוסות היפוקמפוס אקוטיות מעכברים בוגרים ומזדקנים.

המכשול העיקרי לכדאיות vivo לשעבר לטווח ארוך של parenchyma המוח יונקים הוא הנזק היפוקסי הראשוני המתרחשת במהירות ברגע זרימת הדם למוח מפסיק בעקבות עריפת ראש. אובדן חמצן גורם לצריכה חילוף חומרים מהירה של משאבי אנרגיה עיקריים במוח עם אובדן של פוספו-קריאטין (P-קריאטין) להיות המהיר ביותר, ואחריו גלוקוז, אדנוזין טריפוספט (ATP), וגלוקוגן4. שימור ATP הוא בעל חשיבות מיוחדת לבריאות לטווח ארוך של פרוסות מוח, כמו ATP נדרש כדי לשמור על פוטנציאל קרום באמצעות ATPase Na-K, וכתוצאה מכך את הפעילותהעצבית 5,6. רמת ה-ATP במוח המכרסמים הבוגרים היא כ-2.5 מ"מ, והיא יורדת במהירות בתוך 20 שניות של עריפת ראש כדי להגיע למצב יציב של בסיס (כ-0.5 מ"מ) בסביבות דקה לאחר עריפתראש 4,,7,,8. בבעלי חיים צעירים, לוקח יותר זמן לצפות באותה ירידה ATP (~ 2 דקות); עם הרדמה פנוברביטל הוא הואט עוד יותר 4 דקות4. שיקולים אלה מראים כי מניעת אובדן ATP ומשאבי אנרגיה אחרים היא אסטרטגיה הכרחית כדי למנוע נזק היפוקסי למוח ובכך כדי לשמור על הבריאות של פרוסות המוח על פני פרקי זמן ארוכים יותר, במיוחד בבעלי חיים בוגרים.

טמפרטורות נמוכות מאטות את חילוף החומרים. כתוצאה מכך, הוכח כי היפותרמיה צנועה מגנה על עתודות אנרגיית המוח: בבעלי חיים צעירים, הורדת טמפרטורת הגוף בשש מעלות, מ 37 °C ל 31 ° C, משמרת את רמות ATP סביב 80% של רמות נורמליות מעל 4 שעות של היפוקסיהמבוקרת 9. רמות P-קריאטין נשמרים באופן דומה, כמו גם פוטנציאל פוספורילציההכוללת 9. זה מצביע על כך שהורדת טמפרטורת הגוף לפני עריפת ראש יכול להיות neuroprotective, כמו רמות כמעט נורמליות של ATP יכול להישמר באמצעות חיתוך פרוסה ופרוסה התאוששות תקופות.

במידה כי ירידה ATP לא ניתן למנוע לחלוטין על עריפת ראש, פונקציה לקויה חלקית של ATPase Na-K צפוי, ואחריו depolarization באמצעות זרם נתרן פסיבי. כמו זרם נתרן פסיבי מלווה בכניסת מים לתאים, זה גורם בצקת ציטוקוקסית ובסופו של דבר פיקנוזיס. בחולדות בוגרות, החלפת יונים Na+ עם סוכרוז בפתרונות חיתוך פרוסה כבר אסטרטגיה מוצלחת כדי להקל על הנטל של בצקת cytotoxic10,11. לאחרונה, cations אורגני מתילציה המפחיתים חחולערוץ נתרן 12 הראו להציע הגנה יעילה יותר מאשר סוכרוז, במיוחד פרוסות מעכברים בוגרים, עם N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG) להיות ישים ביותר על פני גילאים שונים ואזורי מוח13,,14,,15,,16.

פרוטוקולים רבים לחיתוך מוח כרוכים בשימוש בטמפרטורות קרות רק במהלך שלב חיתוך הפרוסה, לעתים בשילוב עם Na+ ion החלפתאסטרטגיה 16,17. בבעלי חיים צעירים, פרוטוקולים אלה מופיעים להציע הגנה עצבית מספקת מאז המוח ניתן לחלץ במהירות לאחר עריפת ראש כי הגולגולת היא עדיין רזה וקל להסיר3. עם זאת, אסטרטגיה זו אינה מייצרת פרוסות בריאות מבעלי חיים בוגרים. עם הזמן, מספר מעבדות החוקרות מכרסמים בוגרים הציגו זיעה בין-לבית עם תמיסה קרה כקרח כדי להקטין את טמפרטורת הגוף של החיה, ולכן נזק היפוקסי למוח, לפני עריפת ראש. הליך זה הוחל בהצלחה כדי לייצר פרוסות המוח18, פרוסות המוח האמצעי19, פרוסות neocortical11,20, קליפת פריהינלית21, היפוקמפוסחולדה 10,22,23, נורהחוש הריח 24, סטריאטוםאוורור 25, קליפת המוח,החזותית 26.

למרות היתרונות המוצעים על ידי עירוי transcardial ו Na+ תחליף יון בהכנת פרוסות מעכברוש ובאיזורים מסוימים במוח בעכברים, היפוקמפוס העכבר נשאר אחד האזורים המאתגרים ביותר כדי להגן מפני היפוקסיה13,20. עד כה, אחת הגישות הנפוצות ביותר לחיתוך היפוקמפוס מעכברים מזדקנים ומודלים עכבר של ניוון עצבי כרוך חיתוך מהיר קלאסי של היפוקמפוס מבודד27. בפרוטוקול המתואר כאן, אנו ממזערים את אובדן ATP במוח הבוגר על ידי הצגת היפותרמיה לפני עריפת הראש על ידי חפירת החיה באופן טראנס-קר עם Na קר כקרח+- נוזל מוחי מוחי מלאכותי מבוסס NMDG חינם (NMDG-aCSF). לאחר מכן, הפרוסות נחתכו ב-Naהקר כקרח +NMDG-aCSF ללא תשלום. עם פרוטוקול משופר זה אנו מקבלים פרוסות היפוקמפוס חריפה מעכברים בוגרים ומזדקנים כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאימים לטווח ארוך שדה הקלטות מחקרים טלאי-מהדק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מתבצע בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי הוועדה למוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת סטנפורד. שיטות הן גם בהתאם למדיניות של האגודה למדעי המוח על השימוש בבעלי חיים ובני אדם במחקר מדעי המוח.

הערה: כל העכברים נשמרו בסביבה ללא פתוגן. עכברים מסוג פראי על C57Bl מעורב / 6 x SV / 129J רקע גנטי שימשו כאן, אלא אם צוין אחרת.

1. כיוונון

  1. הכן 1 L של 1 aCSF (בmM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 מ"ג2 אז4·7H2O, 2.5 CaCl2, 25 גלוקוז (טבלה 1). השתמש בפתרון זה עבור תא השחזור וההקלטות הבאות.
    הערה: אחסן aCSF כפתרון מניות 10x המכיל NaCl, NaHCO3, KCl, ו KH2PO4. אחסןMg 2SO4·7H2O ו- CaCl2 כפתרונות מניות 1 M. הכן את פתרון העבודה ביום הניסוי מפתרונות המלאי לעיל, והוסף גלוקוז לפני התאמת הנפח הסופי עם 18 MΩ מים.
    הערה: בהתאם לאזור המוח או לזן העכבר, aCSF מקורר יכול לשמש גם עבור עירוי עירויעם הצלחה 11,15,26.
  2. להכין 300 מ"ל של NMDG-aCSF (בmM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 כולין ביקרבונט, 10 גלוקוז(שולחן 1). נפח זה של NMDG-aCSF מספיק הן עבור עירוי בין-לב והן עבור שלבי חיתוך.
    הערה: אחסן NMDG-aCSF כפתרון מניות פי 3 ב- 4 °C. הכן פתרון עבודה ביום הניסוי; להוסיף כולין ביקרבונט וגלוקוז לפני התאמת הנפח הסופי עם 18 MΩ מים. מבעבע את הפתרון עם 95%O2/5%CO2 כדי לאגור אותו, ורוויה בחמצן.
    הערה: מניית NMDG מתחילה כאלקליין מאוד, ודורשת חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl) כדי להתאים את ה-pH ל-7.4~ . תוספת של חומצה הידרוכלורית צריך להיות איטי פעם אחת מתחת pH 8, כפי שהוא קל חומצי את הפתרון ~ pH 3 עם HCl עודף. יש לבצע התאמה זו לפני הוספת cations divalent. מתכון NMDG-aCSF זה הוא ללא נתרן. מתכוני NMDG שפורסמו בעבר להשתמש 30 mM NaHCO3 עבור אגירה, וכתוצאה מכך נתרן 30 mM קיים NMDG-aCSF13,20.
  3. הגדר את מגש החיתוך המיקרו-טומים הרוטט ואת דיסק ההרכבה ל- -20°C.
  4. הכן את תא ההתאוששות.
    1. ממלאים את תא ההתאוששות מעל רשת הפרוסה, שומרים אותו על הספסל בטמפרטורת החדר, ובועות.
      הערה: תא שחזור הפרוסות המשמש כאן דומה מאוד לתאים הקלאסיים שתוארו קודם לכן על ידי אדוארדס וקונרת'3. aCSF נשמר ב זכוכית (400 מל) שמחזיק מסגרת אקריליק עגולה עם רשת ניילון שחורה מודבקת לתחתית. מסגרת אקריליק מושעה באמצע הבקת באמצעות וו אקרילי נח על קצה המסגרת. מבעבע הזכוכית מוכנס כל הדרך לתחתית. העיצוב מאפשר חמצון של שני צידי פרוסות. מבעבע מספק גם ערבוב מתמיד של aCSF בתא השחזור. הרשת השחורה מספקת ניגודיות גבוהה כנגד הפרוסות הלבנות, שאז קל יותר לראותן.
  5. הכן את התמיסה והחיתוך של הקרדיה.
    1. מצננים את כל 300 מ"ל NMDG-aCSF במקפיא, עד גבישי קרח מתחילים להוות על פני השטח ועל הקירות של הבקבוק. אל תקפאו יותר!
    2. מניחים את הבקבוק עם NMDG-aCSF מקורר על קרח ובועות. הפתרון צריך להיות בין 0\u20122 °C.
      הערה: Slushy NMDG- aCSF מרמז על כך שיש את רוב הפתרון כנוזל, בעוד שבריר קטן של קרח ברד נוכח ישמור על הפתרון ליד 0 ° C לאורך כל perfusion וחיתוך. יש לנקוט טיפול כדי להרחיק גבישי קרח מהמוח במהלך החיתוך.
  6. הכן את הדיסק להרכבת רקמות.
    1. להוציא את הדיסק מהמקפיא, לנגב אותו יבש במידת הצורך.
    2. חותכים בלוק של 5% אגר מצלחת הגר שהוכנה קודם לכן, ולהדביק אותו במרכז הדיסק באמצעות שכבה דקה של דבק ציאנוקרילט. החתיכה agar צריך להיות בערך בגודל של מוח עכבר. מניחים את הדיסק עם אגר מודבק על קרח, ומכסים במגבות נייר עד שהוא מוכן לשימוש.
      1. עבור 5% צלחת אגר, להמיס 5 גרם אגר ב 100 מ"ל של 18 MΩ מים על ידי microwaving, ויוצקים לתוך צלחת פטרי נקייה. שמור על 4 °C.
  7. להוציא את מגש החיתוך מהמקפיא, למקם אותו לתוך microtome, להקיף אותו בקרח, ולטעון את הלהב.

2. עירוי טרנזיה וחילוץ מוח

  1. עכברים ממנת יתר באמצעות הזרקת תוך-אפרטון של קוקטייל הרדמה. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הכאב (צביטה בהון); עכבר לא צריך להציג את הרפלקס ברגע שהוא מגיע להרדמה עמוקה.
    הערה: מתכון קוקטייל הרדמה מכרסמים: קטמין HCl (66 מ"ג / מ"ל), xylazine HCl (6.6 מ"ג / מ"ל), acepromazine maleate (0.1 מ"ג / מ"ל), 18 MΩ מים לנפח הסופי. מינון: 0.4 מ"ג / g משקל גוף, 0.04 מ"ג / גרם משקל גוף, 6 x 10-4 מ"ג / גרם משקל גוף עבור קטמין, קסילאזין, acepromazine, בהתאמה.
  2. הגדר את המשאבה פריסלטית עבור עירוי טרנזיה בין-לב. הכנס צד אחד של משאבת הצינורות לתוך הבקבוק עם NMDG-aCSF קר. להתאים את הצד השני של הצינורות עם מחט 27 G כי יהיה מוכנס לתוך החדר השמאלי.
  3. הגדר את מהירות המשאבה על כ 3.5 מ"ל/ דקה. במהירות זו, הזרימה של NMDG-aCSF היא טפטוף מהיר, לא זרימה רציפה.
    הערה: התפליטה בכוח המשיכה היא תחליף טוב לתחלוב המשאבה פריסלטית, כל עוד ניתן להשיג את אותו קצב זרימה משוער. תפרה בקצב זרימה גבוה תגרום לכלי דם מתפוצצים במוח. סימן מסגיר של תפרה מהירה מדי ולחץ מוגבר בכלי הדם הוא פתרון יוצא מהאף של החיה.
  4. התפליטה
    1. מניחים את העכבר המהוים כראוי על גבו על חיתול. באמצעות נייר נייר, הדבק את רגליו הקדמיות וה האחוריות כך שהחזה והבטן ייחשפו.
    2. לחתוך חלקה גדולה של העור על גבי החזה, הולך מתחת לעצם החזה לגרון; תסה זה אמור לספק אזור עבודה גדול. תפוס את עצם החזה עם ממחטות, להרים בעדינות, ולהתחיל לחתוך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים עד חלל החזה נחשף.
    3. חותכים את הסרעפת כדי לחשוף את חלל החזה. יש להשאיר את הדש של כלוב הצלעות מחובר באמצעות חתיכת שריר דקה. זה צריך להיות אפשרי להגדיר אותו בצד מבלי שהוא יפול בחזרה לחלל החזה החשוף. תבדוק שהלב עדיין פועם. ודא כי רוב הכבד גלוי.
    4. הכנס את מחט 27 G לחדר השמאלי; החדר השמאלי של העכבר נראה בהיר יותר בצבע מאשר ימין. אתר את האטריום הימני בצבע אדום כהה. חותכים דרך האטריום הימני עם מספריים קטנות; הדם צריך להתחיל לזרום החוצה.
    5. הפעל את המשאבה המוגדרת מראש למהירות הזרימה הנכונה. אם הכל נעשה כראוי, הכבד צריך להתחיל לשנות צבע מאדום לחום זמן קצר לאחר תחילת התחלוק. לפקח על צבע הכבד כדי לקבוע את אורך העירוי; הכבד אמור להפוך לחום חיוור.
    6. הפעל את המשאבה לעוד כמה דקות. אם באמצעות מדחום פי הטבעת, טמפרטורת הגוף צריך לרדת 28\u201229 °C, האף של בעלי חיים צריך להיות קר למגע.
  5. חילוץ מוח.
    הערה: בשלב זה, יש את כלי החיתוך הבאים מוכנים: מספריים עריפת ראש, מספריים קטנים עם להב ישר או זוויתי, אזמל #10 להב, להב קצה יחיד, מקצות #3, מרית עם צד אחד כפוף 90°, מרית, "60 מעלות" כלי(איור 1A,B),ומברשת רכה קטנה.
    1. ערפו את ראשו של העכבר עם מספריים גדולים של עריפת ראש. בעזרת אזמל #10 להב, חותכים את העור מעל הגולגולת. עם מספריים בזווית קטנה, לחתוך את הגולגולת בקו האמצע. לאחר מכן, #3 מפסי התות, לחטט את החצאים הימניים ושמאליים של הגולגולת, להיות זהיר לקחת את הדורה עם זה. המוח צריך להיחשף עכשיו.
      הערה: אם dura ניתוק מהגולגולת, זה יישאר מעל המוח ויש להסיר בנפרד. הקצוות של dura הנותרים יכול להדק ולחתוך עמוק דרך המוח, פוטנציאל לפגוע באזור המוח של עניין.
    2. הסר את המוח על ידי גרף אותו החוצה עם מרית קטנה. השליכו את המוח לתמיסת NMDG-aCSF הממוקמת בבקת קטנה נפרדת על קרח. תשאיר את זה שם עד דקה.
      הערה: בנוסף להיפותרמיה, חשיפה לתמיסת מלח קרה כקרח מתמצת במוח, אשר הכרחי אפילו לחיתוך. כל ההליך מעריפת ראש לחילוץ המוח צריך להיות מתחת ל-30 שניות.

3. חיתוך

  1. תוציא את המוח מה-NMDG-aCSF ושים אותו על פיסת נייר סינון.
  2. גזור והסר טריז של 60° מהקצה הרוזסטרלי של התזה באמצעות כלי "60°" הממורכז בקו האמצע. משטחים חתוכים ישמשו להרכבה כדי להשיג את הזווית הנכונה עבור פרוסות היפוקמפוס transversal כפי שנדון להלן(איור 1A,B).
    NOTE: Two single-edged blades held together via a home-made holder make an easy-to-use tool for making the 60° cut (Figure 1A).
  3. ההמיספרות הנפרדות בקו האמצע עם האזמל.
  4. הדבק את ההמיספרות לדיסק ההרכבה כדלקמן. קח את דיסק ההרכבה שהיה על קרח עד עכשיו. במידת הצורך, נגב אותו שוב. להדביק כל חצי כדור לפני בלוק אגר, לחתוך את הצד למטה.
  5. ודא שהצד האוורני של כל חצי כדור הארץ נוגע בבלוק הגר. בלוק אגר מספק תמיכה נוספת במהלך חיתוך והוא חיוני אפילו פרוסות. הצדדים הגב של כל חצי הכדור צריך להיות מול הלהב. כאשר מודבק בצד החתוך, כל חצי הכדור הוא מונחה ביחס ללהב באופן שתוצאות פרוסות רוחביות של היפוקמפוס גב ב situ (איור 1B).
  6. להחזירה של הדיסק עם חציות לתוך תא חיתוך המכיל NMDG-aCSF קר כקרח.
  7. חותכים 400 μm מקטעים. חיתוך צריך להיעשות בפחות מ 10 דקות. מיקרוטומים שונים ידרשו הגדרות שונות כדי להשיג הפעם. בסך הכל 8\u201210 פרוסות מאזור היפוקמפוס הגב יושגו.

4. שחזור

  1. מעבירים פרוסות לתא שחזור המכיל aCSF מופוגן בטמפרטורת החדר באמצעות פיפטות העברה חד-פעמיות עםטיפים חתוכים (איור 1C).
    הערה: מומלץ מאוד לחזק את תא השחזור-aSCF עם 5 mM Na-ascorbate ו 3 mM Na-pyruvate. Pyruvate הוא פרוצה אנרגיה המוצגת כדי להגביר את הייצור של ATP בפרוסות28, בעוד Na-ascorbate הוא quencherרדיקלים חופשיים 29.
  2. דגירה בטמפרטורת החדר (22\u201224 °C) במשך כ 2 שעות לפני ההקלטה (עד 4 שעות).
    הערה: דגירה ארוכה יותר בטמפרטורת החדר גורמת לפרוסות בריאות יותר לפרקי זמן ארוכים יותר, יחסית לדגירה הסטנדרטית ב-37°C למשך 30 דקות ולאחריה דגירה בטמפרטורת החדר. חממה מחדש ב 37 °C יכול להציג בצקת cytotoxic13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יישם את הפרוטוקול לעיל כדי ליצור פרוסות היפוקמפוס מ Camkiia-Cre+; עכברי WT על רקע גנטי מעורב C57Bl / 6 x SV / 129J, ב P > 120. מספר גדול של תאים פירמידתיים בשדה CA1 (איור 2A) וסוביקולום(איור 2B)מופיעים בניגודיות נמוכה כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופ ניגודיות דיפרה-אדום (IR-DIC), סימן היכר של תאים בריאים בהכנה לפרוסה. עם הכנה זו, שיעור גבוה של חותמות giga-ohm (>90%) מושגת באופן שגרתי בעת מיקוד התאים הבריאים ביותר כ 20\u201250 מיקרון מתחת לפני השטח. עבור שיעור הצלחה זה, חשוב להשתמש ביעד NA גבוה עבור IR-DIC, כגון יעד טבילה במים 60x, על מנת להשיג הדמיה נאותה של תאים פירמידה בעומק זה(איור 2A,B).

הקלטות תיקון-מהדק מנויירונים בודדים ניתנים להשגה בקלות באמצעות הכנת פרוסת היפוקמפוס זה גם בעכברים מעל גיל שישה חודשים. איור 2C מציג ניסוי לדוגמה באמצעות זרמים פוסט-סינפטיים זעירים (mEPSCs) הקלטות מנוירים CA1. אינדוקציה של כימי NMDA-בע"מ עם יישום אמבטיה של 20 μM NMDA עבור 3 דקות מוריד את תדירות mEPSC בתאי CA1 כאשר מוערך 60 דקות לאחר NMDA טיפול. ממצא זה מצביע על כך NMDA-LTD גורמת גיזום תלוי פעילות של סינאפסות ב CA1 בעכברים מבוגרים (תוצאות הותאמו Djurisic ואח'15). שינוי משרעת mEPSC לא זוהה. במהלך הקלטות mEPSC, תאי CA1 היו גם מלאים ביוציטין. איור 2D חושף ארבור דנדריטי שלם ו habitus תא בריא של נוירונים פירמידה CA1 מלא ביוציטין. התפלגות חזקה של צבע פלורסנט בכל התא מאפשרת הערכה שגרתית של מאפייני עמוד השדרה דנדריטי בתנאים ניסיוניים שונים.

באמצעות הקלטות שדה, ההגרה לטווח ארוך (LTP) של ~ 170% של סינמפסות CA3-CA1 בפרוסות מעכברים בוגרים נצפתה בקלות, מציע תחזוקה של מפלים איתות הדרושים LTP (איור 2E, F). קישוריות רשת הדרושה עבור שדה חזק מעורר פוסט-ינפטי פוטנציאל (fEPSP) אות נשמר גם(איור 2E). היכולת להעריך פלסטיות סינפטית בפרוסות היפוקמפוס מעכברים בוגרים או מזדקנים רלוונטית במיוחד עבור מודלים של עכבר של מחלות ניווניות כמו תפקוד סינפטי סימן ההיכר שלהם מתפתח מאוחר יותר בחיים.

יחד, התוצאות שלנו מוכיחות כי הכנה היפוקמפוס חריפה מעכברים בוגרים ומזדקנים מאפשרת הערכה של תפקוד סינפטי ברמה של תאים בודדים ואוכלוסייה של תאים באופן שגרתי, כל עוד זינג'ים transcardial ופתרונות מבוססי NMDG קר כקרח משמשים כדי למזער נזק היפוקסי.

Figure 1
איור 1: שיטת חיתוך והתאוששות של פרוסות היפוקמפוס טרנסוורסל מעכברים מבוגרים ומזדקנים. (A) כלי "60°" המשמש להסרת טריז 60° מהסוף הרוזל של המוח, במרכז קו האמצע. (ב)מיקום ההמיספרות לחיתוך פרוסות טרנסוורסל. איור של חתך של 60° מוצג משמאל ובלוחות הימניים העליונים; מיקום של שתי ההמיספרות על פני השטח עם דבק באופן המוצג בלוח הימני התחתון מבטיח אוריינטציה ניצבת של היפוקמפוס גב יחסית ללהב. כיוון זה תוצאה של פרוסות טרנסוורסל של היפוקמפוס. מבנים צהובים הם עיבוד תלת-ממדי של היפוקמפוס בתוך מוח המכרסם (אפור). איור זה מותאם מתוך SynapseWeb30. כל הנופים הם של הצד הגב של המוח. פרוסותהיפוקמפוס טרנסוורסל חתוכות מעכבר בן 4 חודשים בתא התאוששות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מדידות מלחצי תיקון ופלסטיות סינפטיות בפרוסות היפוקמפוס מעכברים ב- P120\u2012180. (A) מיקרוגרף IR-DIC לדוגמה של אזור CA1. (ב)מיקרוגרפים IR-DIC לדוגמה של סוביקולום. הן A והן B, תמונות נלקחות 3 שעות לאחר חיתוך עם יעד טבילה מים 60x. סרגל הכיול הוא 10 μm.(C)ההשפעה של NMDA-LTD כימי על mEPSCs ב CA1 נוירונים מ P120\u2012180 עכברים. החלונית העליונה היא עקבות לדוגמה של mEPSCs שנרשמו בקו הבסיס ואחרי פעימה NMDA-LTD. פאנל שמאלי תחתון: NMDA-LTD הביאה לתדר MEPSC נמוך יותר. החלונית הימנית התחתונה: שינוי משרעת mEPSC לאחר NMDA-LTD אינו מזוהה. N = 17 תאים בבסיס ו- n = 15 תאים עבור NMDA-LTD, 6 עכברים. P = 0.004, t-מבחן. נתון זה שונה מ- Djurisic ואח '15. (ד)דוגמה לתא פירמידה CA1 מלא ביוציטין. (E)דוגמה של אות fEPSP מרדיאטום שכבת CA1 לאחר גירוי משני של שייפר. העקבות האפורים מתקבלים במהלך ההקלטה הבסיסית, והעקבות השחורים נצפו 20 דקות לאחר גירוי טטי. כל עקבות הם ממוצע של 30 עקבות רצופים. (F) ממוצע מצטבר של החזקה לטווח ארוך של סינמפסות CA3-CA1 לאחר 4 רכבות של אינדוקציה של 100 הרץ; n = 23 פרוסות מ-8 עכברי WT בערך P90. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (aCSF)
חומרי גלם Mw (מ"מ) פיוס סופי (mM) ז/2 ליטר (פי 10) ג/ליטר (1X)
נ.א.ק. 58.44 125 146.1 -
3 אנשים 84.01 26 43.68 -
קיי.סי.איי. 74.55 2.3 3.43 -
ח'2PO4 (1199) 136.1 1.26 3.44 -
MG2SO4*7H2O 203.3 1.3 - 1.3 מ"ל של מלאי 1M
CaCl2*2H2O 147.02 2.5 - 2.5 מ"ל של 1M מניות
גלוקוז*H2O 180.2 25 - 4.5 גר'
a) להוסיף Mg2SO4*7H2O ו CaCl2 *2H2O ממניות 1M
ב) aCSF פי 10 לשמור @RT
ג) aCSF 1X @4°C עבור 24 שעות
NMDG-aCSF
חומרי גלם Mw (מ"מ) פיוס סופי (mM) ז/2 ליטר (פי 3) g/300 מ"ל (1X)
NMDG (1197) 195.22 135 158.13 -
pH = 7.4 עם HCl
קיי.סי.איי. 74.55 1 0.4473 -
ח'2PO4 (1199) 136.1 1.2 0.9799 -
ג'י.ג'י.2*6H2O 203.3 1.5 1.8297 -
CaCl2*2H2O 147.02 0.5 0.4411 -
כולין ביקרבונט 80% 20 - 1238 μl
גלוקוז*H2O 180.2 10 - 0.54
א) סינון ואחסון של פתרון מניות פי 3 ב-4°C

טבלה 1: ניסוחים תקשורתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כי פרוסות היפוקמפוס המתקבלות מעכברים מבוגרים ומזדקנים יכולים להישאר בריאים וכדאיים במשך שעות רבות לאחר החיתוך. הפרוסות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מתאימות להקלטות של מהדק-תיקון, כמו גם להקלטות שדה לאורך זמן באזורי CA1.

קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. השלב הראשון הוא שלב ההתמזגות התוך-לב עם תמיסה קרה כקרח. שחרור מהיר של דם מאותת על ידי שינוי מהיר של צבע הכבד. המוח שחולץ צריך להיות כבוי לבן בצבע. אם המוח נשאר ורוד, זה אומר שדם מערכתי לא הוחלף NMDG-aCSF קר, ואת הירידה בטמפרטורת הגוף לא הושגה. זה יכול להיגרם על ידי מיקום לא תקין של המחט לתוך הלב, או בגלל הלב נוקב דרך. מוח מעכברים סוטה גרוע לא צריך לשמש לחיתוך. השלב הקריטי השני הוא השימוש ב-NMDG כתחליף לנתרן יון. וריאציה מוקדמת ידועה של הפרוטוקול המשתמש בהצלחה סוכרוז כתחליף Na+ במוחחולדה 10,31 אינו מייצר פרוסות היפוקמפוס בריא מספיק בעכברים (ראה גם דינג ואח'13). השימוש NMDG כתחליף יון נתרן הוא קריטי עבור פרוסות היפוקמפוס העכבר.

בעוד פרוסות היפוקמפוס בריא מתקבלות באופן אמין באמצעות הפרוטוקול המתואר, הכנת היפוקמפוס מבעלי חיים בוגרים ומזדקנים נשאר מאתגר. הקושי שלה משתנה גם עם קווי עכבר שונים ורקעים גנטיים. שינויים פוטנציאליים שיש לקחת בחשבון הם תוספים NMDG-aCSF ופתרונות שחזור-aCSF כמו טאורין, D-serine, או N-אצטילציסטאין (NAC), זה יכול להגדיל את הפונקציה העצבית הסינאפטית13,,29, להגדילאת חמצון 29.  החלפה של CL-יונים צריך לשקול גם במהלך עירוי וחיתוך32. השימוש בתא שחזור ממשק הוא דרך נוספת לשמור על חמצון מוגבר, אשר רלוונטי במיוחד עבור הקלטות שדה פלסטיות לטווח ארוך. תא השחזור המתואר(איור 1C)ניתן לשנות למטרה זו (למשל, תבשיל הוספת תרבות הנישא מלמטה על ידי aSCF, יכול להחליף את רשת השקועה). החלפת להבי פלדה בלהבי ספיר או קרמיקה יכולה להקטין את דחיסת הרקמות המחריפה על ידי מיליציה כבדה של חומר לבן סביב היפוקמפוס; זה בתורו יכול לשפר עוד יותר את איכות הנוירונים ליד פני השטח פרוסה. שימוש במיקרוטומים שנועדו למזער את הרטט האנכי (לדוגמה, zero-z ב- Leica VT1200S), הוא צעד נוסף הניתן לניתן לניתן.

אזורים אחרים במוח יכולים להיחתך באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, עם שינויים מתאימים בזוויות חיתוך. בנוסף, ניתן להתאים את ההתכונה של הפרוסה, כמו אזורי מוח שונים רגישים היפוקסיה בדרגות שונות.. פרוטוקול המשתמש NMDG-aSCF דווח עבור neocortex עכבר מבוגר וטריאטיםפרוסת הכנות 13,20; הוא משתמש NMDG-aCSF המכיל 30 mM NaHCO3 (כלומר זה לא Na+-חינם)20, ובמקרים מסוימים עירוי transcardial הוא עם NMDG-aCSFבטמפרטורת החדר 13. עם זאת, עבור אזור רגיש להיפות כמו היפוקסיה כמו היפוקמפוס, באמצעות Na+-חינם NMDG-aCSF ו- עירוי עירוי קר כקרח יכול לעשות הבדל קריטי.

פרוטוקול זה ישים למערך העצום של קווי עכבר טרנסגניים מידול מחלות ניווניות. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות שונה עוד יותר פרוסות מוח ממין מודל יונקים אחרים, כמו גם. יחד, פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס להכנה מתוקנת לפרוסות היפוקמפוס אקוטיות מבעלי חיים מזדקנים, ובכך להקל על השוואות בין מחקרים בהקשר של מנגנוני מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחבר אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אני מודה לד"ר קרלה ג'יי שץ על ייעוץ ותמיכה, וד"ר ברברה ק. בראט ומישל ק. דוקס על שקראו את כתב היד באופן ביקורתי. העבודה נתמכת על ידי NIH EY02858 וקרן הצדקה מאת'רס מעניקה ל-CJS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
“60 degree” tool made in-house
#10 scalpel blade Bard-Parker (Aspen Surgical) 371110
1M CaCl2 Fluka Analytical 21114
95%O2/5%CO2 Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect) Henry Schein 5700850
Agar Fisher BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2 Ted Pella Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera Olympus XM10
Choline bicarbonate Pfalz & Bauer C21240
Cyanoacrilate glue Krazy glue Singles
Decapitation scissors FST 14130-17
Feather blades Feather FA-10
Filter paper #2 Whatman Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps A. Dumont & Fils Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 Robuglas.com 18103 or 18113 Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose Sigma-Aldrich G8270
HCl Fisher A144SI-212
Ice buckets
KCl Sigma-Aldrich P4504
Ketamine HCl (KetaVed) VEDCO NDC 50989-996-06
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
Leica Tissue slicer VT1000S The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O Sigma-Aldrich 230391
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
MilliQ water machine Millipore Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate Sigma-Aldrich A4035
Na-pyruvate Sigma-Aldrich P8574
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaHCO3 EMD SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG Sigma-Aldrich M2004
Paper tape
Peristaltic pump Cole-Parmer #7553-70
Peristaltic pump head Cole-Parmer Masterflex #7518-00
Personna blades Personna double edge Amazon
pH meter
Recovery chamber in-house made
Scalpel blade handle size 3 Bard-Parker (Aspen Surgical) 371030
Scissors angled blade FST 14081-09
Single edge industrial razor blade #9 VWR 55411
Spatulas
Transfer pipettes Samco Scientific 225
Upright microscope Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed) VetOne 510650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
  2. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  3. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
  4. Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
  5. Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
  6. Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
  7. Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
  8. Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
  9. Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
  10. Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
  11. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
  12. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
  13. Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
  14. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
  15. Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
  16. Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
  17. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  18. Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
  19. Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
  20. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
  21. Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
  22. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
  23. Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
  24. Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
  25. Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
  26. Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
  27. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
  28. Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
  29. Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  30. Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
  31. Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
  32. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).

Tags

מדעי המוח גיליון 161 פרוסות היפוקמפוס מבוגר הזדקנות היפוקסיה ATP NMDG CA1 טלאי-מהדק הקלטות שדה
מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Djurisic, M. Minimizing Hypoxia inMore

Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. J. Vis. Exp. (161), e61377, doi:10.3791/61377 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter