Summary
Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.
Abstract
Le fette acute dell'ippocampo hanno permesso a generazioni di neuroscienziati di esplorare le proprietà sinaptiche, neuronali e dei circuiti in dettaglio e con alta fedeltà. L'esplorazione dei meccanismi LTP e LTD, il calcolo dendritico singolo neurone e i cambiamenti dipendenti dall'esperienza nei circuiti, non sarebbero stati possibili senza questa preparazione classica. Tuttavia, con poche eccezioni, la maggior parte della ricerca di base utilizzando fette acute di ippocampo è stata eseguita utilizzando fette di roditori di età relativamente giovani, P20-P40, anche se i meccanismi di eccitabilità sinaptica e intrinseca hanno una lunga coda di sviluppo che raggiunge oltre P60. Il fascino principale dell'utilizzo di giovani fette di ippocampo è la conservazione della salute neuronale aiutata da una maggiore tolleranza ai danni ipossici. Tuttavia, c'è bisogno di comprendere la funzione neuronale in fasi più mature di sviluppo, ulteriormente accentuate dallo sviluppo di vari modelli animali di malattie neurodegenerative che richiedono una preparazione cerebrale di invecchiamento. Qui descriviamo una modifica a una preparazione acuta a fette di ippocampo che fornisce in modo affidabile fette sane da ippocampo di topo adulto e invecchiamento. I passaggi critici del protocollo sono la perfusione trascardica e il taglio con NMDG-aSCF senza sodio ghiacciato. Insieme, questi passaggi attenuano il calo indotto dall'ipossia nell'ATP al momento della decapitazione, così come l'edema citotossico causato da flussi di sodio passivo. Dimostriamo come tagliare fette trasversali di ippocampo più corteccia utilizzando un microtome vibrante. Le fette acute di ippocampo ottenute in questo modo sono affidabili per molte ore di registrazione e sono appropriate sia per le registrazioni sul campo che per le registrazioni mirate di morsetto patch, incluso il targeting dei neuroni etichettati fluorescentemente.
Introduction
L'avvento dei preparati a fette cerebrali acute dei mammiferi ha facilitato esperimenti a livello cellulare e sinaptico che in precedenza erano possibili solo in preparazioni invertebrate come Aplysia1. Lo sviluppo di fette acute di ippocampo era di particolare importanza, in quanto è una struttura responsabile della memoria di lavoro e della formazione del contesto, e ha un circuito tri-sinaptico specializzato che è su misura per una facile manipolazione fisiologica. Tuttavia, la stragrande maggioranza delle fette cerebrali acute sono ancora preparate da topi e ratti relativamente giovani, in quanto è più facile preservare neuroni e circuiti sani e le fette rimangono vitali per lunghi periodidi tempo 2,3,4. Qui, introduciamo modifiche ai protocolli di sezionamento standard che si traducono in una maggiore vitalità delle fette acute di ippocampo da topi adulti e invecchiati.
Il principale ostacolo alla vitalità ex vivo a lungo termine del parenchyma cerebrale dei mammiferi è il danno ipossico iniziale che si verifica rapidamente una volta che il flusso sanguigno al cervello smette di essere decapitato. La perdita di ossigeno si traduce in un rapido consumo metabolico di grandi risorse energetiche nel cervello con la perdita di fosfo-creatina (P-creatine) essendo il più rapido, seguito da glucosio, adenosina triphosphate (ATP), e glicogeno4. La conservazione dell'ATP è di particolare importanza per la salute a lungo termine delle fette cerebrali, in quanto l'ATP è necessario per mantenere il potenziale della membrana tramite l'ATPase Na-K, e di conseguenza l'attività neurale5,6. Il livello ATP nel cervello dei roditori adulti è di 2,5 mM, e scende precipitosamente entro 20 s di decapitazione per raggiungere uno stato stabile basale (0,5 mM) a circa 1 min dopo ladecapitazione 4,7,8. Negli animali giovani, ci vuole più tempo per osservare lo stesso calo dell'ATP (2 min); con anestesia fenobarbitale è ulteriormente rallentato a 4 min4. Queste considerazioni dimostrano che prevenire la perdita di ATP e altre risorse energetiche è una strategia necessaria per prevenire danni ipossici al cervello e a sua volta per mantenere la salute delle fette cerebrali per lunghi periodi di tempo, soprattutto negli animali adulti.
Le basse temperature rallentano il metabolismo. Di conseguenza, è stato dimostrato che una modesta ipotermia protegge le riserve di energia cerebrale: negli animali giovani, abbassando la temperatura corporea di sei gradi, da 37 gradi centigradi a 31 gradi centigradi, mantiene i livelli di ATP a circa l'80% dei livelli normali oltre i 4 h di ipossiacontrollata 9. I livelli di P-creatina sono conservati allo stesso modo, così come il potenziale di fosforilazione complessiva9. Ciò suggerisce che abbassare la temperatura corporea prima della decapitazione potrebbe essere neuroprotettivo, come quasi normale livelli di ATP potrebbero essere mantenuti attraverso il taglio fetta e slice periodi di recupero.
Nella misura in cui un calo ATP non può essere completamente impedito al momento della decapitazione, si prevede una funzione parzialmente compromessa del Na-K ATPase, seguita dalla depolarizzazione tramite afflusso passivo di sodio. Poiché l'afflusso passivo di sodio è seguito dall'ingresso di acqua nelle cellule, provoca edema citotossico e infine pyknosis. Nei ratti adulti, la sostituzione degli ioni di Naè con il saccarosio nelle soluzioni di taglio delle fette è stata una strategia di successo per alleviare il peso dell'edema citotossico10,11. Più di recente, le cations organiche metilate che riducono la permeabilità del canale di sodio12 hanno dimostrato di offrire una protezione più efficace rispetto al saccarosio, soprattutto nelle fette di topi adulti, con N-methyl-D-glucamina (NMDG) più ampiamente applicabile tra diverse età e regioni del cervello13,14,15,16.
Numerosi protocolli di taglio del cervello prevedono l'utilizzo di temperature fredde solo durante la fase di taglio delle fette, a volte in combinazionecon la strategia di sostituzione degli ioniNa 16,17. Nei giovani animali, questi protocolli sembrano offrire sufficiente neuroprotezione poiché il cervello può essere estratto rapidamente dopo la decapitazione perché il cranio è ancora sottile e facile da rimuovere3. Tuttavia, questa strategia non produce fette sane da animali adulti. Nel corso del tempo, un certo numero di laboratori che studiano roditori adulti hanno introdotto la perfusione transcardiale con una soluzione ghiacciata per diminuire la temperatura corporea dell'animale, e quindi danni ipossici al cervello, prima della decapitazione. Questa procedura è stata applicata con successo per produrre fette cerebellari18, fette midbrain19, fette neocorticali11,20, corteccia perirhinale21, ippocampo di ratto10,22,23, bulbo olfattivo24, ventrala stritatum25, corteccia visiva26.
Nonostante i vantaggi offerti dalla perfusione transcarriale e dalla sostituzione degli ioni na- nella preparazione di fette di ratto e in alcune regioni cerebrali nei topi, l'ippocampo dei topi rimane una delle aree più impegnative da proteggere dall'ipossia13,20. Ad oggi, uno degli approcci più comuni per affettare l'ippocampo da topi e modelli murini di invecchiamento della neurodegenerazione comporta il classico affettatura veloce dell'ippocampoisolato 27. Nel protocollo qui descritto, riduciamo al minimo la perdita di ATP nel cervello adulto introducendo l'ipotermia prima della decapitazione mediante la decifrazione dell'animale conna- liquido cerebrospinale artificiale a base di NMDG (NMDG-aCSF) gratuito. Le fette vengono poi tagliate+in NMDG-aCSF senza ghiaccio. Con questo protocollo avanzato otteniamo fette acute di ippocampo da topi adulti e di invecchiamento che sono sani fino a 10 h dopo il sezionamento e sono appropriati per le registrazioni sul campo a lungo termine e gli studi di patch-clamp.
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Protocol
Il protocollo viene eseguito in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stanford University. I metodi sono anche in conformità con le politiche della Società per le neuroscienze sull'uso degli animali e degli esseri umani nella ricerca sulle neuroscienze.
NOTA: tutti i topi sono stati mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni. Qui sono stati utilizzati topi di tipo selvatico su sfondo genetico misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, se non diversamente indicato.
1. Configurazione
- Preparare 1 L di 1x aCSF (in mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 Mg2SO4, 7H2O, 2.5 CaCl2, 25 glucosio (Tabella 1). Utilizzare questa soluzione per la camera di recupero e le registrazioni successive.
NOTA: memorizzare aCSF come soluzione stock 10x che contiene NaCl, NaHCO3, KCl e KH2PO4. Memorizzare Mg2SO47H2O e CaCl2 come 1 M soluzioni stock. Preparare la soluzione di lavoro il giorno dell'esperimento dalle soluzioni di stock di cui sopra e aggiungere il glucosio prima di regolare il volume finale con 18 MΩ acqua.
NOTA: A seconda della regione del cervello o del ceppo del topo, l'aCSF refrigerato può essere utilizzato anche per la perfusione trascardicacon successo 11,15,26. - Preparare 300 mL di NMDG-aCSF (in mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 bicarbonato di colina, 10 glucosio(Tabella 1). Questo volume di NMDG-aCSF è sufficiente sia per la perfusione transcardiale che per le fasi di taglio.
NOTA: Conservare NMDG-aCSF come soluzione di stock 3x a 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione di lavoro il giorno dell'esperimento; aggiungere bicarbonato di colina e glucosio prima di regolare il volume finale con 18 MΩ acqua. Far bollire la soluzione con 95%O2/5%CO2 per tamponarla e saturarla di ossigeno.
NOTA: lo stock NMDG inizia come altamente alcalino e richiede l'acido cloridrico concentrato (HCl) per regolare il pH a 7,4 USD. L'aggiunta di acido cloridrico deve essere lenta una volta al di sotto del pH 8, in quanto è facile acidificare la soluzione a pH 3 con HCl in eccesso. Questa regolazione deve essere effettuata prima di aggiungere cations divalenti. Questa ricetta NMDG-aCSF è senza sodio. Ricette NMDG pubblicate in precedenza utilizzano 30 mM NaHCO3 per il buffering, che si traduce in 30 mM di sodio presente in NMDG-aCSF13,20. - Impostare il vassoio di taglio microtome vibrante e il disco di montaggio a -20 gradi centigradi.
- Preparare la camera di recupero.
- Riempire la camera di recupero appena sopra la maglia a fette, tenerla sul banco a temperatura ambiente e bolla.
NOTA: La camera di recupero fetta utilizzata qui è molto simile alle camere classiche descritte in precedenza da Edwards e Konnerth3. aCSF è tenuto in un bicchiere di vetro (400 mL) che contiene un telaio acrilico rotondo con maglia di nylon nero incollata sul fondo. Il telaio acrilico è sospeso al centro del becher tramite un gancio acrilico che poggia sul bordo del becher. Il bubbler di vetro viene inserito fino in fondo. Il design permette l'ossigenazione di entrambi i lati delle fette. Il bubbling fornisce anche una miscelazione costante di aCSF nella camera di recupero. La maglia nera fornisce un contrasto elevato rispetto alle fette bianche, che sono quindi più facili da vedere.
- Riempire la camera di recupero appena sopra la maglia a fette, tenerla sul banco a temperatura ambiente e bolla.
- Preparare la soluzione di perfusione e taglio trascardica.
- Raffreddare l'intero 300 mL di NMDG-aCSF in un congelatore, fino a quando i cristalli di ghiaccio iniziano a formarsi sulla superficie e sulle pareti della bottiglia. NON congelare troppo!
- Mettere la bottiglia con NMDG-aCSF refrigerato sul ghiaccio e bolla. La soluzione deve essere compresa tra 0 e 20122 .
NOTA: Slushy NMDG- aCSF implica avere la maggior parte della soluzione come liquido, mentre una piccola frazione di ghiaccio fangoso presente manterrà la soluzione vicino a 0 gradi centigradi durante la perfusione e il taglio. Si dovrebbe fare attenzione a tenere lontani i cristalli di ghiaccio dal cervello durante il taglio.
- Preparare il disco di montaggio dei tessuti.
- Togliere il disco dal freezer, asciugarlo se necessario.
- Tagliare un blocco di 5% agar dalla piastra di agar precedentemente preparata, e incollarlo al centro del disco utilizzando un sottile strato di colla cianoacrilato. Il pezzo di agar dovrebbe essere circa le dimensioni di un cervello di topo. Mettere il disco con l'agar incollato sul ghiaccio e coprire con carta assorbente fino a quando non è pronto per l'uso.
- Per 5% agar piatto, sciogliere 5 g di agar in 100 mL di 18 MΩ acqua da microwaving, e versare in un piatto di Petri pulito. Tenere a 4 gradi centigradi.
- Togliere il vassoio di taglio dal congelatore, posizionarlo nel microtome, circondarlo di ghiaccio e caricare la lama.
2. Perfusione trascardica ed estrazione cerebrale
- Overdose di topi tramite un'iniezione intraperitoneale di cocktail anestetico. Controllare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del dolore (pizzicamento delle dita dei piedi); un topo non deve mostrare il riflesso una volta che raggiunge l'anestesia profonda.
NOTA: Ricetta di cocktail per l'anestesia dei roditori: Ketamina HCl (66 mg/mL), HCl xylazine (6,6 mg/mL), maschio di acepromazina (0,1 mg/mL), 18 MΩ acqua al volume finale. Dose: 0,4 mg/g di peso corporeo, 0,04 mg/g di peso corporeo, 6 x 10-4 mg/g di peso corporeo rispettivamente per ketamina, xylazina e acepromazina. - Impostare la pompa peristaltica per la perfusione trascardica. Inserire un lato della pompa tubing nella bottiglia con NMDG-aCSF ghiacciato. Montare l'altro lato del tubo con l'ago da 27 G che verrà inserito nel ventricolo sinistro.
- Impostare la velocità della pompa a circa 3,5 mL/min. A questa velocità, il deflusso di NMDG-aCSF è una flebo veloce, non un flusso continuo.
NOTA: La perfusione per gravità è un buon sostituto della perfusione della pompa peristaltica, purché sia possibile raggiungere la stessa velocità di flusso approssimativa. Una perfusione ad alta velocità di flusso si tradurrà in scoppio vasi sanguigni nel cervello. Un segno rivelatore di una perfusione eccessivamente veloce e di una maggiore pressione nei vasi sanguigni è la soluzione che esce dal naso dell'animale. - Aspersione
- Posizionare il mouse correttamente anethetizzato sulla schiena su un pannolino. Utilizzando nastro adesivo, nastro adesivo lungo le zampe anteriori e posteriori in modo che il torace e l'addome sono esposti.
- Ritagliare una grande macchia della pelle in cima al petto, passando da sotto lo sterno alla gola; questo dovrebbe fornire un'ampia area di lavoro. Afferrare lo sterno con le forcelle, sollevare delicatamente e iniziare a tagliare attraverso la gabbia toracica su entrambi i lati fino a quando la cavità toracica è esposta.
- Tagliare il diaframma per esporre la cavità toracica. Il lembo della gabbia toracica deve essere lasciato attaccato tramite un sottile pezzo di muscolo. Dovrebbe essere possibile impostarlo su un lato senza farlo ricad vedere la cavità toracica esposta. Controlla che il cuore batte ancora. Assicurarsi che la maggior parte del fegato sia visibile.
- Inserire l'ago da 27 G nel ventricolo sinistro; il ventricolo sinistro del mouse sembra più chiaro di destra. Individuare l'atrio destro di colore rosso scuro. Tagliare l'atrio destro con piccole forbici; il sangue dovrebbe iniziare a scorrere.
- Avviare la pompa che è stata preimpostata alla velocità di flusso corretta. Se tutto è stato fatto correttamente, il fegato dovrebbe iniziare a cambiare colore da rosso a marrone subito dopo l'inizio della perfusione. Monitorare il colore del fegato per determinare la lunghezza della perfusione; il fegato dovrebbe diventare marrone pallido.
- Eseguire la pompa per qualche minuto in più. Se si utilizza il termometro rettale, la temperatura corporea dovrebbe scendere a 28-u201229 gradi centigradi, e il naso dell'animale dovrebbe essere freddo al tatto.
- Estrazione cerebrale.
NOTA: Per questo passo, avere pronti i seguenti strumenti di dissezione: forbici di decapitazione, piccole forbici con lama dritta o angolata, bisturi e lama #10, lama a bordo singolo, #3 force, spatola con un lato piegato a 90 gradi, una spatola, uno strumento "60"(Figura 1A,B) e un piccolo pennello morbido.- Decapitare il topo con grandi forbici di decapitazione. Utilizzando un bisturi #10 lama, tagliare la pelle sulla parte superiore del cranio. Con piccole forbici angolate, tagliare il cranio sulla linea mediana. Successivamente, usando le #3, leva via le metà destra e sinistra del cranio, facendo attenzione a portare via la dura. Il cervello dovrebbe essere esposto ora.
NOTA: Se la dura si stacca dal cranio, rimarrà sopra il cervello e deve essere rimossa separatamente. I bordi della dura rimanente possono stringere e tagliare in profondità attraverso il cervello, potenzialmente danneggiando la regione del cervello di interesse. - Rimuovere il cervello scavando fuori con una piccola spatola. Far cadere il cervello nella soluzione NMDG-aCSF posta in un piccolo becher separato sul ghiaccio. Lascialo lì per un minuto.
NOTA: Oltre all'ipotermia, l'esposizione alla salina ghiacciata insaesta il cervello, che è necessario anche per il taglio. L'intera procedura dalla decapitazione all'estrazione cerebrale dovrebbe essere inferiore a 30 s.
- Decapitare il topo con grandi forbici di decapitazione. Utilizzando un bisturi #10 lama, tagliare la pelle sulla parte superiore del cranio. Con piccole forbici angolate, tagliare il cranio sulla linea mediana. Successivamente, usando le #3, leva via le metà destra e sinistra del cranio, facendo attenzione a portare via la dura. Il cervello dovrebbe essere esposto ora.
3. Affettare
- Togliere il cervello dal NMDG-aCSF e posizionarlo su un pezzo di carta da filtro.
- Tagliare e rimuovere un cuneo di 60 gradi dall'estremità rostrale del freno a reggino utilizzando un utensile "60" centrato sulla linea mediana. Le superfici tagliate verranno utilizzate per il montaggio per ottenere l'angolo corretto per le sezioni dell'ippocampo trasversale, come descritto di seguito (Figura 1A,B).
NOTA: Due lame a taglio singolo tenute insieme tramite un supporto fatto in casa rendono uno strumento facile da usare per realizzare il taglio a 60 gradi(Figura 1A). - Separare gli emisferi lungo la linea mediana con il bisturi.
- Incollare gli emisferi sul disco di montaggio come segue. Prendi il disco di montaggio che è stato sul ghiaccio fino ad ora. Se necessario, asciugarlo di nuovo. Incollare ogni emisfero di fronte al blocco agar, tagliare lato verso il basso.
- Assicurarsi che il lato ventrale di ogni emisfero tocchi il blocco agar. Il blocco agar fornisce ulteriore supporto durante il taglio ed è essenziale per le fette pari. I lati dorsali di ogni emisfero devono essere rivolti verso la lama. Quando incollato sul lato taglio, ogni emisfero è orientato rispetto alla lama in un modo che si traduce in fette trasversali di ippocampo dorsale in situ (Figura 1B).
- Immergere il disco con gli emisferi in una camera di taglio contenente NMDG-aCSF carbogenato a ghiaccio freddo.
- Tagliare le sezioni di 400 m. Il taglio deve essere fatto in meno di 10 min. Microtomi diversi richiederanno impostazioni diverse per raggiungere questo tempo. Si ottiene un totale di 8 fette di 8-u201210 dalla regione dell'ippocampo dorsale.
4. Recupero
- Trasferire le fette in una camera di recupero contenente aCSF carbogenato a temperatura ambiente utilizzando pipette di trasferimento usa e getta con punte di taglio (Figura 1C).
NOTA: Si consiglia vivamente di fortificare il recupero camera-aSCF con 5 mM Na-ascorbate e 3 mM Na-pyruvate. Pyruvate è un substrato energetico mostrato per aumentare la produzione di ATP infette 28, mentre Na-ascorbate è un spezzone libero-radicale29. - Incubare a temperatura ambiente (22 u201224) per circa 2 h prima della registrazione (fino a 4 h).
NOTA: Un'incubazione più lunga a temperatura ambiente si traduce in fette più sane per periodi di tempo più lunghi, rispetto all'incubazione standard a 37 gradi centigradi per 30 min seguita dall'incubazione della temperatura ambiente. Il riscaldamento a 37 gradi centigradi può introdurre l'edema citotossico13.
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Representative Results
Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per generare fette di ippocampo da CamKIIa-Cre; Topi WT su sfondo genetico misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, a P > 120. Un gran numero di cellule piramidali nel campo CA1 (Figura 2A) e subiculum (Figura 2B) appaiono in basso contrasto quando osservati sotto la microscopia a contrasto differenziale a infrarossi (IR-DIC), un segno distintivo delle cellule sane in una preparazione di sezione. Con questa preparazione, un alto tasso di sigilli giga-ohm (>90%) è regolarmente raggiunto quando si prendono di mira le cellule più sane circa 20-u201250 micron sotto la superficie. Per questo tasso di successo, è importante utilizzare un obiettivo NA elevato per IR-DIC, ad esempio un obiettivo di immersione in acqua 60x, al fine di ottenere un'adeguata visualizzazione delle cellule piramidali a questa profondità (Figura 2A,B).
Le registrazioni di morsetto a patch da singoli neuroni sono facilmente raggiungibili utilizzando questa preparazione a slice ippocampale anche nei topi di età superiore ai sei mesi. Nella figura 2C viene illustrato un esperimento di esempio che utilizza registrazioni di correnti postynaptice in miniatura (mEPSC) dai neuroni CA1. L'induzione di NMDA-LTD chimico con applicazione del bagno di 20 NMDA per 3 minuti riduce la frequenza mEPSC nelle cellule CA1 quando viene valutato 60 min dopo il trattamento NMDA. Questa scoperta suggerisce che NMDA-LTD causa la potatura dipendente dall'attività delle sinapsi in CA1 nei topi più anziani (risultati adattati da Djurisic et al.15). Non è stata rilevata una modifica dell'ampiezza mEPSC. Durante le registrazioni mEPSC, le cellule CA1 sono state riempite anche di biocitina. Figura 2D rivela un pergolato dendritico intatto e habitus cellulare sano di neuroni piramidali CA1 pieni di biocitina. Una robusta distribuzione del colorante fluorescente in tutta la cellula consente una valutazione di routine delle proprietà della colonna vertebrale dendritica in diverse condizioni sperimentali.
Utilizzando le registrazioni sul campo, è stato facilmente osservato il potenziamento a lungo termine (LTP) del 170% delle sinapsi CA3-CA1 nelle fette dei topi adulti, suggerendo la manutenzione delle cascate di segnalazione necessarie per LTP (Figura 2E,F). Viene mantenuta anche la connettività di rete necessaria per un segnale di potenziale post-sinaptico (fEPSP) robusto sul campo (Figura 2E). La capacità di valutare la plasticità sinaptica nelle fette di ippocampale da topi adulti o invecchiamento è particolarmente rilevante per i modelli murini di malattie neurodegenerative come la loro disfunzione sinaptica segno si sviluppa più tardi nella vita.
Insieme, i nostri risultati dimostrano che una preparazione acuta dell'ippocampo da topi adulti e di invecchiamento consente la valutazione della funzione sinaptica a livello di singole cellule e della popolazione di cellule di routine, purché la perfusione trascardica e le soluzioni a base di NMDG ghiacciate siano utilizzate per ridurre al minimo i danni ipossici.
Figura 1: Metodo di taglio e recupero di fette di ippocampo trasversali da topi adulti e anziani. (A) Uno strumento "60" utilizzato per rimuovere il cuneo di 60 gradi dall'estremità rostrale del cervello, centrato sulla linea mediana. (B) Posizionamento degli emisferi per il taglio delle fette trasversali. Un'illustrazione di un taglio di 60 gradi è mostrata sui pannelli sinistro e superiore destro; il posizionamento dei due emisferi sulla superficie con colla nel modo mostrato nel pannello inferiore destro garantisce un orientamento perpendicolare dell'ippocampo dorsale rispetto alla lama. Questo orientamento si traduce in fette trasversali di ippocampo. Le strutture gialle sono un rendering 3D dell'ippocampo all'interno del cervello dei roditori (grigio). Questa illustrazione è adattata da SynapseWeb30. Tutti i punti di vista sono del lato dorsale del cervello. (C) Fette di ippocampo trasversali tagliate da un topo di 4 mesi in una camera di recupero. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misure di plasticità patch-clamp e sinaptica nelle fette di ippocampo dei topi a P120-u2012180. (A) Un esempio di micrografia IR-DIC dell'area CA1. (B) Esempio di micrografie IR-DIC di subiculum. Sia in A che in B, le immagini vengono scattate 3 h dopo il taglio con un obiettivo di immersione in acqua 60x. La barra di calibrazione è di 10m.( C ) L'effetto della sostanza chimica NMDA-LTD su mEPSC nei neuroni CA1 da topi P120-u2012180. Il pannello superiore sono tracce di esempio di mEPSC registrate alla linea di base e dopo l'impulso NMDA-LTD. Pannello inferiore sinistro: NMDA-LTD ha provocato una frequenza mEPSC inferiore. Pannello inferiore destro: mEPSC modifica dell'ampiezza dopo che NMDA-LTD non viene rilevato. N - 17 cellule al basale e n - 15 cellule per NMDA-LTD, 6 topi. P - 0,004, test t. Questa cifra è stata modificata da Djurisic et al.15. (D) Esempio di cella piramidale CA1 piena di biocitina. (E) Esempio di segnale fEPSP dal radiatum dello strato CA1 dopo la stimolazione collaterale Di Schaffer. La traccia grigia si ottiene durante la registrazione di base, e la traccia nera viene osservata 20 minuti dopo la stimolazione tetanica. Ogni traccia è una media di 30 tracce consecutive. (F) Media cumulativa del potenziamento a lungo termine delle sinapsi CA3-CA1 dopo 4 treni di 100 Hz di induzione; n - 23 fette da 8 topi WT a circa P90. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) | ||||
| Ingredienti | Mw | Conc. finale (mM) | g/2 litri (10X) | g/litro (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kcl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4-7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml di brodo da 1 M |
| CaCl2-2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml di brodo da 1 M |
| Glucosio -H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) Aggiungere mg2SO4-7H2O e CaCl2-2H2O da 1M azioni | ||||
| b) aCSF 10X mantenere @RT | ||||
| c) aCSF 1X 4oC per 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ingredienti | Mw | Conc. finale (mM) | g/2 litri (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH-7,4 con HCl | ||||
| Kcl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2-6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2-2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Bicarbonato di colina | 80% | 20 | - | 1238 l |
| Glucosio -H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filtrare e conservare la soluzione di magazzino 3X a 4 gradi centigradi | ||||
Tabella 1: Formulazioni multimediali.
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Discussion
Il protocollo qui descritto dimostra che le fette di ippocampo ottenute da topi adulti e anziani possono rimanere sane e vitali per molte ore dopo il taglio. Le sezioni preparate utilizzando questo protocollo sono appropriate per le registrazioni di patch-clamp, così come le registrazioni sul campo di lunga durata nelle regioni CA1.
Esistono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo passo è il passo di perfusione trascardica con una soluzione ghiacciata. La rapida liquidazione del sangue è segnalata da un rapido cambiamento del colore del fegato. Il cervello estratto dovrebbe essere di colore bianco. Se il cervello rimane rosa, significa che il sangue sistemico non è stato sostituito con il nmDG-aCSF freddo, e il calo della temperatura corporea non è stato raggiunto. Questo potrebbe essere causato da posizionamento improprio dell'ago nel cuore, o perché il cuore è stato perforato attraverso. I cervelli provenienti da topi mal perfuso non devono essere utilizzati per affettare. Il secondo passo critico è l'uso di NMDG come sostituto degli ioni di sodio. Una nota variante precedente del protocollo che utilizza con successo il saccarosiocome sostituto di Na - nei cervelli diratto 10,31 non produce fette di ippocampo sufficientemente sane nei topi (vedi anche Ting et al.13). L'uso di NMDG come sostituto degli ioni di sodio è fondamentale per le fette di ippocampo del topo.
Mentre le fette di ippocampo sani sono ottenute in modo affidabile utilizzando il protocollo descritto, la preparazione dell'ippocampo da animali adulti e anziani rimane difficile. La sua difficoltà cambia anche con diverse linee di topo e sfondi genetici. Le potenziali modifiche da considerare sono additivi per NMDG-aCSF e soluzioni di recupero-aCSF come taurina, D-serina o N-acetylcysteine (NAC), che potrebbero aumentare la funzione neuronale e sinaptica13,29, aumentare l'ossigenazione29. La sostituzione degli ioni di Cl deve essere presa in considerazione anche durante la perfusione e iltaglio 32. L'uso di una camera di recupero dell'interfaccia è un altro modo per mantenere una maggiore ossigenazione, che è particolarmente rilevante per le registrazioni di campo di plasticità a lungo termine. La camera di recupero descritta (Figura 1C) è modificabile a tale scopo (ad esempio, un piatto di inserto di coltura che è inacidito dal basso da aSCF, potrebbe sostituire la maglia sommersa). La sostituzione delle lame d'acciaio con lame di zaffiro o ceramica potrebbe ridurre la compressione dei tessuti esacerbata dalla pesante mielinazione della materia bianca intorno all'ippocampo; questo a sua volta potrebbe migliorare ulteriormente la qualità dei neuroni vicino alla superficie della fetta. L'utilizzo di microtomi progettati per ridurre al minimo la vibrazione verticale (ad esempio, zero-z in Leica VT1200S), è un altro passo modificabile.
Altre regioni del cervello potrebbero essere tagliate utilizzando il protocollo descritto qui, con modifiche appropriate negli angoli di taglio. Inoltre, la serietà della preparazione della sezione può essere regolata, poiché diverse regioni del cervello sono sensibili all'ipossia a diversi gradi. È stato segnalato un protocollo che utilizza un NMDG-aSCF per i preparati per neocortex e striato per adulti13,20; utilizza un NMDG-aCSF che contiene 30 mM NaHCO3 (cioè nonèNa e -free)20, e in alcuni casi la perfusione trascardica è con NMDG-aCSF a temperaturaambiente 13. Tuttavia, per una regione suscettibile all'ipossia come l'ippocampo,l'utilizzodi NMDG-aCSF senza problemi e di perfusione ghiacciata potrebbe fare una differenza critica.
Questo protocollo è applicabile alla vasta gamma di linee di topo transgenici che modellano malattie neurodegenerative. Inoltre, il protocollo potrebbe essere ulteriormente modificato a fette cerebrali di altre specie di modelli di mammiferi. Insieme, questo protocollo potrebbe servire come base per una preparazione standardizzata per le fette acute di ippocampo da animali che invecchiano, e quindi facilitare i confronti tra gli studi nel contesto dei meccanismi della malattia.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringrazio la dottoressa Carla J. Shatz per i consigli e il supporto, e la dottoressa Barbara K. Brott e Michelle K. Drews per aver letto criticamente il manoscritto. Il lavoro è sostenuto da NIH EY02858 e dalla Mathers Charitable Foundation concede a CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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