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Cancer Research

कैंसर फार्माकोलॉजी अनुसंधान के लिए पीडीएक्स और पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड के वीवो/इन विट्रो रोगी-व्युत्पन्न मॉडल जोड़े में मिलान करना

doi: 10.3791/61382 Published: May 5, 2021

Summary

इन विट्रो स्क्रीनिंग के लिए रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड बनाने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप वीवो/इन विट्रो मॉडल में मिलान जोड़े होते हैं। पीडीएक्स ट्यूमर को यांत्रिक रूप से या एंजाइमेटिक रूप से छोटे टुकड़ों में काटा/संसाधित किया गया था, जिसके बाद चालाकों की विधि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए थी जो पारित, क्रायोप्रेयरवित और मूल पीडीएक्स के खिलाफ विशेषता थी।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर xenografts (PDXs) सबसे भविष्य कहनेवाला पूर्व नैदानिक मॉडल माना जाता है, मोटे तौर पर पारंपरिक कैंसर दवा मूल्यांकन के लिए कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) द्वारा संचालित माना जाता है । पीडीएक्सएस का एक बड़ा पुस्तकालय रोगी आबादी की विविधता को प्रतिबिंबित करता है और इस प्रकार जनसंख्या आधारित प्रीक्लिनिकल परीक्षणों ("चरण द्वितीय-जैसे माउस नैदानिक परीक्षण"); हालांकि, पीडीएक्स में कम थ्रूपुट, उच्च लागत और लंबी अवधि की व्यावहारिक सीमाएं हैं। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड, रोगी-व्युत्पन्न सीएससी-संचालित मॉडल भी हैं, को पीडीएक्स के इन विट्रो समकक्ष के रूप में माना जा सकता है, जो ऑर्गेनॉइड या यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों से निपटने के लिए कुछ पीडीएक्स सीमाओं पर काबू पा सकते हैं। यह अध्ययन पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीएक्सओ) बनाने की विधि का वर्णन करता है, जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो और वीवो फार्माकोलॉजी अनुसंधान के लिए जोड़ा गया मॉडल होता है। चमड़े के द्वारा प्रत्यारोपित PDX-CR2110 ट्यूमर ट्यूमर असर चूहों से एकत्र किए गए जब ट्यूमर 200-800 मिमी3तक पहुंच गया, एक अनुमोदित शव परीक्षण प्रक्रिया के अनुसार, आसन्न गैर ट्यूमर ऊतकों को हटाने और छोटे ट्यूमर के टुकड़ों में वियोजन के बाद । छोटे ट्यूमर के टुकड़े को धोया गया और मलबे को हटाने के लिए 100 माइक्रोन सेल छलनी से गुजरना किया गया। सेल क्लस्टर एकत्र किए गए थे और तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) समाधान में निलंबित कर दिया गया था और सीओ2 इनक्यूबेटर में विकास के लिए आसपास के तरल मीडिया के साथ एक ठोस बूंद के रूप में 6-अच्छी प्लेट में चढ़ाया गया था। ऑर्गेनॉइड विकास की निगरानी प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत साप्ताहिक रूप से दो बार की गई और फोटोग्राफी द्वारा दर्ज की गई, जिसके बाद सप्ताह में 2 या 3 बार तरल मध्यम परिवर्तन हुआ। बड़े ऑर्गेनॉइड को आगे (7 दिन बाद) यांत्रिक कतरनी का उपयोग करके बीएमई एम्बेडेड ऑर्गेनॉइड को बाधित करके 1:2 अनुपात में पारित किया गया था, जो ट्राइपसिन के अलावा और 10 माइक्रोन वाई-27632 के अलावा सहायता प्राप्त था। ऑर्गेनॉइड को लंबे समय तक भंडारण के लिए क्रायो-ट्यूब में क्रायोप्रेयराई किया गया था, बीएमई से अपकेंद्रित्र द्वारा रिहाई के बाद, और आगे के लक्षण वर्णन के लिए (जैसे, डीएनए, आरएनए और एफएफपीई ब्लॉक) का नमूना भी लिया गया था।

Introduction

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कैंसर विविध आनुवंशिक और प्रतिरक्षा विकारों का एक संग्रह हैं। प्रभावी उपचार का सफल विकास प्रयोगात्मक मॉडल पर अत्यधिक निर्भर करता है जो प्रभावी रूप से नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी करते हैं। अच्छी तरह से विशेषता रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDX) के बड़े पुस्तकालयों लंबे समय से पसंद के वीवो प्रणाली में अनुवाद के रूप में देखा गया है केमो परीक्षण करने के लिए-और/या रोगी ट्यूमर विशेषताओं, विषमता और रोगी दवा प्रतिक्रिया 1 को फिर सेcapइट करने की क्षमता के कारण चिकित्सा लक्षित, इस प्रकार चरण द्वितीय कीतरहमाउस नैदानिक परीक्षणों को सक्षम करने के लिए नैदानिक सफलता में सुधार2,3। पीडीएक्स को आम तौर पर कैंसर स्टेम सेल रोगों के रूप में माना जाता है, जिसमें आनुवंशिक स्थिरता होती है, सेल लाइन के विपरीत व्युत्पन्न xenografts2। पिछले कुछ दशकों में, पीडीएक्स के बड़े संग्रह दुनिया भर में बनाए गए हैं, जो आज कैंसर दवा विकास का वर्कहॉर्स बन गए हैं। हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और महान अनुवाद मूल्य के साथ, इन पशु मॉडल आंतरिक रूप से महंगा है, समय लेने वाली और कम थ्रूपुट, इसलिए बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अपर्याप्त हैं । पीडीएक्स प्रतिरक्षा-छेड़छाड़ प्रकृति4के कारण इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी (आईओ) परीक्षण के लिए भी अवांछनीय हैं। इस प्रकार पीडीएक्स की उपलब्ध बड़ी लाइब्रेरी का पूरा लाभ उठाना अव्यावहारिक है।

हंस चतुर्स की प्रयोगशाला5द्वारा बीड़ा उठाए गए हाल की खोजों ने एपिथेलियलमूलके अधिकांश मानव अंगों में वयस्क स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न ऑर्गेनॉइड की इन विट्रो संस्कृतियों की स्थापना की है। इन प्रोटोकॉलों को और परिष्कृत किया गया है ताकि विभिन्न संकेतों के मानव कार्सिनोमा में ग्रहण किए गए सीएससी से ऑर्गेनॉइड के विकास की अनुमति दी जा सके ये रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) जीनोमिक रूप से स्थिर8,9 हैं और इन्हें नैदानिक उपचार परिणामों10, 11,12के अत्यधिक पूर्वानुमानित दिखाया गया है। इसके अलावा, पीडीओ की इन विट्रो प्रकृति उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस)13को सक्षम बनाती है, इस प्रकार संभावित रूप से वीवो मॉडल में लाभ प्रदान करती है और रोगी आबादी के किराए के रूप में बड़े ऑर्गेनॉइड पुस्तकालयों का लाभ उठाती है। पीडीओ ऊपर वर्णित पीडीएक्स की कई सीमाओं पर काबू पाने के लिए एक महत्वपूर्ण खोज और अनुवाद मंच बनने के लिए तैयार हैं।

पीडीओ और पीडीएक्स दोनों रोगी-व्युत्पन्न और सीएससी-संचालित मॉडल हैं, जो व्यक्तिगत उपचार या नैदानिक परीक्षण प्रारूप के संदर्भ में चिकित्सीय का मूल्यांकन करने की क्षमता रखते हैं। पीडीएक्स के मौजूदा बड़े पुस्तकालय, जैसे >3000 पीडीएक्स14,15,16,17कामालिकाना संग्रह, इसलिए ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड, या पीडीएक्सओ) के पुस्तकालयों की तेजी से पीढ़ी के लिए उपयुक्त हैं, जिसके परिणामस्वरूप पेयएक्स और पीडीएक्सओ मॉडल की एक मेल खाती लाइब्रेरी होती है। यह रिपोर्ट अपने पैतृक पीडीएक्स-सीआर 2110 मॉडल16के संबंध में कोलोरेक्टल कैंसर पीडीएक्सओ-सीआर2110 बनाने और उसकी विशेषता बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करती है।

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Protocol

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अध्ययन करने से पहले क्राउन बायोसाइंस इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा जानवरों की देखभाल और उपयोग से जुड़ी सभी प्रोटोकॉल और संशोधन या प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और उन्हें मंजूरी दी गई । पशुओं की देखभाल और उपयोग AAALAC (प्रयोगशाला पशु देखभाल के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन) अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था के रूप में देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में रिपोर्ट, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद (२०११) । सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं एसपीएफ (विशिष्ट रोगजनक-मुक्त) सुविधाओं में बाँझ परिस्थितियों में थीं और विभिन्न सरकारी संस्थानों (जैसे, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों) से प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के सख्त अनुसार आयोजित की जाती थीं। प्रोटोकाल को सुविधा संस्थान (जैसे संस्थागत आईएसीयूसी समिति) में पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिए तैयारी

  1. पशु आवास
    1. हाउस Balb/c नग्न चूहों (n =5) व्यक्तिगत हवादार पिंजरों में, 20-26 डिग्री सेल्सियस पर, 30-70% आर्द्रता, और 12-h प्रकाश/12-एच अंधेरे के एक प्रकाश चक्र, मकई सिल बिस्तर के साथ साप्ताहिक बदल गया है, और विकिरण निष्फल सूखी कण्य भोजन प्लस बाँझ पीने के पानी ad libitum ।
  2. दाता ट्यूमर टुकड़ा तैयारी
    1. शरीर के वजन के लिए ट्यूमर असर दाता चूहों की बारीकी से निगरानी करें (बीडब्ल्यू, वजन संतुलन के माध्यम से), और ट्यूमर की मात्रा (टीवी, कैलिपर माप द्वारा)।
    2. जब टीवी 800-1000 मिमी 3 तक पहुंचता है, तो ट्यूमर युक्त जानवरों को बायोहैजार्डहुडमें इच्छामृत्यु दें।
      1. चूहों को एक ढक्कन के साथ इच्छामृत्यु कक्ष में रखें जो सीओ2 गैस को कक्ष में बचाता है। एक प्रवाह दर पर कक्ष में गैस का निर्वहन करें जो जानवर को न्यूनतम संकट के साथ तेजी से बेहोशी पैदा करता है। सीओ2 के लिए इष्टतम प्रवाह दर 2-2.5 एलपीएम के आसपास है ।
      2. यह देखकर इच्छामृत्यु सुनिश्चित करें कि जानवरों को होश नहीं है।
      3. स्पष्ट नैदानिक मृत्यु के बाद, >1 मिनट के लिए गैस प्रवाह बनाए रखने की संभावना है कि एक जानवर ठीक हो सकता है कम करने के लिए ।
    3. इओडोफोर झाड़ू का उपयोग करके ट्यूमर के आसपास की त्वचा को स्टरलाइज करें। आसन्न गैर ट्यूमर ऊतकों को हटाने और एक पेट्री डिश में रखने के द्वारा ट्यूमर ले लीजिए जिसमें पीबीएस के 20 एमएल, इच्छामृत्यु से पहले प्री-ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) होता है।
    4. एक और पेट्री डिश में PBS के साथ ट्यूमर धोने के लिए रक्त घटकों को दूर करने के बाद आधे में काटने और किसी भी अतिरिक्त त्वचा, रक्त वाहिकाओं, calcification और/या परिगलन को हटाने के बाद ।
    5. प्रत्यारोपण के लिए एक अलग पशु कमरे में परिवहन से पहले, पीबीएस के 20 एमएल के साथ एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में केवल बरकरार ट्यूमर टुकड़े रखें।

2. चमड़े के नीचे ट्यूमर विकास

  1. इम्यूनोसमझौता चूहों में ट्यूमर टुकड़ा के चमड़े के नीचे टीका
    1. एक स्केलपेल के साथ 2 मिमी टुकड़ों में पीडीएक्स ट्यूमर काटें, और प्रत्येक को चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) प्रत्यारोपण के लिए ट्रोनिक्स में रखें।
    2. प्राप्तकर्ता जानवरों को 5% आइसोफ्लुनान (1% पर नाक शंकु द्वारा बनाए रखा गया) के साथ एनेस्थेटाइज करें। जानवर आराम करते हैं, अपने राइटिंग पलटा खोते हैं और अंततः स्थिर हो जाते हैं, जब तक कि दर्द का जवाब नहीं देते। सही पार्श्व स्थिति में एक प्रयोग बोर्ड पर एनेस्थेटाइज्ड चूहों को ठीक करें और iodophor झाड़ू, विशेष रूप से ट्यूमर टीका की साइट के आसपास के क्षेत्रों के साथ निष्फल ।
    3. बाईं पार्श्व त्वचा पर सिर्फ कूल्हे के लिए कपाल, एक स्केलपेल के साथ एक 0.5 सेमी चीरा बनाने के लिए और अग्रभाग, 2-3 सेमी की ओर त्वचा के नीचे एक सुरंग बनाने के लिए, कुंद संदंश का उपयोग कर।
    4. असेप्टिक रूप से मध्यम से टीका साइट प्रति ट्यूमर टुकड़े के एक घन को स्थानांतरित करें और चमड़े के नीचे सुरंग के अंदर गहरे रखें। नेत्रहीन घाव क्लिप के साथ घाव के बंद होने से पहले टुकड़े की स्थिति की पुष्टि करें।
    5. ट्यूमर प्रत्यारोपित चूहों (5) की निगरानी करें जब तक कि वे स्टर्नल अनुलम्बक बनाए रखने के लिए सचेत न हो जाएं, और फिर संज्ञाहरण से उनकी पूर्ण वसूली के बाद ही उन्हें अपने पिंजरे में वापस कर दें।
  2. ट्यूमर असर चूहों स्वास्थ्य निगरानी
    1. पानी और भोजन की खपत दैनिक जांचें और साप्ताहिक शरीर के वजन को रिकॉर्ड करें।
    2. नियमित निगरानी के दौरान चूहों की जांच करें। गतिशीलता, श्वास, सौंदर्य और सामान्य उपस्थिति, भोजन और पानी की खपत, बीडब्ल्यू लाभ/हानि, एसाइट्स आदि पर कोई भी प्रभाव रिकॉर्ड करें।
    3. टीवी को दो बार साप्ताहिक कैलिपर्स का उपयोग करके मापें औरमिमी 3 प्रति में एक्सप्रेस करें: टीवी = 0.5 बी2×, जहां ए और बी ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई क्रमशः हैं।
    4. जब निम्नलिखित संकेतों में से कोई भी दिखाई देता है तो नमूने एकत्र करने के लिए जानवरों का बलिदान करें: बीडब्ल्यू हानि >20%; बिगड़ा गतिशीलता (खाने या पीने में सक्षम नहीं); महत्वपूर्ण ascites या बढ़े हुए पेट के कारण सामान्य रूप से स्थानांतरित करने में असमर्थ; श्वसन में प्रयास; मृत्यु।

3. नेक्रॉप्सी और ट्यूमर फसल

  1. जब ट्यूमर की मात्रा 200-800 मिमी3तक पहुंच गई, तो अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें (चरण 1.2.2 देखें)।
  2. आसन्न गैर ट्यूमर ऊतकों को हटाने के द्वारा ट्यूमर ऊतकों को इकट्ठा, वियोजन से पहले एडी + + + (बर्फ पर) के साथ एक ५० मिलीएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक रखने के बाद ।

4. पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए तैयारी

नोट: सभी निम्नलिखित कदम ऊतक संस्कृति मानक दिशानिर्देशों के अनुसार एक जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर किए गए थे। उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 96-, 24-और 6-अच्छी प्लेटों के पूर्व-गर्म स्टॉक रखें।

  1. रिएजेंट की तैयारी
    1. बेसमेंट झिल्ली निकालने (बीएमई) समाधान (विकास कारक कम, फिनॉल रेड-फ्री) तैयार करें। बीएमई के 10 एमएल को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में रात भर रखें। एक बार गल जाने के बाद, फैलाव सुनिश्चित करने के लिए बीएमई बोतल को चक्कर लगाना।
    2. बेस मीडिया/वाशिंग बफर विज्ञापन + + + तैयार करें । 5 एमएल पिपेट के साथ पाइपिंग करके 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1 एम एचईपी और पेन/स्ट्रीप को एडवांस्ड डीएमईएम/एफ12 मीडिया में जोड़ें।
    3. सातो एट अल द्वारा वर्णित कोलन ऑर्गेनॉइड माध्यम तैयार करें।18 एन-एसी (1 mM), A83-01 (५०० एनएम), B27 (1x), EGF (५० एनजी/एमएल), Noggin (१०० एनजी/एमएल), निकोटिनामाइड (10 mM), SD20219 के साथ आधार मीडिया के पूरक के माध्यम से 0 (10 एनएम), आर-स्पॉन्डिन (५०० एनजी/एमएल), एल-ग्लूटामाइन (2 एमएम), हेपी (10 माइक्रोन), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) और वाई-२७६२३ (10 माइक्रोन)19
    4. विज्ञापन +++ पाचन माध्यम तैयार करें: 1x ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया के 10 एमएल में 500 माइक्रोन के साथ कोलेजनस टाइप II (20 मिलीग्राम/एमएल) और 10 माइक्रोन के साथ RhoKI Y-27632 (10 mM) ।
  2. ट्यूमर वियोजन20
    1. ट्यूमर को 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 10 सेमी पेट्री डिश में ट्रांसफर करें। एक शासक के साथ एक स्थूल तस्वीर लें और इसकी स्थितियों (यानी, आकार, वसा ऊतकों, संवहनी, परिगलन, परिगलन आदि) का विवरण रिकॉर्ड करें।
    2. आकांक्षा द्वारा अतिरिक्त एडी +++ निकालें, और ट्यूमर ऊतक को कैंची द्वारा छोटे टुकड़ों में काट दें जिसके बाद सूखी बर्फ पर स्नैप फ्रीजिंग के लिए 1-2 टुकड़ों को 2 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। जीनोमिक प्रोफाइलिंग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विज्ञापन + + + का उपयोग कर एक ५० एमएल प्लास्टिक ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले कैंची द्वारा महीन टुकड़ों में शेष टुकड़ों कीमा ।
    3. विज्ञापन + + + के 35 एमएल द्वारा कीमा बनाया हुआ ऊतक 2-3 बार धोएं, इसके बाद पाचन माध्यम के 10 एमएल (चरण 4.1.4 देखें) को जोड़ा जाए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 4 x ग्राम पर एक कक्षीय शेखर पर प्लेसमेंट किया जाए।
    4. 5 एमएल बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके पचाने वाले ऊतकों को ऊपर और नीचे से जोड़ दें, इसके बाद 100 माइक्रोन सेल छन्नी द्वारा एडी + + + और निस्पंदन के 20 एमएल को जोड़ा जाए।
    5. एडी + + + (5 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर स्पिन) के साथ दो बार पास-थ्रिल करें, इसके बाद बीएमई में पुनर्संकलण (निलंबन के लिए गोली में बीएमई की 4x मात्रा जोड़ें) और बर्फ19पर रखें।
  3. ऑर्गेनॉइड संस्कृति की तैयारी
    1. बीएमई सेल निलंबन को कई बूंदों में 6-वेल प्लेट में जोड़ें कुल 200 माइक्रोल प्रति अच्छी तरह से।
    2. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। 30 मिनट के बाद, जेल बूंदें जमना।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से ऑर्गेनॉइड मीडिया के 2 एमएल जोड़ें, जिसमें एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2)में स्थानांतरित करने से पहले सूक्ष्म फोटोग्राफी द्वारा दर्ज प्रतिनिधि बूंदों के साथ।
    4. हर 3-4 दिनों में मध्यम परिवर्तन के साथ ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को बनाए रखें, और हर 7 दिनों में 1:2 अनुपात पर या उनके विकास और घनत्व के आधार पर पारित करें।

5. हिस्टोपैथोलॉजी और अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) विश्लेषण

  1. हिस्टोपैथोलॉजी
    1. P1000 पिपेट का उपयोग करके मौजूदा माध्यम के साथ अच्छी तरह से ऑर्गेनॉइड ले लीजिए, इसके बाद अपकेंद्रित्र (5 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर स्पिन), पीबीएस के साथ धोना और 1 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में निर्धारण।
    2. फिक्स्ड ऑर्गेनॉइड को 100% जिलेटिन में 50 एमएल शंकु नली के नीचे रखें, इसके बाद रूटीन टिश्यू प्रोसेसिंग और एम्बेडिंग करें।
    3. 4 मिमी पैराफिन वर्गों पर मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके हीमैटॉक्सीलिन-ईओसिन (एचएंडई) धुंधला करें।
  2. आरएनसीक्यू और पूरे एक्सोम अनुक्रमण
    1. P1000 पिपेट का उपयोग करके मौजूदा संस्कृति माध्यम के साथ अच्छी तरह से ऑर्गेनॉइड ले लीजिए, जिसके बाद अधिकतम गति (12,000 x ग्राम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज (12,000 x ग्राम)का उपयोग करके अपकेंद्रित्रीकरण किया जाता है।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए मध्यम सुपरनैंट को हटाकर गोली को इकट्ठा करें कि कोई दृश्यमान बीएमई मौजूद नहीं था, इसके बाद माइक्रोट्यूब (सूखी बर्फ) में स्नैप फ्रीजिंग और फिर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
    3. निर्माताओं से मानक प्रक्रिया का उपयोग करके आरएनए या डीएनए निकालें और आरएनसीक्यू और पूरे एक्सोम अनुक्रमण (WES) दोनों के लिए एनजीएस विश्लेषण करें।

6. आईसी50 परख20

  1. आईसी50 परख के लिए 384-वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड सीडिंग
    1. बीएमई में ऑर्गेनॉइड प्रत्येक कुएं (पचाने वाले बीएमई) से प्रत्येक कुएं (6-वेल प्लेट) में 100x dispase समाधान के 20 μL जोड़कर, जिसमें ऑर्गेनॉइड माध्यम के 2 एमएल शामिल थे, इसके बाद 37 सी पर 10 मिनट इनक्यूबेशन।
    2. पिपेट ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करने के लिए 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सभी कुओं से ऑर्गेनॉइड को पचाता है।
    3. ऑर्गेनॉइड एकाग्रता के निर्धारण के लिए माइक्रोस्कोपी के तहत ऑर्गेनॉइड की गणना करें। बर्फ पर 5% (v/v) की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए बीएमई जोड़ने से पहले, संस्कृति माध्यम का उपयोग कर ऑर्गेनॉइड को निलंबित करें ।
    4. इसी ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडियम में 200 CR2110 पीडीएक्सओ के सीडिंग डेंसिटी के साथ प्लेट मैप के अनुसार, लिक्विड डिस्पेंसर के साथ प्रत्येक 384-वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  2. सिस्प्लैटिन और इरिनोटन उपचार
    1. सिस्प्लैटिन (100 माइक्रोन की उच्चतम एकाग्रता के साथ) और "इरिनोटन" (10 माइक्रोन की उच्चतम एकाग्रता के साथ) का उपयोग करें। डिजिटल डिस्पेनर द्वारा सीरियल कमजोर पड़ने में, 9 खुराक के लिए दवा कमजोर पड़ने की योजना के अनुसार, irinotecan जो आमतौर पर वीवो अध्ययन में के लिए प्रयोग किया जाता है) के विपरीत, एसएन-38 (irinotecan का एक मेटाबोलाइट) जोड़ें।
    2. डिजिटल डिस्पेंसर सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करके प्लेटमैप बनाएं। 5 माइक्रोन स्टारुरोस्पोरिन के 100% व्यवहार्यता और पोस्टिव कंट्रोल के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण वाहन शामिल करें, जिसने 0% व्यवहार्यता दिखाई।
    3. दवा का इलाज करने वाली 384-अच्छी प्लेटों को वापस 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  3. दवा उपचार के बाद ऑर्गेनॉइड सेल व्यवहार्यता का निर्धारण
    1. दवा उपचार के 5 दिनों के अंत में, निर्माता की अनुशंसित प्रक्रिया के अनुसार ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता अभिकर्मकों का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड सेल व्यवहार्यता निर्धारित करें। तरल डिपेनर के साथ प्रत्येक कुएं में ल्यूमिनेसेंट रिएजेंट जोड़ें और प्लेट शेकर पर 5 मिनट के लिए मिलाएं, इसके बाद अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट इनक्यूबेशन।
    2. ल्यूमिनेसेंट सिग्नल को ल्यूमिनेसेंस मल्टी-वेल प्लेट रीडर पर रिकॉर्ड करें।
    3. प्लेट रीडर से कच्चे रीडिंग का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से सामान्यीकृत विग्रहों की गणना करें और नॉनलाइनर वक्र फिटिंग द्वारा एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र और आईसी50 मूल्य बनाएं।

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Representative Results

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पीडीएक्सओएस की आकृति विज्ञान, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत ऑर्गेनॉइड की विशिष्ट, और माता-पिता के साथ संगत पीडीएक्स प्रति एचएंडई धुंधला
प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत, PDXO-CR2110 विशिष्ट सिस्टिक आकृति विज्ञान(चित्रा 1A) को दर्शाता है,जैसा कि रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) के लिए पहले वर्णित है, एक ही संस्कृति स्थितियों के तहत पीडीएक्सओ और पीडीओ के बीच समानता का समर्थन करने वाले सबूत।

एचएंडई स्टेनिंग द्वारा हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा से पता चलता है कि पीडीएक्सओ-सीआर2110(चित्रा 1B)के ऊतक संरचनाएं और सेल प्रकार मूल पीडीएक्स-सीआर2110(चित्रा 1C)के चिंतनशील हैं, जो यह समर्थन करते हैं कि पीडीएक्स और पीडीएक्सओ को एक ही मूल से विकसित किया गया था: CR2110। यह अवलोकन अपने माता-पिता पीडीएक्स को पीडीएक्स की समानता का समर्थन करने के लिए हिस्टोपैथोलॉजी साक्ष्य प्रदान करता है।

ट्रांसक्रिप्टोम अभिव्यक्ति और पूरे एक्सोम अनुक्रमण पीडीएक्स-सीआर2110 और माता-पिता पीडीएक्स-सीआर 2110 के बीच उच्च संबंध को दर्शाता है
पीडीएक्स-सीआर2110 ट्यूमर को पहले टेप्टोम अनुक्रमण (आरएनसीक्यू, एमआरएनए)16 और पूरे एक्सोम (डब्ल्यूईएस, डीएनए) अनुक्रमित का उपयोग करके जीनोमिक-प्रोफाइल किया गया है। अब हम इसी तरह इसी PDXO-CR2110 प्रोफाइल है । इसी मिलान पीडीएक्स और पीडीएक्सओ(चित्रा 2)की जीनोमिक प्रोफाइल तुलना ट्रांसक्रिप्टोम (एमआरएनए) अभिव्यक्ति (एपिजेनेटिक) में 94.92% का उच्च सहसंबंध और डीएनए म्यूटेशन (डब्ल्यूईएस) (आनुवंशिक) के 97.67% के उच्च सामंजस्य को प्रदर्शित करती है, जो मॉडलों की इस जोड़ी के बीच समग्र जीनोमिक समानता का सुझाव देती है।

इन विट्रो पीडीएक्स-सीआर2110 और वीवो पीडीएक्स-सीआर2110 के बीच औषधीय गुणों के लिए देखी गई समानताएं
दवा संवेदनशीलता परख PDXO-CR2110 पर ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रदर्शन किया गया, चित्रा 3Aमें दिखाया परिणाम के साथ । PDXO-CR2110 irinotecan के प्रति संवेदनशील था और सिस्प्लैटिन के लिए प्रतिरोधी था, पीडीएक्स उपचार परिणामों के अनुरूप(चित्रा 3B)जहां टीजीआई (ट्यूमर वृद्धि अवरोध) 100 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक के स्तर पर, पीआईपी, इरिनोटकर के लिए Q3Dx3 और 5 मिलीग्राम/किलो, आईपी, सिस्प्लैटिन के लिए Q4Dx4 क्रमशः 84.63% और 6.61% है। यह मनाया फार्माकोलॉजी स्थिरता दोनों मॉडलों की संभावित जैविक तुल्यता का समर्थन करती है, और इसका उपयोग विट्रो और वीवो में पूरक फार्माकोलॉजी अध्ययनों के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: PDXO-CR2110 की आकृति विज्ञान। (A)प्रकाश माइक्रोस्कोपी (सिस्टिक प्रकार) के तहत आकृति विज्ञान। (B,C) पीडीएक्सओ-सीआर2110 और पीडीएक्स-सीआर2110 की हिस्टोपैथोलॉजी क्रमशः। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: PDXO-CR2110 बनाम PDX-CR2110, WES और RNAseq के जीनोमिक प्रोफाइल । ऊपरी पैनल: पीडीएक्स-सीआर2110 और पीडीएक्सओ-सीआर2110 प्रति आरएनसीक्यू के बीच वैश्विक एमआरएनए अभिव्यक्ति सहसंबंध। लोअर पैनल: आरएनएईक्यू प्रति एमआरएनए अभिव्यक्ति सहसंबंधों और डीएनए उत्परिवर्तन कॉनकेशन प्रति डब्ल्यूईएस: पीडीएक्स- बनाम पीडीएक्सओ-सीआर2110 दोनों की तालिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: वीवो में प्रोव्टो में पीडीएक्सओ-सीआर2110 और एससी पीडीएक्स-सीआर2110 दोनों के औषधीय गुण। (A)पीडीएक्सओ-सीआर2110 इन विट्रो डोज-टेस्ट यौगिकों के लिए प्रतिक्रिया । (ख)वीवो में सीआर2110 पर एक ही परीक्षण यौगिकों द्वारा प्रेरित ट्यूमर विकास अवरोध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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इस रिपोर्ट में पीडीएक्स-/पीडीएक्सओ-सीआर2110 के प्रारंभिक आंकड़े जीनोमिक्स, हिस्टोपैथोलॉजी और फार्माकोलॉजी के संबंध में पीडीएक्स और इसके डेरिवेटिव, पीडीएक्सओ के बीच जैविक तुल्यता का समर्थन करते हैं, क्योंकि दोनों मॉडल रोगी के मूल सीएससी से प्राप्त रोग रूपों का प्रतिनिधित्व करते हैं । दोनों मॉडल रोगी-व्युत्पन्न रोग मॉडल हैं, जो रोगियों की नैदानिक प्रतिक्रिया के संभावित पूर्वानुमानितहैं 10,11,12, 21। इन विट्रो और वीवो मॉडल में मिलान जोड़ी विट्रो स्क्रीनिंग और वीवो में सत्यापन के लिए एक दूसरे के पूरक हो सकते हैं, दवा की खोज की सफलता दर में सुधार और संभावित नैदानिक विकास में उदासीनता दरों को कम करने । यह ध्यान देने योग्य है कि पीडीएक्सओ अब एचटीएस को उपलब्ध बड़े रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड पुस्तकालयों का लाभ उठाने में सक्षम बना सकता है, जहां पीडीएक्स वीवो लागत और लंबी समयसीमा में उच्च होने के कारण विफल हो जाते हैं। कहने की जरूरत नहीं है, एक मिलान PDX-PDXO पुस्तकालय की संभावना निकट भविष्य में दवा की खोज और अनुवाद अनुसंधान का समर्थन करने के लिए पसंद का मंच बन जाएगा ।

एनोटेटेड पीडीएक्स मॉडल की मौजूदा लाइब्रेरी को परिवर्तित करना एक औद्योगिक प्रक्रिया को नियोजित करके एक व्यावहारिक ऑर्गेनॉइड पुस्तकालय के निर्माण के लिए एक तेज और उत्पादक दृष्टिकोण हो सकता है। इस रिपोर्ट ने इस तरह की प्रक्रिया की व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए एक पीडीएक्स को पीडीएक्स में परिवर्तित कर दिया, और उपयोग की गई विधि एक व्यापक पीडीएक्सओ लाइब्रेरी बनाने के लिए बड़े पैमाने पर प्रक्रिया का समर्थन करने के लिए एक नींव हो सकती है। व्यावहारिक रूप से, पीडीएक्सओ बनाने के तरीके आम तौर पर पीडीओ18की पीढ़ी के लिए व्यापक रूप से वर्णित विधि के समान होते हैं, जिसमें रोगी ऊतक चूहों के स्रोत के अपवाद के साथ होता है।

यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं कि पीडीएक्सओ सफलतापूर्वक बनाए जाते हैं: 1) ताजा पीडीएक्स ट्यूमर छोटे टुकड़ों में खंडित हैं; 2) चतुर और सहयोगियों द्वारा वर्णित ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए वर्णित संस्कृति की स्थिति को ईमानदारी से18,22लागू किया जाता है, लेकिन विभिन्न ऑर्गेनॉइड के लिए समायोजित किया जा सकता है; 3) विभिन्न ऑर्गेनॉइड की विकास दर अलग-अलग होती है, जो ऑर्गेनॉइड संस्कृति और स्वास्थ्य के साथ-साथ दवा उपचार अवधि के लिए अवधि को प्रभावित करती है; 4) माउस सामग्री बनाम मानव सामग्री निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी परख यह सुनिश्चित करने के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है कि संस्कृतियों में काफी हद तक मानव ऑर्गेनॉइड हैं, क्योंकि कुछ संस्कृतियों में अनिवार्य रूप से लगातार माउस ऊतक/ यदि प्रभावी पहचान और हटाने के तरीकों का उपयोग नहीं किया जाता है तो माउस संदूषण पीडीएक्सओ बायोबैंक बनाने में महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक हो सकता है।

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Disclosures

सभी लेखक क्राउन बायोसाइंस, इंक के वर्तमान पूर्णकालिक कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन और संपादन के लिए डॉ जोडी बारबांका, फेडरिका परसी और राजेंद्र कुमारी को धन्यवाद देना चाहते हैं । लेखक ों को भी अपने महान तकनीकी प्रयासों के लिए विट्रो में क्राउन बायोसाइंस ऑन्कोलॉजी और वीवो टीम में शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634028 Base medium
DMEM Hyclone SH30243.01 Washing medium
Collagenese type II Invitrogen 17101015 Digest tumor
Matrigel Corning 356231 Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac Sigma A9165 Organoid culture medium
A83-01 Tocris 2939 Organoid culture medium
B27 Life Technologies 17504044 Organoid culture medium
EGF Peprotech AF-100-15 Organoid culture medium
Noggin Peprotech 120-10C Organoid culture medium
Nicotinamide Sigma N0636 Organoid culture medium
SB202190 Sigma S7076 Organoid culture medium
Gastrin Sigma G9145 Organoid culture medium
Rspondin Peprotech 120-38-1000 Organoid culture medium
L-glutamine Life Technologies 35050038 Organoid culture medium
Hepes Life Technologies 15630056 Organoid culture medium
penicillin-streptomycin Life Technologies 15140122 Organoid culture medium
Y-27632 Abmole M1817 Organoid culture medium
Dispase Life Technologies 17105041 Screening assay
CellTiter-Glo 3D Promega G9683 Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser Thermo Fisher Multidrop combi Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener Tecan D300e Compound addition
Envision Plate reader Perkin Elmer 2104 Luminescence reading
Balb/c nude mice Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit Qiagen 74104 tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 DNA purification kit
Histogel Thermo Fisher HG-4000-012 Organoid embedding

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References

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कैंसर फार्माकोलॉजी अनुसंधान के लिए पीडीएक्स और पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड के वीवो/इन विट्रो रोगी-व्युत्पन्न मॉडल जोड़े में मिलान करना
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Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).More

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